Summary
Her beskriver vi en enkel protokoll for å generere DNA-fingeravtrykkprofiler ved å forsterke VNTR-locus D1S80 fra epitelcelle-DNA.
Abstract
I biovitenskap har DNA-fingeravtrykk blitt mye brukt til farskapstesting, rettsmedisinske anvendelser og fylogenetiske studier. Her beskriver vi en pålitelig og robust metode for genotyping av individer etter variabelt antall Tandem Repeat (VNTR) analyse i sammenheng med lavere laboratorieklasser. Det menneskelige D1S80 VNTR-locus brukes i denne protokollen som en svært polymorfisk markør basert på variasjon i antall repeterende sekvenser.
Denne enkle protokollen formidler nyttig informasjon for lærere og implementering av DNA-fingeravtrykk i praktiske laboratorieklasser. I den presenterte laboratorieøvelsen brukes DNA-ekstraksjon etterfulgt av PCR-forsterkning til å bestemme genetisk variasjon ved D1S80 VNTR-locus. Forskjeller i fragmentstørrelsen på PCR-produkter visualiseres ved agarose gelelektroforese. Fragmentstørrelsene og repetisjonstallene beregnes basert på en lineær regresjon av størrelsen og migrasjonsavstanden til en DNA-størrelsesstandard.
Ved å følge denne veiledningen skal elevene kunne:
• Høste og trekke ut DNA fra bukkale slimhinne epitelceller
• Utføre et PCR-eksperiment og forstå funksjonen til ulike reaksjonskomponenter
• Analyser amlikonene ved agarose gelelektroforese og tolke resultatene
• Forstå bruken av VNTRs i DNA-fingeravtrykk og dens anvendelse i biologiske vitenskaper
Introduction
Molekylær fingeravtrykk, også referert til som DNA-fingeravtrykk, ble introdusert av Sir Alec Jeffreys mens han jobbet ved Institutt for genetikk ved Universitetet i Leicester i 19841. Den er basert på 0,1% av det menneskelige genomet som er forskjellig mellom individer og består av omtrent tre millioner varianter. Disse unike forskjellene i genotypen tillater differensiering mellom individer og kan derfor fungere som et genetisk fingeravtrykk bortsett fra monozygotiske tvillinger. Følgelig brukes DNA-fingeravtrykk til estimering av relaterthet hos forskjellige personer som brukes, for eksempel i farskapstesting eller i befolkningsmangfoldstudier. I laboratorieklassene våre hadde vi som mål å formidle begrepet DNA-fingeravtrykk og allelefrekvenser. Metoden beskrevet her demonstrerer en pålitelig og robust metode for genetisk fingeravtrykk ved å analysere variabelt antall tandem repetisjoner (VNTR) ved D1S80 locus. Metoden består av utvinning av DNA fra bukkale slimhinne epitelceller og påfølgende Polymerase Chain Reaction (PCR) for å forsterke D1S80-locus, etterfulgt av visualisering av fragmentlengdeforskjeller på en agarosegel.
D1S80 VNTR minisatellite locus er svært variabel og ligger i det telomeriske området av kromosom 1 (1p36-p35). Det ble identifisert og beskrevet av Karsai og medarbeidere i 1990 som et locus med en kjerne repetisjon enhet på 16 bp, noe som muliggjør separasjon av alleler forskjellig med bare en enhet2. Videre viser D1S80 en høy grad av variasjon med en mutasjonshastighet på ca. 7,77 x 10-53. D1S80 har en høy grad av heterozygositet4,5 (f.eks. 80,8% heterozygositet for kaukasiere6 og opptil 87% heterozygositet for afroamerikanere7). I tillegg er D1S80-gresset polymorfisk i de fleste populasjoner, med vanligvis over 15 forskjellige alleler som bærer 14 til 41 repetisjoner hver. Frekvensen av D1S80-alleler varierer mellom populasjoner. Allelen med 24 repetisjonsenheter (allel 24) er hyppigst i europeiske og asiatiske populasjoner, mens allel 21 er mest vanlig i afrikanske populasjoner4,7,8,9,10. Allelefrekvensfordelingene er derfor diagnostiske for ulike menneskelige populasjoner og må tas i betraktning for estimering av slektskap (f.eks. i farskapstester).
PCR-basert forsterkning av D1S80 VNTR-locus har vært en svært nyttig metode i rettsmedisinsk vitenskap, farskapstester, sykdomsanalyse og befolkningsmangfoldsstudier11,12,13,14. Mens i rettsmedisin i dag har bruken av VNTRs blitt erstattet av korte tandem repetisjoner, D1S80 VNTR locus er mye brukt i bestemmelse av opprinnelse og genetiske relasjoner mellom og mellom populasjoner4,8,9,11. Videre brukes det ofte til å lære DNA fingeravtrykk i praktiske laboratorieklasser15,16. Metoden beskrevet her representerer en robust, kostnadseffektiv og brukervennlig metode med svært høy suksessrate i lavere laboratorieklasser. Formålet med denne artikkelen er å gi en oversikt over arbeidsflyten for molekylær analyse av den menneskelige D1S80 minisalitt locus fra bukkale slimhinne epitelceller. Det inkluderer demonstrasjon av teknikker, forenklede protokoller og praktiske forslag beskrevet i tidligere publiserte verk2,17.
