Summary
هنا نصف بروتوكول بسيط لتوليد ملامح بصمات الحمض النووي عن طريق تضخيم موقع VNTR D1S80 من الحمض النووي للخلية الظهارية.
Abstract
في العلوم البيولوجية، تم استخدام بصمات الحمض النووي على نطاق واسع لاختبار الأبوة، وتطبيقات الطب الشرعي والدراسات النباتية. هنا، ونحن نصف طريقة موثوقة وقوية للأفراد genotyping حسب العدد المتغير من تكرار الترادف (VNTR) تحليل في سياق الفصول المختبرية الجامعية. يستخدم الموضع D1S80 VNTR البشري في هذا البروتوكول كعلامة متعددة الأشكال للغاية استنادا إلى الاختلاف في عدد التسلسلات المتكررة.
ينقل هذا البروتوكول البسيط معلومات مفيدة للمعلمين وتنفيذ بصمات الحمض النووي في الفصول المختبرية العملية. في التمرين المختبري المقدم ، يتم استخدام استخراج الحمض النووي يليه تضخيم PCR لتحديد الاختلاف الجيني في مكان D1S80 VNTR. الاختلافات في حجم جزء من منتجات PCR تصورها أجاروز هلام الكهربائي. يتم حساب أحجام الأجزاء والأرقام المتكررة استنادا إلى انحدار خطي لحجم ومسافة الترحيل لمعيار حجم الحمض النووي.
باتباع هذا الدليل، يجب أن يكون الطلاب قادرين على:
• حصاد واستخراج الحمض النووي من الخلايا الظهارية الغشاء المخاطي
• إجراء تجربة PCR وفهم وظيفة مكونات رد الفعل المختلفة
• تحليل amplicons بواسطة أجاروز هلام الكهربائي وتفسير النتائج
• فهم استخدام VNTRs في أخذ بصمات الحمض النووي وتطبيقه في العلوم البيولوجية
Introduction
تم تقديم بصمات الأصابع الجزيئية ، التي يشار إليها أيضا باسم بصمات الحمض النووي ، من قبل السير أليك جيفريز أثناء عمله في قسم علم الوراثة في جامعة ليستر في عام 19841. وهو يستند إلى 0.1٪ من الجينوم البشري الذي يختلف بين الأفراد ويتكون من حوالي ثلاثة ملايين متغير. هذه الاختلافات الفريدة في النمط الجيني تسمح بالتمايز بين الأفراد وبالتالي يمكن أن تعمل كبصمات وراثية باستثناء التوائم أحادية الزيجوت. وبالتالي، يستخدم أخذ بصمات الحمض النووي لتقدير صلة مختلف الأفراد التي تطبق على سبيل المثال في اختبار الأبوة أو في دراسات التنوع السكاني. في فصول المختبر لدينا كنا نهدف إلى نقل مفهوم بصمات الحمض النووي وترددات أليل. الطريقة الموصوفة هنا توضح طريقة موثوقة وقوية لأخذ البصمات الجينية من خلال تحليل العدد المتغير للتكرارات الترادفية (VNTR) في موقع D1S80. تتضمن الطريقة استخراج الحمض النووي من الخلايا الظهارية الغشاء المخاطي والبوليميراز اللاحقة سلسلة التفاعل (PCR) لتضخيم الموضع D1S80 ، تليها تصور الاختلافات طول جزء على هلام agarose.
إن موضع الساتل الصغير D1S80 VNTR متغير للغاية ويقع في منطقة التيلومريك من الكروموسوم 1 (1p36-p35). تم تحديده ووصفه من قبل Karsai وزملاء العمل في عام 1990 كمقع مع وحدة تكرار أساسية من 16 نقطة أساس ، مما يسمح بفصل الأليل تختلف بوحدة واحدة فقط2. وعلاوة على ذلك، D1S80 يظهر درجة عالية من الاختلاف مع معدل طفرة من حوالي 7.77 × 10-5 3. D1S80 لديه درجة عالية من heterozygosity4،5 (على سبيل المثال ، 80.8 ٪ heterozygosity للقوقازيين6 وحتى 87 ٪ heterozygosity للأميركيين الأفارقة7). بالإضافة إلى ذلك، فإن الموضع D1S80 متعدد الأشكال في معظم السكان، وعادة ما يكون أكثر من 15 أليل مختلف يحمل 14 إلى 41 يكرر كل منهما. يختلف تردد أليلات D1S80 بين السكان. أليل مع 24 وحدة مكررة (أليل 24) هو الأكثر شيوعا في السكان الأوروبيين والآسيويين، في حين أليل 21 هو الأكثر شيوعا في السكان الأفارقة4،7،8،9،10. وبالتالي، فإن توزيعات تردد الأليل تشخيصية لمختلف المجموعات البشرية ويجب أن تؤخذ في الاعتبار لتقدير الصلة (على سبيل المثال، في اختبارات الأبوة).
PCR التضخيم القائم على D1S80 VNTR كان مكانا طريقة مفيدة جدا في علم الطب الشرعي، واختبارات الأبوة، وتحليل الأمراض ودراسات التنوع السكاني11،12،13،14. بينما في الطب الشرعي اليوم تم استبدال استخدام VNTRs بتكرارات قصيرة جنبا إلى جنب ، يستخدم على نطاق واسع مكان D1S80 VNTR في تحديد الأصول والعلاقات الجينية بين السكان4و8و9و11. وعلاوة على ذلك، فإنه غالبا ما يستخدم لتعليم بصمات الحمض النووي في فصول مختبر عملي15،16. تمثل الطريقة الموصوفة هنا طريقة قوية وفعالة من حيث التكلفة وسهلة الاستخدام مع معدل نجاح مرتفع جدا في الفصول المختبرية الجامعية. الغرض من هذه المقالة هو تقديم لمحة عامة عن سير العمل للتحليل الجزيئي للجراد القمر الصناعي الصغير D1S80 الإنسان من الخلايا الظهارية الغشاء المخاطي. وهو يتضمن عرض توضيحي للتقنيات والبروتوكولات المبسطة والاقتراحات العملية الموصوفة في الأعمال المنشورة سابقا2،17.
