Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט כדי ליצור פרופילי טביעת אצבע DNA על ידי הגברת VNTR לוקוס D1S80 מ- DNA תא אפיתל.
Abstract
במדעי הביולוגיה, טביעת אצבע DNA כבר בשימוש נרחב עבור בדיקות אבהות, יישומים משפטיים ומחקרים פילוגנטיים. כאן, אנו מתארים שיטה אמינה וחזקה עבור אנשים genotyping לפי מספר משתנה של ניתוח טנדם חזור (VNTR) בהקשר של מחלקות מעבדה לתואר ראשון. לוקוס D1S80 VNTR האנושי משמש בפרוטוקול זה כסמן פולימורפי מאוד המבוסס על וריאציה במספר הרצפים החוזרים על עצמו.
פרוטוקול פשוט זה מעביר מידע שימושי למורים ויישום טביעת אצבע של DNA בשיעורי מעבדה מעשיים. בתרגיל המעבדה שהוצג, מיצוי DNA ואחריו הגברה PCR משמש כדי לקבוע וריאציה גנטית בבית D1S80 VNTR לוקוס. הבדלים בגודל השבר של מוצרי PCR הם דמיינו על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose. גדלי הקטעים ומספרי החזרה מחושבים בהתבסס על רגרסיה ליניארית של הגודל והמרחק של תקן גודל DNA.
בעקבות מדריך זה, התלמידים צריכים להיות מסוגלים:
• קציר וחילוץ DNA מתאי אפיתל רירית buccal
• לבצע ניסוי PCR ולהבין את הפונקציה של רכיבי תגובה שונים
• לנתח את האמפליקונים על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose ולפרש את התוצאות
• להבין את השימוש ב- VNTRs בטביעת אצבע DNA ויישומו במדעי הביולוגיה
Introduction
טביעת אצבע מולקולרית, המכונה גם טביעת אצבע DNA, הוצג על ידי סר אלק ג'פריס בעת שעבד במחלקה לגנטיקה באוניברסיטת לסטר בשנת 19841. הוא מבוסס על 0.1% מהגנום האנושי השונה בין יחידים ומורכב משלושה מיליון גרסאות. הבדלים ייחודיים אלה בגנוטיפ מאפשרים את ההבחנה בין אנשים ולכן יכולים לתפקד כטביעת אצבע גנטית למעט תאומים מונוזיגוטיים. כתוצאה מכך, טביעת אצבע DNA משמש להערכת קרובי משפחה של אנשים שונים המיושמת למשל בבדיקות אבהות או במחקרים גיוון האוכלוסייה. בשיעורי המעבדה שלנו התכוונו להעביר את המושג טביעת אצבע של DNA ותדרי אלל. השיטה המתוארת כאן מדגימה שיטה אמינה וחזקה לטביעת אצבע גנטית על ידי ניתוח המספר המשתנה של חזרות טנדם (VNTR) ב- D1S80 לוקוס. השיטה כוללת את החילוץ של DNA מתאי אפיתל רירית buccal ותגובת שרשרת פולימראז הבאים (PCR) כדי להגביר את לוקוס D1S80, ואחריו הדמיה של הבדלים באורך שבר על ג'ל agarose.
לוקוס מיני-סאטליט D1S80 VNTR משתנה מאוד וממוקם באזור הטלומרי של כרומוזום 1 (1p36-p35). זה זוהה ותואר על ידי קרסאי ועמיתים לעבודה בשנת 1990 כמו מוקד עם יחידת ליבה חוזרת של 16 bp, המאפשר הפרדת אללים שונים על ידי יחידה אחת בלבד2. יתר על כן, D1S80 מראה רמה גבוהה של וריאציה עם שיעור מוטציה של כ 7.77 x 10-5 3. D1S80 יש רמה גבוהה של הטרוזיגוזיות4,5 (למשל, 80.8% הטרוזיגוזיות עבור הקווקזים6 ועד 87% הטרוזיגוזיות עבור אפרו-אמריקאים7). בנוסף, לוקוס D1S80 הוא פולימורפי ברוב האוכלוסיות, עם בדרך כלל מעל 15 אללים שונים הנושאים 14 עד 41 חוזר כל אחד. התדירות של אללים D1S80 משתנה בין אוכלוסיות. האלל עם 24 יחידות חוזרות (allele 24) הוא הנפוץ ביותר באוכלוסיות אירופה ואסיה, ואילו אלל 21 הוא הנפוץ ביותר באוכלוסיות אפריקאיות4,7,8,9,10. כתוצאה מכך, התפלגויות תדרי האלל הן אבחון עבור אוכלוסיות אנושיות שונות ויש לקחת בחשבון את הערכת ההתייחסות (למשל, בבדיקות אבהות).
PCR מבוסס הגברה של D1S80 VNTR לוקוס כבר שיטה שימושית מאוד במדע זיהוי פלילי, בדיקות אבהות, ניתוח מחלות ומחקרי גיוון האוכלוסייה11,12,13,14. בעוד בזיהוי פלילי היום השימוש VNTRs הוחלף על ידי חזרות טנדם קצר, לוקוס VNTR D1S80 נמצא בשימוש נרחב בקביעת מקורות ויחסים גנטייםבין אוכלוסיות 4,8,9,11. יתר על כן, הוא משמש לעתים קרובות ללמד טביעת אצבע DNA בשיעורי מעבדה מעשית15,16. השיטה המתוארת כאן מייצגת שיטה חזקה, חסכונית וקלה לשימוש עם שיעור הצלחה גבוה מאוד בשיעורי מעבדה לתואר ראשון. מטרת מאמר זה היא לספק סקירה כללית של זרימת העבודה לניתוח מולקולרי של לוקוס מיניסטליט D1S80 האנושי מתאי אפיתל רירית buccal. הוא כולל הדגמה של טכניקות, פרוטוקולים פשוטים והצעות מעשיות המתוארות בעבודות שפורסמו בעבר2,17.
