Summary
Her beskriver vi en simpel protokol til generering af DNA-fingeraftryksprofiler ved at forstærke VNTR locus D1S80 fra epitelcelle-DNA.
Abstract
Inden for biologiske videnskaber er DNA-fingeraftryk blevet udbredt til faderskabstest, retsmedicinske anvendelser og fylogenetiske undersøgelser. Her beskriver vi en pålidelig og robust metode til genotyping individer ved variabelt antal Tandem Repeat (VNTR) analyse i forbindelse med bachelor laboratorieklasser. Den menneskelige D1S80 VNTR locus bruges i denne protokol som en meget polymorf markør baseret på variation i antallet af gentagne sekvenser.
Denne enkle protokol formidler nyttige oplysninger til lærere og implementering af DNA-fingeraftryk i praktiske laboratorieklasser. I den præsenterede laboratorieøvelse anvendes DNA-ekstraktion efterfulgt af PCR-forstærkning til at bestemme genetisk variation ved D1S80 VNTR-locus. Forskelle i fragmentstørrelsen af PCR-produkter visualiseres af agarose gel elektroforese. Fragmentstørrelserne og gentagelsestallene beregnes ud fra en lineær regression af størrelsen og migreringsafstanden for en DNA-størrelsesstandard.
Ved at følge denne vejledning skal eleverne kunne:
• Høst og ekstrakt DNA fra buccal slimhinde epitelceller
• Udføre et PCR-eksperiment og forstå funktionen af forskellige reaktionskomponenter
• Analysere ampliconer ved agarose gel elektroforese og fortolke resultaterne
• Forstå brugen af VNTR'er i DNA-fingeraftryk og dets anvendelse i biologiske videnskaber
Introduction
Molekylære fingeraftryk, også kaldet DNA fingeraftryk, blev indført af Sir Alec Jeffreys, mens du arbejder i Institut for Genetik ved University of Leicester i 19841. Den er baseret på de 0,1% af det menneskelige genom, der adskiller sig mellem individer og består af ca. tre millioner varianter. Disse unikke forskelle i genotypen giver mulighed for differentiering mellem individer og kan derfor fungere som et genetisk fingeraftryk bortset fra monozygotiske tvillinger. Derfor anvendes DNA-fingeraftryk til vurdering af relaterede personer, der anvendes til f.eks. faderskabstest eller i undersøgelser af befolkningsdiversitet. I vores laboratorieklasser sigtede vi mod at formidle begrebet DNA-fingeraftryk og allelfrekvenser. Den metode, der er beskrevet her, demonstrerer en pålidelig og robust metode til genetisk fingeraftryk ved at analysere det variable antal Tandem Repeats (VNTR) ved D1S80-locus. Metoden omfatter ekstraktion af DNA fra buccal slimhinde epitelceller og efterfølgende Polymerase Chain Reaction (PCR) for at forstærke D1S80-locus efterfulgt af visualisering af fragmentlængdeforskelle på en agarosegel.
D1S80 VNTR minisatellit locus er meget variabel og placeret i den telomeriske region kromosom 1 (1p36-p35). Det blev identificeret og beskrevet af Karsai og kolleger i 1990 som et locus med en kerne gentage enhed på 16 bp, der giver mulighed for adskillelse af alleler forskellig med blot én enhed2. Desuden viser D1S80 en høj grad af variation med en mutationshastighed på ca. 7,77 x 10-53. D1S80 har en høj grad af heterozygositet4,5 (f.eks 80,8% heterozygositet for kaukasiere6 og op til 87% heterozygositet for afrikansk-amerikanere7). Derudover er D1S80 locus polymorfe i de fleste populationer, med typisk over 15 forskellige alleler transporterer 14 til 41 gentager hver. Hyppigheden af D1S80 alleler varierer mellem populationer. Allelen med 24 gentagne enheder (allel 24) er hyppigst i europæiske og asiatiske populationer, mens allel 21 er mest almindelig i afrikanske populationer4,7,8,9,10. Derfor er allelefrekvensfordelingen diagnostisk for forskellige befolkningsgrupper og skal tages i betragtning ved vurderingen af slægtskab (f.eks. i faderskabstest).
PCR-baseret forstærkning af D1S80 VNTR-locus har været en meget nyttig metode inden for retsvidenskab, faderskabstest, sygdomsanalyse og befolkningsdiversitetsundersøgelser11,12,13,14. Mens brugen af VNTR i dag er blevet erstattet af korte tandem-gentagelser, anvendes D1S80 VNTR-locus i vid udstrækning til bestemmelse af oprindelse og genetiske relationer mellem og mellem populationer4,8,9,11. Desuden bruges det ofte til at undervise i DNA-fingeraftryk i praktiskelaboratorieklasser 15,16. Den metode, der er beskrevet her, repræsenterer en robust, omkostningseffektiv og brugervenlig metode med en meget høj succesrate i bachelorlaboratorieklasser. Formålet med denne artikel er at give et overblik over arbejdsgangen for molekylær analyse af den menneskelige D1S80 minisatellit locus fra buccal slimhinde epitelceller. Det omfatter demonstration af teknikker, forenklede protokoller og praktiske forslag, der er beskrevet i tidligere offentliggjorte værker2,17.
