Summary
Här beskriver vi ett enkelt protokoll för att generera DNA-fingeravtrycksprofiler genom att förstärka VNTR locus D1S80 från epitelcells-DNA.
Abstract
Inom biologiska vetenskaper har DNA-fingeravtryck använts i stor utsträckning för faderskapstestning, rättsmedicinska tillämpningar och fylogenetiska studier. Här beskriver vi en tillförlitlig och robust metod för genotypning av individer genom variabelt antal Tandem Repeat (VNTR) analys i samband med grundutbildningslaboratoriet klasser. Den mänskliga D1S80 VNTR locus används i detta protokoll som en mycket polymorf markör baserat på variation i antalet repetitiva sekvenser.
Detta enkla protokoll förmedlar användbar information för lärare och implementering av DNA-fingeravtryck i praktiska laboratorieklasser. I den presenterade laboratorieövningen används DNA-extraktion följt av PCR-förstärkning för att bestämma genetisk variation vid D1S80 VNTR-locus. Skillnader i fragmentstorleken på PCR-produkter visualiseras av agarose gel elektrofores. Fragmentstorlekarna och upprepningsnumren beräknas baserat på en linjär regression av storleken och migrationsavståndet för en DNA-storleksstandard.
Enligt den här guiden bör eleverna kunna:
• Skörda och extrahera DNA från buccal slemhinnor epitelceller
• Utför ett PCR-experiment och förstå funktionen hos olika reaktionskomponenter
• Analysera ampliconerna med agarose gelelektrofores och tolka resultaten
• Förstå användningen av VNTR i DNA-fingeravtryck och dess tillämpning inom biologiska vetenskaper
Introduction
Molekylär fingeravtryck, även kallad DNA-fingeravtryck, introducerades av Sir Alec Jeffreys när han arbetade vid institutionen för genetik vid University of Leicester 19841. Det är baserat på de 0,1% av det mänskliga genomet som skiljer sig mellan individer och består av cirka tre miljoner varianter. Dessa unika skillnader i genotypen möjliggör differentiering mellan individer och kan därför fungera som ett genetiskt fingeravtryck förutom monozygota tvillingar. Följaktligen används DNA-fingeravtryck för uppskattning av släktskap hos olika individer som tillämpas till exempel i faderskapstestning eller i studier av befolkningsmångfald. I våra laboratorieklasser strävade vi efter att förmedla begreppet DNA-fingeravtryck och allelfrekvenser. Metoden som beskrivs här visar en tillförlitlig och robust metod för genetisk fingeravtryck genom att analysera variabelt antal tandemrepetitioner (VNTR) vid D1S80-locus. Metoden omfattar extraktion av DNA från buccal slemhinnor epitelceller och efterföljande Polymerase Chain Reaction (PCR) för att förstärka D1S80 locus, följt av visualisering av fragment längd skillnader på en agarose gel.
D1S80 VNTR minisatellite locus är mycket varierande och ligger i den telomeriska regionen kromosom 1 (1 p36-p35). Det identifierades och beskrevs av Karsai och medarbetare 1990 som en locus med en kärnrepetitionsenhet på 16 bp, vilket möjliggör separation av alleler som skiljer sig med bara en enhet2. Dessutom visar D1S80 en hög grad av variation med en mutationshastighet på cirka 7,77 x 10-53. D1S80 har en hög grad av heterozygositet4,5 (t.ex. 80,8% heterozygositet för kaukasier6 och upp till 87% heterozygositet för afroamerikaner7). Dessutom är D1S80-locus polymorf i de flesta populationer, med vanligtvis över 15 olika alleler som bär 14 till 41 repetitioner vardera. Frekvensen av D1S80-alleler varierar mellan populationerna. Allelen med 24 upprepade enheter (allel 24) är vanligast i europeiska och asiatiska populationer, medan allel 21 är vanligast i afrikanskapopulationer 4,7,8,9,10. Följaktligen är fördelningen av allelfrekvensen diagnostisk för olika befolkningsgrupper och måste beaktas vid uppskattningen av släktskap (t.ex. i faderskapstester).