Protocol
הערה: פרוטוקול זה ישמש רק אם סטודנטים או אפוטרופוסים חוקיים בהתאמה הסכימו להנהלת פרוטוקול זה כפרופילים genotypic לתת תובנות על יחסים גנטיים. טביעת אצבע של דנ"א היא שיטה נפוצה לביולוגיה מולקולרית המיושמת בעיקר על מחקרי אוכלוסייה ועניינים משפטיים. לכן, יש להקדיש תשומת לב כדי לשמור על סיכוני זיהום נמוכים ככל האפשר. כדי למנוע זיהום של המדגם עם DNA ממקור חיצוני או DNases, כפפות יש ללבוש, מכשירים יש לנקות ביסודיות או מעוקרים פתרונות צריך להיות מסנן מעוקר או autoclaved לפני השימוש.
1. קצירת תאי אפיתל רירית buccal
התראה: עבודה עם רוק ותאי אפיתל יכולה להוביל להעברת מחלות זיהומיות. לכן, יש ליישם אמצעי זהירות סטנדרטיים ומבוססים על שידור (למשל, שימוש בציוד מגן אישי מתאים).
הערה: כלול פקד חיובי, המסופק על ידי המדריך (למשל, DNA שחולץ על ידי המדריך) ונכלל בשלבי העיבוד במורד הזרם.
- המתן לפחות שעה אחת לאחר אכילה או צחצוח שיניים לפני איסוף הדגימה.
- תווית צינור ריק וסטרילי 2.0 מ"ל microcentrifuge.
- הסר ספוגית buccal סטרילית אחת מן האריזה ולשפשף במרץ על החלק הפנימי של הלחי במשך 30-40 פעמים או 30-40 שניות כדי לקצור תאי אפיתל רירית buccal.
- מניחים את קצה ספוגית האוסף לתוך הצינור microcentrifuge סטרילי שכותרתו בעבר לשבור את אורך הפלסטיק המשתרע מעבר לקצה, או ביד או באמצעות מספריים סטריליים.
- מניחים את המכסה בבטחה על הצינור, איטום ספוגית האוסף בפנים.
2. מיצוי דנ"א גנומי מתאים אנושיים
- לפני החילוץ, להגדיר מערבל תרמי או בלוק חימום ל 65 °C (65 °F) עבור תמוגה מדגם.
התראה: כימיקלים מסוימים המשמשים מסווגים מסוכנים. קרא בעיון את גליון נתוני הבטיחות ונקוט באמצעי בטיחות מתאימים לפני הטיפול.- הכן ועקר על ידי סינון או autoclaving כל המאגרים והפתרונות הנדרשים (פתרון תמוגה, 8 אצטט אשלגן M, 2-propanol, 70% אתנול מאגר elution).
הערה: יש לבצע את כל שלבי הצנטריפוגה בטמפרטורת החדר (20-30 מעלות צלזיוס) אלא אם צוין.
- הכן ועקר על ידי סינון או autoclaving כל המאגרים והפתרונות הנדרשים (פתרון תמוגה, 8 אצטט אשלגן M, 2-propanol, 70% אתנול מאגר elution).
- הוסף 500 μL של פתרון תמוגה (50 mM Tris /HCl, pH 8.0; 10 mM אתילנדיאמין חומצה טטרה אצטית (EDTA); 2% נתרן דודציל סולפט (SDS)) כדי ספוגית buccal, לוודא כי המדגם הוא שקוע לחלוטין בתמיסת תמוגה.
- וורטקס במרץ לפחות 5 שניות.
- דגימות דגירה ב 65 מעלות צלזיוס במיקסר תרמי במשך 10 דקות.
- יש לערבב דגימה 3-4 פעמים על ידי מערבולת דופק במשך 5 שניות במהלך הדגירה.
- הסר ספוגית ממאגר התמוגה, לחץ על ספוגית נגד החלק הפנימי של הצינור כדי להשיג נפח מדגם מקסימלי.
- הוסף 100 μL של 8 אצטט אשלגן מ 'לתאים lysed.
- מערבבים ביסודיות על ידי היפוך הצינור עד שיש משקע לבן.
- דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- צנטריפוגה המדגם במשך 5 דקות ב 18,000 x g.
- העבר 450 μL של supernatant לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה נקי וסטרילי 1.5 מ"ל.
- מוסיפים 450 μL של 2-propanol ומערבבים ביסודיות על ידי היפוך הצינור (משקעים של ה- DNA).
- דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 18,000 x גרם.
- להשליך את supernatant ולהוות את הצינור על מגבת נייר נקייה לייבש את גלולה כדי למנוע זיהום צולב.
- דגירה DNA במשך 5 דקות ב 65 מעלות צלזיוס בבלוק חימום לייבש את גלולה לחלוטין.
- כדי לשטוף את ה-DNA, להוסיף 500 μL של 70% אתנול.
