Summary
Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll zur Erstellung von DNA-Fingerabdruckprofilen durch Amplifizierung des VNTR-Locus D1S80 aus Epithelzell-DNA.
Abstract
In den Biowissenschaften wurde der DNA-Fingerabdruck häufig für Vaterschaftstests, forensische Anwendungen und phylogenetische Studien verwendet. Hier beschreiben wir eine zuverlässige und robuste Methode zur Genotypisierung von Individuen durch Variable Number of Tandem Repeat (VNTR) Analyse im Rahmen von Bachelor-Laborkursen. Der menschliche D1S80 VNTR-Locus wird in diesem Protokoll als hochpolymorpher Marker verwendet, der auf der Variation der Anzahl der sich wiederholenden Sequenzen basiert.
Dieses einfache Protokoll vermittelt nützliche Informationen für Lehrer und die Implementierung von DNA-Fingerprinting in praktischen Laborklassen. In der vorgestellten Laborübung wird die DNA-Extraktion mit anschließender PCR-Amplifikation verwendet, um die genetische Variation am D1S80 VNTR-Locus zu bestimmen. Unterschiede in der Fragmentgröße von PCR-Produkten werden durch Agarosegelelektrophorese visualisiert. Die Fragmentgrößen und Wiederholungszahlen werden auf der Grundlage einer linearen Regression der Größe und des Migrationsabstands eines DNA-Größenstandards berechnet.
Nach diesem Leitfaden sollten die Schüler in der Lage sein:
• Ernte und Extraktion von DNA aus Epithelzellen der Wangenschleimhaut
• Führen Sie ein PCR-Experiment durch und verstehen Sie die Funktion verschiedener Reaktionskomponenten
• Analyse der Amplicons durch Agarosegelelektrophorese und Interpretation der Ergebnisse
• Verstehen Sie die Verwendung von VNTRs bei DNA-Fingerabdrücken und ihre Anwendung in den biowissenschaftlichen Wissenschaften
Introduction
Molekulare Fingerabdrücke, auch dna-Fingerprinting genannt, wurden 1984 von Sir Alec Jeffreys eingeführt, als er in der Abteilung für Genetik an der University of Leicester arbeitete1. Es basiert auf den 0,1% des menschlichen Genoms, die sich zwischen Individuen unterscheiden und besteht aus etwa drei Millionen Varianten. Diese einzigartigen Unterschiede im Genotyp ermöglichen die Unterscheidung zwischen Individuen und können daher als genetischer Fingerabdruck fungieren, mit Ausnahme von einzygoten Zwillingen. Folglich wird der DNA-Fingerabdruck zur Abschätzung der Verwandtschaft verschiedener Individuen verwendet, die beispielsweise bei Vaterschaftstests oder in Population Diversity Studies angewendet wird. In unseren Laborkursen wollten wir das Konzept des DNA-Fingerabdrucks und der Allelfrequenzen vermitteln. Die hier beschriebene Methode demonstriert eine zuverlässige und robuste Methode für den genetischen Fingerabdruck durch die Analyse der variablen Anzahl von Tandem-Wiederholungen (VNTR) am D1S80-Locus. Die Methode umfasst die Extraktion von DNA aus bukkalen Schleimhautepithelzellen und die anschließende Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Amplifizierung des D1S80-Locus, gefolgt von der Visualisierung von Fragmentlängenunterschieden auf einem Agarosegel.
Der D1S80 VNTR Minisatelliten-Locus ist sehr variabel und befindet sich im Telomerbereich des Chromosoms 1 (1p36-p35). Es wurde 1990 von Karsai und Mitarbeitern als Einort mit einer Kernwiederholeinheit von 16 bp identifiziert und beschrieben, was die Trennung von Allelen ermöglichte, die sich nur um eine Einheit2unterscheiden. Weiterhin zeigt D1S80 einen hohen Variationsgrad mit einer Mutationsrate von ca. 7,77 x 10-5 3. D1S80 hat einen hohen Grad an Heterozygotie4,5 (z. B. 80,8% Heterozygotie für Kaukasier6 und bis zu 87% Heterozygotie für Afroamerikaner7). Darüber hinaus ist der D1S80-Locus in den meisten Populationen polymorph, wobei typischerweise über 15 verschiedene Allele jeweils 14 bis 41 Wiederholungen tragen. Die Häufigkeit von D1S80-Allelen variiert zwischen den Populationen. Das Allel mit 24 Wiederholungseinheiten (Allel 24) ist in europäischen und asiatischen Populationen am häufigsten, während Allel 21 am häufigsten in afrikanischen Populationen4,7,8,9,10 vorkommt. Folglich sind die Allelhäufigkeitsverteilungen für verschiedene menschliche Populationen diagnostisch und müssen bei der Abschätzung der Verwandtschaft berücksichtigt werden (z. B. bei Vaterschaftstests).
Die PCR-basierte Amplifikation des D1S80 VNTR-Locus war eine sehr nützliche Methode in der forensischen Wissenschaft, Vaterschaftstests, Krankheitsanalyse und Populationsdiversitätsstudien11,12,13,14. Während in der Forensik heute die Verwendung von VNTRs durch kurze Tandemwiederholungen ersetzt wurde, wird der D1S80 VNTR-Locus häufig bei der Bestimmung von Ursprüngen und genetischen Beziehungen zwischen und zwischen Populationen4,8,9,11verwendet. Darüber hinaus wird es häufig verwendet, um DNA-Fingerabdruck in praktischen Laborklassen15,16zu unterrichten. Die hier beschriebene Methode stellt eine robuste, kostengünstige und einfach anzuwendende Methode mit einer sehr hohen Erfolgsquote in bachelorigen Laborklassen dar. Der Zweck dieses Artikels ist es, einen Überblick über den Workflow für die molekulare Analyse des menschlichen D1S80-Minisatelliten-Locus aus bukkalen Schleimhautepithelzellen zu geben. Es enthält die Demonstration von Techniken, vereinfachten Protokollen und praktischen Vorschlägen, die in zuvor veröffentlichten Werken2,17beschrieben sind.