PCR-baserad förstärkning av D1S80 VNTR locus har varit en mycket användbar metod inom kriminalteknik, faderskapstester, sjukdomsanalys och befolkningsmångfaldsstudier11,12,13,14. Medan i kriminalteknik idag användningen av VNTR har ersatts av korta tandemrepetitioner, används D1S80 VNTR-johannesbröd i stor utsträckning vid bestämning av ursprung och genetiska relationer mellan och mellanpopulationerna 4,8,9,11. Dessutom används det ofta för att lära DNA-fingeravtryck i praktiskalaboratorieklasser 15,16. Metoden som beskrivs här representerar en robust, kostnadseffektiv och lättanvänd metod med en mycket hög framgångsgrad i grundutbildningslaboratoriet. Syftet med denna artikel är att ge en översikt över arbetsflödet för molekylär analys av den mänskliga D1S80 minisatellite locus från buccal slemhinnan epitelceller. Det inkluderar demonstration av tekniker, förenklade protokoll och praktiska förslag som beskrivs i tidigare publicerade verk2,17.
Protocol
OBS: Detta protokoll ska endast användas om studenter eller respektive vårdnadshavare samtyckte till att detta protokoll skulle ledas eftersom genotypiska profiler ger insikter om genetiska relationer. DNA-fingeravtryck är en vanlig molekylärbiologisk metod som främst tillämpas på populationsstudier och kriminaltekniska frågor. Därför bör uppmärksamhet ägnas åt att hålla föroreningsriskerna så låga som möjligt. För att undvika kontaminering av provet med DNA från en extern källa eller DNases bör handskar bäras, instrumenten rengöras noggrant eller steriliseras och lösningarna bör filtreras eller autoklaveras före användning.
1. Skörd av buccal slemhinnor epitelceller
VARNING: Arbete med saliv och epitelceller kan leda till överföring av infektionssjukdomar. Därför bör standard- och överföringsbaserade försiktighetsåtgärder tillämpas (t.ex. användning av lämplig personlig skyddsutrustning).
OBS: Inkludera en positiv kontroll, som tillhandahålls av instruktören (t.ex. DNA som extraheras av instruktören) och ingår i bearbetningsstegen nedströms.
- Vänta minst 1 timme efter att du ätit eller borstat tänder före provsamling.
- Märk ett tomt och sterilt 2,0 ml mikrocentrifugrör.
- Ta bort en steril buccal svabb från förpackningen och gnugga kraftigt på insidan av kinden i 30-40 gånger eller 30-40 sekunder för att skörda buccal slemhinnor epitelceller.
- Placera kollektionspinnens spets i det tidigare märkta sterila mikrocentrifugröret och bryt av plastlängden som sträcker sig utanför kanten, antingen för hand eller med steril sax.
- Placera locket ordentligt på röret och försegla uppsamlingspinnen inuti.
2. Extraktion av genomiskt DNA från mänskliga celler
- Före extraktion, ställ in en termisk blandare eller ett värmeblock på 65 °C för provlys.
VARNING: Vissa kemikalier som används klassificeras som farliga. Läs säkerhetsdatabladet noggrant och vidta lämpliga säkerhetsåtgärder innan du hanterar det.- Förbered och sterilisera genom att filtrera eller autoklavera alla nödvändiga buffertar och lösningar (lyslösning, 8 M kaliumacetat, 2-propanol, 70% etanol och elueringsbuffert).
OBS: Alla centrifugeringssteg ska utföras vid rumstemperatur (20-30 °C) om inget annat anges.
- Förbered och sterilisera genom att filtrera eller autoklavera alla nödvändiga buffertar och lösningar (lyslösning, 8 M kaliumacetat, 2-propanol, 70% etanol och elueringsbuffert).
- Tillsätt 500 μL lyslösning (50 mM Tris/HCl, pH 8,0; 10 mM etylendiamintetra-ättiksyra (EDTA); 2% natriumddecylsulfat (SDS)) till buccal-svabbprovet och se till att provet är helt nedsänkt i lyslösningen.
- Virvel kraftigt i minst 5 s.
- Inkubera prover vid 65 °C i en termisk blandare i 10 minuter.