Protocol
ملاحظة: هذا البروتوكول هو فقط لاستخدامها إذا وافق الطلاب أو الأوصياء القانونيين المعنية على تنفيذ هذا البروتوكول كما يعطي لمحات جينية رؤى في العلاقات الوراثية. أخذ بصمات الحمض النووي هو طريقة مشتركة للبيولوجيا الجزيئية تطبق بشكل رئيسي على الدراسات السكانية ومسائل الطب الشرعي. ولذلك، ينبغي إيلاء الاهتمام للحفاظ على مخاطر التلوث منخفضة قدر الإمكان. لتجنب تلوث العينة بالحمض النووي من مصدر خارجي أو DNases ، يجب ارتداء القفازات ، وينبغي تنظيف الأدوات بدقة أو تعقيمها وينبغي تعقيم المحاليل أو تعقيمها تلقائيا قبل الاستخدام.
1. حصاد الخلايا الظهارية الغشاء المخاطي
تنبيه: يمكن أن يؤدي العمل مع اللعاب والخلايا الظهارية إلى انتقال الأمراض المعدية. ولذلك، ينبغي تطبيق الاحتياطات المعيارية والقائمة على الإرسال (مثل استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة).
ملاحظة: تضمين عنصر تحكم موجب، والذي يتم توفيره من قبل المدرب (على سبيل المثال، الحمض النووي المستخرج من قبل المدرب) والمضمن في خطوات المعالجة في المصب.
- انتظر ساعة واحدة على الأقل بعد تناول الطعام أو تنظيف الأسنان بالفرشاة قبل جمع العينات.
- تسمية أنبوب طرد دقيق فارغ ومعقم سعة 2.0 مل.
- إزالة مسحة واحدة معقمة من العبوة وفرك بقوة على داخل الخد لمدة 30-40 مرة أو 30-40 ثانية لحصاد الخلايا الظهارية الغشاء المخاطي.
- ضع طرف مسحة المجموعة في أنبوب الطرد الدقيق المعقم المسمى سابقا واقطع طول البلاستيك الذي يمتد إلى ما وراء الحافة ، إما باليد أو باستخدام مقص معقم.
- ضع الغطاء بأمان على الأنبوب ، وختم مسحة المجموعة في الداخل.
2. استخراج الحمض النووي الجينومي من الخلايا البشرية
- قبل الاستخراج، قم بتعيين خلاط حراري أو كتلة تسخين إلى 65 درجة مئوية لتحلل العينة.
تنبيه: تصنف بعض المواد الكيميائية المستخدمة على أنها خطرة. اقرأ ورقة بيانات السلامة بعناية واتخاذ تدابير السلامة المناسبة قبل التعامل معها.- إعداد وتعقيم عن طريق تصفية أو autoclaving جميع المخازن المؤقتة المطلوبة والحلول (حل التحلل، خلات البوتاسيوم 8 M، 2-propanol، 70٪ الإيثانول والوضوء العازلة).
ملاحظة: يجب تنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة (20-30 درجة مئوية) ما لم يتم تحديدها.
- إعداد وتعقيم عن طريق تصفية أو autoclaving جميع المخازن المؤقتة المطلوبة والحلول (حل التحلل، خلات البوتاسيوم 8 M، 2-propanol، 70٪ الإيثانول والوضوء العازلة).
- أضف 500 ميكرولتر من محلول التحلل (50 مليون متر تريس/HCl، درجة الحموضة 8.0؛ 10 م إيثيلينديامين رباعي الأسيتيك حمض (EDTA)؛ 2٪ كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS)) إلى المسحة الصدفية، مع التأكد من أن العينة مغمورة تماما في محلول التحلل.
- دوامة بقوة لمدة 5 ق على الأقل.
- احتضان العينات في 65 درجة مئوية في خلاط حراري لمدة 10 دقائق.
- مزيج عينة 3-4 مرات عن طريق دوامة النبض لمدة 5 ثوان أثناء الحضانة.
- إزالة مسحة من العازلة تحلل، اضغط على مسحة ضد داخل الأنبوب للحصول على الحد الأقصى لحجم العينة.
- إضافة 100 ميكرولتر من خلات البوتاسيوم 8 M إلى الخلايا lysed.
- تخلط جيدا عن طريق عكس الأنبوب حتى يكون هناك عجل أبيض.
- حضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- الطرد المركزي العينة لمدة 5 دقائق في 18000 x ز.
- نقل 450 ميكرولتر من supernatant في أنبوب جهاز طرد دقيق نظيفة ومعقمة 1.5 مل.
- إضافة 450 ميكرولتر من 2-بروبانول وتخلط جيدا عن طريق عكس الأنبوب (هطول الأمطار من الحمض النووي).
- حضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 18,000 x g.
- تجاهل supernatant وعكس الأنبوب على منشفة ورقية نظيفة لتجفيف بيليه وتجنب التلوث المتبادل.
- احتضان الحمض النووي لمدة 5 دقائق في 65 درجة مئوية في كتلة التدفئة لتجفيف بيليه تماما.