Protocol
HINWEIS: Dieses Protokoll darf nur verwendet werden, wenn Studenten oder entsprechende Erziehungsberechtigte der Durchführung dieses Protokolls zugestimmt haben, da genotypische Profile Einblicke in genetische Zusammenhänge geben. DNA-Fingerprinting ist eine gängige molekularbiologische Methode, die hauptsächlich auf Populationsstudien und forensische Angelegenheiten angewendet wird. Daher sollte darauf geachtet werden, das Kontaminationsrisiko so gering wie möglich zu halten. Um eine Kontamination der Probe mit DNA von einer externen Quelle oder DNases zu vermeiden, sollten Handschuhe getragen, Instrumente gründlich gereinigt oder sterilisiert und Lösungen vor der Verwendung filtersterilisiert oder autoklaviert werden.
1. Ernte von Epithelzellen der Bukkalschleimhaut
ACHTUNG: Die Arbeit mit Speichel und Epithelzellen kann zu einer Übertragung von Infektionskrankheiten führen. Daher sollten standard- und übertragungsbasierte Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden (z. B. die Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung).
HINWEIS: Fügen Sie eine Positivkontrolle hinzu, die vom Ausbilder bereitgestellt wird (z. B. DNA, die vom Ausbilder extrahiert wurde) und in die nachgelagerten Verarbeitungsschritte einbezogen wird.
- Warten Sie mindestens 1 h nach dem Essen oder Zähneputzen vor der Probenentnahme.
- Beschriften Sie ein leeres und steriles 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Entfernen Sie einen sterilen Wangenabstrich aus der Verpackung und reiben Sie 30-40 Mal oder 30-40 Sekunden kräftig auf der Innenseite der Wange, um Bukkaschleimhautepithelzellen zu ernten.
- Legen Sie die Spitze des Auffangtupfers in das zuvor markierte sterile Mikrozentrifugenröhrchen und brechen Sie die Länge des Kunststoffs, die über den Rand hinausreicht, entweder von Hand oder mit einer sterilen Schere ab.
- Setzen Sie die Kappe sicher auf das Rohr und versiegeln Sie den Auffangtupfer im Inneren.
2. Extraktion genomischer DNA aus menschlichen Zellen
- Vor der Extraktion einen Thermomischer oder einen Heizblock zur Probenlyse auf 65 °C stellen.
ACHTUNG: Einige verwendete Chemikalien sind als gefährlich eingestuft. Lesen Sie das Sicherheitsdatenblatt sorgfältig durch und ergreifen Sie vor der Handhabung geeignete Sicherheitsmaßnahmen.- Vorbereiten und sterilisieren Sie durch Filtern oder Autoklavieren aller erforderlichen Puffer und Lösungen (Lyselösung, 8 M Kaliumacetat, 2-Propanol, 70% Ethanol und Elutionspuffer).
HINWEIS: Alle Zentrifugationsschritte sollten bei Raumtemperatur (20-30 °C) durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben.
- Vorbereiten und sterilisieren Sie durch Filtern oder Autoklavieren aller erforderlichen Puffer und Lösungen (Lyselösung, 8 M Kaliumacetat, 2-Propanol, 70% Ethanol und Elutionspuffer).
- 500 μL Lyselösung (50 mM Tris/HCl, pH 8,0; 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA); 2% Natriumdodecylsulfat (SDS)) werden in den Wangenabstrich geben, wobei sichergestellt wird, dass die Probe vollständig in die Lyselösung eingetaucht ist.
- Wirbel kräftig für mindestens 5 s.
- Proben bei 65 °C in einem Thermomischer für 10 min inkubieren.
- Mischen Sie die Probe 3-4 mal durch Pulswirbel für 5 s während der Inkubation.
- Tupfer aus dem Lysepuffer entfernen, tupfern Sie ihn gegen die Innenseite des Röhrchens, um ein maximales Probenvolumen zu erhalten.
- Fügen Sie 100 μL 8 M Kaliumacetat zu lysierten Zellen hinzu.
- Mischen Sie gründlich, indem Sie das Röhrchen umkehren, bis ein weißer Niederschlag entsteht.
- 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Zentrifuge die Probe für 5 min bei 18.000 x g.
- 450 μL des Überstandes in ein sauberes und steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen geben.
- Fügen Sie 450 μL 2-Propanol hinzu und mischen Sie gründlich, indem Sie das Röhrchen invertieren (Ausfällung der DNA).
- 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Zentrifuge für 5 min bei 18.000 x g.
- Entsorgen Sie den Überstand und kehren Sie das Röhrchen auf einem sauberen Papiertuch um, um das Pellet zu trocknen und Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
- Inkubieren Sie die DNA für 5 min bei 65 °C in einem Heizblock, um das Pellet vollständig zu trocknen.
- Um die DNA zu waschen, fügen Sie 500 μL 70% Ethanol hinzu.
- Zentrifuge für 1 min bei 18.000 x g.