Protocol
BEMÆRK: Denne protokol må kun bruges, hvis studerende eller respektive værger accepterede gennemførelsen af denne protokol, da genotypiske profiler giver indsigt i genetiske relationer. DNA-fingeraftryk er en almindelig molekylærbiologisk metode, der hovedsagelig anvendes til befolkningsundersøgelser og retsmedicinske spørgsmål. Der bør derfor lægges vægt på at holde forureningsrisikoen så lav som muligt. For at undgå kontaminering af prøven med DNA fra en ekstern kilde eller DNases skal handsker bæres, instrumenterne skal rengøres grundigt eller steriliseres, og opløsningerne skal filtreres steriliseres eller autoklaveres inden brug.
1. Høst af buccal slimhinde epitelceller
ADVARSEL: Arbejde med spyt og epitelceller kan føre til overførsel af smitsomme sygdomme. Der bør derfor træffes standard- og transmissionsbaserede forholdsregler (f.eks. brug af passende personlige værnemidler).
BEMÆRK: Medtag en positiv kontrol, som leveres af instruktøren (f.eks. DNA udvundet af instruktøren) og inkluderet i downstream-behandlingstrinnene.
- Vent mindst 1 time efter at have spist eller børstet tænder før prøveopsamling.
- Mærk et tomt og sterilt mikrocentrifugerør på 2,0 mL.
- Fjern en steril buccal vatpind fra emballagen og gnid kraftigt på indersiden af kinden i 30-40 gange eller 30-40 sekunder for at høste buccal slimhinde epitelceller.
- Hæld spidsen af opsamlingspinden i det tidligere mærkede sterile mikrocentrifugerør, og afbryd længden af plast, der strækker sig ud over kanten, enten i hånden eller ved hjælp af steril saks.
- Placer hætten sikkert på røret, forsegling af kollektionen podning indeni.
2. Udvinding af genomisk DNA fra menneskelige celler
- Før ekstraktionen indstilles en termisk mixer eller en varmeblok til 65 °C for prøve lysis.
ADVARSEL: Nogle kemikalier, der anvendes, er klassificeret som farlige. Læs sikkerhedsdatabladet omhyggeligt, og foranstaltninger, der skal træffes, inden håndteringen.- Forbered og steriliser ved filtrering eller autoklavering af alle nødvendige buffere og opløsninger (lysisopløsning, 8 M kaliumacetat, 2-propanol, 70% ethanol og eluerbuffer).
BEMÆRK: Alle centrifugeringstrin skal udføres ved stuetemperatur (20-30 °C), medmindre andet er angivet.
- Forbered og steriliser ved filtrering eller autoklavering af alle nødvendige buffere og opløsninger (lysisopløsning, 8 M kaliumacetat, 2-propanol, 70% ethanol og eluerbuffer).
- Der tilsættes 500 μL lysisopløsning (50 mM Tris/HCl, pH 8,0; 10 mM ethylendiamin tetraeddikesyre (EDTA); 2% natrium dodecyl sulfat (SDS)) til buccalprøven, idet det sikres, at prøven er helt nedsænket i lysisopløsningen.
- Vortex kraftigt i mindst 5 s.
- Prøver ved 65 °C inkuberes i en termisk mixer i 10 min.
- Bland prøve 3-4 gange ved puls-vortexing for 5 s under inkubation.
- Fjern vatpinden fra lysisbufferen, tryk vatpinden mod indersiden af røret for at opnå maksimal prøvevolumen.
- Der tilsættes 100 μL 8 M kaliumacetat til lysede celler.
- Bland grundigt ved at vende røret, indtil der er et hvidt bundfald.
- Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Prøven centrifuges i 5 min. ved 18.000 x g.
- 450 μL af supernatanten overføres til et rent og sterilt mikrocentrifugerør på 1,5 mL.
- Der tilsættes 450 μL 2-propanol, og røres grundigt ved at vende røret (udfældning af DNA).
- Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Centrifuge i 5 min ved 18.000 x g.
- Kassér supernatanten, og vend røret på et rent køkkenrulle for at tørre pelleten og for at undgå krydskontaminering.
- Dna'et inkuberes i 5 minutter ved 65 °C i en varmeblok for at tørre pelletlen helt.
- For at vaske DNA'et tilsættes 500 μL 70% ethanol.
- Centrifuge i 1 min ved 18.000 x g.
- Kassér supernatanten og vend røret på et rent køkkenrulle for at tørre pelleten.
- 30 μL resuspensionsbuffer (10 mM Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) til pelletlen tilsættes.