Protocol
MERK: Denne protokollen skal bare brukes hvis studenter eller respektive foresatte er enige om adferden av denne protokollen, da genotypiske profiler gir innsikt i genetiske forhold. DNA-fingeravtrykk er en vanlig molekylærbiologisk metode som hovedsakelig brukes på befolkningsstudier og rettsmedisinske forhold. Derfor bør det tas hensyn til å holde forurensningsrisikoen så lav som mulig. For å unngå kontaminering av prøven med DNA fra en ekstern kilde eller DNases, bør hansker brukes, instrumentene bør rengjøres grundig eller steriliseres, og løsningene bør filtreres steriliseres eller autoklaveres før bruk.
1. Høsting av bukkale slimhinne epitelceller
FORSIKTIG: Arbeid med spytt og epitelceller kan føre til overføring av smittsomme sykdommer. Derfor bør standard- og overføringsbaserte forholdsregler brukes (f.eks. bruk av egnet personlig verneutstyr).
MERK: Inkluder en positiv kontroll, som leveres av instruktøren (f.eks. DNA hentet ut av instruktøren) og inkludert i nedstrøms behandlingstrinnene.
- Vent minst 1 time etter å ha spist eller pusset tenner før prøveoppsamling.
- Merk et tomt og sterilt 2,0 ml mikrosenterrør.
- Fjern en steril bukkal vattpinne fra emballasjen og gni kraftig på innsiden av kinnet i 30-40 ganger eller 30-40 sekunder for å høste bukkale slimhinne epitelceller.
- Plasser spissen av oppsamlingspinnen i det tidligere merkede sterile mikrosenterrøret og bryt av lengden på plasten som strekker seg utover kanten, enten for hånd eller ved hjelp av steril saks.
- Plasser hetten godt på røret, og tett opp oppsamlingspinnen innvendig.
2. Utvinning av genomisk DNA fra menneskelige celler
- Før ekstraksjon, sett en termisk mikser eller en varmeblokk til 65 °C for prøvelys.
FORSIKTIG: Noen kjemikalier som brukes er klassifisert som farlige. Les sikkerhetsdatabladet nøye og ta passende sikkerhetstiltak før håndtering.- Forbered og steriliser ved filtrering eller autoklavering av alle nødvendige buffere og løsninger (lysisoppløsning, 8 M kaliumacetat, 2-propanol, 70% etanol og elutionbuffer).
MERK: Alle sentrifugeringstrinn skal utføres ved romtemperatur (20-30 °C) med mindre annet er spesifisert.
- Forbered og steriliser ved filtrering eller autoklavering av alle nødvendige buffere og løsninger (lysisoppløsning, 8 M kaliumacetat, 2-propanol, 70% etanol og elutionbuffer).
- Tilsett 500 μL lysis-oppløsning (50 mM Tris/HCl, pH 8,0; 10 mM etylendiamin tetra-eddiksyre (EDTA); 2% natrium dodecylsulfat (SDS)) til bukkal vattpinne, og sørg for at prøven er helt nedsenket i lysisløsningen.
- Virvel kraftig i minst 5 s.
- Inkuber prøver ved 65 °C i en termisk mikser i 10 minutter.
- Bland prøven 3-4 ganger ved pulsvirvel i 5 s under inkubasjon.
- Fjern vattpinnen fra lysisbufferen, trykk vattpinnen mot innsiden av røret for å oppnå maksimalt prøvevolum.
- Tilsett 100 μL 8 M kaliumacetat til lysede celler.
- Bland grundig ved å invertere røret til det er et hvitt bunnfall.
- Inkuber i 5 min ved romtemperatur.
- Sentrifuger prøven i 5 min ved 18 000 x g.
- Overfør 450 μL av supernatanten til et rent og sterilt 1,5 ml mikrosenterrør.
- Tilsett 450 μL 2-propanol og bland grundig ved å invertere røret (utfelling av DNA).
- Inkuber i 5 min ved romtemperatur.
- Sentrifuge i 5 min ved 18 000 x g.
- Kast supernatanten og snu røret på et rent papirhåndkle for å tørke pelletsen og for å unngå krysskontaminering.
- Inkuber DNA-et i 5 min ved 65 °C i en varmeblokk for å tørke pelletsen helt.
- For å vaske DNA, tilsett 500 μL 70% etanol.
- Sentrifuge i 1 min ved 18 000 x g.