- Entsorgen Sie den Überstand und kehren Sie das Röhrchen auf einem sauberen Papiertuch um, um das Pellet zu trocknen.
- 30 μL Resuspensionspuffer (10 mM Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) werden dem Pellet zugefüllt.
- Inkubieren Sie die DNA für 10 min bei 65 °C in einem Heizblock, um DNasen zu inaktivieren.
3. Verstärkung des D1S80 VNTR-Locus mittels PCR
HINWEIS: Notieren Sie die Anzahl der Proben, die verwendet werden, und erstellen Sie ein Arbeitsblatt mit den erforderlichen Reagenzien und deren Volumina, bevor Sie die erforderlichen Kunststoffe und andere Materialien sammeln. Kennzeichnen Sie die sterilen Röhrchen/Streifen/Platten, die für die PCR verwendet werden sollen, mit Probennummern. Denken Sie daran, eine Negativkontrolle mitH2O anstelle von DNA und eine Positivkontrolle (z. B. mit der vom Ausbilder bereitgestellten DNA) einzubeziehen, um die PCR zu validieren.
- Herstellung des 1x PCR-Mastermixes mit 10 μL 5x PCR-Reaktionspuffer (mit 15 mMMgCl2),1 μL Desoxyribonukleotidtriphosphat (dNTPs) (10 mM), 5 μL (10 pmol) jedes Primers pMCT118-f und pMCT118-r (vorwärts - 5'-GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCGCCG-3', umgekehrt - 5'-GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCTTGC-3') gemäß Kasai et al.2,23,8 μL hochreinerH2O und 0,2 μL Taq DNA-Polymerase (5 U/μL).
HINWEIS: Die Primer pMCT118-f/pMCT118-r wurden auf den flankierenden Regionen der D1S80 VNTR-Region entwickelt, die den gesamten Locus verstärken. - Beschriften Sie die PCR-Röhrchen/-Streifen/-Platten mit den zu verwendenden Probennummern.
- Aliquot 45 μL der Mastermischung zu jedem markierten PCR-Probenröhrchen oder -gut.
- Fügen Sie 5 μL der DNA-Vorlage zum Master-Mix in jeder PCR-Röhrchen-/Plattenbohrung hinzu, um ein Gesamtvolumen von 50 μL zu erhalten.
- Fügen Sie ein NTC (No Template Control) ein, indem Sie hochreinesH2O anstelle von DNA verwenden.
- PCR-Schläuche/-Streifen oder Siegelplatte verschließen und mischen.
- Zentrifugieren Sie die PCR-Röhren/-Streifen/-Platten für 20 s mit einer Tischzentrifuge.
HINWEIS: Die in diesem Protokoll angegebenen PCR-Bedingungen wurden mit der DNA-Polymerase und dem verwendeten PCR-Thermocycler optimiert. Im Allgemeinen müssen die PCR-Bedingungen an die DNA-Polymerase angepasst werden. Die Standardverlängerungszeit für eine Taq DNA Polymerase beträgt 1 min/kb. - Die Probenröhrchen/-streifen/-platten in den Thermocycler geben und Reaktionen unter folgenden Bedingungen (DNA-Polymerase-Verlängerungszeit) inkubieren: 1 Zyklus von 95 °C für 2 min; 25 Zyklen von 94 °C für 15 s, 60 °C für 15 s, 72 °C für 30 s; 1 Zyklus von 72 °C für 10 min.
- Wenn das Programm abgeschlossen ist, entfernen Sie die Produkte aus dem Thermocycler und lagern Sie sie bei 4 °C über Nacht oder -20 °C bis zur Elektrophorese.
4. Agarosegelelektrophorese von PCR-Produkten
- Bereiten Sie ein 1,5% iges Agarosegel vor.
- Verwenden Sie 1,5 g Agarosepulver und mischen Sie es mit 100 ml 1x Tris-Acetat-EDTA (TAE) Pufferlösung in einem Kolben.
- Die Mischung ca. 1,5-2 min in einer Mikrowelle (600 W) erhitzen. Den Inhalt verwirbeln und bei Bedarf erneut erhitzen, um die Agarose vollständig aufzulösen. Leicht abkühlen lassen und 2 μL PeqGreen zur Agarose geben.
- Gießen Sie das Gel in form eines Kamms mit genügend Vertiefungen für alle Proben und fügen Sie mindestens einen Molekulargewichtsmarker hinzu.
ACHTUNG: Es kann zu einer siedenden Verzögerung kommen. Schütteln Sie den Kolben vorsichtig, wenn Sie die noch nicht aufgelöste Agarose wieder auffüllen.
HINWEIS: PeqGreen ist ein ungiftiger Farbstoff zum Nachweis von Nukleinsäuren. Es eignet sich zur Färbung von doppelsträngiger DNA (dsDNA) und einzelsträngiger DNA (ssDNA) sowie RNA. Die Empfindlichkeit ist vergleichbar mit Ethidiumbromid.
- Entfernen Sie die PCR-Produkte von 4 °C und zentrifuge für ca. 10 s.
- Laden Sie die Vertiefungen des Gels mit 10 μL Probe. Überladen Sie das Gel nicht.
HINWEIS: Der DNA-Polymerase-Puffer enthält auch Verbindungen, die die Probendichte erhöhen, so dass Proben direkt auf Gele geladen werden können, ohne dass ein Ladefarbstoff erforderlich ist. Dadurch kann die Probe in den Brunnen sinken und Farbstoffe helfen zu verfolgen, wie weit die DNA-Probe migriert ist.- Fügen Sie den flankierenden Vertiefungen einen Molekulargewichtsstandard hinzu (vorzugsweise einen Molekulargewichtsstandard von 50 bp).