- Inkuber DNA'et i 10 minutter ved 65 °C i en varmeblok for at inaktivere DNases.
3. Forstærkning af D1S80 VNTR-locus ved hjælp af PCR
BEMÆRK: Registrer antallet af prøver, der skal anvendes, og forbered et regneark med de krævede reagenser og deres volumener, før du indsamler den nødvendige plast og andre materialer. De sterile rør/bånd/plader, der skal anvendes til PCR, mærkes med prøvenumre. Husk at inkludere en negativ kontrol ved hjælp af H2O i stedet for DNA og en positiv kontrol (f.eks. ved hjælp af DNA fra instruktøren) for at validere PCR.
- 1x PCR-masterblandingen, der indeholder 10 μL 5x PCR-reaktionsbuffer (indeholdende 15 mM MgCl2), 1 μL deoxyribonukleotidtrifosphat (dNTP' er) (10 mM), 5 μL (10 pmol) af hver prime 5'-GAAACTGGCCTCCAAACACACTGCCCGCCG-3', omvendt - 5'-GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCTTGC-3') ifølge Kasai et al.2, 23,8 μL ultrapure H2O og 0,2 μL Taq DNA polymerase (5 U/μL).
BEMÆRK: Primerne pMCT118-f/pMCT118-r blev designet på flankerende regioner i D1S80 VNTR-regionen, der forstærker hele locus. - Mærke PCR-rørene/strimlerne/pladen med de prøvenumre, der skal anvendes.
- Aliquot 45 μL af masterblandingen til hvert mærket PCR-prøverør eller -brønd.
- Der tilsættes 5 μL DNA-skabelonen til masterblandingen i hvert PCR-rør/hver pladebrønd for at opnå et samlet volumen på 50 μL.
- Medtag et no template control (NTC) ved hjælp af ultrapure H2O i stedet for DNA.
- Luk PCR-rør/strimler eller tætningsplade og bland.
- Centrifuge PCR-rørene/strimlerne/pladerne i 20 s ved hjælp af en bordpladecentrifuge.
BEMÆRK: PCR-betingelserne i denne protokol blev optimeret ved hjælp af DNA-polymerasen og den anvendte PCR-termiske cyklus. Generelt skal PCR-betingelserne tilpasses DNA-polymerasen. Standardforlængelsestiden for en Taq DNA-polymerase er 1 min/kb. - Prøveglasset/strimlerne/pladen anbringes i termocyklen, og reaktionerne inkuberes under anvendelse af følgende betingelser (DNA-polymeraseforlængelsestid): 1 cyklus på 95 °C i 2 min. 25 cyklusser på 94 °C for 15 s, 60 °C for 15 s, 72 °C for 30 s 1 cyklus på 72 °C i 10 min.
- Når programmet er færdigt, fjernes produkterne fra termocyklen og opbevares ved 4 °C natten over eller -20 °C indtil elektroforese.
4. Agarosegelelektroforese af PCR-produkter
- Forbered en 1,5% agarose gel.
- Der anvendes 1,5 g agarosepulver, og det blandes med 100 ml 1x Tris-acetat-EDTA (TAE) bufferopløsning i en kolbe.
- Blandingen opvarmes i ca. 1,5-2 minutter i en mikrobølgeovn (600 W). Slyng indholdet og opvarm igen, hvis det er nødvendigt, for helt at opløse agarose. Afkøl lidt og tilsæt 2 μL PeqGreen til agarose.
- Hæld gelen i en form ved hjælp af en kam med nok brønde til alle prøver og tilsæt mindst en molekylvægtmarkør.
ADVARSEL: Der kan forekomme kogning. Kolben rystes forsigtigt, når agarosen genbruges, og den er endnu ikke opløst.
BEMÆRK: PeqGreen er et ikke-giftigt farvestof til påvisning af nukleinsyrer. Det gælder for farvning af dobbeltstrenget DNA (dsDNA) og enkeltstrenget DNA (ssDNA) samt RNA. Følsomheden kan sammenlignes med ethidiumbromid.
- Pcr-produkterne fjernes fra 4 °C og centrifuge i ca. 10 s.
- Gelens brønde fyldes med 10 μL prøve. Gelen må ikke overbelastes.
BEMÆRK: DNA-polymerasebufferen indeholder også forbindelser, der øger prøvetætheden, så prøverne kan læsses direkte på geler uden behov for et belastningsfarvningsstof. Dette gør det muligt for prøven at synke ned i brønden, og farvestoffer hjælper med at spore, hvor langt DNA-prøven er migreret.- Tilføj en molekylvægtstandard til de flankerende brønde (helst en 50 bp molekylvægtstandard).
BEMÆRK: Rest-PCR-prøverne opbevares ved -20 °C, hvis agarosegelelektroforese skal gentages.
- Tilføj en molekylvægtstandard til de flankerende brønde (helst en 50 bp molekylvægtstandard).