- لغسل الحمض النووي، أضف 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪.
- جهاز طرد مركزي لمدة دقيقة واحدة عند 18,000 x g.
- تجاهل supernatant وعكس الأنبوب على منشفة ورقية نظيفة لتجفيف بيليه.
- إضافة 30 ميكرولتر من العازلة إعادة الإنفاق (10 mM تريس / HCl درجة الحموضة 8.0، 1 mM EDTA) إلى بيليه.
- احتضان الحمض النووي لمدة 10 دقائق في 65 درجة مئوية في كتلة التدفئة لعطل DNases.
3. تضخيم D1S80 VNTR الموضع باستخدام PCR
ملاحظة: سجل عدد العينات التي سيتم استخدامها وإعداد ورقة عمل مع الكواشف المطلوبة وأحجامها قبل جمع المواد البلاستيكية وغيرها من المواد الضرورية. تسمية أنابيب العقيمة / شرائط / لوحات لاستخدامها لPCR مع أرقام العينة. تذكر تضمين عنصر تحكم سلبي باستخدام H2O بدلا من الحمض النووي والتحكم الإيجابي (على سبيل المثال، استخدام الحمض النووي الذي يقدمه المدرب) للتحقق من صحة PCR.
- إعداد 1x PCR مزيج رئيسي يحتوي على 10 ميكرولتر من 5x تفاعل PCR العازلة (التي تحتوي على 15 mM MgCl2),1 ميكرولتر من ثلاثي الفوسفات ثنائي الفوسفات ديوكسيريبونوكليوتيد (dNTPs) (10 mM), 5 ميكرولتر (10 pmol) من كل رئيس الوزراء pMCT118-f وpMCT118-r (إلى الأمام - 5'-GAAACTGGCCCTCTCTCAACACACACCTCCCCCCCCG-3'، عكس - 5'-GTCTTGGGGGAGCACGTCCCCCCTTGC-3') وفقا لكاساي وآخرون.2،23.8 ميكرولتر من فائقة الشراء H2O، و 0.2 ميكرولتر من Taq DNA بوليمرات (5 U/μL).
ملاحظة: تم تصميم التهيئة pMCT118-f/pMCT118-r على المناطق المحيطة بمنطقة D1S80 VNTR التي تضخم الموضع بأكمله. - تسمية أنابيب PCR / شرائط / لوحة مع أرقام العينة لاستخدامها.
- Aliquot 45 μL من المزيج الرئيسي لكل أنبوب عينة PCR المسمى أو جيدا.
- إضافة 5 ميكرولتر من قالب الحمض النووي إلى المزيج الرئيسي في كل أنبوب PCR / لوحة جيدا للحصول على حجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر. تغيير تلميح ماصة لكل عينة الحمض النووي لتجنب التلوث عبر.
- تضمين عنصر تحكم قالب (NTC) باستخدام ultrapure H2O بدلا من DNA.
- إغلاق أنابيب PCR / شرائط أو ختم لوحة ومزيج.
- طرد مركزي أنابيب PCR / شرائط / لوحات لمدة 20 ثانية باستخدام جهاز طرد مركزي الطاولة.
ملاحظة: تم تحسين ظروف PCR المذكورة في هذا البروتوكول باستخدام بوليمرات الحمض النووي ودورة PCR الحرارية المستخدمة. بشكل عام ، يجب تكييف ظروف PCR مع بوليمرات الحمض النووي. وقت التمديد القياسي لبلمرة الحمض النووي Taq هو 1 دقيقة / كيلوبايت. - ضع أنابيب العينة / شرائط / لوحة في thermocycler وتفاعلات الحضانة باستخدام الشروط التالية (الحمض النووي بوليمراز تمديد الوقت): 1 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ 25 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 15 s، 60 °C لمدة 15 s، 72 °C لمدة 30 s؛ دورة واحدة من 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- عند اكتمال البرنامج، قم بإزالة المنتجات من المدور الحراري وتخزينها عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها أو -20 درجة مئوية حتى الكهروفوريسيس.
4. Agarose هلام الكهربائي من منتجات PCR
- إعداد هلام الآغاروز 1.5٪.
- استخدام 1.5 غرام من مسحوق الآغاروز ومزجها مع 100 مل من 1x تريس خلات-EDTA (TAE) محلول عازلة في قارورة.
- سخني الخليط لمدة 1.5-2 دقيقة في فرن الميكروويف (600 واط). دوامة محتويات والحرارة مرة أخرى، إذا لزم الأمر، لإذابة تماما agarose. تبرد قليلا وإضافة 2 ميكرولتر من PeqGreen إلى agarose.
- صب الجل في شكل باستخدام مشط مع ما يكفي من الآبار لجميع العينات وإضافة علامة الوزن الجزيئي واحد على الأقل.
تنبيه: قد يحدث التخلف الغليان. يهز قارورة بعناية عند إعادة تعليق agarose التي لم يتم حلها حتى الآن.
ملاحظة: PeqGreen هو صبغة غير سامة للكشف عن الأحماض النووية. وهي قابلة للتطبيق على تلطيخ الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل (dsDNA) والحمض النووي أحادية الذين تقطعت بهم السبل (ssDNA) وكذلك الحمض النووي الريبي. الحساسية مماثلة لبروميد الإيثيديوم.
- إزالة منتجات PCR من 4 °C والطرد المركزي لحوالي 10 ق.
- تحميل الآبار من هلام مع عينة 10 ميكرولتر. لا تفرط في الجل.
