Summary
Здесь мы описываем простой протокол для генерации профилей отпечатков пальцев ДНК путем амплификации локуса VNTR D1S80 из ДНК эпителиальных клеток.
Abstract
В биологических науках ДНК-дактилоскопия широко используется для тестирования отцовства, судебно-медицинской экспертизы и филогенетических исследований. Здесь мы описываем надежный и надежный метод генотипирования людей с помощью анализа переменного числа тандемных повторов (VNTR) в контексте лабораторных занятий бакалавриата. Человеческий локус D1S80 VNTR используется в этом протоколе в качестве высокополиморфного маркера, основанного на изменении числа повторяющихся последовательностей.
Этот простой протокол передает полезную информацию для преподавателей и внедрения ДНК-дактилоскопии на практических лабораторных занятиях. В представленном лабораторном упражнении экстракция ДНК с последующей амплификацией ПЦР используется для определения генетической вариации в локусе D1S80 VNTR. Различия в размерах фрагментов продуктов ПЦР визуализируются электрофорезом агарозного геля. Размеры фрагментов и числа повторов рассчитываются на основе линейной регрессии размера и расстояния миграции стандарта размера ДНК.
Следуя этому руководству, учащиеся должны уметь:
• Сбор и извлечение ДНК из эпителиальных клеток слизистой оболочки щечки
• Провести эксперимент с ПЦР и понять функцию различных компонентов реакции
• Анализ ампликонов методом электрофореза агарозного геля и интерпретация результатов
• Понимание использования VNTR в ДНК-дактилоскопии и его применение в биологических науках
Introduction
Молекулярная дактилоскопия, также называемая ДНК-дактилоскопией, была введена сэром Алеком Джеффрисом во время работы на кафедре генетики в Университете Лестера в 1984году 1. Он основан на 0,1% генома человека, который отличается между людьми и состоит примерно из трех миллионов вариантов. Эти уникальные различия в генотипе позволяют дифференцировать людей и, следовательно, могут функционировать как генетический отпечаток пальца, за исключением монозиготных близнецов. Следовательно, ДНК-дактилоскопия используется для оценки родства различных людей, что применяется, например, в тестировании на отцовство или в исследованиях разнообразия популяций. В наших лабораторных занятиях мы стремились передать концепцию ДНК-дактилоскопии и частот аллелей. Метод, описанный здесь, демонстрирует надежный и надежный метод генетической дактилоскопии путем анализа переменного числа тандемных повторов (VNTR) в локусе D1S80. Способ включает экстракцию ДНК из эпителиальных клеток слизистой оболочки щечки и последующую полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для амплации локуса D1S80 с последующей визуализацией различий длины фрагментов на агарозном геле.
Локус минисателлита D1S80 VNTR сильно варьируется и расположен в теломерной области хромосомы 1 (1p36-p35). Он был идентифицирован и описан Карсаем и его коллегами в 1990 году как локус с основной повторяющейся единицей 16 bp, что позволяет разделять аллели, отличающиеся только одним блоком2. Кроме того, D1S80 показывает высокую степень вариации со скоростью мутации примерно 7,77 x 10-53. D1S80 имеет высокую степень гетерозиготности4,5 (например, 80,8% гетерозиготности для кавказцев6 и до 87% гетерозиготности для афроамериканцев7). Кроме того, локус D1S80 полиморфен в большинстве популяций, причем обычно более 15 различных аллелей несут от 14 до 41 повтора каждый. Частота аллелей D1S80 варьируется между популяциями. Аллель с 24 повторяющимися единицами (аллель 24) наиболее часто встречается в европейских и азиатских популяциях, тогда как аллель 21 наиболее распространен в африканских популяциях4,7,8,9,10. Следовательно, распределение частот аллелей является диагностическим для различных человеческих популяций и должно учитываться для оценки родства (например, в тестах на отцовство).
Амплификация локуса D1S80 VNTR на основе ПЦР была очень полезным методом в судебной медицине, тестах на отцовство, анализе заболеваний и исследованиях разнообразия населения11,12,13,14. В то время как в криминалистике сегодня использование VNTR было заменено короткими тандемными повторами, локус D1S80 VNTR широко используется при определении происхождения и генетических отношений между популяциями4,8,9,11. Кроме того, он часто используется для обучения ДНК-дактилоскопии в практических лабораторных классах15,16. Метод, описанный здесь, представляет собой надежный, экономически эффективный и простой в использовании метод с очень высоким уровнем успеха в лабораторных классах бакалавриата. Целью данной статьи является предоставление обзора рабочего процесса молекулярного анализа локуса минисателлита D1S80 человека из эпителиальных клеток слизистой оболочки щечки. Она включает в себя демонстрацию методик, упрощенных протоколов и практических предложений, описанных в ранее опубликованных работах2,17.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол должен использоваться только в том случае, если студенты или соответствующие законные опекуны согласились на проведение этого протокола, поскольку генотипические профили дают представление о генетических отношениях. ДНК-дактилоскопия является распространенным методом молекулярной биологии, в основном применяемым к популяционные исследованиям и судебно-медицинским вопросам. Поэтому следует уделять внимание тому, чтобы риски загрязнения были как можно ниже. Чтобы избежать загрязнения образца ДНК из внешнего источника или ДНКаз, следует надеть перчатки, инструменты должны быть тщательно очищены или стерилизованы, а растворы должны быть стерилизованы фильтром или автоклавированы перед использованием.
