Summary
Aquí describimos un protocolo simple para generar perfiles de huellas dactilares de ADN mediante la amplificación del locus VNTR D1S80 de ADN de células epiteliales.
Abstract
En ciencias biológicas, las huellas dactilares de ADN se han utilizado ampliamente para pruebas de paternidad, aplicaciones forenses y estudios filogenéticos. Aquí, se describe un método confiable y robusto para genotipado de individuos por número variable de repetición en tándem (VNTR) análisis en el contexto de las clases de laboratorio de pregrado. El locus VNTR D1S80 humano se utiliza en este protocolo como un marcador altamente polimórfico basado en la variación en el número de secuencias repetitivas.
Este sencillo protocolo transmite información útil para los profesores y la implementación de huellas dactilares de ADN en clases prácticas de laboratorio. En el actual ejercicio de laboratorio, la extracción de la DNA seguida por la amplificación de la polimerización en cadena se utiliza para determinar la variación genética en el lugar geométrico de VNTR D1S80. Las diferencias en el tamaño del fragmento de los productos de PCR se visualizan por electroforesis en gel de agarosa. Los tamaños de fragmento y los números de repetición se calculan en función de una regresión lineal del tamaño y la distancia de migración de un estándar de tamaño de ADN.
Siguiendo esta guía, los estudiantes deben ser capaces de:
• Cosechar y extraer ADN de las células epiteliales de la mucosa bucal
• Realizar un experimento de PCR y comprender la función de los diversos componentes de la reacción
• Analizar los amplicones por electroforesis en gel de agarosa e interpretar los resultados
• Comprender el uso de VNTRs en la toma de huellas dactilares de ADN y su aplicación en ciencias biológicas
Introduction
La huella molecular, también conocida como huellas dactilares de ADN, fue introducida por Sir Alec Jeffreys mientras trabajaba en el Departamento de Genética de la Universidad de Leicester en 19841. Se basa en el 0,1% del genoma humano que difiere entre los individuos y se compone de aproximadamente tres millones de variantes. Estas diferencias únicas en el genotipo permiten la diferenciación entre los individuos y por lo tanto pueden funcionar como huella genética a excepción de gemelos monocigóticos. En consecuencia, la huella dactilar de ADN se utiliza para la estimación de la relación de diferentes individuos que se aplica, por ejemplo, en las pruebas de paternidad o en los estudios de diversidad de poblaciones. En nuestras clases de laboratorio nos propusimos transmitir el concepto de huellas dactilares de ADN y frecuencias de alelos. El método descrito aquí demuestra un método confiable y robusto para la huella genética mediante el análisis del número variable de repeticiones en tándem (VNTR) en el lugar geométrico D1S80. El método comprende la extracción de ADN de las células epiteliales de la mucosa bucal y la posterior reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar el lugar geométrico D1S80, seguido de la visualización de las diferencias de longitud de fragmento en un gel de agarosa.
El lugar geométrico del minisatellite D1S80 VNTR es altamente variable y situado en la región telomeric del cromosoma 1 (1p36-p35). Fue identificado y descrito por Karsai y sus colaboradores en 1990 como un locus con una unidad de repetición central de 16 pb, lo que permite la separación de alelos que difieren en una sola unidad2. Además, D1S80 muestra un alto grado de variación con una tasa de mutación de aproximadamente 7,77 x 10-53. D1S80 tiene un alto grado de heterocigoto4,5 (por ejemplo, 80,8% de heterocigoto para los caucásicos6 y hasta un 87% de heterocigoto para los afroamericanos7). Además, el locus D1S80 es polimórfico en la mayoría de las poblaciones, con típicamente más de 15 alelos diferentes que llevan de 14 a 41 repeticiones cada uno. La frecuencia de los alelos D1S80 varía entre las poblaciones. El alelo con 24 unidades de repetición (alelo 24) es más frecuente en poblaciones europeas y asiáticas, mientras que el alelo 21 es más común en poblaciones africanas4,7,8,9,10. En consecuencia, las distribuciones de frecuencia de los alelos son diagnósticas para diferentes poblaciones humanas y deben tenerse en cuenta para la estimación de la relación (por ejemplo, en las pruebas de paternidad).