- Blanda provet 3-4 gånger genom pulsvirkning i 5 s under inkubation.
- Ta bort svabbprovet från lysbufferten, tryck svabbprovet mot insidan av röret för att få maximal provvolym.
- Tillsätt 100 μL kaliumacetat på 8 M till lysceller.
- Blanda noggrant genom att vända röret tills det finns en vit fällning.
- Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Centrifugera provet i 5 minuter vid 18 000 x g.
- Överför 450 μL av supernatanten till ett rent och sterilt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 450 μL 2-propanol och blanda noggrant genom att invertera röret (utfällning av DNA).
- Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Centrifugera i 5 min vid 18 000 x g.
- Kassera supernaten och vänd röret på en ren pappershandduk för att torka pelleten och för att undvika korskontaminering.
- Inkubera DNA i 5 min vid 65 °C i ett värmeblock för att torka pelleten helt.
- För att tvätta DNA, tillsätt 500 μL 70% etanol.
- Centrifugera i 1 min vid 18 000 x g.
- Kassera supernaten och vänd röret på en ren pappershandduk för att torka pelleten.
- Tillsätt 30 μL återsuspensionsbuffert (10 mM Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) till pelleten.
- Inkubera DNA i 10 min vid 65 °C i ett värmeblock för att inaktivera DNases.
3. Förstärka D1S80 VNTR-locus med PCR
OBS: Registrera antalet prover som ska användas och förbered ett kalkylblad med de reagenser som krävs och deras volymer innan nödvändiga plaster och andra material samlas in. Märk de sterila rör/remsor/plattor som ska användas för PCR med provnummer. Kom ihåg att inkludera en negativ kontroll med H2O istället för DNA och en positiv kontroll (t.ex. med hjälp av DNA från instruktören) för att validera PCR.
- Förbered 1x PCR master mix som innehåller 10 μL 5x PCR reaktionsbuffert (innehållande 15 mM MgCl2),1 μL deoxyribonukleotid triphosfat (dNTPs) (10 mM), 5 μL (10 pmol) av varje prime pMCT118-f och pMCT118-r (framåt - 5'-GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG-3', omvänd - 5'-GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC-3') enligt Kasai et al.2,23,8 μL ultrapure H2O och 0,2 μL Taq DNA-polymeras (5 U/μL).
OBS: Primers pMCT118-f/pMCT118-r designades på flankerande regioner i D1S80 VNTR-regionen som förstärker hela locus. - MÄRK PCR-rören/remsorna/plattan med de provnummer som ska användas.
- Alikvot 45 μL av huvudblandningen till varje märkt PCR-provrör eller brunn.
- Tillsätt 5 μL AV DNA-mallen till huvudblandningen i varje PCR-rör/plåtbrunn för att få en total volym på 50 μL. Byt pipettspets för varje DNA-prov för att undvika korskontaminering.
- Inkludera en NTC (No Template Control) med hjälp av ultrapure H2O istället för DNA.
- Stäng PCR-rör/remsor eller tätningsplatta och blanda.
- Centrifug PCR-rören/remsorna/plattorna i 20 s med hjälp av en bordscentrifug.
OBS: PCR villkor som anges i detta protokoll optimerades med hjälp av DNA polymeras och PCR termisk cyklator används. I allmänhet måste PCR-förhållandena anpassas till DNA-polymerasen. Standardförlängningstiden för en Taq DNA-polymeras är 1 min/kb. - Placera provrören/remsorna/plattan i termocyklisten och inkubera reaktioner med hjälp av följande villkor (förlängningstid för DNA-polymeras): 1 cykel på 95 °C i 2 min. 25 cykler på 94 °C för 15 s, 60 °C för 15 s, 72 °C för 30 s, 1 cykel på 72 °C i 10 min.
- När programmet är klart, ta bort produkterna från termocyklisten och förvara vid 4 °C över natten eller -20 °C tills elektroforesen.
4. Agarose gel elektrofores av PCR-produkter
- Förbered en 1,5% agarose gel.
- Använd 1,5 g agarospulver och blanda det med 100 ml buffertlösning 1x Tris-acetat-EDTA (TAE) i en kolv.