- צנטריפוגה למשך דקה ב- 18,000 x גרם.
- להשליך את supernatant ולהוות את הצינור על מגבת נייר נקייה לייבש את גלולה.
- הוסף 30 μL של מאגר ההשעיה (10 מ"מ Tris / HCl pH 8.0, 1 מ"מ EDTA) לכדור.
- דגירה DNA במשך 10 דקות ב 65 מעלות צלזיוס בבלוק חימום כדי להשבית DNases.
3. להגביר את לוקוס VNTR D1S80 באמצעות PCR
הערה: רשום את מספר הדגימות שישמשו והכן גליון עבודה עם ריאגנטים נדרשים ונפחים שלהם לפני איסוף הפלסטיק הדרוש וחומרים אחרים. תווית צינורות סטריליים / רצועות / צלחות לשמש עבור PCR עם מספרים לדוגמה. זכור לכלול שליטה שלילית באמצעות H2O במקום DNA ושליטה חיובית (למשל, באמצעות ה- DNA שסופק על ידי המדריך) כדי לאמת את PCR.
- הכן את 1x PCR מאסטר לערבב המכיל 10 μL של 5x מאגר תגובת PCR (המכיל 15 mM MgCl2), 1 μL של deoxyribonucleotide triphosphate (dNTPs) (10 מ"מ), 5 μL (10 pmol) של כל פריים pMCT118-f ו pMCT118-r (קדימה - 5'-GAAACTGGCCTCCAAACTGCCCCG-3', הפוך - 5'-GTCTTGGGGGGGGGGGGGGGGCCCCTTGC-3') על פי Kasai et al.2, 23.8 μL של אולטרה-דק H2O, ו 0.2 μL של פולימראז DNA Taq (5 U / μL).
הערה: פריימרים pMCT118-f/pMCT118-r תוכננו על אזורי האגפים של אזור D1S80 VNTR להגביר את הלוקוס כולו. - תווית צינורות PCR / רצועות / צלחת עם מספרי המדגם לשימוש.
- Aliquot 45 μL של תערובת הורים לכל צינור מדגם PCR שכותרתו או טוב.
- הוסף 5 μL של תבנית ה- DNA לתערובת הראשית בכל צינור PCR / צלחת היטב כדי לרכוש נפח כולל של 50 μL. שנה את קצה פיפטה עבור כל דגימת DNA כדי למנוע זיהום צולב.
- כלול פקד ללא תבנית (NTC)על-ידישימוש ב- H 2 O אולטרה-דק במקום ב- DNA.
- סגור צינורות PCR / רצועות או צלחת חותם ומערבבים.
- צנטריפוגה צינורות PCR / רצועות / צלחות במשך 20 s באמצעות צנטריפוגה שולחן.
הערה: תנאי PCR שניתנו בפרוטוקול זה היו אופטימיזציה באמצעות פולימראז DNA ואת מחזור תרמי PCR בשימוש. באופן כללי, תנאי PCR חייבים להיות מותאמים פולימראז DNA. זמן ההארכה הסטנדרטי לפולימראז דנ"א של Taq הוא 1 דקות / kb. - מניחים את צינורות המדגם / רצועות / צלחת בתרמוציקלר ותגובות דגירה באמצעות התנאים הבאים (זמן הארכת פולימראז DNA): 1 מחזור של 95 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות; 25 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס עבור 15 s, 60 °C (60 °F) עבור 15 s, 72 °C (72 °F) עבור 30 s; 1 מחזור של 72 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
- כאשר התוכנית הושלמה, להסיר את המוצרים מן התרמוציקלר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס לילה או -20 מעלות צלזיוס עד אלקטרופורזה.
4. אלקטרופורזה ג'ל אגרוז של מוצרי PCR
- מכינים 1.5% ג'ל אגרוז.
- השתמש 1.5 גרם של אבקת agarose ומערבבים אותו עם 100 מ"ל של 1x Tris-אצטט-EDTA (TAE) פתרון מאגר בבקבוקון.
- מחממים את התערובת כ 1.5-2 דקות במיקרוגל (600 W). מערבולת התוכן והחום שוב, במידת הצורך, כדי להמיס לחלוטין את agarose. מצננים מעט ומוסיפים 2 μL של PeqGreen לאגרוז.
- יוצקים את הג'ל בצורה באמצעות מסרק עם מספיק בארות עבור כל הדגימות ומוסיפים לפחות סמן משקל מולקולרי אחד.
התראה: עלול להתרחש פיגור רותח. לנער את הבקבוק בזהירות בעת resuspending agarose אשר עדיין לא מומס.
הערה: PeqGreen הוא צבע לא רעיל לגילוי חומצות גרעין. זה ישים עבור כתמים של DNA דו גדילי (dsDNA) ו- DNA חד גדילי (ssDNA) כמו גם RNA. הרגישות דומה לאתידיום ברומיד.
- הסר את מוצרי PCR מ 4 מעלות צלזיוס וצנטריפוגה במשך כ 10 s.
- לטעון את בארות הג'ל עם מדגם μL 10. אין להעמיס על הג'ל.
הערה: מאגר הפולימראז DNA כולל גם תרכובות המגבירות את צפיפות הדגימה כך שניתן לטעון דגימות ישירות על ג'לים ללא צורך בצבע טעינה. זה מאפשר לדגימה לשקוע לתוך הבאר וצבעים לעזור לעקוב אחר כמה רחוק דגימת ה-DNA עברה.- הוסף תקן משקל מולקולרי לבארות האגפים (רצוי תקן משקל מולקולרי של 50 bp).