ملاحظة: يحتوي مخزن بوليميراز DNA أيضا على مركبات تزيد كثافة العينة بحيث يمكن تحميل العينات مباشرة على المواد الهلامية دون الحاجة إلى صبغة تحميل. وهذا يسمح للعينة بالغرق في البئر وتساعد الأصباغ على تتبع مدى هجرة عينة الحمض النووي.- إضافة معيار الوزن الجزيئي إلى الآبار المحيطة (ويفضل أن يكون معيار الوزن الجزيئي 50 نقطة أساس).
ملاحظة: تخزين عينات PCR المتبقية في -20 درجة مئوية في حالة وجود إلكتروفورسيس هلام agarose يجب أن تتكرر.
- إضافة معيار الوزن الجزيئي إلى الآبار المحيطة (ويفضل أن يكون معيار الوزن الجزيئي 50 نقطة أساس).
- تشغيل هلام في 1x TAE تشغيل العازلة في 150 V (ثابت) لمدة 40 دقيقة تقريبا أو حتى الجبهة صبغة صفراء أقل أن يسافر في حوالي 50 نقطة أساس تصل إلى الطرف السفلي من هلام.
- صورة الجل بينما الضوء الأزرق أو الأشعة فوق البنفسجية (UV) يتم تطبيقها وتسجيل صورة لتحليل طول جزء.
تنبيه: يمكن أن يؤدي ضوء الأشعة فوق البنفسجية إلى تلف عينيك وبشرتك. ارتدي دائما ملابس واقية ونظارات السلامة للأشعة فوق البنفسجية عند استخدام صندوق ضوء الأشعة فوق البنفسجية. - التخلص من الجل وفقا لسياسة المواد الخطرة المؤسسية.
5. تحليل نتائج طول الجزء
ملاحظة: استخدم تحليل الانحدار الخطي لتقدير أطوال الأجزاء.
- لتحجيم شظايا D1S80 PCR، ضع مسطرة على صورة هلام على 50 bp الوزن الجزيئي حارة القياسية بحيث أعلى خطوط المسطرة حتى مع الجزء السفلي من البئر الذي تم تحميل العينة(الشكل 1).
ملاحظة: لحساب معادلة الانحدار الخطي لمعيار الوزن الجزيئي (معيار الوزن الجزيئي 50 نقطة أساس) تم استخدام برنامج جدول بيانات. - سجل المسافة من البئر (على سبيل المثال، في سم) لكل نطاق من معيار الوزن الجزيئي 50 نقطة أساس في جدول باستخدام برنامج جدول البيانات(الشكل 2).
- تحديد السجل (على سبيل المثال، قاعدة 10) من كل حجم جزء من معيار الوزن الجزيئي 50 نقطة أساس وأدخل قيم السجل في الجدول(الشكل 2).
- رسم كل نقطة بيانات إلى رسم بياني مع سجل أحجام النطاق على المحور العمودي (المحور ص) والمسافة التي تم قياسها من أعلى الجل إلى كل شريط من معيار الوزن الجزيئي على المحور الأفقي (المحور س) باستخدام مبعثر (الشكل 3).
- احتواء خط اتجاه (خط انحدار خطي) وإظهار معادلة الانحدار (ص = ax + b) وقيمة R2 على الرسم البياني(الشكل 4).
- قياس المسافة التي هاجرت (على سبيل المثال، في سم) لكل أمبيرليكون D1S80 (الشكل 5).
- تقدير حجم كل أمبيرليكون D1S80 باستخدام معادلة الانحدار: y = ax + b
حيث y = سجل حجم الجزء
أ = ميل الخط (محسوب في النقطة 5)
x = المسافة من البئر (بالسم)
b = النقطة التي يعترض فيها خط الانحدار محور ص (محسوب بالنقطة 5)
ملاحظة: بما أن قيمة y تمثل سجل حجم الجزء، يجب حساب antilog(10 y)للحصول على حجم الجزء في bp من amplicons D1S80.
6. تقدير عدد الوحدات المتكررة في الأليل للأفراد المختبرين
ملاحظة: وحدة تكرار D1S80 هو 16 bp في الطول. أصغر أليل معروف لD1S80 لديه 14 يكرر. مخطط amplicon الموصوفة هنا تنتج amplicons مع المناطق المحيطة إضافة ما يصل 145 نقطة أساس إضافية إلى الحجم النهائي.
- استخدم الجدول 1 لتقدير عدد الوحدات المكررة الموجودة في كل جزء من أجزاء PCR. يجب أن يكون الحجم المستنبط باستخدام الانحدار الخطي ضمن 8 bp من أي أليل معين.
- تسجيل النمط الجيني لكل فرد اختبارها كمزيج من أرقام حجم تكرار أليل.
Representative Results
باستخدام البروتوكول الموصوف ، تم إجراء تحليل علامة D1S80 VNTR على الحمض النووي الجينومي البشري المستخرج من الخلايا الظهارية الغشاء المخاطي الغشاء المخاطي التي تم حصادها عن طريق أخذ عينات المسحة(الشكل 6). بعد التضخيم باستخدام PCR ، يظهر تمثيل نموذجي لهلام الآغاروز الذي يحتوي على amplicons D1S80 في الشكل 1. يظهر Lane 1 معيار الوزن الجزيئي 50 bp. بجانب معيار الوزن الجزيئي ، يتم تصور منتجات PCR من ثماني عينات طلابية. يظهر الممر 10 المجلس الانتقالي الذي تم فيه استخدام المياه بدلا من الحمض النووي القالب. معظم العينات التي تم تحليلها بوضوح عرض اثنين من العصابات، التي تمثل الأفراد heterozygous لجراد D1S80. حارة 2 ولين 9 تظهر فرقة واحدة تمثل الأفراد homozygous لجراد D1S80. حارة 5 يظهر الفرقة واحدة غامضة والتي هي أوسع بكثير بالمقارنة مع العصابات الأخرى. قد يكون هذا نتيجة لإحدى أليلات D1S80 تختلف في وحدة تكرار واحدة فقط. ولمزيد من التحليل، ستعتبر العينة في الممر 5 كشريط واحد، يمثل فردا متجانسا.