- Värm blandningen i ca 1,5-2 min i mikrovågsugn (600 W). Snurra innehållet och värm igen, om det behövs, för att helt lösa upp agarosen. Kyl något och tillsätt 2 μL PeqGreen till agarosen.
- Häll gelén i en form med en kam med tillräckligt med brunnar för alla prover och tillsätt minst en molekylviktsmarkör.
VARNING: Kokande retardation kan förekomma. Skaka kolven försiktigt när du återanvänder agarosen som ännu inte har lösts upp.
OBS: PeqGreen är ett giftfritt färgämne för påvisande av nukleinsyror. Det är tillämpligt för färgning av dubbelsträngat DNA (dsDNA) och enkelsträngat DNA (ssDNA) samt RNA. Känsligheten är jämförbar med ethidiumbromid.
- Ta bort PCR-produkterna från 4 °C och centrifug i ca 10 s.
- Ladda gelens brunnar med 10 μL prov. Överbelasta inte gelén.
OBS: DNA-polymerasbufferten innehåller också föreningar som ökar provtätheten så att prover kan laddas direkt på geler utan behov av ett lastfärgämne. Detta gör att provet kan sjunka ner i brunnen och färgämnen hjälper till att spåra hur långt DNA-provet har migrerat.- Lägg till en molekylviktsstandard till de flankerande brunnarna (helst en 50 bp molekylviktsstandard).
OBS: Förvara de återstående PCR-proverna vid -20 °C om agarose gelelektroforesen måste upprepas.
- Lägg till en molekylviktsstandard till de flankerande brunnarna (helst en 50 bp molekylviktsstandard).
- Kör gelén i 1x TAE löpbuffert vid 150 V (konstant) i cirka 40 min eller tills den nedre gula färgfronten som färdas vid cirka 50 bp når geléns nedre ände.
- Avbilda gelén medan blått ljus eller ultraviolett (UV) ljus appliceras och spela in en bild för fragmentlängdsanalys.
VARNING: UV-ljus kan skada ögon och hud. Använd alltid skyddskläder och UV-skyddsglasögon när du använder en UV-ljuslåda. - Kassera gelén i enlighet med policyn för institutionella farliga material.
5. Analys av fragmentlängdsresultat
OBS: Använd linjär regressionsanalys för att uppskatta fragmentens längder.
- För att storleksbesyrliga D1S80 PCR-fragmenten, placera en linjal på gelfotot över standardbanan på 50 bp molekylvikt så att linjalens överkant ligger i linje med botten av brunnen i vilken provet laddades (figur 1).
OBS: För att beräkna den linjära regressionsekvationen för molekylviktsstandarden (50 bp molekylviktsstandard) användes ett kalkylbladsprogram. - Registrera avståndet från brunnen (t.ex. i cm) för varje band av 50 bp molekylviktsstandarden i en tabell med hjälp av ett kalkylprogram (figur 2).
- Bestäm loggen (t.ex. bas 10) för varje fragmentstorlek på 50 bp molekylviktsstandarden och ange loggvärdena i tabellen (figur 2).
- Rita varje datapunkt till ett diagram med stocken över bandstorlekarna på den vertikala axeln (y-axeln) och det uppmätta köravståndet från gelens överdel till varje band av molekylviktsstandarden på den horisontella axeln (x-axeln) med hjälp av en scatterplot (figur 3).
- Anpassa en trendlinje (linjär regressionslinje) och visa regressionsekvationen (y = ax + b) och R2-värdet i diagrammet (bild 4).
- Mät det migrerade avståndet (t.ex. i cm) för varje D1S80-amplicon (figur 5).
- Uppskatta storleken på varje D1S80-amplicon med regressionsekvationen: y = ax + b
där y = stocken över fragmentstorleken
a = linjens lutning (beräknad i punkt 5)
x = avståndet från brunnen (i cm)
b = den punkt där regressionslinjen fångar upp y-axeln (beräknad i punkt 5)
OBS: Eftersom y-värdet representerar stocken av fragmentstorleken måste antilogen (10y)beräknas för att erhålla fragmentstorleken i bp av D1S80-ampliconerna.