- Kør gelen i 1x TAE kører buffer ved 150 V (konstant) i ca 40 min eller indtil den nederste gule farvestof front, der bevæger sig på omkring 50 bp når den nederste ende af gelen.
- Billede gelen, mens blåt lys eller ultraviolet (UV) lys påføres, og optag et billede til fragmenteringslængdeanalyse.
ADVARSEL: UV-lys kan beskadige dine øjne og hud. Brug altid beskyttelsestøj og UV-sikkerhedsbriller, når du bruger en UV-lyskasse. - Gelen skal bortskaffes i overensstemmelse med politikken for institutionelle farlige materialer.
5. Analyse af fragmenteringslængderesultater
BEMÆRK: Brug lineær regressionsanalyse til at estimere fragmenternes længder.
- Til dimensionering af D1S80 PCR-fragmenter skal du placere en lineal på gelfotografiet over 50 bp-molekylvægtstandardbanen, således at toppen af linealen linjer op med bunden af brønden, hvor prøven blev indlæst (Figur 1).
BEMÆRK: For at beregne den lineære regressionsligning for molekylvægtstandarden (50 bp molekylvægtstandard) blev der anvendt et regnearksprogram. - Optag afstanden fra brønden (f.eks. i cm) for hvert bånd i 50 bp-molekylvægtstandarden i en tabel ved hjælp af et regnearksprogram (Figur 2).
- Logbogen (f.eks. basis 10) for hver fragmentstørrelse af 50 bp-molekylvægtstandarden bestemmes, og logværdierne indsættes i tabellen (Figur 2).
- Parre hvert datapunkt med en graf med logpunktet over båndstørrelserne på den lodrette akse (y-akse) og den målte løbeafstand fra toppen af gelen til hvert bånd i molekylvægtstandarden på den vandrette akse (x-akse) ved hjælp af en scatterplot (Figur 3).
- Tilpas en tendenslinje (lineær regressionslinje), og vis regressionsligningen (y = ax + b) og R2-værdien på grafen (Figur 4).
- Den overflyttede afstand måles (f.eks. i cm) for hver D1S80 amplicon (figur 5).
- Anslå størrelsen af hver D1S80 amplicon ved hjælp af regressionsligningen: y = ax + b
hvor y = fragmentstørrelsens log
a = linjens hældning (beregnet i punkt 5)
x = afstanden fra brønden (i cm)
b = det punkt, hvor regressionslinjen opfanger y-aksen (beregnet i punkt 5)
BEMÆRK: Da y-værdien repræsenterer fragmentstørrelsens log, skal antistoppet (10y) beregnes for at opnå fragmentstørrelsen i bp af D1S80-ampliconerne.
6. Vurdering af antallet af gentagne enheder i allelerne af de testede personer
BEMÆRK: D1S80-gentagelsesenheden er 16 bp i længden. Den mindste kendte allel til D1S80 har 14 gentagelser. Den her beskrevne ampliconordning giver ampliconer med flankerende regioner, der udgør yderligere 145 basispoint til den endelige størrelse.
- Brug tabel 1 til at anslå, hvor mange gentagne enheder der er indeholdt i hvert PCR-fragment. Størrelsen ekstrapoleret ved hjælp af den lineære regression skal være inden for 8 bp af en bestemt allel.
- Registrer genotypen for hver testet person som en kombination af allel-gentagelsesstørrelsesnumre.
Representative Results
Ved hjælp af den beskrevne protokol blev der udført D1S80 VNTR-markøranalyse på humant genomisk DNA udvundet af buccal slimhinde epitelceller høstet ved prøvetagning af svaberprøver (Figur 6). Efter forstærkningen ved hjælp af PCR er en typisk gengivelse af en agarosegel, der indeholder D1S80-ampliconerne, vist i figur 1. Bane 1 viser 50 bp molekylvægtstandarden. Ved siden af molekylvægtstandarden visualiseres PCR-produkter fra otte elevprøver. Bane 10 viser NTC, hvor vand blev brugt i stedet for skabelon-DNA. De fleste af de analyserede prøver viser tydeligt to bånd, der repræsenterer individer heterozygogous for D1S80 locus. Lane 2 og Lane 9 viser et enkelt band, der repræsenterer enkeltpersoner homozygogous for D1S80 locus. Lane 5 viser et tvetydigt enkelt band, som er meget bredere i forhold til de andre bands. Dette kan skyldes, at to D1S80-alleler kun adskiller sig fra hinanden i én gentagelsesenhed. Til yderligere analyse vil prøven i bane 5 blive betragtet som et enkelt bånd, der repræsenterer en homozygotperson.