تم استخدام تحليل جزء الجل المصب الكهربائي الذي تم إجراؤه على منتجات PCR التي تم التحقق منها لاستدعاء الحجم لجراد D1S80 VNTR لعينات الطلاب المختلفة. يعتمد تفسير أحجام amplicon التي تم الحصول عليها من خلال تحليل PCR على معيار الوزن الجزيئي المستخدم. تم قياس المسافة من البئر لكل نطاق من معيار الوزن الجزيئي(الشكل 1)وسجلت (الشكل 2). استنادا إلى حجم والمسافة الهجرة حجم النطاقات الفردية يمكن حسابها باستخدام تحليل الانحدار الخطي. تم تحديد السجل (قاعدة 10) لكل نطاق في عينات الطلاب(الشكل 5)ويمثل antilog المعنية عدد bp لكل أمبيرليكون. يمكن حساب عدد الوحدات المتكررة وفقا لحجم amplicon الذي تم الحصول عليه(الجدول 2).
لكل عينة طالب تم حساب أحجام amplicon عن طريق الانحدار الخطي ويمكن تعيين كل نطاق بسهولة إلى أليل معين كما هو موضح في الجدول 2. ويمكن بعد ذلك استخدام المعلومات عن أحجام أليل D1S80 لتحديد ترددات أليل بين مجموعة فرعية صغيرة من السكان من الطلاب الجامعيين. أليل 28 مكرر هو الأكثر شيوعا بين الطلاب بسبب اثنين من الأفراد homozygous لهذا أليل تكرار (الأفراد 1 و 4). ويلي الثاني الأكثر شيوعا هو أليل 18 تكرار، الذي يحمله الفرد homozygous 8 والفرد heterozygous 6. أليليس التردد المنخفض هي الأليل 21-و 26-و 30-repeat وجدت مرة واحدة فقط في الأفراد 6 و 5 و 3، على التوالي. ويمكن كذلك مقارنة أنماط تردد أليل من موقع D1S80 VNTR من عدد الطلاب الصغيرة إلى وتيرة أليل من السكان البشرية أكبر، على سبيل المثال السكان القادمة من قارات مختلفة4،7،8،9،10.
بين الطلاب، والأفراد 2 و 3 حصة أليل 24 تكرار، والأفراد 2 و 7 حصة أليل 20 تكرار والأفراد 5 و 7 حصة أليل 23 تكرار. ومن المثير للاهتمام ، واثنين من الأفراد D1S80 homozygous (الفردية 1 و 4) حصة أليل 28 تكرار. مطابقة الأليل بين شخصين يمكن أن تشير إلى صلة محتملة. ومع ذلك، يمكن أن تحدث الأليل المشتركة أيضا عن طريق الصدفة. وبالتالي، من المهم تحديد احتمال وجود مباراة أليل بين شخصين. يعتمد الاحتمال على تردد الأليل الفردي في عامة السكان وينبغي استخدام النهج الإحصائية لإرفاق وزن إحصائي بتحليل علامة VNTR مثل النهج بايزي. وباختصار، يمكن استخدام طريقة أخذ البصمات المعروضة في العمليات العملية العملية للفصل العملي لتعليم استخدام VNTRs في أخذ بصمات الحمض النووي وتطبيقه في العلوم البيولوجية.
الشكل 1: تمثيل هلام agarose بعد الكهربائي من منتجات التضخيم D1S80 مع مسطرة وضعت بجانب 50 bp الوزن الجزيئي حارة القياسية. يحتوي Lane 1 على معيار الوزن الجزيئي 50 bp ، في حين تحتوي الممرات 2-9 على منتجات تفاعل PCR. يحتوي Lane 10 على عنصر تحكم القالب (NTC). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحديد مسافة هجرة جزء الحمض النووي وسجل كل حجم جزء من معيار الوزن الجزيئي 50 bp. يتم تسجيل المسافة من البئر (بالسم) لكل نطاق من معيار الوزن الجزيئي 50 bp ويتم تحديد السجل (الأساس 10) لكل جزء. يتم إدخال القيم في جدول باستخدام برنامج جدول بيانات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:مخطط مبعثر تم إنشاؤه بواسطة رسم مسافة ترحيل جزء الحمض النووي لمعيار الوزن الجزيئي على المحور x مقابل السجل (الأساس 10) لحجم كل جزء على المحور ص. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4:استغلال خط الانحدار الخطي ومعادلة الانحدار وكذلك قيمة R2 للبيانات.