- Kast supernatanten og snu røret på et rent papirhåndkle for å tørke pelletsen.
- Tilsett 30 μL resuspension buffer (10 mM Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) i pelletsen.
- Inkuber DNA-et i 10 min ved 65 °C i en varmeblokk for å inaktivere DNases.
3. Forsterke D1S80 VNTR-locus ved hjelp av PCR
MERK: Registrer antall prøver som skal brukes, og lag et regneark med de nødvendige reagensene og volumene deres før du samler inn nødvendig plast og andre materialer. Merk de sterile rørene/stripene/platene som skal brukes til PCR med prøvenumre. Husk å inkludere en negativ kontroll ved hjelp av H2O i stedet for DNA og en positiv kontroll (f.eks. ved hjelp av DNA fra instruktøren) for å validere PCR.
- Forbered 1x PCR-masterblandingen som inneholder 10 μL 5x PCR-reaksjonsbuffer (inneholder 15 mM MgCl2), 1 μL deoksyribonukleotidtrifosfat (dNTPer) (10 mM), 5 μL (10 pmol) av hver primer pMCT118-f og pMCT118-r (fremover - 5'-GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG-3', omvendt - 5'-GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC-3') ifølge Kasai et al.2, 23,8 μL ultraren H2O og 0,2 μL Taq DNA-polymerase (5 U/μL).
MERK: Primerne pMCT118-f/pMCT118-r ble designet på flankeområdene i D1S80 VNTR-regionen som forsterker hele locus. - Merk PCR-rørene/strimlene/platen med prøvenumrene som skal brukes.
- Aliquot 45 μL av masterblandingen til hvert merket PCR-prøverør eller brønn.
- Tilsett 5 μL av DNA-malen i hovedblandingen i hver PCR-rør/platebrønn for å skaffe et totalt volum på 50 μL. Endre pipettespissen for hver DNA-prøve for å unngå krysskontaminering.
- Inkluder en ingen malkontroll (NTC) ved å bruke ultrapure H2O i stedet for DNA.
- Lukk PCR-rør/strimler eller tetningsplate og bland.
- Sentrifuger PCR-rørene/strimlene/platene i 20 s ved hjelp av en sentrifuge på bordplaten.
MERK: PCR-forholdene som er gitt i denne protokollen ble optimalisert ved hjelp av DNA-polymerasen og PCR-termosyren som ble brukt. Generelt må PCR-forholdene tilpasses DNA-polymerasen. Standard forlengelsestid for en Taq DNA-polymerase er 1 min/kb. - Plasser prøverørene/strimlene/platen i termosykleren og inkuber reaksjoner ved hjelp av følgende forhold (DNA-polymeraseforlengelsestid): 1 syklus på 95 °C i 2 minutter; 25 sykluser på 94 °C i 15 s, 60 °C i 15 s, 72 °C i 30 s; 1 syklus på 72 °C i 10 minutter.
- Når programmet er ferdig, fjern produktene fra termosykleren og oppbevar dem ved 4 °C over natten eller -20 °C til elektroforese.
4. Agarose gel elektroforese av PCR-produkter
- Forbered en 1,5% agarose gel.
- Bruk 1,5 g agarosepulver og bland det med 100 ml 1x Tris-aceta-EDTA (TAE) bufferløsning i en kolbe.
- Varm blandingen i ca 1,5-2 min i en mikrobølgeovn (600 W). Virvle innholdet og varme igjen, om nødvendig, for å fullstendig oppløse agarose. Avkjøl litt og tilsett 2 μL PeqGreen til agarose.
- Hell gelen i en form ved hjelp av en kam med nok brønner til alle prøver og tilsett minst en molekylvektmarkør.
FORSIKTIG: Kokende retardasjon kan forekomme. Rist kolben forsiktig når du resuspenderer agarose som ikke er oppløst ennå.
MERK: PeqGreen er et giftfritt fargestoff for påvisning av nukleinsyrer. Det gjelder for farging av dobbeltstrenget DNA (dsDNA) og enkeltstrenget DNA (ssDNA) samt RNA. Følsomheten kan sammenlignes med ethidiumbromid.
- Fjern PCR-produktene fra 4 °C og sentrifuger i ca. 10 s.
- Last brønnene på gelen med 10 μL prøve. Ikke overbelast gelen.
MERK: DNA-polymerasebufferen inneholder også forbindelser som øker prøvetettheten slik at prøver kan lastes direkte på geler uten behov for et lastefargestoff. Dette gjør at prøven synker ned i brønnen og fargestoffer bidrar til å spore hvor langt DNA-prøven har migrert.- Tilsett en molekylvektstandard til flankebrønnene (helst en 50 bp molekylvektstandard).
MERK: Oppbevar de resterende PCR-prøvene ved -20 °C i tilfelle agarosegelelektroforesen må gjentas.
- Tilsett en molekylvektstandard til flankebrønnene (helst en 50 bp molekylvektstandard).