Downstream gel elektrophoresis fragment analyse udført på verificerede PCR produkter blev brugt til størrelse opkald af D1S80 VNTR locus af forskellige studerende prøver. Fortolkningen af de ampliconstørrelser, der opnås ved PCR-analyse, afhænger af den anvendte molekylvægtstandard. Afstanden fra brønden for hvert bånd i molekylvægtstandarden blev målt (figur 1) og registreret (figur 2). Baseret på størrelse og migreringsafstand kan størrelsen af de enkelte bånd beregnes ved hjælp af en lineær regressionsanalyse. Logbogen (base 10) blev bestemt for hvert bånd i elevprøverne (figur 5), og den respektive antilog repræsenterer antallet af bp for hver amplicon. Antallet af gentagne enheder kan beregnes i henhold til den opnåede ampliconstørrelse (tabel 2).
For hver elevprøve blev ampliconstørrelserne beregnet ved lineær regression, og hvert bånd kunne let henføres til en bestemt allel som vist i tabel 2. Oplysningerne om D1S80 allel størrelser kan derefter bruges til at bestemme allel frekvenser blandt de små befolkning delmængde af bachelorstuderende. Den 28-gentagne allel er den hyppigste blandt de studerende på grund af to homozygobåde individer til denne gentagne allel (personer 1 og 4). Den næsthyppigste allel er den 18-gentagne allel, som bæres af homozygogous individuelle 8 og af heterozygous individuelle 6. Lavfrekvente alleler er de 21-, 26- og 30-gentagne alleler, der kun findes en gang hos personer henholdsvis 6, 5 og 3. Allelfrekvensmønstrene for D1S80 VNTR-locus for den lille studenterpopulation kan yderligere sammenlignes med allelfrekvensen for større befolkningsgrupper, for eksempel populationer fra forskellige kontinenter4,7,8,9,10.
Blandt de studerende deler personer 2 og 3 den 24-gentagne allel, enkeltpersoner 2 og 7 deler den 20-gentagne allel, og enkeltpersoner 5 og 7 deler den 23-gentagne allel. Interessant, de to D1S80 homozygogous individer (individuelle 1 og 4) deler 28-gentag allel. Matchende alleler mellem to personer kan indikere en potentiel slægtskab. Delte alleler kan dog også forekomme ved en tilfældighed. Således er det afgørende at bestemme sandsynligheden for en allel match mellem to personer. Sandsynligheden afhænger af allelfrekvensen af de enkelte alleler i den almindelige befolkning, og der bør anvendes statistiske metoder til at knytte en statistisk vægt til VNTR-markøranalyser som f.eks. Sammenfattende kan den præsenterede fingeraftryksmetode bruges i praktiske praktiske hands-on-klasser til at undervise i brugen af VNTR'er i DNA-fingeraftryk og dets anvendelse i biologisk videnskab.
Figur 1: Repræsentation af en agarosegel efter elektroforese af D1S80 forstærkningsprodukter med en lineal placeret ved siden af standardbanen med 50 bp molekylvægt. Bane 1 indeholder 50 bp molekylvægtstandarden, mens bane 2-9 indeholder PCR-reaktionsprodukter. Bane 10 indeholder intet skabelonkontrolelement (NTC). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:Bestemmelse af DNA-fragmentmigrationsafstand og log for hver fragmentstørrelse af 50 bp-molekylvægtstandarden. Afstanden fra brønden (i cm) for hvert bånd af 50 bp molekylvægtstandarden registreres, og stammen (base 10) for hvert fragment bestemmes. Værdier indtastes i en tabel ved hjælp af et regnearksprogram. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Scatter-plot genereret ved at afbilde DNA-fragmentmigrationsafstanden af molekylvægtstandarden på x-aksen mod log (base 10) af størrelsen af hvert fragment på y-aksen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Udnyttelse af den lineære regressionslinje og regressionsligningen samt R2-værdien for dataene. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Bestemmelse af størrelsen af D1S80-amplicons. Afstanden fra brønden for hvert fragment er indtastet i regressionsligningen. Antistoppet for y-værdien repræsenterer fragmentstørrelsen i bp. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Foreslået tidslinje og arbejdsgang for D1S80 VNTR-analyse. Hele den D1S80 VNTR-analyseprocedure, der præsenteres her, fra buckal epitelcellehøst til fragmentlængdeevaluering, kan afsluttes inden for en enkelt arbejdsdag. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Allel størrelse (i bp) | Antal gentagelser |
| 369 | 14 |
| 385 | 15 |
| 401 | 16 |
| 417 | 17 |
| 433 | 18 |
| 449 | 19 |
| 465 | 20 |
| 481 | 21 |
| 497 | 22 |
| 513 | 23 |
| 529 | 24 |
| 545 | 25 |
| 561 | 26 |
| 577 | 27 |
| 593 | 28 |
| 609 | 29 |
| 625 | 30 |
| 641 | 31 |
| 657 | 32 |
| 673 | 33 |
| 689 | 34 |
| 705 | 35 |
| 721 | 36 |
| 737 | 37 |
| 753 | 38 |
| 769 | 39 |
| 785 | 40 |
| 801 | 41 |
Tabel 1: Ampliconstørrelse for hver D1S80 VNTR-locus.