הערה: אחסן את שאריות דגימות PCR ב -20 מעלות צלזיוס למקרה שיש לחזור על אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
- הוסף תקן משקל מולקולרי לבארות האגפים (רצוי תקן משקל מולקולרי של 50 bp).
- הפעל את הג'ל במאגר ריצה 1x TAE ב 150 V (קבוע) במשך כ 40 דקות או עד חזית הצבע הצהוב התחתון שנוסע בסביבות 50 bp מגיע לקצה התחתון של הג'ל.
- תמונה הג'ל בעוד אור כחול או אור אולטרה סגול (UV) מוחל ולהקליט תמונה לניתוח אורך קטע.
התראה: אור UV עלול לגרום נזק לעיניים ולעור. יש ללבוש תמיד ביגוד מגן ומשקפי בטיחות UV בעת שימוש בקופסת אור UV. - יש להשליך את הג'ל בהתאם למדיניות החומרים המסוכנים המוסדיים.
5. ניתוח של תוצאות אורך קטע
הערה: השתמש בניתוח רגרסיה ליניארית כדי להעריך את אורכי הקטעים.
- לשינוי גודל שברי ה-D1S80 PCR, הניחו סרגל על תצלום הג'ל מעל הנתיב הסטנדרטי של המשקל המולקולרי של 50 bp, כך שחלקו העליון של הסרגל יתאים לתחתית הבאר שלתוכו נטענה המדגם (איור 1).
הערה: כדי לחשב את משוואת הרגרסיה הליניארית עבור תקן המשקל המולקולרי (50 bp משקל מולקולרי רגיל) נעשה שימוש בתוכנית גיליון אלקטרוני. - הקלט את המרחק מהבאר (למשל, בס"מ) עבור כל רצועה של תקן המשקל המולקולרי של 50 bp בטבלה באמצעות תוכנית גיליון אלקטרוני(איור 2).
- קבעו את יומן הרישום (למשל בסיס 10) של כל גודל קטע בתקן המשקל המולקולרי של 50 bp והזינו את ערכי יומן הרישום בטבלה (איור 2).
- התווה כל נקודת נתונים לגרף עם יומן הגודל של הפס על הציר האנכי (ציר y) ועל מרחק הריצה הנמדד מראש הג'ל לכל רצועה של תקן המשקל המולקולרי על הציר האופקי (ציר x) באמצעות פיזור (איור 3).
- התאימו קו מגמה (קו רגרסיה ליניארי) והצגו את משוואת הרגרסיה (y = גרזן + b) ואת ערך R2 בגרף (איור 4).
- מדוד את המרחק שהועבר (למשל, בס"מ) עבור כל אמפליפון D1S80 (איור 5).
- הערכת הגודל של כל אמפליקון D1S80 באמצעות משוואת הרגרסיה: y = גרזן + b
כאשר y = יומן הרישום של גודל הקטע
a = שיפוע השורה (מחושב בנקודה 5)
x = המרחק מהבאר (בס"מ)
b = הנקודה שבה קו הרגרסיה מיירט את ציר ה- y (מחושב בנקודה 5)
הערה: מכיוון שערך ה- y מייצג את יומן הרישום של גודל הקטע, יש לחשב את האנטילוג (10y)כדי לקבל את גודל הקטע ב- bp של אמפליקנטי D1S80.
6. הערכת מספר היחידות החוזרות באללים של הנבדקים
הערה: אורכו של יחידת החזרה D1S80 הוא 16 bp. האלל הקטן ביותר הידוע עבור D1S80 יש 14 חזרות. ערכת האמפליקון המתוארת כאן מייצרת אמפליפונים עם אזורי איגוף המוסיפים 145 bp נוספים לגודל הסופי.
- השתמש בטבלה 1 כדי להעריך כמה יחידות חוזרות כלולות בכל קטע PCR. הגודל אקסטרפולציה באמצעות רגרסיה ליניארית צריך להיות בתוך 8 bp של כל אלל מסוים.
- רשום את הגנוטיפ של כל אדם שנבדק כשילוב של מספרי גודל חוזרים של אלל.
Representative Results
באמצעות הפרוטוקול המתואר, ניתוח סמן D1S80 VNTR בוצע על DNA גנומי אנושי שחולץ מתאי אפיתל רירית בוקאלי שנקטפו על ידי דגימת ספוגית (איור 6). בעקבות ההגברה באמצעות PCR, מוצג באיור 1ייצוג טיפוסי של ג'ל אגרוז המכיל את האמפליקונים D1S80 . נתיב 1 מראה את תקן המשקל המולקולרי 50 bp. לצד תקן המשקל המולקולרי, מוצרי PCR משמונה דגימות סטודנטים מוצגים באופן חזותי. נתיב 10 מראה את NTC שבו נעשה שימוש במים במקום DNA תבנית. רוב הדגימות שנותחו מציגות בבירור שתי להקות, המייצגות אנשים הטרוזיגניים עבור לוקוס D1S80. ליין 2 וליין 9 מציגים להקה אחת המייצגת אנשים הומוזיגיים עבור לוקוס D1S80. ליין 5 מציג להקה אחת מעורפלת שהיא הרבה יותר רחבה בהשוואה ללהקות האחרות. זו יכולה להיות תוצאה של שתי אללים D1S80 שונים ביחידה חוזרת אחת בלבד. לצורך ניתוח נוסף, המדגם בנתיב 5 ייחשב כלהקה אחת, המייצגת אדם הומוזיגי.