1. Сбор эпителиальных клеток слизистой оболочки щечки
ВНИМАНИЕ: Работа со слюной и эпителиальными клетками может привести к передаче инфекционных заболеваний. Поэтому следует применять стандартные и основанные на передаче меры предосторожности (например, использование соответствующих средств индивидуальной защиты).
ПРИМЕЧАНИЕ: Включите положительный контроль, который обеспечивается инструктором (например, ДНК, извлеченная инструктором) и включается в последующие этапы обработки.
- Подождите не менее 1 ч после еды или чистки зубов перед сбором образцов.
- Наклейте этикетку на пустую и стерильную микроцентрифужную трубку 2,0 мл.
- Извлеките один стерильный щечный тампон из упаковки и энергично втирайте внутрь щеки в течение 30-40 раз или 30-40 секунд для сбора эпителиальных клеток слизистой оболочки щеки.
- Поместите наконечник тампона для сбора в ранее маркированную стерильную микроцентрифужную трубку и отломите длину пластика, которая выходит за пределы края, либо вручную, либо с помощью стерильных ножниц.
- Надежно поместите колпачок на трубку, запечатав тампон для сбора.
2. Извлечение геномной ДНК из клеток человека
- Перед экстракцией установите термомикшер или нагревательный блок на 65 °C для лизиса образца.
ВНИМАНИЕ: Некоторые используемые химические вещества классифицируются как опасные. Внимательно прочитайте паспорт безопасности и примите соответствующие меры безопасности перед обработкой.- Готовят и стерилизуют путем фильтрации или автоклавирования все необходимые буферы и растворы (раствор лизиса, 8 М ацетата калия, 2-пропанол, 70% этанол и буфер элюирования).
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы центрифугирования должны выполняться при комнатной температуре (20-30 °C), если это не указано иное.
- Готовят и стерилизуют путем фильтрации или автоклавирования все необходимые буферы и растворы (раствор лизиса, 8 М ацетата калия, 2-пропанол, 70% этанол и буфер элюирования).
- Добавьте 500 мкл раствора лизиса (50 мМ Tris/HCl, рН 8,0; 10 мМ этилендиамина тетрааусной кислоты (ЭДТА); 2% додецилсульфата натрия (SDS)) в буккальный тампон, убедившись, что образец полностью погружен в раствор лизиса.
- Вихрь энергично в течение не менее 5 с.
- Инкубировать образцы при 65 °C в термомешале в течение 10 мин.
- Перемешайте образец 3-4 раза импульсно-вихрево в течение 5 с во время инкубации.
- Извлеките тампон из буфера лизиса, прижмите тампон к внутренней части пробирки, чтобы получить максимальный объем образца.
- Добавьте 100 мкл 8 М ацетата калия в лизированные клетки.
- Тщательно перемешайте, перевертив трубку, пока не появится белый осадок.
- Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Центрифугировать образец в течение 5 мин при 18 000 х г.
- Перенесите 450 мкл супернатанта в чистую и стерильную микроцентрифужную трубку 1,5 мл.
- Добавьте 450 мкл 2-пропанола и тщательно перемешайте, инвертив трубку (осаждение ДНК).
- Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Центрифуга в течение 5 мин при 18 000 х г.
- Выбросьте супернатант и перевертите трубку на чистом бумажном полотенце, чтобы высушить гранулу и избежать перекрестного загрязнения.
- Инкубируйте ДНК в течение 5 мин при 65 °C в нагревательном блоке, чтобы полностью высушить гранулу.
- Чтобы промыть ДНК, добавьте 500 мкл 70% этанола.
- Центрифуга в течение 1 мин при 18 000 х г.
- Выбросьте супернатант и перевертите трубку на чистом бумажном полотенце, чтобы высушить гранулу.
- Добавьте к грануле 30 мкл буфера ресуспенсии (10 мМ Tris/HCl pH 8,0, 1 мМ ЭДТА).
- Инкубируют ДНК в течение 10 мин при 65 °C в нагревательном блоке для инактивации ДНКаз.