- Kjør gelen i 1x TAE løpebuffer ved 150 V (konstant) i ca. 40 minutter eller til den nedre gule fargefronten som beveger seg rundt 50 bp når den nedre enden av gelen.
- Bilde gelen mens blått lys eller ultrafiolett (UV) lys påføres og ta opp et bilde for fragmentlengdeanalyse.
FORSIKTIG: UV-lys kan skade øynene og huden. Bruk alltid verneklær og UV-vernebriller når du bruker en UV-lysboks. - Kast gelen i henhold til retningslinjene for institusjonelle farlige materialer.
5. Analyse av fragmentlengderesultater
MERK: Bruk lineær regresjonsanalyse for å estimere lengdene på fragmentene.
- For å endre størrelsen på D1S80 PCR-fragmentene, plasser en linjal på gelfotografiet over standardbanen på 50 bp molekylvekt slik at toppen av linjalen stiller seg opp med bunnen av brønnen som prøven ble lastet inn i (Figur 1).
MERK: For å beregne den lineære regresjonsligningen for molekylvektstandarden (50 bp molekylvektstandard) ble det brukt et regnearkprogram. - Registrer avstanden fra brønnen (f.eks. i cm) for hvert bånd av 50 bp molekylvektstandarden i en tabell ved hjelp av et regnearkprogram (Figur 2).
- Bestem loggen (f.eks. grunntall 10) for hver fragmentstørrelse på standarden 50 bp molekylvekt, og angi loggverdiene i tabellen (figur 2).
- Tegn inn hvert datapunkt til et diagram med loggen over båndstørrelsene på den loddrette aksen (y-aksen) og den målte løpeavstanden fra toppen av gelen til hvert bånd av molekylvektstandarden på den vannrette aksen (x-aksen) ved hjelp av en scatterplot (figur 3).
- Tilpass en trendlinje (lineær regresjonslinje) og vis regresjonsligningen (y = ax + b) og R2-verdien i diagrammet (figur 4).
- Mål avstanden som er migrert (f.eks. i cm) for hver D1S80-amlikon (figur 5).
- Beregn størrelsen på hver D1S80-amplikon ved hjelp av regresjonsligningen: y = ax + b
der y = loggen for fragmentstørrelsen
a = stigningstallet for linjen (beregnet i punkt 5)
x = avstanden fra brønnen (i cm)
b = punktet der regresjonslinjen fanger opp y-aksen (beregnet i punkt 5)
MERK: Siden y-verdien representerer loggen for fragmentstørrelsen, må antilogen (10y) beregnes for å oppnå fragmentstørrelsen i bp av D1S80-amlikonene.
6. Estimering av antall repetisjonsenheter i allelene til de testede individene
MERK: D1S80 repetisjonsenheten er 16 bp i lengde. Den minste kjente allelen for D1S80 har 14 repetisjoner. Amplicon ordningen beskrevet her produserer amlikoner med flanke regioner legge opp en ekstra 145 bp til den endelige størrelsen.
- Bruk tabell 1 til å beregne hvor mange repetisjonsenheter som finnes i hvert PCR-fragment. Størrelsen ekstrapolert ved hjelp av den lineære regresjonen bør være innenfor 8 bp av et bestemt allel.
- Registrer genotypen til hver testet person som en kombinasjon av repetisjonsstørrelsesnumre for alleler.
Representative Results
Ved hjelp av den beskrevne protokollen ble D1S80 VNTR-markøranalyse utført på humant genomisk DNA ekstrahert fra buccal slimhinne epitelceller høstet av vattpinneprøvetaking (Figur 6). Etter forsterkningen ved hjelp av PCR vises en typisk representasjon av en agarosegel som inneholder D1S80-amlikonene, i figur 1. Bane 1 viser 50 bp molekylvektstandarden. Ved siden av molekylvektstandarden visualiseres PCR-produkter fra åtte studentprøver. Kjørefelt 10 viser NTC der vann ble brukt i stedet for mal-DNA. De fleste av de analyserte prøvene viser tydelig to bånd, som representerer individer heterozygote for D1S80-locus. Lane 2 og Lane 9 viser et enkelt band som representerer individer homozygote for D1S80-gresset. Lane 5 viser et tvetydig enkeltband som er mye bredere sammenlignet med de andre bandene. Dette kan være et resultat av at to D1S80-alleler er forskjellige i bare én repetisjonsenhet. For videre analyse vil prøven i bane 5 bli betraktet som et enkelt bånd, som representerer et homozygot individ.