La amplificación basada en PCR del locus VNTR D1S80 ha sido un método muy útil en la ciencia forense, pruebas de paternidad, análisis de enfermedades y estudios de diversidad de poblaciones11,12,13,14. Mientras que en la medicina forense hoy en día el uso de VNTRs ha sido reemplazado por repeticiones cortas en tándem, el locus VNTR D1S80 es ampliamente utilizado en la determinación de orígenes y relaciones genéticas entre y entre poblaciones4,8,9,11. Además, se utiliza a menudo para enseñar las huellas dactilares de ADN en las clases prácticas de laboratorio15,16. El método descrito aquí representa un método robusto, rentable y fácil de usar con una tasa de éxito muy alta en las clases de laboratorio de pregrado. El propósito de este artículo es proporcionar una descripción del flujo de trabajo para el análisis molecular del lugar geométrico humano del minisatellite D1S80 de las células epiteliales bucales de la mucosa. Incluye demostración de técnicas, protocolos simplificados y sugerencias prácticas descritas en trabajos previamente publicados2,17.
Protocol
NOTA: Este protocolo sólo debe ser utilizado si los estudiantes o tutores legales respectivos estuvieron de acuerdo con la conductancia de este protocolo, ya que los perfiles genotípicos dan información sobre las relaciones genéticas. La huella digital del ADN es un método común de biología molecular aplicado principalmente a estudios de población y asuntos forenses. Por lo tanto, se debe prestar atención a mantener los riesgos de contaminación lo más bajos posible. Para evitar la contaminación de la muestra con ADN de una fuente externa o DNases, se deben usar guantes, los instrumentos deben limpiarse o esterilizarse a fondo y las soluciones deben esterilizarse por filtro o autoclavarse antes de su uso.
1. Cosecha de células epiteliales de la mucosa bucal
PRECAUCIÓN: El trabajo con saliva y células epiteliales puede conducir a una transmisión de enfermedades infecciosas. Por lo tanto, se deben aplicar precauciones estándar y basadas en la transmisión (por ejemplo, el uso de equipos de protección personal apropiados).
NOTA: Incluya un control positivo, que es proporcionado por el instructor (por ejemplo, ADN extraído por el instructor) e incluido en los pasos de procesamiento aguas abajo.
- Espere al menos 1 h después de comer o cepillarse los dientes antes de la recolección de la muestra.
- Etiquete un tubo de microcentrífuga vacío y estéril de 2,0 mL.
- Retire un hisopo bucal estéril del envase y frote vigorosamente en el interior de la mejilla durante 30-40 veces o 30-40 segundos para cosechar las células epiteliales de la mucosa bucal.
- Coloque la punta del hisopo de recolección en el tubo de microcentrífuga estéril previamente etiquetado y rompa la longitud del plástico que se extiende más allá del borde, ya sea a mano o usando tijeras estériles.
- Coloque la tapa de forma segura sobre el tubo, sellando el hisopo de recolección en el interior.
2. Extracción de ADN genómico de células humanas
- Antes de la extracción, ajuste un mezclador térmico o un bloque de calentamiento a 65 °C para la lisis de la muestra.
PRECAUCIÓN: Algunos productos químicos utilizados se clasifican como peligrosos. Lea cuidadosamente la hoja de datos de seguridad y tome las medidas de seguridad adecuadas antes de manipular.- Preparar y esterilizar filtrando o autoclavando todos los tampones y soluciones requeridos (solución de lisis, acetato de potasio 8 M, 2-propanol, etanol al 70% y tampón de elución).
NOTA: Todos los pasos de centrifugación deben realizarse a temperatura ambiente (20-30 °C) a menos que se especifique.
- Preparar y esterilizar filtrando o autoclavando todos los tampones y soluciones requeridos (solución de lisis, acetato de potasio 8 M, 2-propanol, etanol al 70% y tampón de elución).
- Añadir 500 μL de solución de lisis (50 mM Tris/HCl, pH 8,0; 10 mM de ácido etilendiamina tetra-acético (EDTA); 2% de dodecil sulfato de sodio (SDS)) al hisopo bucal, asegurándose de que la muestra esté completamente sumergida en la solución de lisis.