ניתוח שבר אלקטרופורזה במורד הזרם שבוצע על מוצרי PCR מאומתים שימש לקריאת גודל של לוקוס VNTR D1S80 של דגימות תלמיד שונות. פרשנות של גדלי האמפליקון המתקבלים על ידי ניתוח PCR מסתמכת על תקן המשקל המולקולרי המשמש. המרחק מהבאר עבור כל רצועה של תקן המשקל המולקולרי נמדד (איור 1) והוקלט (איור 2). בהתבסס על הגודל ומרחק ההעברה ניתן לחשב את גודל הרצועות הבודדות באמצעות ניתוח רגרסיה ליניארית. יומן הרישום (בסיס 10) נקבע עבור כל רצועה בדוגמיות התלמידים (איור 5) והאנטילוגיה המתאימה מייצגת את מספר ה- bp עבור כל אמפליפון. ניתן לחשב את מספר היחידות החוזרות בהתאם לגודל האמפליקון המתקבל (טבלה 2).
עבור כל מדגם סטודנט גודלי האמפליקון חושבו על ידי רגרסיה ליניארית וניתן להקצות בקלות כל רצועה לאל מסוים כפי שמוצג בטבלה 2. לאחר מכן ניתן להשתמש במידע על גדלי האלל של D1S80 כדי לקבוע את תדרי האלל בקרב קבוצת המשנה הקטנה של סטודנטים לתואר ראשון. אלל 28-לחזור הוא הנפוץ ביותר בקרב התלמידים בשל שני אנשים homozygous עבור אלל זה לחזור (אנשים 1 ו 4). האלל השני בשכיחותו הוא אלל 18-חוזר, אשר נישא על ידי הפרט homozygous 8 ועל ידי הפרט heterozygous 6. אללים בתדר נמוך הם אללים 21, 26 ו-30 חוזרים שנמצאו רק פעם אחת אצל אנשים 6, 5 ו-3, בהתאמה. דפוסי תדר האלל של לוקוס VNTR D1S80 של אוכלוסיית התלמידים הקטנים ניתן להשוות עוד יותר את תדירות האלל שלאוכלוסיותאנושיות גדולות יותר, למשל אוכלוסיות שמקורן ביבשות שונות 4,7,8,9,10.
בקרב התלמידים, יחידים 2 ו -3 חולקים את האלל 24-חוזר, אנשים 2 ו -7 חולקים את האלל 20-חוזרים ואנשים 5 ו -7 חולקים את האלל 23-חוזר. מעניין, שני אנשים homozygous D1S80 (בודדים 1 ו 4) לשתף את האלל 28-לחזור. התאמת אללים בין שני אנשים יכולה להצביע על קשר פוטנציאלי. עם זאת, אללים משותפים יכולים להתרחש גם במקרה. לכן, זה חיוני כדי לקבוע את הסבירות של משחק אלל בין שני אנשים. הסבירות תלויה בתדירות האלל של אללים בודדים באוכלוסייה הכללית ויש להשתמש בגישות סטטיסטיות כדי לצרף משקל סטטיסטי לניתוח סמן VNTR כגון הגישה הבייסיאנית. לסיכום, ניתן להשתמש בשיטת טביעת האצבע המוצגת במעשים מעשיים כדי ללמד את השימוש ב- VNTRs בטביעת אצבע של DNA ואת היישום שלה במדע הביולוגי.
איור 1: ייצוג של ג'ל אגרוז לאחר אלקטרופורזה של מוצרי הגברה D1S80 עם סרגל ממוקם ליד הנתיב הסטנדרטי משקל מולקולרי 50 bp. נתיב 1 מכיל את תקן המשקל המולקולרי 50 bp, בעוד נתיבים 2-9 מכילים מוצרי תגובת PCR. נתיב 10 מכיל את פקד ללא תבנית (NTC). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: קביעת מרחק נדידת שברי DNA ויומן של כל גודל שבר של תקן המשקל המולקולרי של 50 bp. המרחק מהבאר (בס"מ) עבור כל רצועה של תקן המשקל המולקולרי 50 bp נרשם ואת היומן (בסיס 10) עבור כל קטע נקבע. ערכים מוזנים לטבלה באמצעות תוכנית גיליון אלקטרוני. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: התוויית פיזור הנוצרת על-ידי התוויית מרחק ההעברה של מקטע ה- DNA של תקן המשקל המולקולרי על ציר ה- x מול יומן הרישום (בסיס 10) בגודל של כל קטע על ציר ה- y. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניצול קו הרגרסיה הליניארי ומשוואת הרגרסיה וכן את ערך R2 עבור הנתונים.