| individuel | allel | Afstand (i cm) | Størrelse (i bp) | Antal gentagne enheder |
| 1 | homozygogous | 5 | 600 | 28 |
| 2 | heterozygogous | 5.2 ; 5.5 | 535, 458 | 24, 20 |
| 3 | heterozygogous | 4.9 ; 5.2 | 626, 535 | 30, 24 |
| 4 | homozygogous | 5 | 600 | 28 |
| 5 | heterozygogous | 5.1 ; 5.3 | 564, 508 | 26, 23 |
| 6 | heterozygogous | 5.4 ; 5.6 | 483, 435 | 21, 18 |
| 7 | heterozygogous | 5.3 ; 5.5 | 508, 458 | 23, 20 |
| 8 | homozygogous | 5.6 | 435 | 18 |
Tabel 2: Allel sammensætning af de forskellige testede personer. Antallet af gentagne enheder kan tilnærmes i henhold til den ampliconstørrelse, der opnås ved lineær regressionsanalyse.
Discussion
Her beskrev vi en enkel og omkostningseffektiv metode til implementering af molekylære fingeraftryk i bachelor praktiske klasser.
For at screene for genetisk variation ved D1S80-locus kræves menneskelig biologisk prøvesamling sammen med DNA-ekstraktion og analyse. Det er vigtigt, at den etiske anvendelse af menneskelige biologiske enheder sikres gennem hele processen. Stikprøveforvaltningen kontrolleres inden for en omfattende lovgivningsmæssig ramme, der sikrer korrekt anvendelse af prøver og tilhørende data18 (f.eks. samtykke til anvendelse af humant biologisk materiale). Deltagerne skal informeres behørigt om anvendelsen af deres prøver, risikoen for opdagelse af uregelmæssigheder i genetiske relationer (f.eks. for beslægtede personer), beskyttelse af privatlivets fred og intentioner om fremtidig opbevaring af de biologiske prøver og data. Alle donorer (studerende eller kolleger) skal give samtykke frit og forstå retten til at trække sig uden at give grund. Generelt er det uundværligt at gøre sig bekendt med de respektive retningslinjer og regler for human prøvestyring, før de udfører denne laboratorieklasse.
Ved indsamling af buccal slimhindearceller i bachelorlaboratoriekurser skal man sørge for at undgå kontaminering af DNA-prøverne med DNA fra operatøren eller med DNases. Det anbefales, at laboratoriekitler, handsker og beskyttelsesbriller altid anvendes samt sterile svaberprøver og mikrocentrifugerør. Buccal podning-baseret cellehøst betragtes som en bekvem og omkostningseffektiv metode til indsamling af genetisk materiale egnet til PCR-baseret VNTR-analyse, da det er relativt billigt og ikke-invasivt. Ved siden af buccal svaberprøver, spyt er den mest almindelige oral prøvetagning metode til medicinsk forskning. Det har vist sig, at buccal svaberprøver indeholder en højere andel af epitelceller end spyt, hvilket gør dem mere pålidelige med hensyn til at levere tilstrækkelig mængde og kvalitet af DNA til PCR-baseret D1S80 VNTR-analyse19,20. Derudover kan buccalprøver sendes ud efter selvindsamling overvindelse af geografiske hindringer, når de bruges, for eksempel i populationsdiversitetsundersøgelser21.
DNA-ekstraktion er blevet relativt let på grund af udviklingen af ekstraktionssæt fra forskellige virksomheder. Ikke desto mindre er brugen af disse kits muligvis ikke egnet i laboratorieklasser på grund af begrænsede finansielle ressourcer. Her præsenterede vi en nem, hurtig og omkostningseffektiv metode til DNA-ekstraktion fra menneskelige prøver uden behov for et kommercielt tilgængeligt DNA-ekstraktionssæt. Den beskrevne DNA-ekstraktionsmetode anvender ikke organiske opløsningsmidler, men fjernes i stedet for cellulære proteiner ved at øge saltkoncentrationen ved hjælp af en 8 M kaliumacetatopløsning. Denne metode gør det også muligt at håndtere flere prøver på én gang og giver tilstrækkelig DNA til flere genotypeanalyser for hver prøve.
PCR er en almindelig teknik i mange molekylære laboratorier. Mens generelt problemfri, der er faldgruber, der kan komplicere reaktionen producerer falske resultater, som er blevet drøftet andre steder22. PCR-betingelser præsenteret her har vist sig meget robuste i lyset af dårlig skabelon DNA-kvalitet, men manglende PCR-forstærkning blev ikke desto mindre lejlighedsvis observeret, når man brugte skabeloner med ekstremt lave DNA-koncentrationer på grund af dårlig buccal epitelcellehøst. De DNA-primere, der anvendes i denne undersøgelse, kan bestilles fra forskellige virksomheder, som dem, der er nævnt i materialetabellen i slutningen af dette papir. Der skal udvises særlig forsigtighed, når der arbejdes med DNA-primere for at undgå kontaminering med DNases eller DNA fra operatøren. PCR-produkter bør også holdes kolde, når de ikke er i brug.