HINWEIS: Lagern Sie die restlichen PCR-Proben bei -20 °C, falls die Agarosegelelektrophorese wiederholt werden muss.
- Fügen Sie den flankierenden Vertiefungen einen Molekulargewichtsstandard hinzu (vorzugsweise einen Molekulargewichtsstandard von 50 bp).
- Führen Sie das Gel in 1x TAE-Laufpuffer bei 150 V (konstant) für ca. 40 min oder bis die untere gelbe Farbstofffront, die sich mit etwa 50 bp bewegt, das untere Ende des Gels erreicht.
- Stellen Sie das Gel ab, während blaues Licht oder ultraviolettes (UV) Licht aufgetragen wird, und zeichnen Sie ein Bild für die Fragmentlängenanalyse auf.
ACHTUNG: UV-Licht kann Ihre Augen und Haut schädigen. Tragen Sie immer Schutzkleidung und UV-Schutzbrille, wenn Sie einen UV-Leuchtkasten verwenden. - Entsorgen Sie das Gel in Übereinstimmung mit der institutionellen Gefahrstoffrichtlinie.
5. Analyse der Ergebnisse der Fragmentlänge
HINWEIS: Verwenden Sie die lineare Regressionsanalyse, um die Länge der Fragmente zu schätzen.
- Um die D1S80 PCR-Fragmente zu dimensionieren, legen Sie ein Lineal auf das Gelfoto über die 50 bp Molekulargewichts-Standardspur, so dass die Oberseite des Lineals mit der Unterseite des Brunnens ausgerichtet ist, in den die Probe geladen wurde (Abbildung 1).
HINWEIS: Zur Berechnung der linearen Regressionsgleichung für den Molekulargewichtsstandard (50 bp Molekulargewichtsstandard) wurde ein Tabellenkalkulationsprogramm verwendet. - Notieren Sie den Abstand vom Bohrplatz (z. B. in cm) für jedes Band des 50 bp Molekulargewichtsstandards in einer Tabelle mit einem Tabellenkalkulationsprogramm (Abbildung 2).
- Bestimmen Sie das Protokoll (z. B. Basis 10) jeder Fragmentgröße des Molekulargewichtsstandards von 50 bp und geben Sie die Protokollwerte in die Tabelle ein (Abbildung 2).
- Zeichnen Sie jeden Datenpunkt in ein Diagramm mit dem Protokoll der Bandgrößen auf der vertikalen Achse (y-Achse) und dem gemessenen Laufabstand von der Oberseite des Gels zu jedem Band des Molekulargewichtsstandards auf der horizontalen Achse (x-Achse) mit einem Streudiagramm (Abbildung 3).
- Passen Sie eine Trendlinie (lineare Regressionslinie) an und zeigen Sie die Regressionsgleichung (y = ax + b) und denR2-Wert im Diagramm an (Abbildung 4).
- Messen Sie den migrierten Abstand (z. B. in cm) für jedes D1S80-Amplicon (Abbildung 5).
- Schätzen Sie die Größe jedes D1S80-Amplicons mithilfe der Regressionsgleichung: y = ax + b
wobei y = das Protokoll der Fragmentgröße
a = die Steigung der Linie (berechnet in Punkt 5)
x = Abstand zum Brunnen (in cm)
b = der Punkt, an dem die Regressionslinie die y-Achse abfängt (berechnet in Punkt 5)
HINWEIS: Da der y-Wert das Protokoll der Fragmentgröße darstellt, muss das Antilog (10y)berechnet werden, um die Fragmentgröße der D1S80-Amplicons in bp zu erhalten.
6. Schätzung der Anzahl der Wiederholungseinheiten in den Allelen der getesteten Personen
HINWEIS: Die D1S80-Wiederholungseinheit ist 16 bp lang. Das kleinste bekannte Allel für D1S80 hat 14 Wiederholungen. Das hier beschriebene Amplicon-Schema erzeugt Amplicons mit flankierenden Regionen, die zusätzliche 145 bp zur endgültigen Größe addieren.
- Verwenden Sie Tabelle 1, um abzuschätzen, wie viele Wiederholungseinheiten in jedem PCR-Fragment enthalten sind. Die mit der linearen Regression extrapolierte Größe sollte innerhalb von 8 bp eines bestimmten Allels liegen.
- Notieren Sie den Genotyp jedes getesteten Individuums als Kombination von Allelwiederholungsgrößennummern.
Representative Results
Unter Verwendung des beschriebenen Protokolls wurde die D1S80 VNTR-Markeranalyse an menschlicher genomischer DNA durchgeführt, die aus Epithelzellen der bukkalen Schleimhaut extrahiert wurde, die durch Abstrichproben entnommen wurden (Abbildung 6). Nach der Amplifikation mittels PCR ist in Abbildung 1eine typische Darstellung eines Agarosegels mit den D1S80-Ampliconen dargestellt. Spur 1 zeigt den Molekulargewichtsstandard von 50 bp. Neben dem Molekulargewichtsstandard werden PCR-Produkte aus acht Schülerproben visualisiert. Spur 10 zeigt den NTC, in dem Wasser anstelle von Vorlagen-DNA verwendet wurde. Die meisten der analysierten Proben zeigen eindeutig zwei Bänder, die heterozygote Individuen für den D1S80-Locus darstellen. Lane 2 und Lane 9 zeigen ein einzelnes Band, das Homozygote für den D1S80-Locus darstellt. Lane 5 zeigt ein mehrdeutiges Single-Band, das im Vergleich zu den anderen Bands viel breiter ist. Dies könnte darauf liegen, dass sich zwei D1S80-Allele in nur einer Wiederholungseinheit unterscheiden. Für die weitere Analyse wird die Probe in Bahn 5 als ein einzelnes Band betrachtet, das ein homozygotes Individuum darstellt.