איור 5: קביעת גודל האמפליקונים D1S80. המרחק מהבאר עבור כל קטע מוזן במשוואת הרגרסיה. האנטילוגיה של ערך y מייצגת את גודל הקטע ב- bp. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ציר זמן וזרימת עבודה מוצעים עבור ניתוח D1S80 VNTR. כל הליך ניתוח D1S80 VNTR המוצג כאן, מקציר תא אפיתל buccal להערכת אורך שבר, ניתן להשלים בתוך יום עבודה אחד. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| גודל אלל (ב- bp) | מספר החזרות |
| 369 | 14 |
| 385 | 15 |
| 401 | 16 |
| 417 | 17 |
| 433 | 18 |
| 449 | 19 |
| 465 | 20 |
| 481 | 21 |
| 497 | 22 |
| 513 | 23 |
| 529 | 24 |
| 545 | 25 |
| 561 | 26 |
| 577 | 27 |
| 593 | 28 |
| 609 | 29 |
| 625 | 30 |
| 641 | 31 |
| 657 | 32 |
| 673 | 33 |
| 689 | 34 |
| 705 | 35 |
| 721 | 36 |
| 737 | 37 |
| 753 | 38 |
| 769 | 39 |
| 785 | 40 |
| 801 | 41 |
טבלה 1: גודל אמפליקון עבור כל לוקוס VNTR D1S80.
| בודדים | אלל | מרחק (בס"מ) | גודל (ב- bp) | מספר יחידות חוזרות |
| 1 | הומוזיגוס | 5 | 600 | 28 |
| 2 | הטרוזיגוזי | 5.2 ; 5.5 | 535, 458 | 24, 20 |
| 3 | הטרוזיגוזי | 4.9 ; 5.2 | 626, 535 | 30, 24 |
| 4 | הומוזיגוס | 5 | 600 | 28 |
| 5 | הטרוזיגוזי | 5.1 ; 5.3 | 564, 508 | 26, 23 |
| 6 | הטרוזיגוזי | 5.4 ; 5.6 | 483, 435 | 21, 18 |
| 7 | הטרוזיגוזי | 5.3 ; 5.5 | 508, 458 | 23, 20 |
| 8 | הומוזיגוס | 5.6 | 435 | 18 |
טבלה 2: הרכב אלל של האנשים השונים שנבדקו. ניתן להעריך את מספר היחידות החוזרות בהתאם לגודל האמפליקון המתקבל על ידי ניתוח רגרסיה ליניארית.
Discussion
כאן תיארנו שיטה פשוטה וחסכונית ליישום טביעת אצבע מולקולרית בשיעורים מעשיים לתואר ראשון.
כדי לסנן וריאציה גנטית ב- D1S80 locus, נדרש איסוף מדגם ביולוגי אנושי יחד עם מיצוי וניתוח DNA. חיוני כי השימוש האתי של דגימות ביולוגיות אנושיות מובטח לאורך כל התהליך. ניהול מדגם נשלט במסגרת רגולטורית מקיפה המבטיחה שימוש נכון בדגימות ובנתוניםנלווים 18 (למשל, הסכמה לשימוש בחומר ביולוגי אנושי). יש ליידע את המשתתפים כראוי על השימוש בדגימות שלהם, הסיכון לגילוי חריגות ביחסים גנטיים (למשל, עבור אנשים קשורים), הגנת פרטיות וכוונות לאחסון עתידי של הדגימות והנתונים הביולוגיים. כל התורמים (סטודנטים או עמיתים לעבודה) חייבים לתת הסכמה בחופשיות ולהבין את הזכות לסגת מבלי לתת סיבה. באופן כללי, זה הכרחי כדי להפוך את עצמך מכיר את ההנחיות והתקנות המתאימות לניהול מדגם אנושי לפני ביצוע שיעור מעבדה זה.
לאיסוף תאי אפיתל רירית buccal בקורסים מעבדה לתואר ראשון, יש לנקוט כדי למנוע זיהום של דגימות DNA עם DNA מהמפעיל או עם DNases. מומלץ כי חלוקי מעבדה, כפפות ומשקפי מגן משמשים תמיד, כמו גם ספוגיות סטריליות וצינורות microcentrifuge. קצירת תאים המבוססת על ספוגית Buccal נחשבת לשיטה נוחה וחסכונית לאיסוף חומר גנטי המתאים לניתוח VNTR מבוסס PCR, שכן הוא זול יחסית ולא פולשני. לצד ספוגיות שודד ים, רוק הוא שיטת הדגימה האוראלית הנפוצה ביותר למחקר רפואי. הוכח כי ספוגיות buccal מכילים שיעור גבוה יותר של תאי אפיתל מאשר רוק, מה שהופך אותם אמינים יותר במתן כמות ואיכות מספקת של DNA עבור ניתוח מבוסס PCR D1S80 VNTR19,20. בנוסף, מטליות buccal ניתן לשלוח לאחר איסוף עצמי להתגבר על מכשולים גיאוגרפיים בעת שימוש, למשל, בלימודי גיוון האוכלוסייה21.
מיצוי DNA הפך קל יחסית בשל הפיתוח של ערכות מיצוי מחברות שונות. עם זאת, ייתכן שהשימוש בערכות אלה לא יתאים לשיעורי מעבדה בשל משאבים כספיים מוגבלים. כאן, הצגנו שיטה קלה, מהירה וחסכונית להפקת דנ"א מדגימות אנושיות ללא צורך בערכת מיצוי DNA זמינה מסחרית. שיטת מיצוי ה- DNA המתוארת אינה משתמשת בממסים אורגניים, במקום זאת חלבונים תאיים מוסרים על ידי הגדלת ריכוז המלח באמצעות תמיסת אשלגן אצטט 8 M. שיטה זו גם מאפשרת טיפול במספר דגימות בבת אחת ומניבה דנ"א מספיק עבור מספר ניתוחי גנוטיפ עבור כל דגימה.