6. Uppskattning av antalet upprepade enheter i de testade individernas alleler
OBS: D1S80-repetitionsenheten är 16 bp lång. Den minsta kända allelen för D1S80 har 14 repetitioner. Amplicon-systemet som beskrivs här producerar ampliconer med flankerande regioner som lägger till ytterligare 145 bp till den slutliga storleken.
- Använd tabell 1 för att uppskatta hur många upprepningsenheter som finns i varje PCR-fragment. Storleken extrapolerad med den linjära regressionen bör ligga inom 8 bp från en viss allel.
- Registrera genotypen för varje testad individ som en kombination av allelens upprepade storleksnummer.
Representative Results
Med hjälp av det beskrivna protokollet utfördes D1S80 VNTR-marköranalys på humant genomiskt DNA som extraherats från buccal mucosa epitelceller som skördats genom provtagning av svabba (figur 6). Efter förstärkningen med PCR visas en typisk representation av en agarosgel som innehåller D1S80-ampliconerna i figur 1. Körfält 1 visar 50 bp molekylvikt standard. Bredvid molekylviktsstandarden visualiseras PCR-produkter från åtta studentprover. Körfält 10 visar NTC där vatten användes istället för mall-DNA. De flesta av de analyserade proverna visar tydligt två band, som representerar individer heterozygous för D1S80 locus. Lane 2 och Lane 9 visar ett enda band som representerar individer homozygous för D1S80 locus. Lane 5 visar ett tvetydigt singelband som är mycket bredare jämfört med de andra banden. Detta kan vara ett resultat av två D1S80 alleler som skiljer sig åt i endast en upprepa enhet. För vidare analys kommer provet i bana 5 att betraktas som ett enda band, som representerar en homozygous individ.
Nedströms gel elektrofores fragment analys utförs på verifierade PCR produkter användes för storlek kallar av D1S80 VNTR locus av olika student prover. Tolkningen av ampliconstorlekarna som erhålls genom PCR-analys bygger på den molekylviktsstandard som används. Avståndet från brunnen för varje band av molekylviktsstandarden mättes (figur 1) och registrerades (figur 2). Baserat på storlek och migreringsavstånd kan storleken på de enskilda banden beräknas med hjälp av en linjär regressionsanalys. Loggen (bas 10) fastställdes för varje band i studentproverna (figur 5) och respektive antilog representerar antalet bp för varje amplicon. Antalet upprepade enheter kan beräknas enligt den erhållna ampliconstorleken (tabell 2).
För varje studentprov beräknades ampliconstorlekarna med linjär regression och varje band kunde enkelt tilldelas en viss allel enligt tabell 2. Informationen om D1S80 allelstorlekar kan sedan användas för att bestämma allelfrekvenser bland den lilla befolkningsundergruppen av grundstuderande. Den 28-upprepa allelen är den vanligaste bland eleverna på grund av två homozygous individer för denna upprepade allel (individer 1 och 4). Den näst vanligaste allelen är 18-upprepad allel, som bärs av den homozygous individen 8 och av den heterozygous individen 6. Lågfrekventa alleler är 21-, 26- och 30-upprepa alleler som bara finns en gång i individer 6, 5 respektive 3. Allelfrekvensmönstren hos D1S80 VNTR-locus av den lilla studentpopulationen kan ytterligare jämföras med allelfrekvensen hos större befolkningspopulationer, till exempel populationer som härrör från olikakontinenter 4,7,8,9,10.
Bland eleverna delar individerna 2 och 3 den 24-upprepade allelen, individer 2 och 7 delar 20-upprepad allel och individer 5 och 7 delar 23-upprepad allel. Intressant nog delar de två D1S80 homozygous individerna (individ 1 och 4) 28-upprepa allelen. Matchande alleler mellan två individer kan indikera en potentiell släkthet. Men delade alleler kan också uppstå av en slump. Således är det viktigt att bestämma sannolikheten för en allelmatchning mellan två individer. Sannolikheten beror på allelfrekvensen för enskilda alleler i den allmänna befolkningen och statistiska metoder bör användas för att fästa en statistisk vikt vid VNTR-marköranalys, såsom bayesiska metoden. Sammanfattningsvis kan den presenterade fingeravtrycksmetoden användas i praktiska för att lära användningen av VNTR i DNA-fingeravtryck och dess tillämpning i biologisk vetenskap.