Nedstrøms geleelektroforese fragmentanalyse utført på verifiserte PCR-produkter ble brukt til størrelseskalling av D1S80 VNTR-locus av forskjellige studentprøver. Tolkning av amplikonstørrelsene oppnådd ved PCR-analyse er avhengig av molekylvektstandarden som brukes. Avstanden fra brønnen for hvert bånd i molekylvektstandarden ble målt (figur 1) og registrert (figur 2). Basert på størrelsen og migrasjonsavstanden kan størrelsen på de enkelte båndene beregnes ved hjelp av en lineær regresjonsanalyse. Loggen (grunntall 10) ble bestemt for hvert bånd i studentprøvene (figur 5) og den respektive antilogen representerer antall bp for hver amplikon. Antall repetisjonsenheter kan beregnes i henhold til den oppnådde amlikonstørrelsen (Tabell 2).
For hver studentprøve ble amfisonstørrelsene beregnet ved lineær regresjon, og hvert bånd kunne enkelt tilordnes et bestemt allel som vist i tabell 2. Informasjonen om D1S80 allele størrelser kan deretter brukes til å bestemme allele frekvenser blant den lille befolkningen undergruppe av studenter. Den 28-gjentatte allelen er den hyppigste blant studentene på grunn av to homozygote individer for denne gjentatte allelen (personer 1 og 4). Den nest hyppigste allelen er den 18-gjentatte allelen, som bæres av den homozygote personen 8 og av den heterozygote personen 6. Lavfrekvente alleler er de 21-, 26- og 30-gjentatte allelene som bare finnes en gang i henholdsvis person 6, 5 og 3. Allelfrekvensmønstrene til D1S80 VNTR-locus av den lille studentpopulasjonen kan videre sammenlignes med allelfrekvensen til større menneskelige populasjoner, for eksempel populasjoner som stammer fra forskjelligekontinenter 4,7,8,9,10.
Blant studentene deler individ 2 og 3 den 24-gjentatte allelen, individ 2 og 7 deler 20-repetisjonsgaten og enkeltpersoner 5 og 7 deler den 23-gjentatte allelen. Interessant nok deler de to D1S80 homozygote individer (individuell 1 og 4) den 28-gjentatte allelen. Matchende alleler mellom to personer kan indikere en potensiell relaterthet. Imidlertid kan delte alleler også oppstå ved en tilfeldighet. Dermed er det avgjørende å bestemme sannsynligheten for en allelekamp mellom to personer. Sannsynligheten avhenger av allelfrekvensen til individuelle alleler i den generelle befolkningen, og statistiske tilnærminger bør brukes til å legge en statistisk vekt til VNTR-markøranalyse som bayesiansk tilnærming. Oppsummert kan den presenterte fingeravtrykksmetoden brukes i praktiske praktiske praktiske hender for å lære bruk av VNTRs i DNA-fingeravtrykk og dens anvendelse i biologisk vitenskap.
Figur 1: Representasjon av en agarosegel etter elektroforese av D1S80-forsterkningsprodukter med en linjal plassert ved siden av standardbanen på 50 bp molekylvekt. Lane 1 inneholder 50 bp molekylvektstandard, mens baner 2-9 inneholder PCR-reaksjonsprodukter. Bane 10 inneholder ingen malkontroll (NTC). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bestemmelse av DNA-fragmentmigrasjonsavstand og logg over hver fragmentstørrelse av 50 bp molekylvektstandarden. Avstanden fra brønnen (i cm) for hvert bånd av 50 bp molekylvektstandarden registreres og loggen (base 10) for hvert fragment bestemmes. Verdier registreres i en tabell ved hjelp av et regnearkprogram. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Spredte plott generert ved å plotte DNA fragment migrasjonsavstand av molekylvektstandarden på x-aksen mot loggen (base 10) av størrelsen på hvert fragment på y-aksen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Utnyttelse av den lineære regresjonslinjen og regresjonsligningen samt R2-verdien for dataene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Bestemmelse av størrelsen på D1S80-amlikonene. Avstanden fra brønnen for hvert fragment legges inn i regresjonsligningen. Antilogen til y-verdien representerer fragmentstørrelsen i bp. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Foreslått tidslinje og arbeidsflyt for D1S80 VNTR-analyse. Hele D1S80 VNTR-analyseprosedyren som presenteres her, fra buccal epitelcellehøsting til fragmentlengdeevaluering, kan fullføres innen en enkelt arbeidsdag. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Allel størrelse (i bp) | Antall gjentakelser |
| 369 | 14 |
| 385 | 15 |
| 401 | 16 |
| 417 | 17 |
| 433 | 18 |
| 449 | 19 |
| 465 | 20 |
| 481 | 21 |
| 497 | 22 |
| 513 | 23 |
| 529 | 24 |
| 545 | 25 |
| 561 | 26 |
| 577 | 27 |
| 593 | 28 |
| 609 | 29 |
| 625 | 30 |
| 641 | 31 |
| 657 | 32 |
| 673 | 33 |
| 689 | 34 |
| 705 | 35 |
| 721 | 36 |
| 737 | 37 |
| 753 | 38 |
| 769 | 39 |
| 785 | 40 |
| 801 | 41 |
Tabell 1: Amplikonstørrelse for hvert D1S80 VNTR-locus.