Die nachgeschaltete Gelelektrophorese-Fragmentanalyse, die an verifizierten PCR-Produkten durchgeführt wurde, wurde für die Größenanrufung des D1S80 VNTR-Locus verschiedener Studentenproben verwendet. Die Interpretation der durch PCR-Analyse erhaltenen Amplicongrößen basiert auf dem verwendeten Molekulargewichtsstandard. Der Abstand vom Bohrbrunnen für jedes Band des Molekulargewichtsstandards wurde gemessen (Abbildung 1) und aufgezeichnet (Abbildung 2). Basierend auf der Größe und dem Migrationsabstand kann die Größe der einzelnen Bänder mittels einer linearen Regressionsanalyse berechnet werden. Das Log (Basis 10) wurde für jedes Band in den Schülerstichproben (Abbildung 5) bestimmt und das jeweilige Antilog stellt die Anzahl der bp für jedes Amplicon dar. Die Anzahl der Wiederholungseinheiten kann entsprechend der erhaltenen Amplicongröße berechnet werden (Tabelle 2).
Für jede Schülerstichprobe wurden die Amplikongrößen durch lineare Regression berechnet, und jedes Band konnte leicht einem bestimmten Allel zugeordnet werden, wie in Tabelle 2gezeigt. Die Informationen über die D1S80-Allelgrößen können dann verwendet werden, um Allelfrequenzen unter der kleinen Populationsuntergruppe der Studenten zu bestimmen. Das 28-Wiederholungs-Allel ist das häufigste unter den Schülern aufgrund von zwei homozygoten Individuen für dieses Wiederholungsallele (Individuen 1 und 4). Das zweithäufigste Allel ist das 18-Wiederholungs-Allel, das vom homozygoten Individuum 8 und vom heterozygoten Individuum 6 getragen wird. Niederfrequente Allele sind die 21-, 26- und 30-Wiederholungsallele, die nur einmal bei Individuen 6, 5 und 3 vorkommen. Die Allelfrequenzmuster des D1S80 VNTR-Locus der kleinen Studentenpopulation können weiter mit der Allelfrequenz größerer menschlicher Populationen verglichen werden, zum Beispiel Populationen, die von verschiedenen Kontinenten stammen4,7,8,9,10.
Unter den Schülern teilen sich die Personen 2 und 3 das 24-Wiederholungs-Allel, die Personen 2 und 7 das 20-Wiederholungs-Allel und die Personen 5 und 7 das 23-Wiederholungs-Allel. Interessanterweise teilen sich die beiden homozygoten D1S80-Individuen (Individuum 1 und 4) das 28-Wiederholungs-Allel. Übereinstimmende Allele zwischen zwei Individuen können auf eine potenzielle Verwandtschaft hinweisen. Gemeinsame Allele können jedoch auch zufällig auftreten. Daher ist es entscheidend, die Wahrscheinlichkeit einer Allel-Übereinstimmung zwischen zwei Individuen zu bestimmen. Die Wahrscheinlichkeit hängt von der Allelhäufigkeit einzelner Allele in der Allgemeinbevölkerung ab, und statistische Ansätze sollten verwendet werden, um der VNTR-Markeranalyse wie dem Bayes'schen Ansatz ein statistisches Gewicht beizumessen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorgestellte Fingerprinting-Methode in praktischen Unterrichtspraktiken verwendet werden kann, um die Verwendung von VNTRs im DNA-Fingerabdruck und seine Anwendung in der biologischen Wissenschaft zu lehren.
Abbildung 1: Darstellung eines Agarosegels nach Elektrophorese von D1S80-Amplifikationsprodukten mit einem Lineal neben der 50 bp Molekulargewichts-Standardbahn. Lane 1 enthält den Molekulargewichtsstandard von 50 bp, während Lanes 2-9 PCR-Reaktionsprodukte enthalten. Lane 10 enthält das No Template Control (NTC). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bestimmung der DNA-Fragmentmigrationsentfernung und des Protokolls jeder Fragmentgröße des Molekulargewichtsstandards von 50 bp. Der Abstand vom Brunnen (in cm) für jedes Band des 50 bp Molekulargewichtsstandards wird aufgezeichnet und das Protokoll (Base 10) für jedes Fragment bestimmt. Werte werden mit einem Tabellenkalkulationsprogramm in eine Tabelle eingegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Streudiagramm, das durch Auftakt des DNA-Fragmentmigrationsabstands des Molekulargewichtsstandards auf der x-Achse gegen das Log (Basis 10) der Größe jedes Fragments auf der y-Achse erzeugt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Auswertung der linearen Regressionslinie und Regressionsgleichung sowie desR2-Wertes für die Daten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Bestimmung der Größe der D1S80-Amplicons. Der Abstand vom Brunnen für jedes Fragment wird in die Regressionsgleichung eingegeben. Das Antilog des y-Wertes stellt die Fragmentgröße in bp dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6:Vorgeschlagener Zeitplan und Workflow für die D1S80 VNTR-Analyse. Das gesamte hier vorgestellte D1S80 VNTR-Analyseverfahren, von der bukkalen Epithelzellentnahme bis zur Fragmentlängenbewertung, kann innerhalb eines einzigen Arbeitstages abgeschlossen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Allelgröße (in bp) | Anzahl der Wiederholungen |
| 369 | 14 |
| 385 | 15 |
| 401 | 16 |
| 417 | 17 |
| 433 | 18 |
| 449 | 19 |
| 465 | 20 |
| 481 | 21 |
| 497 | 22 |
| 513 | 23 |
| 529 | 24 |
| 545 | 25 |
| 561 | 26 |
| 577 | 27 |
| 593 | 28 |
| 609 | 29 |
| 625 | 30 |
| 641 | 31 |
| 657 | 32 |
| 673 | 33 |
| 689 | 34 |
| 705 | 35 |
| 721 | 36 |
| 737 | 37 |
| 753 | 38 |
| 769 | 39 |
| 785 | 40 |
| 801 | 41 |
Tabelle 1: Amplicongröße für jeden D1S80 VNTR-Locus.