- Vórtice vigorosamente durante al menos 5 s.
- Incubar muestras a 65 °C en una batidora térmica durante 10 min.
- Mezclar la muestra 3-4 veces por pulso-vórtice durante 5 s durante la incubación.
- Retire el hisopo del tampón de lisis, presione el hisopo contra el interior del tubo para obtener el máximo volumen de muestra.
- Añadir 100 μL de acetato de potasio de 8 M a las células lisadas.
- Mezcle bien invirtiendo el tubo hasta que haya un precipitado blanco.
- Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
- Centrifugar la muestra durante 5 min a 18.000 x g.
- Transferir 450 μL del sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio y estéril de 1,5 mL.
- Añadir 450 μL de 2-propanol y mezclar bien invirtiendo el tubo (precipitación del ADN).
- Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
- Centrífuga durante 5 min a 18.000 x g.
- Deseche el sobrenadante e invierta el tubo en una toalla de papel limpia para secar el pellet y evitar la contaminación cruzada.
- Incubar el ADN durante 5 min a 65 °C en un bloque de calentamiento para secar el pellet por completo.
- Para lavar el ADN, añadir 500 μL de etanol al 70%.
- Centrífuga durante 1 min a 18.000 x g.
- Deseche el sobrenadante e invierta el tubo en una toalla de papel limpia para secar el pellet.
- Añadir 30 μL de tampón de resuspensión (10 mM Tris/HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) al pellet.
- Incubar el ADN durante 10 min a 65 °C en un bloque de calentamiento para inactivar las ADN.
3. Amplificación del locus VNTR D1S80 mediante PCR
NOTA: Registre el número de muestras que se utilizarán y prepare una hoja de trabajo con los reactivos requeridos y sus volúmenes antes de recolectar los plásticos y otros materiales necesarios. Etiquete los tubos/tiras/placas estériles que se utilizarán para la PCR con números de muestra. Recuerde incluir un control negativo usando H2O en lugar de ADN y un control positivo (por ejemplo, usando el ADN proporcionado por el instructor) para validar la PCR.
- Preparar la mezcla maestra de PCR 1x que contenga 10 μL de tampón de reacción de PCR 5x (que contiene 15 mM MgCl2),1 μL de trifosfato de desoxirribonucleótido (dNTPs) (10 mM), 5 μL (10 pmol) de cada cebador pMCT118-f y pMCT118-r (adelante - 5'-GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG-3', inversa - 5'-GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC-3') según Kasai et al.2,23,8 μL de ultrapuroH2O, y 0,2 μL de ADN polimerasa Taq (5 U/μL).
NOTA: Los cebadores pMCT118-f/pMCT118-r se diseñaron en las regiones de flanqueo de la región VNTR D1S80 amplificando todo el locus. - Etiquete los tubos/tiras/placas de PCR con los números de muestra a utilizar.
- Alícuota 45 μL de la mezcla maestra a cada tubo de muestra de PCR etiquetado o pozo.
- Agregue 5 μL de la plantilla de ADN a la mezcla maestra en cada tubo/plato de PCR para adquirir un volumen total de 50 μL. Cambie la punta de la pipeta para cada muestra de ADN para evitar la contaminación cruzada.
- Incluya un control sin plantilla (NTC) utilizandoH2O ultrapuro en lugar de ADN.
- Cierre los tubos/tiras de PCR o la placa de sellado y mezcle.
- Centrifugar los tubos/tiras/placas de PCR durante 20 s utilizando una centrífuga de sobremesa.
NOTA: Las condiciones de PCR dadas en este protocolo se optimizaron utilizando la ADN polimerasa y el ciclador térmico de PCR utilizado. En general, las condiciones de PCR deben adaptarse a la ADN polimerasa. El tiempo de extensión estándar para una ADN polimerasa Taq es de 1 min/kb. - Colocar los tubos/tiras/placa de la muestra en el termociclador e incubar las reacciones utilizando las siguientes condiciones (tiempo de extensión de la ADN polimerasa): 1 ciclo de 95 °C durante 2 min; 25 ciclos de 94 °C para 15 s, 60 °C para 15 s, 72 °C para 30 s; 1 ciclo de 72 °C durante 10 min.