3. Амплификовка локуса VNTR D1S80 с помощью ПЦР
ПРИМЕЧАНИЕ: Запишите количество образцов, которые будут использоваться, и подготовьте рабочий лист с необходимыми реагентами и их объемами перед сбором необходимых пластмасс и других материалов. Маркировка стерильных пробирок/полосок/пластин, которые будут использоваться для ПЦР, номерами образцов. Не забудьте включить отрицательный контроль с использованиемH2O вместо ДНК и положительный контроль (например, с использованием ДНК, предоставленной инструктором) для проверки ПЦР.
- Готовят 1x ПЦР мастер-микс, содержащий 10 мкл 5x реакционного буфера ПЦР (содержащего 15 мМMgCl2),1 мкл дезоксирибонуклеотидтрифосфата (dNTPs) (10 мМ), 5 мкл (10 пмоль) каждого праймера pMCT118-f и pMCT118-r (вперед - 5'-GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCCG-3', реверс - 5'-GTCTTGGGGGGGGATGCACGTGCCCCCCGC-3') согласно Kasai et al.2,23,8 мкл сверхчистогоH2O и 0,2 мкл ДНК-полимеразы Taq (5 U/μL).
ПРИМЕЧАНИЕ: Грунтовки pMCT118-f/pMCT118-r были спроектированы на фланговых областях области D1S80 VNTR, усиливая весь локус. - Маркировка пробирок/полосок/пластин ПЦР с номерами образцов, которые будут использоваться.
- Aliquot 45 мкл мастер-микса на каждую маркированную ПЦР пробои или колодец.
- Добавьте 5 мкл шаблона ДНК в мастер-микс в каждой ПЦР-трубке/пластинчатой скважине, чтобы получить общий объем 50 мкл. Измените наконечник пипетки для каждого образца ДНК, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
- Включите элемент управления без шаблона (NTC), используя сверхчистый H2O вместо ДНК.
- Закройте ПЦР-трубки/полоски или уплотнителивую пластину и перемешайте.
- Центрифугировать ПЦР-трубки/полоски/пластины в течение 20 с помощью настольной центрифуги.
ПРИМЕЧАНИЕ: Условия ПЦР, приведенные в этом протоколе, были оптимизированы с использованием ДНК-полимеразы и термического циклизатора ПЦР. В целом, условия ПЦР должны быть адаптированы к ДНК-полимеразе. Стандартное время расширения для ДНК-полимеразы Taq составляет 1 мин/кб. - Поместите пробирки/полоски/пластины в термоциклер и инкубируют реакции с использованием следующих условий (время растяжения ДНК-полимеразы): 1 цикл 95 °C в течение 2 мин; 25 циклов при 94 °C в течение 15 с, 60 °C в течение 15 с, 72 °C в течение 30 с; 1 цикл 72 °C в течение 10 мин.
- Когда программа будет завершена, извлеките продукты из термоциклера и храните при 4 °C в течение ночи или -20 °C до электрофореза.
4. Агарозовый гель электрофорез продуктов ПЦР
- Приготовьте 1,5% агарозный гель.
- Используйте 1,5 г порошка агарозы и смешайте его со 100 мл 1x буферного раствора Tris-acetate-EDTA (TAE) в колбе.
- Нагревайте смесь около 1,5-2 мин в микроволновой печи (600 Вт). Закрутите содержимое и снова нагрейте, при необходимости, чтобы полностью растворить агарозу. Слегка остудить и добавить 2 мкл ПекГрина к агарозе.
- Налейте гель в форму с помощью гребня с достаточным количеством колодцев для всех образцов и добавьте хотя бы один маркер молекулярной массы.
ВНИМАНИЕ: Может возникнуть задержка кипения. Тщательно встряхните колбу при повторном сусении агарозы, которая еще не растворена.
ПРИМЕЧАНИЕ: PeqGreen является нетоксичным красителем для обнаружения нуклеиновых кислот. Он применим для окрашивания двухцепочечной ДНК (dsDNA) и одноцепочечной ДНК (ssDNA), а также РНК. Чувствительность сравнима с бромидом этидия.
- Удалите продукты ПЦР с 4 °C и центрифугу в течение примерно 10 с.
- Загрузите в колодцы геля пробу 10 мкл. Не перегружайте гель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер ДНК-полимеразы также включает соединения, которые увеличивают плотность образца, так что образцы могут быть загружены непосредственно на гели без необходимости в нагрузочном красителе. Это позволяет образцу погружаться в колодец, а красители помогают отслеживать, как далеко мигрировал образец ДНК.- Добавьте стандарт молекулярной массы к фланковым скважинам (предпочтительно стандарт молекулярной массы 50 bp).