| Individuum | Allel | Abstand (in cm) | Größe (in bp) | Anzahl der Wiederholungseinheiten |
| 1 | homozygot | 5 | 600 | 28 |
| 2 | heterozygot | 5.2 ; 5.5 | 535, 458 | 24, 20 |
| 3 | heterozygot | 4.9 ; 5.2 | 626, 535 | 30, 24 |
| 4 | homozygot | 5 | 600 | 28 |
| 5 | heterozygot | 5.1 ; 5.3 | 564, 508 | 26, 23 |
| 6 | heterozygot | 5.4 ; 5.6 | 483, 435 | 21, 18 |
| 7 | heterozygot | 5.3 ; 5.5 | 508, 458 | 23, 20 |
| 8 | homozygot | 5.6 | 435 | 18 |
Tabelle 2: Allelzusammensetzung der verschiedenen getesteten Personen. Die Anzahl der Wiederholungseinheiten kann entsprechend der durch lineare Regressionsanalyse erhaltenen Amplicongröße angenähert werden.
Discussion
Hier haben wir eine einfache und kostengünstige Methode zur Implementierung von molekularem Fingerabdruck in der praktischen Ausbildung beschrieben.
Um nach genetischen Variationen am D1S80-Locus zu suchen, ist eine menschliche biologische Probenentnahme zusammen mit DNA-Extraktion und -Analyse erforderlich. Es ist wichtig, dass die ethische Verwendung menschlicher biologischer Proben während des gesamten Prozesses sichergestellt wird. Das Probenmanagement wird innerhalb eines umfassenden regulatorischen Rahmens gesteuert, der die korrekte Verwendung von Proben und zugehörigen Daten gewährleistet18 (z. B. Zustimmung zur Verwendung von humanbiologischem Material). Die Teilnehmer müssen ordnungsgemäß über die Verwendung ihrer Proben, das Risiko der Entdeckung von Anomalien in genetischen Beziehungen (z. B. für verwandte Personen), den Schutz der Privatsphäre und die Absichten für die zukünftige Speicherung der biologischen Proben und Daten informiert werden. Alle Spender (Studenten oder Kollegen) müssen ihre Einwilligung frei erteilen und das Recht verstehen, ohne Angabe von Gründen zurückzutreten. Generell ist es unerlässlich, sich vor der Durchführung dieses Laborkurses mit den jeweiligen Richtlinien und Vorschriften für das Menschliche Probenmanagement vertraut zu machen.
Bei der Entnahme von bukkalen Schleimhautepithelzellen in Bachelor-Laborkursen muss darauf geachtet werden, eine Kontamination der DNA-Proben mit DNA des Bedieners oder mit DNasen zu vermeiden. Es wird empfohlen, immer Laborkittel, Handschuhe und Schutzbrillen sowie sterile Tupfer und Mikrozentrifugenröhrchen zu verwenden. Die auf Wangenabstrichen basierende Zellentnahme gilt als eine bequeme und kostengünstige Methode zur Sammlung von genetischem Material, das für die PCR-basierte VNTR-Analyse geeignet ist, da es relativ kostengünstig und nichtinvasiv ist. Neben Wangenabstrichen ist Speichel die häufigste orale Probenahmemethode für die medizinische Forschung. Es wurde gezeigt, dass Wangenabstriche einen höheren Anteil an Epithelzellen enthalten als Speichel, was sie zuverlässiger bei der Bereitstellung einer ausreichenden Quantität und Qualität der DNA für die PCR-basierte D1S80 VNTR-Analyse macht19,20. Darüber hinaus können Wangenabstriche nach Selbstabholung verschickt werden, um geografische Hindernisse zu überwinden, wenn sie beispielsweise in Population Diversity Studies verwendet werden21.
Die DNA-Extraktion ist aufgrund der Entwicklung von Extraktionskits verschiedener Unternehmen relativ einfach geworden. Dennoch ist die Verwendung dieser Kits aufgrund begrenzter finanzieller Ressourcen möglicherweise nicht für Laborklassen geeignet. Hier haben wir eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zur DNA-Extraktion aus menschlichen Proben vorgestellt, ohne dass ein handelsübliches DNA-Extraktionskit erforderlich ist. Bei der beschriebenen DNA-Extraktionsmethode werden keine organischen Lösungsmittel verwendet, sondern zelluläre Proteine werden durch Erhöhung der Salzkonzentration mit einer 8 M Kaliumacetatlösung entfernt. Diese Methode ermöglicht auch die gleichzeitige Handhabung mehrerer Proben und liefert ausreichend DNA für mehrere Genotypanalysen für jede Probe.