| individ | Allel | Avstand (i cm) | Størrelse (i bp) | Antall gjentatte enheter |
| 1 | homozygot | 5 | 600 | 28 |
| 2 | heterozygot | 5.2 ; 5.5 | 535, 458 | 24, 20 |
| 3 | heterozygot | 4.9 ; 5.2 | 626, 535 | 30, 24 |
| 4 | homozygot | 5 | 600 | 28 |
| 5 | heterozygot | 5.1 ; 5.3 | 564, 508 | 26, 23 |
| 6 | heterozygot | 5.4 ; 5.6 | 483, 435 | 21, 18 |
| 7 | heterozygot | 5.3 ; 5.5 | 508, 458 | 23, 20 |
| 8 | homozygot | 5.6 | 435 | 18 |
Tabell 2: Allelsammensetning av de ulike personene som er testet. Antall repetisjonsenheter kan tilnærmes i henhold til amplikonstørrelsen oppnådd ved lineær regresjonsanalyse.
Discussion
Her beskrev vi en enkel og kostnadseffektiv metode for implementering av molekylær fingeravtrykk i grunnleggende praktiske klasser.
For å screene for genetisk variasjon ved D1S80-locus, er det nødvendig med menneskelig biologisk prøveinnsamling sammen med DNA-ekstraksjon og analyse. Det er avgjørende at den etiske bruken av menneskelige biologiske prøver sikres gjennom hele prosessen. Prøvestyring styres innenfor et omfattende regelverk som sikrer riktig bruk av prøver og tilhørende data18 (f.eks. samtykke til bruk av humant biologisk materiale). Deltakerne må informeres på riktig måte om bruken av prøvene sine, risikoen for oppdagelse av uregelmessigheter i genetiske relasjoner (f.eks. for beslektede personer), personvern og intensjoner for fremtidig lagring av biologiske prøver og data. Alle givere (studenter eller kolleger) må gi samtykke fritt og forstå retten til å trekke seg uten å oppgi grunn. Generelt er det uunnværlig å gjøre seg kjent med de respektive retningslinjene og forskriftene for menneskelig prøvehåndtering før du gjennomfører denne laboratorieklassen.
For innsamling av bukkale slimhinne epitelceller i lavere laboratoriekurs, må det tas hensyn til å unngå forurensning av DNA-prøvene med DNA fra operatøren eller med DNases. Det anbefales at labfrakker, hansker og vernebriller alltid brukes, samt sterile vattpinner og mikrocentrifugerør. Buccal vattpinnebasert cellehøsting regnes som en praktisk og kostnadseffektiv metode for innsamling av genetisk materiale egnet for PCR-basert VNTR-analyse, da det er relativt billig og ikke-invasivt. Ved siden av bukkale vattpinner er spytt den vanligste orale prøvetakingsmetoden for medisinsk forskning. Det har vist seg at bukkale vattpinner inneholder en høyere andel epitelceller enn spytt, noe som gjør dem mer pålitelige i å gi tilstrekkelig mengde og kvalitet på DNA for PCR-basert D1S80 VNTR-analyse19,20. I tillegg kan bukkale vattpinner sendes ut etter at selvoppsamling overvinne geografiske hindringer når de brukes, for eksempel i befolkningsmangfoldsstudier21.
DNA-utvinning har blitt relativt enkelt på grunn av utviklingen av ekstraksjonssett fra forskjellige selskaper. Likevel kan bruk av disse settene ikke være egnet i laboratorieklasser på grunn av begrensede økonomiske ressurser. Her presenterte vi en enkel, rask og kostnadseffektiv metode for DNA-ekstraksjon fra menneskelige prøver uten behov for et kommersielt tilgjengelig DNA-ekstraksjonssett. Dna-ekstraksjonsmetoden som er beskrevet, bruker ikke organiske løsningsmidler, i stedet fjernes cellulære proteiner ved å øke saltkonsentrasjonen ved hjelp av en 8 M kaliumacetatoppløsning. Denne metoden muliggjør også håndtering av flere prøver samtidig og gir tilstrekkelig DNA for flere genotypeanalyser for hver prøve.
PCR er en vanlig teknikk i mange molekylære laboratorier. Selv om det generelt er problemfritt, er det fallgruver som kan komplisere reaksjonen som gir falske resultater, som har blitt diskutert andre steder22. PCR-forhold presentert her har vist seg svært robuste i møte med dårlig mal DNA-kvalitet, men mangel på PCR-forsterkning ble likevel av og til observert ved bruk av maler med ekstremt lave DNA-konsentrasjoner på grunn av dårlig buccal epitelcellehøsting. DNA-primerne som brukes i denne studien kan bestilles fra forskjellige selskaper, for eksempel de som er sitert i materialtabellen på slutten av dette papiret. Spesiell forsiktighet må utvises ved arbeid med DNA-primere for å unngå forurensning med DNases eller DNA fra operatøren. PCR-produkter bør også holdes kalde når de ikke er i bruk.