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните остаточные образцы ПЦР при -20 °C в случае, если электрофорез агарозного геля необходимо повторить.
- Добавьте стандарт молекулярной массы к фланковым скважинам (предпочтительно стандарт молекулярной массы 50 bp).
- Запускайте гель в 1x TAE, работающем буфере при 150 В (постоянное) в течение примерно 40 минут или до тех пор, пока нижняя желтая передняя часть красителя, которая движется со скоростью около 50 bp, не достигнет нижнего конца геля.
- Визульсируйте гель при нанесении синего или ультрафиолетового (УФ) света и запишите изображение для анализа длины фрагмента.
ВНИМАНИЕ: ультрафиолетовый свет может повредить ваши глаза и кожу. Всегда носите защитную одежду и защитные очки УФ-излучения при использовании УФ-светового короба. - Утилизируйте гель в соответствии с институциональной политикой в отношении опасных материалов.
5. Анализ результатов длины фрагмента
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте линейный регрессионный анализ для оценки длины фрагментов.
- Для оцифровки фрагментов ПЦР D1S80 поместите линейку на фотографию геля над стандартной полосой молекулярной массы 50 bp таким образом, чтобы верхняя часть линейки выровнялась с нижней частью скважины, в которую был загружен образец(рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для расчета уравнения линейной регрессии для стандарта молекулярной массы (стандарт молекулярной массы 50 бп) использовалась программа электронных таблиц. - Запишите расстояние от скважины (например, в см) для каждой полосы стандарта молекулярной массы 50 бп в таблице с помощью программы электронных таблиц(рисунок 2).
- Определите логарифм (например, основание 10) каждого размера фрагмента стандарта молекулярной массы 50 bp и введите значения журнала в таблицу(рисунок 2).
- Наведите каждую точку данных на график с логарифмом размеров полосы по вертикальной оси (оси Y) и измеренным расстоянием пробега от верхней части геля до каждой полосы стандарта молекулярной массы по горизонтальной оси (оси X) с помощью диаграммы рассеяния(рисунок 3).
- Подогнать линию тренда (линию линейной регрессии) и показать уравнение регрессии (y = ax + b) и значение R2 на графике(рисунок 4).
- Измерьте расстояние миграции (например, в см) для каждого ампликона D1S80 (рисунок 5).
- Оцените размер каждого ампликона D1S80 с помощью уравнения регрессии: y = ax + b
где y = журнал размера фрагмента
a = наклон линии (вычисляется в точке 5)
x = расстояние от скважины (в см)
b = точка, в которой линия регрессии перехватывает ось Y (вычисляется в точке 5)
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку значение y представляет собой логарифм размера фрагмента, антилог (10y)должен быть рассчитан для получения размера фрагмента в bp ампликонов D1S80.
6. Оценка количества повторяющихся единиц в аллелях имитируемых лиц
ПРИМЕЧАНИЕ: Длина блока повтора D1S80 составляет 16 бит/с. Самый маленький известный аллель для D1S80 имеет 14 повторов. Описанная здесь схема ампликона производит ампликоны с фланговыми областями, складывающими дополнительные 145 bp к конечному размеру.
- Используйте таблицу 1, чтобы оценить, сколько повторяющихся единиц содержится в каждом фрагменте ПЦР. Размер, экстраполированный с помощью линейной регрессии, должен быть в пределах 8 bp от любого конкретного аллеля.
- Запишите генотип каждой иституемой особи в виде комбинации чисел размера аллеля.
Representative Results
Используя описанный протокол, был проведен анализ маркера D1S80 VNTR на геномной ДНК человека, извлеченной из эпителиальных клеток слизистой оболочки щечки, собранных путем забора мазка(рисунок 6). После амплификации с помощью ПЦР типичное представление агарозного геля, содержащего ампликоны D1S80, показано на рисунке 1. Полоса 1 показывает стандарт молекулярной массы 50 bp. Рядом со стандартом молекулярной массы визуализируются продукты ПЦР из восьми образцов учащихся. Полоса 10 показывает NTC, в котором вода использовалась вместо шаблонной ДНК. Большинство проанализированных образцов четко отображают две полосы, представляющие людей, гетерозиготных для локуса D1S80. Lane 2 и Lane 9 показывают одну группу, представляющую людей, гомозиготных для локуса D1S80. Lane 5 показывает неоднозначную одиночную группу, которая намного шире по сравнению с другими группами. Это может быть результатом того, что два аллеля D1S80 различаются только одним повторяющимся блоком. Для дальнейшего анализа образец в полосе 5 будет рассматриваться как единая полоса, представляющая гомозиготную особь.