الشكل 5: تحديد حجم amplicons D1S80. يتم إدخال المسافة من البئر لكل جزء في معادلة الانحدار. يمثل antilog من قيمة y حجم جزء في bp. الرجاء انقر هنا لعرض إصدار أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: الجدول الزمني المقترح وسير العمل لتحليل D1S80 VNTR. يمكن الانتهاء من إجراء تحليل D1S80 VNTR بأكمله المعروض هنا ، من حصاد الخلايا الظهارية الظهارية إلى تقييم طول الشظايا ، في غضون يوم عمل واحد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| حجم أليل (في نقطة أساس) | عدد التكرارات |
| 369 | 14 |
| 385 | 15 |
| 401 | 16 |
| 417 | 17 |
| 433 | 18 |
| 449 | 19 |
| 465 | 20 |
| 481 | 21 |
| 497 | 22 |
| 513 | 23 |
| 529 | 24 |
| 545 | 25 |
| 561 | 26 |
| 577 | 27 |
| 593 | 28 |
| 609 | 29 |
| 625 | 30 |
| 641 | 31 |
| 657 | 32 |
| 673 | 33 |
| 689 | 34 |
| 705 | 35 |
| 721 | 36 |
| 737 | 37 |
| 753 | 38 |
| 769 | 39 |
| 785 | 40 |
| 801 | 41 |
الجدول 1: حجم أمبليكون لكل مكان D1S80 VNTR.
| فرد | اليل | المسافة (بالسم) | الحجم (بالبت في الثانية) | عدد الوحدات المتكررة |
| 1 | متجانسة | 5 | 600 | 28 |
| 2 | هيتروزيغوس | 5.2 ; 5.5 | 535, 458 | 24, 20 |
| 3 | هيتروزيغوس | 4.9 ; 5.2 | 626, 535 | 30, 24 |
| 4 | متجانسة | 5 | 600 | 28 |
| 5 | هيتروزيغوس | 5.1 ; 5.3 | 564, 508 | 26, 23 |
| 6 | هيتروزيغوس | 5.4 ; 5.6 | 483, 435 | 21, 18 |
| 7 | هيتروزيغوس | 5.3 ; 5.5 | 508, 458 | 23, 20 |
| 8 | متجانسة | 5.6 | 435 | 18 |
الجدول 2: تكوين أليل لمختلف الأفراد الذين تم اختبارهم. يمكن تقريب عدد الوحدات المتكررة وفقا لحجم amplicon الذي تم الحصول عليه من خلال تحليل الانحدار الخطي.
Discussion
هنا وصفنا طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لتنفيذ بصمات الجزيئية في الفصول العملية الجامعية.
للكشف عن الاختلاف الجيني في موقع D1S80 ، مطلوب جمع عينات بيولوجية بشرية إلى جانب استخراج الحمض النووي وتحليله. ومن الضروري ضمان الاستخدام الأخلاقي للعينات البيولوجية البشرية طوال العملية برمتها. ويتم التحكم في إدارة العينات ضمن إطار تنظيمي شامل يضمن الاستخدام الصحيح للعينات والبيانات المرتبطة بها18 (مثل الموافقة على استخدام المواد البيولوجية البشرية). ويجب أن يكون المشاركون على علم مناسب باستخدام عيناتهم، وخطر اكتشاف حالات شاذة في العلاقات الجينية (على سبيل المثال، بالنسبة للأفراد ذوي الصلة)، وحماية الخصوصية، والنوايا لتخزين العينات والبيانات البيولوجية في المستقبل. يجب على جميع المتبرعين (الطلاب أو الزملاء) إعطاء الموافقة بحرية وفهم الحق في الانسحاب دون إبداء سبب. بشكل عام ، لا غنى عن جعل نفسه على دراية بالمبادئ التوجيهية واللوائح الخاصة بإدارة العينات البشرية قبل إجراء هذا الصف المختبري.
لجمع الخلايا الظهارية الغشاء المخاطي في الدورات المختبرية الجامعية، يجب توخي الحذر لتجنب تلوث عينات الحمض النووي مع الحمض النووي من المشغل أو مع DNases. من المستحسن أن تستخدم دائما المعاطف المختبر والقفازات والنظارات الواقية وكذلك مسحات معقمة وأنابيب الطرد الدقيق. ويعتبر حصاد الخلايا القائمة على المسحة البخل طريقة مريحة وفعالة من حيث التكلفة لجمع المواد الوراثية المناسبة لتحليل VNTR القائم على PCR ، لأنها غير مكلفة نسبيا وغير قابلة للانفسار. بجانب مسحات البوكال ، اللعاب هو الطريقة الأكثر شيوعا لأخذ العينات عن طريق الفم للأبحاث الطبية. وقد تبين أن مسحات buccal تحتوي على نسبة أعلى من الخلايا الظهارية من اللعاب، مما يجعلها أكثر موثوقية في توفير كمية كافية ونوعية الحمض النووي لتحليل D1S80 VNTR المستندة إلى PCR19،20. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إرسال مسحات buccal بالبريد بعد الجمع الذاتي للتغلب على العوائق الجغرافية عند استخدامها ، على سبيل المثال ، في دراسات التنوع السكاني21.
أصبح استخراج الحمض النووي من السهل نسبيا بسبب تطوير مجموعات استخراج من شركات مختلفة. ومع ذلك، قد لا يكون استخدام هذه الأطقم مناسبا في الفصول المختبرية بسبب محدودية الموارد المالية. هنا، قدمنا طريقة سهلة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة لاستخراج الحمض النووي من العينات البشرية دون الحاجة إلى مجموعة استخراج الحمض النووي المتاحة تجاريا. لا تستخدم طريقة استخراج الحمض النووي الموصوفة المذيبات العضوية ، وبدلا من ذلك تتم إزالة البروتينات الخلوية عن طريق زيادة تركيز الملح باستخدام محلول خلات البوتاسيوم 8 M. كما تسمح هذه الطريقة بالتعامل مع عدة عينات في وقت واحد وتسفر عن حمض نووي كاف لعدة تحليلات للنمط الجيني لكل عينة.