Et annet kritisk skritt er agarose gel elektroforese. Fragmenter som varierer med bare en repetisjonsenhet på 16 bp, kan ikke skilles i gelelektroforesen og vises dermed som et enkelt bånd. I dette tilfellet kan en riktig bestemmelse av antall repetisjonsenheter av D1S80 allelene som testes, ikke sikres. Derfor bør gelens kjøretid økes mens spenningen må reduseres og gelkonsentrasjonen kan økes for å gi en bedre oppløsning og separasjon av enkeltbåndene.
Det er verdt å nevne at ikke alleler for en VNTR locus inneholder komplette repetisjonsenheter. Ikke-konsensus alleler (mikrovarianter) som inneholder ufullstendige repetisjonsenheter er vanlige på de fleste VNTR loci og deres størrelser faller inn mellom størrelser av alleler med full repetisjon enheter. Disse mikrovariantene kan knapt påvises ved agarose gelelektroforese. I motsetning kan teknikker som polyakrylamidgeler eller kapillær elektroforese løse alleler som varierer med en til noen få repetisjonsenheter eller mikrovarianter12,23,24,25,26. Imidlertid er de sistnevnte teknikkene mindre egnet for lavere laboratorieklasser, da de har mange ulemper, inkludert bruk av farlige forbindelser, kompleks forberedelse og mangel på utstyr. For fragmentstørrelsesbestemmelsen må det utvises spesiell forsiktighet ved måling av avstanden til de migrerte DNA-fragmentene. Hvis båndene er for diffuse til å måles nøyaktig, kan beregningen av D1S80 allele fragmentstørrelse ved lineær regresjon være feil, noe som resulterer i feil estimering av repetisjonsenhetsnumre. I så fall anbefales en re-run av agarose gel elektroforese etter optimalisering av gelforholdene som tidligere beskrevet av Lorenz og medarbeidere22.
Hele D1S80 VNTR-analyseprosedyren som presenteres her, fra buccal epitelcellehøsting til fragmentlengdeevaluering, kan fullføres på en enkelt arbeidsdag. Denne protokollen er en robust, kostnadseffektiv og brukervennlig metode som er egnet for grunnleggende praktiske laboratorieklasser.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Kevin Graham for hans voice-over og alle deltakere som donerte prøver for dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72,706 | autoclaved |
| 2 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 7,26,95,500 | autoclaved |
| 2-propanol | Fisher chemical | PI7508/17 | |
| 5x PCR buffer | Promega | M7845 | |
| Acetic acid | Sigma/Merck | A6283-500ML | |
| Agarose | BioBudget | 10-35-1020 | |
| Buccal swabs | BioBudget | 57-BS-05-600 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Combs | BioRad | ||
| dNTPs (10 mM) | Invitrogen | R0192 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.1 | |
| Ethanol | Honeywell | 32221-2.5L | |
| Gel caster | BioRad | ||
| Gel chamber | BioRad | SubCell GT | |
| Gel Doc XR+ | BioRad | ||
| Geltray | BioRad | SubCell GT | |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0371 | |
| Go-Taq Polymerase | Promega | M7845 | |
| Heating block | Eppendorf | Thermomixer | 1.5 mL and 2 mL |
| Microwave | Sharp | R-941STW | |
| peqGreen | VWR | 732-3196 | |
| Pipettes | Gilson | 1000 µL, 200 µL, 20 µL, 2 µL | |
| Potassium acetate | Arcos Organics | 217100010 | |
| PowerPac power supply | BioRad | 100-120/220-240V | |
| Primers | Sigma/Merck | ||
| Scale | Kern | PCB 2.5 kg | |
| SDS | Arcos Organics | 218591000 | |
| Shaker | IKA labortechnik | IKA RH basic | |
| Tabletop centrifuge | myFuge | ||
| Thermal Cycler | BioRad | C100 Touch | |
| Tris | VWR | 103156x | |
| Vortex mixer | LMS | VTX-3000L |
References
- Jeffreys, A. J., Wilson, V., Thein, S. L. Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA. Nature. 314 (6006), 67-73 (1985).
- Kasai, K., Nakamura, Y., White, R. Amplification of a variable number of tandem repeats (VNTR) locus (pMCT118) by the polymerase chain reaction (PCR) and its application to forensic science. Journal of Forensic Science. 35 (5), 1196-1200 (1990).
- Balamurugan, K., Tracey, M. L., Heine, U., Maha, G. C., Duncan, G. T. Mutation at the human D1S80 minisatellite locus. The Scientific World Journal. 2012 (917235), (2012).