Последующий анализ фрагментов электрофореза геля, выполненный на проверенных продуктах ПЦР, был использован для вызова размера локуса D1S80 VNTR различных образцов студентов. Интерпретация размеров ампликонов, полученных с помощью ПЦР-анализа, опирается на используемый стандарт молекулярной массы. Расстояние от скважины для каждой полосы стандарта молекулярной массы измеряли(рисунок 1)и регистрировали(рисунок 2). На основе размера и расстояния миграции размер отдельных полос может быть рассчитан с помощью линейного регрессионного анализа. Логарифм (основание 10) определяли для каждой полосы в студенческих выборках(рисунок 5),а соответствующий антилог представляет собой число bp для каждого ампликона. Количество повторяющихся единиц может быть рассчитано в соответствии с полученным размером ампликона(таблица 2).
Для каждой выборки студента размеры ампликонов рассчитывались методом линейной регрессии, и каждая полоса могла быть легко назначена определенному аллеле, как показано в таблице 2. Информация о размерах аллелей D1S80 может быть использована для определения частот аллелей среди небольшой популяции студентов бакалавриата. 28-повторный аллель является наиболее частым среди студентов из-за двух гомозиготных индивидуумов для этого повторного аллеля (лица 1 и 4). Вторым наиболее частым аллелем является 18-повторный аллель, который переносится гомозиготной особью 8 и гетерозиготной особью 6. Низкочастотные аллели представляют собой 21-, 26- и 30-повторные аллели, встречающиеся только один раз у лиц 6, 5 и 3 соответственно. Паттерны частоты аллелей локуса D1S80 VNTR небольшой студенческой популяции можно дополнительно сравнить с частотой аллелей более крупных человеческих популяций, например популяций, происходящих с разных континентов4,7,8,9,10.
Среди студентов люди 2 и 3 разделяют 24-повторный аллель, люди 2 и 7 разделяют 20-повторный аллель и люди 5 и 7 разделяют 23-повторный аллель. Интересно, что две гомозиготные особи D1S80 (особи 1 и 4) разделяют 28-повторный аллель. Совпадение аллелей между двумя людьми может указывать на потенциальную родство. Однако общие аллели также могут возникать случайно. Таким образом, крайне важно определить вероятность совпадения аллелей между двумя особями. Вероятность зависит от частоты аллелей отдельных аллелей в общей популяции, и статистические подходы должны использоваться для придания статистического веса анализу маркеров VNTR, такому как байесовский подход. Таким образом, представленный метод дактилоскопии может быть использован в практических занятиях по обучению использованию VNTR в ДНК-дактилоскопии и его применению в биологической науке.
Рисунок 1:Изображение агарозного геля после электрофореза продуктов амплификации D1S80 с линейкой, размещенной рядом со стандартной полосой молекулярной массы 50 bp. Полоса 1 содержит стандарт молекулярной массы 50 bp, в то время как полосы 2-9 содержат продукты реакции ПЦР. Полоса 10 содержит элемент управления без шаблона (NTC). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Определение расстояния миграции фрагмента ДНК и логарифм каждого фрагмента размером 50 bp молекулярного стандарта. Регистрируется расстояние от скважины (в см) для каждой полосы стандарта молекулярной массы 50 бп и определяется логарифм (основание 10) для каждого фрагмента. Значения вводятся в таблицу с помощью программы для работы с электронными таблицами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Диаграмма рассеяния, полученная путем построения графика расстояния миграции фрагмента ДНК стандарта молекулярной массы по оси X против логарифма (основание 10) размера каждого фрагмента по оси Y. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Использование линии линейной регрессии и уравнения регрессии, а также значения R2 для данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Определение размера ампликонов D1S80. Расстояние от скважины для каждого фрагмента вводится в уравнение регрессии. Антилог y-значения представляет размер фрагмента в bp. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6:Предлагаемая временная шкала и рабочий процесс для анализа D1S80 VNTR. Вся процедура анализа D1S80 VNTR, представленная здесь, от сбора эпителиальных клеток щечковой эпителии до оценки длины фрагмента, может быть завершена в течение одного рабочего дня. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Размер аллеля (в bp) | Количество повторов |
| 369 | 14 |
| 385 | 15 |
| 401 | 16 |
| 417 | 17 |
| 433 | 18 |
| 449 | 19 |
| 465 | 20 |
| 481 | 21 |
| 497 | 22 |
| 513 | 23 |
| 529 | 24 |
| 545 | 25 |
| 561 | 26 |
| 577 | 27 |
| 593 | 28 |
| 609 | 29 |
| 625 | 30 |
| 641 | 31 |
| 657 | 32 |
| 673 | 33 |
| 689 | 34 |
| 705 | 35 |
| 721 | 36 |
| 737 | 37 |
| 753 | 38 |
| 769 | 39 |
| 785 | 40 |
| 801 | 41 |
Таблица 1: Размер ампликона для каждого локуса D1S80 VNTR.