- Cuando se complete el programa, retire los productos del termociclador y guárdelos a 4 °C durante la noche o -20 °C hasta la electroforesis.
4. Electroforesis en gel de agarosa de productos de PCR
- Prepare un gel de agarosa al 1,5%.
- Utilizar 1,5 g de polvo de agarosa y mezclarlo con 100 mL de 1x solución tampón Tris-acetato-EDTA (TAE) en un matraz.
- Calentar la mezcla durante aproximadamente 1,5-2 min en un horno microondas (600 W). Gire el contenido y vuelva a calentar, si es necesario, para disolver completamente la agarosa. Enfriar ligeramente y añadir 2 μL de PeqGreen a la agarosa.
- Vierta el gel en forma de peine con suficientes pozos para todas las muestras y agregue al menos un marcador de peso molecular.
PRECAUCIÓN: Puede ocurrir retraso en ebullición. Agite el matraz con cuidado al reponer la agarosa que aún no se ha disuelto.
NOTA: PeqGreen es un colorante no tóxico para la detección de ácidos nucleicos. Es aplicable para la tinción de ADN de doble cadena (dsDNA) y ADN monocatenario (ssDNA), así como ARN. La sensibilidad es comparable al bromuro de etidio.
- Retire los productos de PCR de 4 °C y la centrífuga durante aproximadamente 10 s.
- Cargue los pozos del gel con una muestra de 10 μL. No sobrecargue el gel.
NOTA: El tampón de adn polimerasa también incluye compuestos que aumentan la densidad de la muestra para que las muestras se puedan cargar directamente en geles sin la necesidad de un tinte de carga. Esto permite que la muestra se hunda en el pozo y los tintes ayudan a rastrear qué tan lejos ha migrado la muestra de ADN.- Agregue un estándar de peso molecular a los pozos de flanqueo (preferiblemente un estándar de peso molecular de 50 pb).
NOTA: Almacene las muestras residuales de PCR a -20 °C en caso de que la electroforesis en gel de agarosa tenga que repetirse.
- Agregue un estándar de peso molecular a los pozos de flanqueo (preferiblemente un estándar de peso molecular de 50 pb).
- Ejecute el gel en 1x TAE corriendo el tampón a 150 V (constante) durante aproximadamente 40 min o hasta que el frente de tinte amarillo inferior que viaja a alrededor de 50 pb llegue al extremo inferior del gel.
- Muestre la imagen del gel mientras se aplica la luz azul o la luz ultravioleta (UV) y registre una imagen para el análisis de la longitud del fragmento.
PRECAUCIÓN: La luz UV puede dañar los ojos y la piel. Siempre use ropa protectora y gafas de seguridad UV cuando use una caja de luz UV. - Deseche el gel de acuerdo con la política institucional de materiales peligrosos.
5. Análisis de los resultados de la longitud del fragmento
Nota : utilice el análisis de regresión lineal para estimar las longitudes de los fragmentos.
- Para dimensionar los fragmentos de PCR D1S80, coloque una regla en la fotografía en gel sobre el carril estándar de peso molecular de 50 pb de modo que la parte superior de la regla se alore con la parte inferior del pozo en el que se cargó la muestra (Figura 1).
NOTA: Para calcular la ecuación de regresión lineal para el estándar de peso molecular (estándar de peso molecular de 50 pb) se utilizó un programa de hoja de cálculo. - Registre la distancia desde el pozo (por ejemplo, en cm) para cada banda del estándar de peso molecular de 50 pb en una tabla utilizando un programa de hoja de cálculo (Figura 2).
- Determine el logaritmo (por ejemplo, base 10) de cada tamaño de fragmento del estándar de peso molecular de 50 pb e introduzca los valores logarítmico en la tabla (Figura 2).
- Trace cada punto de datos en una gráfica con el logaritmo de los tamaños de banda en el eje vertical (eje y) y la distancia de carrera medida desde la parte superior del gel hasta cada banda del estándar de peso molecular en el eje horizontal (eje x) utilizando una gráfica de dispersión (Figura 3).
- Ajuste una línea de tendencia (línea de regresión lineal) y muestre la ecuación de regresión (y = ax + b) y el valor de R2 en el gráfico (Figura 4).