Et andet kritisk skridt er agarose gel elektroforese. Fragmenter, der kun adskiller sig med én gentagelsesenhed på 16 bp, må ikke adskilles i gelelektroforesen og fremstår således som et enkelt bånd. I dette tilfælde kan det ikke sikres, at antallet af gentagne enheder af de testede D1S80-alleler bestemmes korrekt. Derfor bør gelens køretid øges, mens spændingen skal reduceres, og gelkoncentrationen kan øges for at give en bedre opløsning og adskillelse af de enkelte bånd.
Det er værd at nævne, at ikke alle alleler til en VNTR-locus indeholder komplette gentagne enheder. Ikke-konsensus alleler (mikrovarianter), der indeholder ufuldstændige gentagne enheder er almindelige på de fleste VNTR loci og deres størrelser falder i mellem størrelser af alleler med fuld gentage enheder. Disse mikrovarianter kan næppe påvises ved agarosegelelektroforese. I modsætning hertil kan teknikker som polyacrylamid geler eller kapillær elektrophoresis løse alleler, der adskiller sig med en til et par gentage enheder eller mikrovarianter12,23,24,25,26. Sidstnævnte teknikker er imidlertid mindre velegnede til bachelorlaboratorieklasser, da de har mange ulemper, herunder brug af farlige forbindelser, kompleks forberedelse og mangel på udstyr. Ved bestemmelse af fragmentstørrelsen skal der udvises særlig forsigtighed ved måling af afstanden mellem de migrerede DNA-fragmenter. Hvis båndene er for diffuse til at blive målt præcist, kan beregningen af D1S80-allelfragmentstørrelsen ved lineær regression være forkert, hvilket resulterer i forkert estimering af gentagne enhedsnumre. I så fald er en re-run af agarose gel elektrophoresis efter optimering af gelforholdene tilrådeligt som tidligere beskrevet af Lorenz og kolleger22.
Hele den D1S80 VNTR-analyseprocedure, der præsenteres her, fra buckal epitelcellehøst til fragmentlængdeevaluering, kan afsluttes på en enkelt arbejdsdag. Denne protokol er en robust, omkostningseffektiv og brugervenlig metode, der er velegnet til praktiske laboratorieklasser for studerende.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Kevin Graham for hans voice-over og alle deltagere, der har doneret prøver til dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72,706 | autoclaved |
| 2 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 7,26,95,500 | autoclaved |
| 2-propanol | Fisher chemical | PI7508/17 | |
| 5x PCR buffer | Promega | M7845 | |
| Acetic acid | Sigma/Merck | A6283-500ML | |
| Agarose | BioBudget | 10-35-1020 | |
| Buccal swabs | BioBudget | 57-BS-05-600 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Combs | BioRad | ||
| dNTPs (10 mM) | Invitrogen | R0192 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.1 | |
| Ethanol | Honeywell | 32221-2.5L | |
| Gel caster | BioRad | ||
| Gel chamber | BioRad | SubCell GT | |
| Gel Doc XR+ | BioRad | ||
| Geltray | BioRad | SubCell GT | |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0371 | |
| Go-Taq Polymerase | Promega | M7845 | |
| Heating block | Eppendorf | Thermomixer | 1.5 mL and 2 mL |
| Microwave | Sharp | R-941STW | |
| peqGreen | VWR | 732-3196 | |
| Pipettes | Gilson | 1000 µL, 200 µL, 20 µL, 2 µL | |
| Potassium acetate | Arcos Organics | 217100010 | |
| PowerPac power supply | BioRad | 100-120/220-240V | |
| Primers | Sigma/Merck | ||
| Scale | Kern | PCB 2.5 kg | |
| SDS | Arcos Organics | 218591000 | |
| Shaker | IKA labortechnik | IKA RH basic | |
| Tabletop centrifuge | myFuge | ||
| Thermal Cycler | BioRad | C100 Touch | |
| Tris | VWR | 103156x | |
| Vortex mixer | LMS | VTX-3000L |
References
- Jeffreys, A. J., Wilson, V., Thein, S. L. Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA. Nature. 314 (6006), 67-73 (1985).
- Kasai, K., Nakamura, Y., White, R. Amplification of a variable number of tandem repeats (VNTR) locus (pMCT118) by the polymerase chain reaction (PCR) and its application to forensic science. Journal of Forensic Science. 35 (5), 1196-1200 (1990).
- Balamurugan, K., Tracey, M. L., Heine, U., Maha, G. C., Duncan, G. T. Mutation at the human D1S80 minisatellite locus. The Scientific World Journal. 2012 (917235), (2012).