| индивидуальный | аллель | Расстояние (в см) | Размер (в бп) | Количество повторяющихся блоков |
| 1 | Гомозиготном | 5 | 600 | 28 |
| 2 | гетерозиготные | 5.2 ; 5.5 | 535, 458 | 24, 20 |
| 3 | гетерозиготные | 4.9 ; 5.2 | 626, 535 | 30, 24 |
| 4 | Гомозиготном | 5 | 600 | 28 |
| 5 | гетерозиготные | 5.1 ; 5.3 | 564, 508 | 26, 23 |
| 6 | гетерозиготные | 5.4 ; 5.6 | 483, 435 | 21, 18 |
| 7 | гетерозиготные | 5.3 ; 5.5 | 508, 458 | 23, 20 |
| 8 | Гомозиготном | 5.6 | 435 | 18 |
Таблица 2: Аллельный состав различных истируемых особей. Число повторяющихся единиц может быть аппроксимировано в соответствии с размером ампликона, полученным методом линейного регрессионного анализа.
Discussion
Здесь мы описали простой и экономичный метод внедрения молекулярной дактилоскопии на практических занятиях бакалавриата.
Для скрининга генетической изменчивости в локусе D1S80 требуется сбор биологических образцов человека вместе с извлечением и анализом ДНК. Важно, чтобы этичное использование биологических образцов человека обеспечивалось на протяжении всего процесса. Управление образцами контролируется в рамках всеобъемлющей нормативной базы, которая обеспечивает правильное использование образцов и связанных с ними данных18 (например, согласие на использование биологического материала человека). Участники должны быть должным образом проинформированы об использовании своих образцов, риске обнаружения аномалий в генетических отношениях (например, для связанных лиц), защите конфиденциальности и намерениях для будущего хранения биологических образцов и данных. Все доноры (студенты или коллеги) должны давать согласие свободно и понимать право на выход без причины. В общем, необходимо ознакомиться с соответствующими руководящими принципами и правилами по управлению образцами человека, прежде чем проводить этот лабораторный класс.
Для сбора эпителиальных клеток слизистой оболочки щечки на лабораторных курсах бакалавриата необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать загрязнения образцов ДНК ДНК от оператора или ДНКазами. Рекомендуется всегда использовать лабораторные халаты, перчатки и защитные очки, а также стерильные тампоны и микроцентрифужные трубки. Сбор клеток на основе буккального тампона считается удобным и экономически эффективным методом сбора генетического материала, подходящим для анализа ВНТР на основе ПЦР, поскольку он является относительно недорогим и неинвазивным. Помимо буккальных тампонов, слюна является наиболее распространенным методом перорального отбора проб для медицинских исследований. Показано, что щечковые тампоны содержат более высокую долю эпителиальных клеток, чем слюна, что делает их более надежными в обеспечении достаточного количества и качества ДНК для анализа D1S80 VNTR наоснове ПЦР 19,20. Кроме того, буккальные мазки могут быть отправлены по почте после самостоятельного сбора, преодолевая географические препятствия при использовании, например, в исследованиях разнообразия населения21.
Извлечение ДНК стало относительно легким благодаря разработке наборов для экстракции от разных компаний. Тем не менее, использование этих наборов может не подходить в лабораторных классах из-за ограниченных финансовых ресурсов. Здесь мы представили простой, быстрый и экономичный метод извлечения ДНК из образцов человека без необходимости коммерчески доступного набора для экстракции ДНК. Описанный способ экстракции ДНК не использует органические растворители, вместо этого клеточные белки удаляют путем увеличения концентрации соли с использованием раствора ацетата калия 8 М. Этот метод также позволяет обрабатывать несколько образцов одновременно и дает достаточно ДНК для нескольких анализов генотипа для каждого образца.
ПЦР является распространенным методом во многих молекулярных лабораториях. Хотя в целом они не имеют проблем, существуют подводные камни, которые могут усложнить реакцию, дающую ложные результаты, которые обсуждались в другом месте22. Условия ПЦР, представленные здесь, оказались очень надежными в условиях плохого качества ДНК шаблона, но отсутствие амплификации ПЦР, тем не менее, иногда наблюдалось при использовании шаблонов с чрезвычайно низкими концентрациями ДНК из-за плохого сбора эпителиальных клеток щеки. Праймеры ДНК, используемые в этом исследовании, могут быть заказаны у разных компаний, таких как те, которые приведены в таблице материалов в конце этой статьи. Особую осторожность необходимо соблюдать при работе с ДНК-праймерами, чтобы избежать заражения ДНКазами или ДНК от оператора. Продукты ПЦР также следует хранить в холодном месте, когда они не используются.