- Mida la distancia migrada (por ejemplo, en cm) para cada amplicon D1S80 (Figura 5).
- Estime el tamaño de cada amplicon D1S80 utilizando la ecuación de regresión: y = ax + b
donde y = el registro del tamaño del fragmento
a = la pendiente de la línea (calculada en el punto 5)
x = la distancia desde el pozo (en cm)
b = el punto donde la línea de regresión intercepta el eje Y (calculado en el punto 5)
Nota : puesto que el valor y representa el registro del tamaño del fragmento, el antilog (10y) debe calcularse para obtener el tamaño del fragmento en bp de los amplicons D1S80.
6. Estimación del número de unidades de repetición en los alelos de los individuos ensayados
NOTA: La unidad de repetición D1S80 tiene una longitud de 16 pb. El alelo más pequeño conocido para D1S80 tiene 14 repeticiones. El esquema de amplicones descrito aquí produce amplicones con regiones de flanqueo que suman 145 pb adicionales al tamaño final.
- Utilice el cuadro 1 para estimar cuántas unidades de la repetición se contienen en cada fragmento PCR. El tamaño extrapolado usando la regresión linear debe estar dentro de 8 puntos de ebullición de cualquier alelo particular.
- Registre el genotipo de cada individuo probado como una combinación de números de tamaño de repetición de alelo.
Representative Results
Utilizando el protocolo descrito, se realizó el análisis de marcadores VNTR D1S80 en ADN genómico humano extraído de células epiteliales de la mucosa bucal recolectadas por muestreo de hisopos(Figura 6). Tras la amplificación mediante PCR, en la Figura 1se muestra una representación típica de un gel de agarosa que contiene los amplicones D1S80. El carril 1 muestra el estándar de peso molecular de 50 pb. Junto al estándar de peso molecular, se visualizan productos de PCR de ocho muestras de estudiantes. El carril 10 muestra el NTC en el que se usó agua en lugar de ADN de plantilla. La mayoría de las muestras analizadas muestran claramente dos bandas, que representan individuos heterocigotos para el locus D1S80. El carril 2 y el carril 9 muestran una sola banda que representa a individuos homocigóticos para el locus D1S80. El carril 5 está mostrando una sola banda ambigua que es mucho más amplia en comparación con las otras bandas. Esto podría ser el resultado de dos alelos D1S80 que difieren en una sola unidad de repetición. Para su posterior análisis, la muestra en el carril 5 se considerará como una sola banda, que representa a un individuo homocigótico.
El análisis rio abajo del fragmento de la electroforesis del gel realizado en los productos verificados de la polimerización en cadena fue utilizado para el tamaño que llama del lugar geométrico de D1S80 VNTR de diversas muestras del estudiante. La interpretación de los tamaños de los amplicones obtenidos por el análisis de PCR se basa en el estándar de peso molecular utilizado. Se midió la distancia desde el pozo para cada banda del estándar de peso molecular (Figura 1) y se registró (Figura 2). En función del tamaño y la distancia de migración, el tamaño de las bandas individuales se puede calcular mediante un análisis de regresión lineal. El log (base 10) se determinó para cada banda en las muestras de los estudiantes (Figura 5) y el antílogo respectivo representa el número de bp para cada amplicon. El número de unidades de repetición se puede calcular de acuerdo con el tamaño del amplicon obtenido (Tabla 2).
Para cada muestra de estudiante, los tamaños de los amplicones se calcularon por regresión lineal y cada banda se pudo asignar fácilmente a un alelo en particular, como se muestra en la Tabla 2. La información sobre los tamaños de los alelos D1S80 se puede utilizar para determinar las frecuencias de los alelos entre el pequeño subconjunto de la población de estudiantes de pregrado. El alelo de 28 repeticiones es el más frecuente entre los estudiantes debido a dos individuos homocigóticos para este alelo de repetición (individuos 1 y 4). El segundo alelo más frecuente es el alelo de la repetición 18, que es llevado por el individuo homocigótico 8 y por el individuo heterozigótico 6. Los alelos de baja frecuencia son los alelos de 21, 26 y 30 repeticiones que se encuentran solo una vez en los individuos 6, 5 y 3, respectivamente. Los patrones de frecuencia de alelos del locus VNTR D1S80 de la pequeña población estudiantil se pueden comparar además con la frecuencia de alelos de poblaciones humanas más grandes, por ejemplo poblaciones originarias de diferentes continentes4,7,8,9,10.