PCR هو تقنية شائعة في العديد من المختبرات الجزيئية. في حين عموما خالية من المتاعب، وهناك المزالق التي قد تعقد رد الفعل مما أدى إلى نتائج زائفة، والتي نوقشت في أماكن أخرى22. وقد بدت ظروف PCR المعروضة هنا قوية جدا في مواجهة ضعف جودة الحمض النووي القالب، ولكن لوحظ مع ذلك عدم تضخيم PCR في بعض الأحيان عند استخدام قوالب مع تركيزات الحمض النووي منخفضة للغاية بسبب ضعف حصاد الخلايا الظهارية buccal. يمكن طلب مستلزمات الحمض النووي المستخدمة في هذه الدراسة من شركات مختلفة، مثل تلك المذكورة في جدول المواد في نهاية هذه الورقة. يجب توخي الحذر بشكل خاص عند العمل مع مبرزات الحمض النووي من أجل تجنب التلوث بالناس أو الحمض النووي من المشغل. وينبغي أيضا أن تبقى منتجات PCR الباردة عندما لا تكون قيد الاستخدام.
خطوة حاسمة أخرى هي إلكتروفورسيس هلام الآغاروز. قد لا يتم فصل الشظايا التي تختلف بوحدة تكرار واحدة فقط من 16 نقطة أساس في الكهروفورسيس الهلامي وبالتالي تظهر كفرقة واحدة. في هذه الحالة، لا يمكن التأكد من تحديد عدد الوحدات المتكررة من أليلات D1S80 التي تم اختبارها بشكل صحيح. لذلك ، يجب زيادة وقت تشغيل الجل في حين يجب تقليل الجهد ويمكن زيادة تركيز الجل لتوفير دقة أفضل وفصل العصابات الفردية.
ومن الجدير بالذكر أن ليس كل الأليل لVNTR الموضع تحتوي على وحدات تكرار كاملة. الأليل غير التوافقي (المتغيرات الدقيقة) التي تحتوي على وحدات تكرار غير مكتملة شائعة في معظم VNTR loci وأحجامها تقع بين أحجام الأليل مع وحدات تكرار كاملة. هذه المتغيرات الدقيقة بالكاد يمكن اكتشافها عن طريق إلكتروفورسيس هلام الآغوروز. في المقابل، تقنيات مثل المواد الهلامية البولي أكريلاميد أو الكهربائي الشعري يمكن حل الأليل التي تختلف من واحد إلى عدد قليل من تكرار وحدات أو المتغيرات الدقيقة12،23،24،25،26. ومع ذلك ، فإن التقنيات الأخيرة هي أقل ملاءمة لفصول المختبرات الجامعية لأنها تحتوي على العديد من العيوب بما في ذلك استخدام المركبات الخطرة والإعداد المعقد ونقص المعدات. لتحديد حجم الشظايا، يجب توخي الحذر عند قياس المسافة بين شظايا الحمض النووي المهاجرة. إذا كانت النطاقات منتشرة جدا بحيث لا يمكن قياسها بدقة، فإن حساب حجم جزء أليل D1S80 بالتراجع الخطي قد يكون غير صحيح مما يؤدي إلى التقدير الخاطئ لأرقام الوحدات المتكررة. في هذه الحالة إعادة تشغيل إلكتروفورسيس هلام agarose بعد تحسين الظروف هلام من المستحسن كما وصفها سابقا من قبل لورينز وزملاء العمل22.
يمكن الانتهاء من إجراء تحليل D1S80 VNTR بأكمله المعروض هنا ، من حصاد الخلايا الظهارية الظهارية إلى تقييم طول الشظايا ، في يوم عمل واحد. هذا البروتوكول هو وسيلة قوية وفعالة من حيث التكلفة وسهلة الاستخدام ومناسبة لفصول المختبرات العملية الجامعية.
Disclosures
ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يشكروا كيفن غراهام على صوته وجميع المشاركين الذين تبرعوا بعينات لهذا العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72,706 | autoclaved |
| 2 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 7,26,95,500 | autoclaved |
| 2-propanol | Fisher chemical | PI7508/17 | |
| 5x PCR buffer | Promega | M7845 | |
| Acetic acid | Sigma/Merck | A6283-500ML | |
| Agarose | BioBudget | 10-35-1020 | |
| Buccal swabs | BioBudget | 57-BS-05-600 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Combs | BioRad | ||
| dNTPs (10 mM) | Invitrogen | R0192 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.1 | |
| Ethanol | Honeywell | 32221-2.5L | |
| Gel caster | BioRad | ||
| Gel chamber | BioRad | SubCell GT | |
| Gel Doc XR+ | BioRad | ||
| Geltray | BioRad | SubCell GT | |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0371 | |
| Go-Taq Polymerase | Promega | M7845 | |
| Heating block | Eppendorf | Thermomixer | 1.5 mL and 2 mL |
| Microwave | Sharp | R-941STW | |
| peqGreen | VWR | 732-3196 | |
| Pipettes | Gilson | 1000 µL, 200 µL, 20 µL, 2 µL | |
| Potassium acetate | Arcos Organics | 217100010 | |
| PowerPac power supply | BioRad | 100-120/220-240V | |
| Primers | Sigma/Merck | ||
| Scale | Kern | PCB 2.5 kg | |
| SDS | Arcos Organics | 218591000 | |
| Shaker | IKA labortechnik | IKA RH basic | |
| Tabletop centrifuge | myFuge | ||
| Thermal Cycler | BioRad | C100 Touch | |
| Tris | VWR | 103156x | |
| Vortex mixer | LMS | VTX-3000L |
References
- Jeffreys, A. J., Wilson, V., Thein, S. L. Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA. Nature. 314 (6006), 67-73 (1985).