PCR ist eine gängige Technik in vielen molekularen Laboren. Obwohl im Allgemeinen störungsfrei, gibt es Fallstricke, die die Reaktion erschweren können, die zu falschen Ergebnissen führt, die an anderer Stelle diskutiert wurden22. Die hier vorgestellten PCR-Bedingungen haben sich angesichts der schlechten DNA-Qualität der Vorlagen sehr robust gezeigt, aber dennoch wurde gelegentlich eine fehlende PCR-Amplifikation beobachtet, wenn Vorlagen mit extrem niedrigen DNA-Konzentrationen aufgrund einer schlechten bukkalen Epithelzellentnahme verwendet wurden. Die in dieser Studie verwendeten DNA-Primer können bei verschiedenen Unternehmen bestellt werden, wie sie in der Materialtabelle am Ende dieses Papiers aufgeführt sind. Bei der Arbeit mit DNA-Primern ist besondere Vorsicht geboten, um eine Kontamination mit DNasen oder DNA durch den Bediener zu vermeiden. PCR-Produkte sollten auch kalt gehalten werden, wenn sie nicht verwendet werden.
Ein weiterer kritischer Schritt ist die Agarosegelelektrophorese. Fragmente, die sich nur durch eine Wiederholungseinheit von 16 bp unterscheiden, dürfen in der Gelelektrophorese nicht getrennt werden und erscheinen somit als einzelnes Band. In diesem Fall kann eine korrekte Bestimmung der Anzahl der Wiederholungseinheiten der getesteten D1S80-Allele nicht gewährleistet werden. Daher sollte die Laufzeit des Gels erhöht werden, während die Spannung reduziert werden muss und die Gelkonzentration erhöht werden kann, um eine bessere Auflösung und Trennung der einzelnen Bänder zu ermöglichen.
Es ist erwähnenswert, dass nicht alle Allele für einen VNTR-Locus vollständige Wiederholungseinheiten enthalten. Non-Consensus-Allele (Mikrovarianten), die unvollständige Wiederholungseinheiten enthalten, sind an den meisten VNTR-Loci üblich und ihre Größen liegen zwischen den Größen von Allelen mit vollen Wiederholungseinheiten. Diese Mikrovarianten sind durch Agarosegelelektrophorese kaum nachweisbar. Im Gegensatz dazu können Techniken wie Polyacrylamidgele oder Kapillarelektrophorese Allele auflösen, die sich um eine bis wenige Wiederholungseinheiten oder Mikrovarianten unterscheiden12,23,24,25,26. Letztere Techniken sind jedoch weniger für Laborkurse im Grundstudium geeignet, da sie viele Nachteile haben, einschließlich der Verwendung gefährlicher Verbindungen, komplexer Vorbereitung und fehlender Ausrüstung. Bei der Bestimmung der Fragmentgröße ist bei der Messung des Abstands der migrierten DNA-Fragmente besondere Vorsicht geboten. Wenn die Bänder zu diffus sind, um genau gemessen zu werden, kann die Berechnung der D1S80-Allelfragmentgröße durch lineare Regression falsch sein, was zu einer falschen Schätzung der Wiederholungseinheitenzahlen führt. In diesem Fall ist eine Wiederholung der Agarosegelelektrophorese nach Optimierung der Gelbedingungen ratsam, wie zuvor von Lorenz und Mitarbeitern beschrieben22.
Das gesamte hier vorgestellte D1S80 VNTR-Analyseverfahren, von der bukkalen Epithelzellentnahme bis zur Fragmentlängenbewertung, kann an einem einzigen Arbeitstag abgeschlossen werden. Dieses Protokoll ist eine robuste, kostengünstige und einfach zu bedienende Methode, die sich für praktische Laborkurse eignet.
Disclosures
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offenzulegen.
Acknowledgments
Die Autoren danken Kevin Graham für sein Voice-Over und allen Teilnehmern, die Samples für diese Arbeit gespendet haben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72,706 | autoclaved |
| 2 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 7,26,95,500 | autoclaved |
| 2-propanol | Fisher chemical | PI7508/17 | |
| 5x PCR buffer | Promega | M7845 | |
| Acetic acid | Sigma/Merck | A6283-500ML | |
| Agarose | BioBudget | 10-35-1020 | |
| Buccal swabs | BioBudget | 57-BS-05-600 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Combs | BioRad | ||
| dNTPs (10 mM) | Invitrogen | R0192 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.1 | |
| Ethanol | Honeywell | 32221-2.5L | |
| Gel caster | BioRad | ||
| Gel chamber | BioRad | SubCell GT | |
| Gel Doc XR+ | BioRad | ||
| Geltray | BioRad | SubCell GT | |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0371 | |
| Go-Taq Polymerase | Promega | M7845 | |
| Heating block | Eppendorf | Thermomixer | 1.5 mL and 2 mL |
| Microwave | Sharp | R-941STW | |
| peqGreen | VWR | 732-3196 | |
| Pipettes | Gilson | 1000 µL, 200 µL, 20 µL, 2 µL | |
| Potassium acetate | Arcos Organics | 217100010 | |
| PowerPac power supply | BioRad | 100-120/220-240V | |
| Primers | Sigma/Merck | ||
| Scale | Kern | PCB 2.5 kg | |
| SDS | Arcos Organics | 218591000 | |
| Shaker | IKA labortechnik | IKA RH basic | |
| Tabletop centrifuge | myFuge | ||
| Thermal Cycler | BioRad | C100 Touch | |
| Tris | VWR | 103156x | |
| Vortex mixer | LMS | VTX-3000L |
References
- Jeffreys, A. J., Wilson, V., Thein, S. L. Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA. Nature. 314 (6006), 67-73 (1985).