Другим важным этапом является электрофорез агарозного геля. Фрагменты, отличающиеся только одной повторяющейся единицей 16 bp, не могут быть разделены в гелевом электрофорезе и, таким образом, выглядеть как единая полоса. В этом случае надлежащее определение количества повторяющихся единиц тестируемых аллелей D1S80 не может быть гарантировано. Поэтому время работы геля должно быть увеличено, в то время как напряжение должно быть уменьшено, а концентрация геля может быть увеличена, чтобы обеспечить лучшее разрешение и разделение отдельных полос.
Стоит отметить, что не все аллели для локуса VNTR содержат полные повторяющиеся единицы. Неконсенсусные аллели (микроварианты), содержащие неполные повторяющиеся единицы, распространены в большинстве локусов VNTR, и их размеры находятся между размерами аллелей с полными повторяющимися единицами. Эти микроварианты едва обнаруживаются электрофорезом агарозного геля. Напротив, такие методы, как полиакриламидные гели или капиллярный электрофорез, могут разрешать аллели, которые отличаются от одной до нескольких повторяющихся единиц или микровариантов12,23,24,25,26. Однако последние методы менее подходят для лабораторных занятий бакалавриата, поскольку они имеют много недостатков, включая использование опасных соединений, сложную подготовку и отсутствие оборудования. Для определения размера фрагмента необходимо соблюдать особую осторожность при измерении расстояния до мигрирующих фрагментов ДНК. Если полосы слишком диффузны для точного измерения, расчет размера фрагмента аллеля D1S80 методом линейной регрессии может быть неправильным, что приводит к неправильной оценке повторяющихся номеров единиц. В этом случае рекомендуется повторный запуск электрофореза агарозного геля после оптимизации состояния геля, как описано ранее Лоренцем и его коллегами22.
Вся процедура анализа D1S80 VNTR, представленная здесь, от сбора эпителиальных клеток щечковой до оценки длины фрагмента, может быть завершена за один рабочий день. Этот протокол является надежным, экономически эффективным и простым в использовании методом, подходящим для практических лабораторных занятий бакалавриата.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Кевина Грэма за его голос за кадром и всех участников, которые пожертвовали образцы для этой работы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72,706 | autoclaved |
| 2 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 7,26,95,500 | autoclaved |
| 2-propanol | Fisher chemical | PI7508/17 | |
| 5x PCR buffer | Promega | M7845 | |
| Acetic acid | Sigma/Merck | A6283-500ML | |
| Agarose | BioBudget | 10-35-1020 | |
| Buccal swabs | BioBudget | 57-BS-05-600 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Combs | BioRad | ||
| dNTPs (10 mM) | Invitrogen | R0192 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.1 | |
| Ethanol | Honeywell | 32221-2.5L | |
| Gel caster | BioRad | ||
| Gel chamber | BioRad | SubCell GT | |
| Gel Doc XR+ | BioRad | ||
| Geltray | BioRad | SubCell GT | |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0371 | |
| Go-Taq Polymerase | Promega | M7845 | |
| Heating block | Eppendorf | Thermomixer | 1.5 mL and 2 mL |
| Microwave | Sharp | R-941STW | |
| peqGreen | VWR | 732-3196 | |
| Pipettes | Gilson | 1000 µL, 200 µL, 20 µL, 2 µL | |
| Potassium acetate | Arcos Organics | 217100010 | |
| PowerPac power supply | BioRad | 100-120/220-240V | |
| Primers | Sigma/Merck | ||
| Scale | Kern | PCB 2.5 kg | |
| SDS | Arcos Organics | 218591000 | |
| Shaker | IKA labortechnik | IKA RH basic | |
| Tabletop centrifuge | myFuge | ||
| Thermal Cycler | BioRad | C100 Touch | |
| Tris | VWR | 103156x | |
| Vortex mixer | LMS | VTX-3000L |
References
- Jeffreys, A. J., Wilson, V., Thein, S. L. Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA. Nature. 314 (6006), 67-73 (1985).
- Kasai, K., Nakamura, Y., White, R. Amplification of a variable number of tandem repeats (VNTR) locus (pMCT118) by the polymerase chain reaction (PCR) and its application to forensic science. Journal of Forensic Science. 35 (5), 1196-1200 (1990).
- Balamurugan, K., Tracey, M. L., Heine, U., Maha, G. C., Duncan, G. T. Mutation at the human D1S80 minisatellite locus. The Scientific World Journal. 2012 (917235), (2012).
- Herrera, R. J., Adrien, L. R., Ruiz, L. M., Sanabria, N. Y., Duncan, G. D1S80 single-locus discrimination among African populations. Human Biology. 76 (1), 87-108 (2004).