- Kasai, K., Nakamura, Y., White, R. Amplification of a variable number of tandem repeats (VNTR) locus (pMCT118) by the polymerase chain reaction (PCR) and its application to forensic science. Journal of Forensic Science. 35 (5), 1196-1200 (1990).
- Balamurugan, K., Tracey, M. L., Heine, U., Maha, G. C., Duncan, G. T. Mutation at the human D1S80 minisatellite locus. The Scientific World Journal. 2012 (917235), (2012).
- Herrera, R. J., Adrien, L. R., Ruiz, L. M., Sanabria, N. Y., Duncan, G. D1S80 single-locus discrimination among African populations. Human Biology. 76 (1), 87-108 (2004).
- Lauritzen, S. L., Mazumder, A. Informativeness of genetic markers for forensic inference - An information theoretic approach. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 1 (1), 652-653 (2008).
- Budowle, B., Chakraborty, R., Giusti, A. M., Eisenberg, A. J., Allen, R. C. Analysis of the VNTR locus D1S80 by the PCR followed by high-resolution PAGE. American Journal of Human Genetics. 48 (1), 137 (1991).
- Budowle, B., et al. D1S80 population data in African Americans, Caucasians, southeastern Hispanics, southwestern Hispanics, and Orientals. Journal of Forensic Science. 40 (1), 38-44 (1995).
- Verbenko, D. A., et al. Polymorphisms at locus D1S80 and other hypervariable regions in the analysis of Eastern European ethnic group relationships. Annals of Human Biology. 33 (5-6), 570-584 (2006).
- Walsh, S. J., Eckhoff, C. Australian Aboriginal population genetics at the D1S80 VNTR locus. Annals of Human Biology. 34 (5), 557-565 (2007).
- Limborska, S. A., Khrunin, A. V., Flegontova, O. V., Tasitz, V. A., Verbenko, D. A. Specificity of genetic diversity in D1S80 revealed by SNP-VNTR haplotyping. Annals of Human Biology. 38 (5), 564-569 (2011).
- Sajib, A. A., Yeasmin, S., Akter, M., Uddin, M. A., Akhteruzzaman, S. Phylogenetic analysis of Bangladeshi population with reference to D1S80 VNTR locus. Bioresearch Communications. 2 (1), 146-151 (2016).
- Köseler, A., Atalay, A., Atalay, E. Ö Allele frequency of VNTR locus D1S80 observed in Denizli province of Turkey. Biochemical genetics. 47 (7-8), 540-546 (2009).
- Mastana, S. S., Papiha, S. S. D1S80 distribution in world populations with new data from the UK and the Indian sub-continent. Annals of Human Biology. 28 (3), 308-318 (2001).
- Okuda, H., et al. A Japanese propositus with D-- phenotype characterized by the deletion of both the RHCE gene and D1S80 locus situated in chromosome 1p and the existence of a new CE-D-CE hybrid gene. Journal of Human Genetics. 45 (3), 142-153 (2000).
- Campbell, A. M., Williamson, J. H., Padula, D., Sundby, S. Use PCR & a Single Hair to Produce a "DNA Fingerprint.". The American Biology Teacher. 59 (3), 172-178 (1997).
- Jackson, D. D., Abbey, C. S., Nugent, D. DNA profiling of the D1S80 locus: A forensic analysis for the undergraduate biochemistry laboratory. Journal of Chemical Education. 83 (5), 774 (2006).
- Mansoor, S. K., Hussein, E. F., Ibraheem, A. K. Use the Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) in DNA fingerprinting and its application biological sciences. EurAsian Journal of BioSciences. 14 (2), 2835-2839 (2020).
- Beier, K., Schnorrer, S., Hoppe, N., Lenk, C. The ethical and legal regulation of human tissue and biobank research in Europe. Proceedings of the Tiss. EU Project. , Universitätsverlag Göttingen. (2011).
- Aida, J., et al. Telomere length variations in 6 mucosal cell types of gastric tissue observed using a novel quantitative fluorescence in situ hybridization method. Human Pathology. 38 (8), 1192-1200 (2007).
- Theda, C., et al. Quantitation of the cellular content of saliva and buccal swab samples. Scientific Reports. 8 (1), 1-8 (2018).
- McMichael, G. L., et al. DNA from buccal swabs suitable for high-throughput SNP multiplex analysis. Journal of biomolecular techniques: JBT. 20 (5), 232 (2009).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Destro-Bisol, G., Capelli, C., Belledi, M. Inferring microevolutionary patterns from allele-size frequency distributions of minisatellite loci: a worldwide study of the APOB 3'hypervariable region polymorphism. Human Biology. 72 (5), 733-751 (2000).
- Chen, B., et al. Structure and function of alleles in the 3'end region of human apoB gene. Chinese Medical Journal. 112 (3), 221-223 (1999).
- Renges, H. -H., Peacock, K., Dunning, A. M., Talmud, P., Humphries, S. E. Genetic relationship between the 3 '-VNTR and diallelic apolipoprotein B gene polymorphisms: Haplotype analysis in individuals of European and South Asian origin. Annals of Human Genetics. 56 (1), 11-33 (1992).
- Kravchenko, S. A., Maliarchuk, O. S., Livshits, L. A. A population genetics study of the allelic polymorphism in the hypervariable region of the apolipoprotein B gene in the population of different regions of Ukraine. Tsitologiia i Genetika. 30 (5), 35-41 (1996).