Figur 1:Representation av en agarosgel efter elektrofores av D1S80-förstärkningsprodukter med en linjal placerad bredvid standardbanan med en 50 bp molekylvikt. Körfält 1 innehåller 50 bp molekylviktsstandard, medan körfält 2-9 innehåller PCR-reaktionsprodukter. Körfält 10 innehåller ingen mallkontroll (NTC). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Bestämning av DNA-fragmentmigrationsavstånd och logg över varje fragmentstorlek på 50-bp-molekylviktsstandarden. Avståndet från brunnen (i cm) för varje band i 50 bp molekylviktsstandard registreras och loggen (bas 10) för varje fragment bestäms. Värden anges i en tabell med hjälp av ett kalkylbladsprogram. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Spridningsdiagram som genereras genom att DNA-fragmentet plottas migrationsavstånd för molekylviktsstandarden på x-axeln mot loggen (bas 10) av storleken på varje fragment på y-axeln. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 4: Utnyttjande av den linjära regressionslinjen och regressionsekvationen samt R2-värdet för data. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5:Bestämning av storleken på D1S80-amplikonerna. Avståndet från brunnen för varje fragment anges i regressionsekvationen. Antilogen för y-värdet representerar fragmentstorleken i bp. Klicka här för att visa en större version av den här figuren.
Bild 6: Föreslagen tidslinje och arbetsflöde för D1S80 VNTR-analys. Hela D1S80 VNTR analys förfarande presenteras här, från buccal epitelial cell skörd till fragment längd utvärdering, kan slutföras inom en enda arbetsdag. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Allelstorlek (i bp) | Antal upprepningar |
| 369 | 14 |
| 385 | 15 |
| 401 | 16 |
| 417 | 17 |
| 433 | 18 |
| 449 | 19 |
| 465 | 20 |
| 481 | 21 |
| 497 | 22 |
| 513 | 23 |
| 529 | 24 |
| 545 | 25 |
| 561 | 26 |
| 577 | 27 |
| 593 | 28 |
| 609 | 29 |
| 625 | 30 |
| 641 | 31 |
| 657 | 32 |
| 673 | 33 |
| 689 | 34 |
| 705 | 35 |
| 721 | 36 |
| 737 | 37 |
| 753 | 38 |
| 769 | 39 |
| 785 | 40 |
| 801 | 41 |
Tabell 1: Ampliconstorlek för varje D1S80 VNTR-locus.
| individ | allel | Avstånd (i cm) | Storlek (i bp) | Antal upprepade enheter |
| 1 | homozygous (homozygous) | 5 | 600 | 28 |
| 2 | heterozygous | 5.2 ; 5.5 | 535, 458 | 24, 20 |
| 3 | heterozygous | 4.9 ; 5.2 | 626, 535 | 30, 24 |
| 4 | homozygous (homozygous) | 5 | 600 | 28 |
| 5 | heterozygous | 5.1 ; 5.3 | 564, 508 | 26, 23 |
| 6 | heterozygous | 5.4 ; 5.6 | 483, 435 | 21, 18 |
| 7 | heterozygous | 5.3 ; 5.5 | 508, 458 | 23, 20 |
| 8 | homozygous (homozygous) | 5.6 | 435 | 18 |
Tabell 2: Allelsammansättning av de olika testade individerna. Antalet upprepade enheter kan approximeras beroende på den ampliconstorlek som erhålls genom linjär regressionsanalys.
Discussion
Här beskrev vi en enkel och kostnadseffektiv metod för att implementera molekylär fingeravtryck i grundutbildningskurser.