- Lauritzen, S. L., Mazumder, A. Informativeness of genetic markers for forensic inference - An information theoretic approach. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 1 (1), 652-653 (2008).
- Budowle, B., Chakraborty, R., Giusti, A. M., Eisenberg, A. J., Allen, R. C. Analysis of the VNTR locus D1S80 by the PCR followed by high-resolution PAGE. American Journal of Human Genetics. 48 (1), 137 (1991).
- Budowle, B., et al. D1S80 population data in African Americans, Caucasians, southeastern Hispanics, southwestern Hispanics, and Orientals. Journal of Forensic Science. 40 (1), 38-44 (1995).
- Verbenko, D. A., et al. Polymorphisms at locus D1S80 and other hypervariable regions in the analysis of Eastern European ethnic group relationships. Annals of Human Biology. 33 (5-6), 570-584 (2006).
- Walsh, S. J., Eckhoff, C. Australian Aboriginal population genetics at the D1S80 VNTR locus. Annals of Human Biology. 34 (5), 557-565 (2007).
- Limborska, S. A., Khrunin, A. V., Flegontova, O. V., Tasitz, V. A., Verbenko, D. A. Specificity of genetic diversity in D1S80 revealed by SNP-VNTR haplotyping. Annals of Human Biology. 38 (5), 564-569 (2011).
- Sajib, A. A., Yeasmin, S., Akter, M., Uddin, M. A., Akhteruzzaman, S. Phylogenetic analysis of Bangladeshi population with reference to D1S80 VNTR locus. Bioresearch Communications. 2 (1), 146-151 (2016).
- Köseler, A., Atalay, A., Atalay, E. Ö Allele frequency of VNTR locus D1S80 observed in Denizli province of Turkey. Biochemical genetics. 47 (7-8), 540-546 (2009).
- Mastana, S. S., Papiha, S. S. D1S80 distribution in world populations with new data from the UK and the Indian sub-continent. Annals of Human Biology. 28 (3), 308-318 (2001).
- Okuda, H., et al. A Japanese propositus with D-- phenotype characterized by the deletion of both the RHCE gene and D1S80 locus situated in chromosome 1p and the existence of a new CE-D-CE hybrid gene. Journal of Human Genetics. 45 (3), 142-153 (2000).
- Campbell, A. M., Williamson, J. H., Padula, D., Sundby, S. Use PCR & a Single Hair to Produce a "DNA Fingerprint.". The American Biology Teacher. 59 (3), 172-178 (1997).
- Jackson, D. D., Abbey, C. S., Nugent, D. DNA profiling of the D1S80 locus: A forensic analysis for the undergraduate biochemistry laboratory. Journal of Chemical Education. 83 (5), 774 (2006).
- Mansoor, S. K., Hussein, E. F., Ibraheem, A. K. Use the Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) in DNA fingerprinting and its application biological sciences. EurAsian Journal of BioSciences. 14 (2), 2835-2839 (2020).
- Beier, K., Schnorrer, S., Hoppe, N., Lenk, C. The ethical and legal regulation of human tissue and biobank research in Europe. Proceedings of the Tiss. EU Project. , Universitätsverlag Göttingen. (2011).
- Aida, J., et al. Telomere length variations in 6 mucosal cell types of gastric tissue observed using a novel quantitative fluorescence in situ hybridization method. Human Pathology. 38 (8), 1192-1200 (2007).
- Theda, C., et al. Quantitation of the cellular content of saliva and buccal swab samples. Scientific Reports. 8 (1), 1-8 (2018).
- McMichael, G. L., et al. DNA from buccal swabs suitable for high-throughput SNP multiplex analysis. Journal of biomolecular techniques: JBT. 20 (5), 232 (2009).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Destro-Bisol, G., Capelli, C., Belledi, M. Inferring microevolutionary patterns from allele-size frequency distributions of minisatellite loci: a worldwide study of the APOB 3'hypervariable region polymorphism. Human Biology. 72 (5), 733-751 (2000).
- Chen, B., et al. Structure and function of alleles in the 3'end region of human apoB gene. Chinese Medical Journal. 112 (3), 221-223 (1999).
- Renges, H. -H., Peacock, K., Dunning, A. M., Talmud, P., Humphries, S. E. Genetic relationship between the 3 '-VNTR and diallelic apolipoprotein B gene polymorphisms: Haplotype analysis in individuals of European and South Asian origin. Annals of Human Genetics. 56 (1), 11-33 (1992).
- Kravchenko, S. A., Maliarchuk, O. S., Livshits, L. A. A population genetics study of the allelic polymorphism in the hypervariable region of the apolipoprotein B gene in the population of different regions of Ukraine. Tsitologiia i Genetika. 30 (5), 35-41 (1996).