PCR היא טכניקה נפוצה במעבדות מולקולריות רבות. אמנם בדרך כלל ללא בעיות, יש מלכודות שעלולות לסבך את התגובה לייצר תוצאות מזויפות, אשר נדונו במקומות אחרים22. תנאי PCR המוצגים כאן נראו חזקים מאוד לנוכח איכות DNA תבנית ירודה, אבל חוסר הגברה PCR נצפתה מדי פעם בעת שימוש בתבניות עם ריכוזי DNA נמוכים מאוד עקב קציר תא אפיתל buccal עניים. פרייומרים DNA המשמשים במחקר זה ניתן להזמין מחברות שונות, כגון אלה המצוטטים בטבלת החומרים בסוף מאמר זה. טיפול מיוחד יש לנקוט בעת עבודה עם פרייומרים DNA על מנת למנוע זיהום עם DNases או DNA מהמפעיל. מוצרי PCR צריך גם להישמר קר כאשר לא בשימוש.
צעד קריטי נוסף הוא אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. שברים השונים על ידי יחידה חוזרת אחת בלבד של 16 bp לא ניתן להפריד אלקטרופורזה ג'ל ובכך מופיעים כלהקה אחת. במקרה זה, קביעה נכונה של מספר היחידות החוזרות של אללי D1S80 שנבדקו אינה יכולה להיות מובטחת. לכן, יש להגדיל את זמן הריצה של הג'ל בעוד המתח חייב להיות מופחת ואת ריכוז הג'ל עשוי להיות מוגברת כדי לספק רזולוציה טובה יותר והפרדה של להקות יחיד.
ראוי לציין כי לא כל האללים עבור לוקוס VNTR מכילים יחידות חוזרות מלאות. אללים שאינם בהסכמה (microvariants) המכילים יחידות חוזרות לא שלמות נפוצים לכל היותר לוקוסים VNTR וגדליהם נופלים בין גדלים של אללים עם יחידות חוזרות מלאות. מיקרו-ואריאנטים אלה בקושי ניתנים לגילוי על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. לעומת זאת, טכניקות כמו ג'ל פוליאקרילאמיד או אלקטרופורזה נימי יכול לפתור אללים שונים על ידי אחד עד כמה יחידות חוזרות או microvariants12,23,24,25,26. עם זאת, הטכניקות האחרונות פחות מתאימות לשיעורי מעבדה לתואר ראשון שכן יש להם חסרונות רבים כולל שימוש בתרכובות מסוכנות, הכנה מורכבת ומחסור בציוד. לצורך קביעת גודל הקטע, יש לנקוט משנה זהירות בעת מדידת המרחק של שברי הדנ"א שהועברו. אם הרצועות מפוזרות מכדי שניתן יהיה למדוד אותן במדויק, ייתכן שהחישוב של גודל קטע האלל D1S80 לפי רגרסיה ליניארית שגוי וכתוצאה מכך הערכה שגויה של מספרי יחידות חוזרות. במקרה זה הפעלה מחדש של אלקטרופורזה ג'ל agarose לאחר אופטימיזציה של תנאי הג'ל מומלץ כפי שתואר בעבר על ידי לורנץ ועמיתים לעבודה22.
הליך ניתוח VNTR D1S80 כולו המוצג כאן, מקציר תא אפיתל buccal להערכת אורך שבר, ניתן להשלים ביום עבודה אחד. פרוטוקול זה הוא שיטה חזקה, חסכונית וקלה לשימוש המתאימה לשיעורי מעבדה מעשיים לתואר ראשון.
Disclosures
המחברים אין ניגוד אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לקווין גרהאם על הקריינות שלו ולכל המשתתפים שתרמו דגימות עבור עבודה זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72,706 | autoclaved |
| 2 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 7,26,95,500 | autoclaved |
| 2-propanol | Fisher chemical | PI7508/17 | |
| 5x PCR buffer | Promega | M7845 | |
| Acetic acid | Sigma/Merck | A6283-500ML | |
| Agarose | BioBudget | 10-35-1020 | |
| Buccal swabs | BioBudget | 57-BS-05-600 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Combs | BioRad | ||
| dNTPs (10 mM) | Invitrogen | R0192 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.1 | |
| Ethanol | Honeywell | 32221-2.5L | |
| Gel caster | BioRad | ||
| Gel chamber | BioRad | SubCell GT | |
| Gel Doc XR+ | BioRad | ||
| Geltray | BioRad | SubCell GT | |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0371 | |
| Go-Taq Polymerase | Promega | M7845 | |
| Heating block | Eppendorf | Thermomixer | 1.5 mL and 2 mL |
| Microwave | Sharp | R-941STW | |
| peqGreen | VWR | 732-3196 | |
| Pipettes | Gilson | 1000 µL, 200 µL, 20 µL, 2 µL | |
| Potassium acetate | Arcos Organics | 217100010 | |
| PowerPac power supply | BioRad | 100-120/220-240V | |
| Primers | Sigma/Merck | ||
| Scale | Kern | PCB 2.5 kg | |
| SDS | Arcos Organics | 218591000 | |
| Shaker | IKA labortechnik | IKA RH basic | |
| Tabletop centrifuge | myFuge | ||
| Thermal Cycler | BioRad | C100 Touch | |
| Tris | VWR | 103156x | |
| Vortex mixer | LMS | VTX-3000L |
References
- Jeffreys, A. J., Wilson, V., Thein, S. L. Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA. Nature. 314 (6006), 67-73 (1985).