Entre los estudiantes, los individuos 2 y 3 comparten el alelo de la repetición 24, los individuos 2 y 7 comparten el alelo de la repetición 20 y los individuos 5 y 7 comparten el alelo de la repetición 23. Interesante, los dos individuos homocigóticos D1S80 (individuo 1 y 4) comparten el alelo de la repetición 28. El emparejamiento de alelos entre dos individuos puede indicar una posible relación. Sin embargo, los alelos compartidos también pueden ocurrir por casualidad. Por lo tanto, es crucial determinar la probabilidad de una coincidencia de alelos entre dos individuos. La probabilidad depende de la frecuencia de los alelos individuales en la población general y se deben emplear enfoques estadísticos para asignar un peso estadístico al análisis de marcadores VNTR, como el enfoque bayesiano. En resumen, el método de huellas dactilares presentado se puede utilizar en prácticas prácticas de clase para enseñar el uso de VNTRs en la huella digital de ADN y su aplicación en la ciencia biológica.
Figura 1: Representación de un gel de agarosa después de la electroforesis de los productos de amplificación D1S80 con una regla colocada al lado del carril estándar de peso molecular de 50 pb. El carril 1 contiene el estándar de peso molecular de 50 pb, mientras que los carriles 2-9 contienen productos de reacción por PCR. El carril 10 contiene el control sin plantilla (NTC). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2: Determinación de la distancia de migración del fragmento de ADN y logaritmo de cada tamaño de fragmento del estándar de peso molecular de 50 pb. Se registra la distancia desde el pozo (en cm) para cada banda del estándar de peso molecular de 50 pb y se determina el logaritmo (base 10) para cada fragmento. Los valores se introducen en una tabla mediante un programa de hoja de cálculo. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3: Gráfica de dispersión generada al trazar la distancia de migración del fragmento de ADN del estándar de peso molecular en el eje x contra el logaritmo (base 10) del tamaño de cada fragmento en el eje y. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 4:Explotación de la línea de regresión lineal y la ecuación de regresión, así como el valor R2 de los datos. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 5:Determinación del tamaño de los amplicones D1S80. La distancia desde el pozo para cada fragmento se introduce en la ecuación de regresión. El antilog del valor y representa el tamaño del fragmento en bp. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6:Línea de tiempo y flujo de trabajo sugeridos para el análisis VNTR D1S80. Todo el procedimiento de análisis VNTR D1S80 presentado aquí, desde la recolección de células epiteliales bucales hasta la evaluación de la longitud de los fragmentos, se puede completar en un solo día hábil. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
| Tamaño del alelo (en bp) | Número de repeticiones |
| 369 | 14 |
| 385 | 15 |
| 401 | 16 |
| 417 | 17 |
| 433 | 18 |
| 449 | 19 |
| 465 | 20 |
| 481 | 21 |
| 497 | 22 |
| 513 | 23 |
| 529 | 24 |
| 545 | 25 |
| 561 | 26 |
| 577 | 27 |
| 593 | 28 |
| 609 | 29 |
| 625 | 30 |
| 641 | 31 |
| 657 | 32 |
| 673 | 33 |
| 689 | 34 |
| 705 | 35 |
| 721 | 36 |
| 737 | 37 |
| 753 | 38 |
| 769 | 39 |
| 785 | 40 |
| 801 | 41 |
Tabla 1: Tamaño del amplicon para cada locus VNTR D1S80.
| individual | alelo | Distancia (en cm) | Tamaño (en bp) | Número de unidades de repetición |
| 1 | homocigótico | 5 | 600 | 28 |
| 2 | heterocigótico | 5.2 ; 5.5 | 535, 458 | 24, 20 |
| 3 | heterocigótico | 4.9 ; 5.2 | 626, 535 | 30, 24 |
| 4 | homocigótico | 5 | 600 | 28 |
| 5 | heterocigótico | 5.1 ; 5.3 | 564, 508 | 26, 23 |
| 6 | heterocigótico | 5.4 ; 5.6 | 483, 435 | 21, 18 |
| 7 | heterocigótico | 5.3 ; 5.5 | 508, 458 | 23, 20 |
| 8 | homocigótico | 5.6 | 435 | 18 |
Tabla 2: Composición de alelos de los diferentes individuos ensayados. El número de unidades de repetición se puede aproximar según el tamaño del amplicon obtenido por el análisis de regresión lineal.