- Herrera, R. J., Adrien, L. R., Ruiz, L. M., Sanabria, N. Y., Duncan, G. D1S80 single-locus discrimination among African populations. Human Biology. 76 (1), 87-108 (2004).
- Lauritzen, S. L., Mazumder, A. Informativeness of genetic markers for forensic inference - An information theoretic approach. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 1 (1), 652-653 (2008).
- Budowle, B., Chakraborty, R., Giusti, A. M., Eisenberg, A. J., Allen, R. C. Analysis of the VNTR locus D1S80 by the PCR followed by high-resolution PAGE. American Journal of Human Genetics. 48 (1), 137 (1991).
- Budowle, B., et al. D1S80 population data in African Americans, Caucasians, southeastern Hispanics, southwestern Hispanics, and Orientals. Journal of Forensic Science. 40 (1), 38-44 (1995).
- Verbenko, D. A., et al. Polymorphisms at locus D1S80 and other hypervariable regions in the analysis of Eastern European ethnic group relationships. Annals of Human Biology. 33 (5-6), 570-584 (2006).
- Walsh, S. J., Eckhoff, C. Australian Aboriginal population genetics at the D1S80 VNTR locus. Annals of Human Biology. 34 (5), 557-565 (2007).
- Limborska, S. A., Khrunin, A. V., Flegontova, O. V., Tasitz, V. A., Verbenko, D. A. Specificity of genetic diversity in D1S80 revealed by SNP-VNTR haplotyping. Annals of Human Biology. 38 (5), 564-569 (2011).
- Sajib, A. A., Yeasmin, S., Akter, M., Uddin, M. A., Akhteruzzaman, S. Phylogenetic analysis of Bangladeshi population with reference to D1S80 VNTR locus. Bioresearch Communications. 2 (1), 146-151 (2016).
- Köseler, A., Atalay, A., Atalay, E. Ö Allele frequency of VNTR locus D1S80 observed in Denizli province of Turkey. Biochemical genetics. 47 (7-8), 540-546 (2009).
- Mastana, S. S., Papiha, S. S. D1S80 distribution in world populations with new data from the UK and the Indian sub-continent. Annals of Human Biology. 28 (3), 308-318 (2001).
- Okuda, H., et al. A Japanese propositus with D-- phenotype characterized by the deletion of both the RHCE gene and D1S80 locus situated in chromosome 1p and the existence of a new CE-D-CE hybrid gene. Journal of Human Genetics. 45 (3), 142-153 (2000).
- Campbell, A. M., Williamson, J. H., Padula, D., Sundby, S. Use PCR & a Single Hair to Produce a "DNA Fingerprint.". The American Biology Teacher. 59 (3), 172-178 (1997).
- Jackson, D. D., Abbey, C. S., Nugent, D. DNA profiling of the D1S80 locus: A forensic analysis for the undergraduate biochemistry laboratory. Journal of Chemical Education. 83 (5), 774 (2006).
- Mansoor, S. K., Hussein, E. F., Ibraheem, A. K. Use the Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) in DNA fingerprinting and its application biological sciences. EurAsian Journal of BioSciences. 14 (2), 2835-2839 (2020).
- Beier, K., Schnorrer, S., Hoppe, N., Lenk, C. The ethical and legal regulation of human tissue and biobank research in Europe. Proceedings of the Tiss. EU Project. , Universitätsverlag Göttingen. (2011).
- Aida, J., et al. Telomere length variations in 6 mucosal cell types of gastric tissue observed using a novel quantitative fluorescence in situ hybridization method. Human Pathology. 38 (8), 1192-1200 (2007).
- Theda, C., et al. Quantitation of the cellular content of saliva and buccal swab samples. Scientific Reports. 8 (1), 1-8 (2018).
- McMichael, G. L., et al. DNA from buccal swabs suitable for high-throughput SNP multiplex analysis. Journal of biomolecular techniques: JBT. 20 (5), 232 (2009).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Destro-Bisol, G., Capelli, C., Belledi, M. Inferring microevolutionary patterns from allele-size frequency distributions of minisatellite loci: a worldwide study of the APOB 3'hypervariable region polymorphism. Human Biology. 72 (5), 733-751 (2000).
- Chen, B., et al. Structure and function of alleles in the 3'end region of human apoB gene. Chinese Medical Journal. 112 (3), 221-223 (1999).
- Renges, H. -H., Peacock, K., Dunning, A. M., Talmud, P., Humphries, S. E. Genetic relationship between the 3 '-VNTR and diallelic apolipoprotein B gene polymorphisms: Haplotype analysis in individuals of European and South Asian origin. Annals of Human Genetics. 56 (1), 11-33 (1992).
- Kravchenko, S. A., Maliarchuk, O. S., Livshits, L. A. A population genetics study of the allelic polymorphism in the hypervariable region of the apolipoprotein B gene in the population of different regions of Ukraine. Tsitologiia i Genetika. 30 (5), 35-41 (1996).