- Herrera, R. J., Adrien, L. R., Ruiz, L. M., Sanabria, N. Y., Duncan, G. D1S80 single-locus discrimination among African populations. Human Biology. 76 (1), 87-108 (2004).
- Lauritzen, S. L., Mazumder, A. Informativeness of genetic markers for forensic inference - An information theoretic approach. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 1 (1), 652-653 (2008).
- Budowle, B., Chakraborty, R., Giusti, A. M., Eisenberg, A. J., Allen, R. C. Analysis of the VNTR locus D1S80 by the PCR followed by high-resolution PAGE. American Journal of Human Genetics. 48 (1), 137 (1991).
- Budowle, B., et al. D1S80 population data in African Americans, Caucasians, southeastern Hispanics, southwestern Hispanics, and Orientals. Journal of Forensic Science. 40 (1), 38-44 (1995).
- Verbenko, D. A., et al. Polymorphisms at locus D1S80 and other hypervariable regions in the analysis of Eastern European ethnic group relationships. Annals of Human Biology. 33 (5-6), 570-584 (2006).
- Walsh, S. J., Eckhoff, C. Australian Aboriginal population genetics at the D1S80 VNTR locus. Annals of Human Biology. 34 (5), 557-565 (2007).
- Limborska, S. A., Khrunin, A. V., Flegontova, O. V., Tasitz, V. A., Verbenko, D. A. Specificity of genetic diversity in D1S80 revealed by SNP-VNTR haplotyping. Annals of Human Biology. 38 (5), 564-569 (2011).
- Sajib, A. A., Yeasmin, S., Akter, M., Uddin, M. A., Akhteruzzaman, S. Phylogenetic analysis of Bangladeshi population with reference to D1S80 VNTR locus. Bioresearch Communications. 2 (1), 146-151 (2016).
- Köseler, A., Atalay, A., Atalay, E. Ö Allele frequency of VNTR locus D1S80 observed in Denizli province of Turkey. Biochemical genetics. 47 (7-8), 540-546 (2009).
- Mastana, S. S., Papiha, S. S. D1S80 distribution in world populations with new data from the UK and the Indian sub-continent. Annals of Human Biology. 28 (3), 308-318 (2001).
- Okuda, H., et al. A Japanese propositus with D-- phenotype characterized by the deletion of both the RHCE gene and D1S80 locus situated in chromosome 1p and the existence of a new CE-D-CE hybrid gene. Journal of Human Genetics. 45 (3), 142-153 (2000).
- Campbell, A. M., Williamson, J. H., Padula, D., Sundby, S. Use PCR & a Single Hair to Produce a "DNA Fingerprint.". The American Biology Teacher. 59 (3), 172-178 (1997).
- Jackson, D. D., Abbey, C. S., Nugent, D. DNA profiling of the D1S80 locus: A forensic analysis for the undergraduate biochemistry laboratory. Journal of Chemical Education. 83 (5), 774 (2006).
- Mansoor, S. K., Hussein, E. F., Ibraheem, A. K. Use the Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) in DNA fingerprinting and its application biological sciences. EurAsian Journal of BioSciences. 14 (2), 2835-2839 (2020).
- Beier, K., Schnorrer, S., Hoppe, N., Lenk, C. The ethical and legal regulation of human tissue and biobank research in Europe. Proceedings of the Tiss. EU Project. , Universitätsverlag Göttingen. (2011).
- Aida, J., et al. Telomere length variations in 6 mucosal cell types of gastric tissue observed using a novel quantitative fluorescence in situ hybridization method. Human Pathology. 38 (8), 1192-1200 (2007).
- Theda, C., et al. Quantitation of the cellular content of saliva and buccal swab samples. Scientific Reports. 8 (1), 1-8 (2018).
- McMichael, G. L., et al. DNA from buccal swabs suitable for high-throughput SNP multiplex analysis. Journal of biomolecular techniques: JBT. 20 (5), 232 (2009).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Destro-Bisol, G., Capelli, C., Belledi, M. Inferring microevolutionary patterns from allele-size frequency distributions of minisatellite loci: a worldwide study of the APOB 3'hypervariable region polymorphism. Human Biology. 72 (5), 733-751 (2000).
- Chen, B., et al. Structure and function of alleles in the 3'end region of human apoB gene. Chinese Medical Journal. 112 (3), 221-223 (1999).
- Renges, H. -H., Peacock, K., Dunning, A. M., Talmud, P., Humphries, S. E. Genetic relationship between the 3 '-VNTR and diallelic apolipoprotein B gene polymorphisms: Haplotype analysis in individuals of European and South Asian origin. Annals of Human Genetics. 56 (1), 11-33 (1992).
- Kravchenko, S. A., Maliarchuk, O. S., Livshits, L. A. A population genetics study of the allelic polymorphism in the hypervariable region of the apolipoprotein B gene in the population of different regions of Ukraine. Tsitologiia i Genetika. 30 (5), 35-41 (1996).