Discussion
Aquí describimos un método simple y rentable para implementar la huella molecular en las clases prácticas de pregrado.
Para detectar la variación genética en el lugar geométrico D1S80, se requiere la recolección de muestras biológicas humanas junto con la extracción y el análisis de ADN. Es esencial que se garantice el uso ético de los especímenes biológicos humanos durante todo el proceso. La gestión de muestras se controla dentro de un marco reglamentario amplio que garantiza el uso correcto de las muestras y los datos asociados18 (por ejemplo, el consentimiento para el uso de material biológico humano). Los participantes deben estar debidamente informados sobre el uso de sus muestras, el riesgo de descubrimiento de anomalías en las relaciones genéticas (por ejemplo, para individuos relacionados), la protección de la privacidad y las intenciones para el almacenamiento futuro de las muestras biológicas y los datos. Todos los donantes (estudiantes o colegas) deben dar su consentimiento libremente y entender el derecho a retirarse sin dar razón. En general, es indispensable familiarizarse con las respectivas directrices y regulaciones para el manejo de muestras humanas antes de llevar a cabo esta clase de laboratorio.
Para la recolección de células epiteliales de la mucosa bucal en cursos de laboratorio de pregrado, se debe tener cuidado para evitar la contaminación de las muestras de ADN con ADN del operador o con ADN. Se recomienda que siempre se usen batas de laboratorio, guantes y gafas protectoras, así como hisopos estériles y tubos de microcentrífuga. La recolección de células a base de hisopos bucales se considera un método conveniente y rentable para la recolección de material genético adecuado para el análisis de VNTR basado en PCR, ya que es relativamente barato y no invasivo. Además de los hisopos bucales, la saliva es el método de muestreo oral más común para la investigación médica. Se ha demostrado que los hisopos bucales contienen una mayor proporción de células epiteliales que la saliva, lo que los hace más confiables para proporcionar suficiente cantidad y calidad de ADN para el análisis de VNTR D1S80 basado en PCR19,20. Además, los hisopos bucales pueden ser enviados por correo después de la auto-recolección superando impedimentos geográficos cuando se utilizan, por ejemplo, en estudios de diversidad poblacional21.
La extracción de ADN se ha vuelto relativamente fácil debido al desarrollo de kits de extracción de diferentes compañías. No obstante, el uso de esos kits puede no ser adecuado en las clases de laboratorio debido a los limitados recursos financieros. Aquí, presentamos un método fácil, rápido y rentable para la extracción de ADN de muestras humanas sin la necesidad de un kit de extracción de ADN disponible comercialmente. El método de extracción de ADN descrito no utiliza disolventes orgánicos, sino que las proteínas celulares se eliminan aumentando la concentración de sal utilizando una solución de acetato de potasio de 8 M. Este método también permite el manejo de varias muestras a la vez y produce suficiente ADN para varios análisis de genotipos para cada muestra.
La PCR es una técnica común en muchos laboratorios moleculares. Aunque generalmente no hay problemas, hay escollos que pueden complicar la reacción produciendo resultados espurios, que se han discutido en otra parte22. Las condiciones de la polimerización en cadena presentadas aquí han aparecido muy robustas frente a la calidad pobre de la DNA de la plantilla, pero la carencia de la amplificación de la polimerización en cadena sin embargo fue observada de vez en cuando al usar las plantillas con las concentraciones extremadamente bajas de la DNA debido a la cosecha epitelial bucal pobre de la célula. Los cebadores de ADN utilizados en este estudio se pueden pedir a diferentes empresas, como las citadas en la tabla de materiales al final de este trabajo. Se debe tener especial cuidado al trabajar con cebadores de ADN para evitar la contaminación con ADN o ADN del operador. Los productos de PCR también deben mantenerse fríos cuando no estén en uso.