- Kasai, K., Nakamura, Y., White, R. Amplification of a variable number of tandem repeats (VNTR) locus (pMCT118) by the polymerase chain reaction (PCR) and its application to forensic science. Journal of Forensic Science. 35 (5), 1196-1200 (1990).
- Balamurugan, K., Tracey, M. L., Heine, U., Maha, G. C., Duncan, G. T. Mutation at the human D1S80 minisatellite locus. The Scientific World Journal. 2012 (917235), (2012).
- Herrera, R. J., Adrien, L. R., Ruiz, L. M., Sanabria, N. Y., Duncan, G. D1S80 single-locus discrimination among African populations. Human Biology. 76 (1), 87-108 (2004).
- Lauritzen, S. L., Mazumder, A. Informativeness of genetic markers for forensic inference - An information theoretic approach. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 1 (1), 652-653 (2008).
- Budowle, B., Chakraborty, R., Giusti, A. M., Eisenberg, A. J., Allen, R. C. Analysis of the VNTR locus D1S80 by the PCR followed by high-resolution PAGE. American Journal of Human Genetics. 48 (1), 137 (1991).
- Budowle, B., et al. D1S80 population data in African Americans, Caucasians, southeastern Hispanics, southwestern Hispanics, and Orientals. Journal of Forensic Science. 40 (1), 38-44 (1995).
- Verbenko, D. A., et al. Polymorphisms at locus D1S80 and other hypervariable regions in the analysis of Eastern European ethnic group relationships. Annals of Human Biology. 33 (5-6), 570-584 (2006).
- Walsh, S. J., Eckhoff, C. Australian Aboriginal population genetics at the D1S80 VNTR locus. Annals of Human Biology. 34 (5), 557-565 (2007).
- Limborska, S. A., Khrunin, A. V., Flegontova, O. V., Tasitz, V. A., Verbenko, D. A. Specificity of genetic diversity in D1S80 revealed by SNP-VNTR haplotyping. Annals of Human Biology. 38 (5), 564-569 (2011).
- Sajib, A. A., Yeasmin, S., Akter, M., Uddin, M. A., Akhteruzzaman, S. Phylogenetic analysis of Bangladeshi population with reference to D1S80 VNTR locus. Bioresearch Communications. 2 (1), 146-151 (2016).
- Köseler, A., Atalay, A., Atalay, E. Ö Allele frequency of VNTR locus D1S80 observed in Denizli province of Turkey. Biochemical genetics. 47 (7-8), 540-546 (2009).
- Mastana, S. S., Papiha, S. S. D1S80 distribution in world populations with new data from the UK and the Indian sub-continent. Annals of Human Biology. 28 (3), 308-318 (2001).
- Okuda, H., et al. A Japanese propositus with D-- phenotype characterized by the deletion of both the RHCE gene and D1S80 locus situated in chromosome 1p and the existence of a new CE-D-CE hybrid gene. Journal of Human Genetics. 45 (3), 142-153 (2000).
- Campbell, A. M., Williamson, J. H., Padula, D., Sundby, S. Use PCR & a Single Hair to Produce a "DNA Fingerprint.". The American Biology Teacher. 59 (3), 172-178 (1997).
- Jackson, D. D., Abbey, C. S., Nugent, D. DNA profiling of the D1S80 locus: A forensic analysis for the undergraduate biochemistry laboratory. Journal of Chemical Education. 83 (5), 774 (2006).
- Mansoor, S. K., Hussein, E. F., Ibraheem, A. K. Use the Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) in DNA fingerprinting and its application biological sciences. EurAsian Journal of BioSciences. 14 (2), 2835-2839 (2020).
- Beier, K., Schnorrer, S., Hoppe, N., Lenk, C. The ethical and legal regulation of human tissue and biobank research in Europe. Proceedings of the Tiss. EU Project. , Universitätsverlag Göttingen. (2011).
- Aida, J., et al. Telomere length variations in 6 mucosal cell types of gastric tissue observed using a novel quantitative fluorescence in situ hybridization method. Human Pathology. 38 (8), 1192-1200 (2007).
- Theda, C., et al. Quantitation of the cellular content of saliva and buccal swab samples. Scientific Reports. 8 (1), 1-8 (2018).
- McMichael, G. L., et al. DNA from buccal swabs suitable for high-throughput SNP multiplex analysis. Journal of biomolecular techniques: JBT. 20 (5), 232 (2009).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Destro-Bisol, G., Capelli, C., Belledi, M. Inferring microevolutionary patterns from allele-size frequency distributions of minisatellite loci: a worldwide study of the APOB 3'hypervariable region polymorphism. Human Biology. 72 (5), 733-751 (2000).
- Chen, B., et al. Structure and function of alleles in the 3'end region of human apoB gene. Chinese Medical Journal. 112 (3), 221-223 (1999).
- Renges, H. -H., Peacock, K., Dunning, A. M., Talmud, P., Humphries, S. E. Genetic relationship between the 3 '-VNTR and diallelic apolipoprotein B gene polymorphisms: Haplotype analysis in individuals of European and South Asian origin. Annals of Human Genetics. 56 (1), 11-33 (1992).
- Kravchenko, S. A., Maliarchuk, O. S., Livshits, L. A. A population genetics study of the allelic polymorphism in the hypervariable region of the apolipoprotein B gene in the population of different regions of Ukraine. Tsitologiia i Genetika. 30 (5), 35-41 (1996).