- Kasai, K., Nakamura, Y., White, R. Amplification of a variable number of tandem repeats (VNTR) locus (pMCT118) by the polymerase chain reaction (PCR) and its application to forensic science. Journal of Forensic Science. 35 (5), 1196-1200 (1990).
- Balamurugan, K., Tracey, M. L., Heine, U., Maha, G. C., Duncan, G. T. Mutation at the human D1S80 minisatellite locus. The Scientific World Journal. 2012 (917235), (2012).
- Herrera, R. J., Adrien, L. R., Ruiz, L. M., Sanabria, N. Y., Duncan, G. D1S80 single-locus discrimination among African populations. Human Biology. 76 (1), 87-108 (2004).
- Lauritzen, S. L., Mazumder, A. Informativeness of genetic markers for forensic inference - An information theoretic approach. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 1 (1), 652-653 (2008).
- Budowle, B., Chakraborty, R., Giusti, A. M., Eisenberg, A. J., Allen, R. C. Analysis of the VNTR locus D1S80 by the PCR followed by high-resolution PAGE. American Journal of Human Genetics. 48 (1), 137 (1991).
- Budowle, B., et al. D1S80 population data in African Americans, Caucasians, southeastern Hispanics, southwestern Hispanics, and Orientals. Journal of Forensic Science. 40 (1), 38-44 (1995).
- Verbenko, D. A., et al. Polymorphisms at locus D1S80 and other hypervariable regions in the analysis of Eastern European ethnic group relationships. Annals of Human Biology. 33 (5-6), 570-584 (2006).
- Walsh, S. J., Eckhoff, C. Australian Aboriginal population genetics at the D1S80 VNTR locus. Annals of Human Biology. 34 (5), 557-565 (2007).
- Limborska, S. A., Khrunin, A. V., Flegontova, O. V., Tasitz, V. A., Verbenko, D. A. Specificity of genetic diversity in D1S80 revealed by SNP-VNTR haplotyping. Annals of Human Biology. 38 (5), 564-569 (2011).
- Sajib, A. A., Yeasmin, S., Akter, M., Uddin, M. A., Akhteruzzaman, S. Phylogenetic analysis of Bangladeshi population with reference to D1S80 VNTR locus. Bioresearch Communications. 2 (1), 146-151 (2016).
- Köseler, A., Atalay, A., Atalay, E. Ö Allele frequency of VNTR locus D1S80 observed in Denizli province of Turkey. Biochemical genetics. 47 (7-8), 540-546 (2009).
- Mastana, S. S., Papiha, S. S. D1S80 distribution in world populations with new data from the UK and the Indian sub-continent. Annals of Human Biology. 28 (3), 308-318 (2001).
- Okuda, H., et al. A Japanese propositus with D-- phenotype characterized by the deletion of both the RHCE gene and D1S80 locus situated in chromosome 1p and the existence of a new CE-D-CE hybrid gene. Journal of Human Genetics. 45 (3), 142-153 (2000).
- Campbell, A. M., Williamson, J. H., Padula, D., Sundby, S. Use PCR & a Single Hair to Produce a "DNA Fingerprint.". The American Biology Teacher. 59 (3), 172-178 (1997).
- Jackson, D. D., Abbey, C. S., Nugent, D. DNA profiling of the D1S80 locus: A forensic analysis for the undergraduate biochemistry laboratory. Journal of Chemical Education. 83 (5), 774 (2006).
- Mansoor, S. K., Hussein, E. F., Ibraheem, A. K. Use the Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) in DNA fingerprinting and its application biological sciences. EurAsian Journal of BioSciences. 14 (2), 2835-2839 (2020).
- Beier, K., Schnorrer, S., Hoppe, N., Lenk, C. The ethical and legal regulation of human tissue and biobank research in Europe. Proceedings of the Tiss. EU Project. , Universitätsverlag Göttingen. (2011).
- Aida, J., et al. Telomere length variations in 6 mucosal cell types of gastric tissue observed using a novel quantitative fluorescence in situ hybridization method. Human Pathology. 38 (8), 1192-1200 (2007).
- Theda, C., et al. Quantitation of the cellular content of saliva and buccal swab samples. Scientific Reports. 8 (1), 1-8 (2018).
- McMichael, G. L., et al. DNA from buccal swabs suitable for high-throughput SNP multiplex analysis. Journal of biomolecular techniques: JBT. 20 (5), 232 (2009).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Destro-Bisol, G., Capelli, C., Belledi, M. Inferring microevolutionary patterns from allele-size frequency distributions of minisatellite loci: a worldwide study of the APOB 3'hypervariable region polymorphism. Human Biology. 72 (5), 733-751 (2000).
- Chen, B., et al. Structure and function of alleles in the 3'end region of human apoB gene. Chinese Medical Journal. 112 (3), 221-223 (1999).
- Renges, H. -H., Peacock, K., Dunning, A. M., Talmud, P., Humphries, S. E. Genetic relationship between the 3 '-VNTR and diallelic apolipoprotein B gene polymorphisms: Haplotype analysis in individuals of European and South Asian origin. Annals of Human Genetics. 56 (1), 11-33 (1992).
- Kravchenko, S. A., Maliarchuk, O. S., Livshits, L. A. A population genetics study of the allelic polymorphism in the hypervariable region of the apolipoprotein B gene in the population of different regions of Ukraine. Tsitologiia i Genetika. 30 (5), 35-41 (1996).