Otro paso crítico es la electroforesis en gel de agarosa. Los fragmentos que difieren en una sola unidad de repetición de 16 pb no pueden separarse en la electroforesis en gel y, por lo tanto, aparecer como una sola banda. En este caso, no se puede garantizar una determinación adecuada del número de unidades de repetición de los alelos D1S80 ensayados. Por lo tanto, el tiempo de ejecución del gel debe aumentarse mientras que el voltaje debe reducirse y la concentración del gel puede aumentarse para proporcionar una mejor resolución y separación de las bandas individuales.
Vale la pena mencionar que no todos los alelos para un locus VNTR contienen unidades de repetición completas. Los alelos no consensuadas (microvariantes) que contienen unidades de repetición incompletas son comunes a lo sumo loci VNTR y sus tamaños caen entre tamaños de alelos con unidades de repetición completas. Estos microvariantes son apenas detectables por electroforesis en gel de agarosa. Por el contrario, técnicas como los geles de poliacrilamida o la electroforesis capilar pueden resolver alelos que difieren de una a unas pocas unidades de repetición o microvariantes12,23,24,25,26. Sin embargo, estas últimas técnicas son menos adecuadas para las clases de laboratorio de pregrado, ya que tienen muchas desventajas, incluido el uso de compuestos peligrosos, la preparación compleja y la falta de equipos. Para la determinación del tamaño del fragmento, se debe tener especial cuidado al medir la distancia de los fragmentos de ADN migrados. Si las bandas son demasiado difusas para ser medidas con precisión, el cálculo del tamaño del fragmento del alelo D1S80 por regresión lineal puede ser incorrecto, lo que resulta en la estimación incorrecta de los números de unidad de repetición. En ese caso, es aconsejable volver a ejecutar la electroforesis en gel de agarosa después de optimizar las condiciones del gel, como lo han descrito anteriormente Lorenz y sus compañeros de trabajo22.
Todo el procedimiento de análisis VNTR D1S80 presentado aquí, desde la recolección de células epiteliales bucales hasta la evaluación de la longitud de los fragmentos, se puede completar en un solo día hábil. Este protocolo es un método robusto, rentable y fácil de usar adecuado para las clases prácticas de laboratorio de pregrado.
Disclosures
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.
Acknowledgments
Los autores quieren agradecer a Kevin Graham por su voz en general y a todos los participantes que donaron muestras para este trabajo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72,706 | autoclaved |
| 2 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 7,26,95,500 | autoclaved |
| 2-propanol | Fisher chemical | PI7508/17 | |
| 5x PCR buffer | Promega | M7845 | |
| Acetic acid | Sigma/Merck | A6283-500ML | |
| Agarose | BioBudget | 10-35-1020 | |
| Buccal swabs | BioBudget | 57-BS-05-600 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Combs | BioRad | ||
| dNTPs (10 mM) | Invitrogen | R0192 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.1 | |
| Ethanol | Honeywell | 32221-2.5L | |
| Gel caster | BioRad | ||
| Gel chamber | BioRad | SubCell GT | |
| Gel Doc XR+ | BioRad | ||
| Geltray | BioRad | SubCell GT | |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0371 | |
| Go-Taq Polymerase | Promega | M7845 | |
| Heating block | Eppendorf | Thermomixer | 1.5 mL and 2 mL |
| Microwave | Sharp | R-941STW | |
| peqGreen | VWR | 732-3196 | |
| Pipettes | Gilson | 1000 µL, 200 µL, 20 µL, 2 µL | |
| Potassium acetate | Arcos Organics | 217100010 | |
| PowerPac power supply | BioRad | 100-120/220-240V | |
| Primers | Sigma/Merck | ||
| Scale | Kern | PCB 2.5 kg | |
| SDS | Arcos Organics | 218591000 | |
| Shaker | IKA labortechnik | IKA RH basic | |
| Tabletop centrifuge | myFuge | ||
| Thermal Cycler | BioRad | C100 Touch | |
| Tris | VWR | 103156x | |
| Vortex mixer | LMS | VTX-3000L |
References
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