För att screena för genetisk variation vid D1S80-locus krävs mänsklig biologisk provsamling tillsammans med DNA-extraktion och analys. Det är viktigt att den etiska användningen av mänskliga biologiska exemplar säkerställs under hela processen. Provhanteringen kontrolleras inom ett omfattande regelverk som säkerställer korrekt användning av prover och tillhörande data18 (t.ex. samtycke till användning av humanbiologiskt material). Deltagarna måste informeras på lämpligt sätt om användningen av sina prover, risken för upptäckt av avvikelser i genetiska relationer (t.ex. för närstående personer), integritetsskydd och avsikter för framtida lagring av biologiska exemplar och data. Alla givare (studenter eller kollegor) måste ge sitt samtycke fritt och förstå rätten att dra sig tillbaka utan att ange skäl. I allmänhet är det nödvändigt att göra sig bekant med respektive riktlinjer och förordningar för hantering av mänskliga prover innan man genomför denna labbklass.
För insamling av buccal slemhinnor epitelial celler i grundlaboratorium kurser, måste försiktighet vidtas för att undvika kontaminering av DNA prover med DNA från operatören eller med DNases. Det rekommenderas att labbrockar, handskar och skyddsglasögon alltid används samt sterila svabbprover och mikrocentrifugrör. Buccal swab-baserad cellskörd anses vara en bekväm och kostnadseffektiv metod för insamling av genetiskt material som lämpar sig för PCR-baserad VNTR-analys, eftersom det är relativt billigt och icke-invasivt. Förutom buccal svabbprover är saliv den vanligaste orala provtagningsmetoden för medicinsk forskning. Det har visat sig att buccal svabbprover innehåller en högre andel epitelceller än saliv, vilket gör dem mer tillförlitliga när det gäller att tillhandahålla tillräcklig mängd och kvalitet av DNA för PCR-baserad D1S80 VNTR-analys19,20. Dessutom kan buccal svabbprover skickas ut efter självinsamling som övervinner geografiska hinder när de används, till exempel i befolkningsmångfaldsstudier21.
DNA-extraktion har blivit relativt enkelt på grund av utvecklingen av extraktionssatser från olika företag. Användningen av dessa satser kanske dock inte är lämplig i laboratorieklasser på grund av begränsade ekonomiska resurser. Här presenterade vi en enkel, snabb och kostnadseffektiv metod för DNA-extraktion från mänskliga prover utan behov av ett kommersiellt tillgängligt DNA-extraktionskit. Den beskrivna DNA-extraktionsmetoden använder inte organiska lösningsmedel, utan cellulära proteiner avlägsnas genom att saltkoncentrationen ökar med hjälp av en 8 M kaliumacetatlösning. Denna metod möjliggör också hantering av flera prover samtidigt och ger tillräckligt med DNA för flera genotypanalyser för varje prov.
PCR är en vanlig teknik i många molekylära laboratorier. Även om det i allmänhet är problemfritt finns det fallgropar som kan komplicera reaktionen som ger falska resultat, som har diskuterats någon annanstans22. PCR villkor som presenteras här har verkat mycket robust inför dålig mall DNA kvalitet, men brist på PCR amplifiering observerades ändå ibland när man använder mallar med extremt låga DNA koncentrationer på grund av att dålig buccal epitelial cell skörd. DE DNA-primers som används i denna studie kan beställas från olika företag, till exempel de som citeras i materialtabellen i slutet av detta papper. Särskild försiktighet måste vidtas vid arbete med DNA-primers för att undvika kontaminering med DNases eller DNA från operatören. PCR-produkter bör också hållas kalla när de inte används.
Ett annat kritiskt steg är agarose gel elektrofores. Fragment som skiljer sig åt med endast en upprepad enhet på 16 bp får inte separeras i gelelektroforesen och visas därför som ett enda band. I detta fall kan en korrekt bestämning av antalet upprepade enheter i de testade D1S80-allelerna inte garanteras. Därför bör gelens körtid ökas medan spänningen måste minskas och gelkoncentrationen kan ökas för att ge en bättre upplösning och separation av de enskilda banden.
Det är värt att nämna att inte alla alleler för en VNTR-locus innehåller kompletta repetitionsenheter. Icke-konsensus alleler (mikrovarianter) som innehåller ofullständiga upprepade enheter är vanliga som mest VNTR lokus och deras storlekar faller i mellan storlekar av alleler med full upprepa enheter. Dessa mikrovarianter kan knappt detekterbara med agarose gelelektrofores. Däremot kan tekniker som polyakrylamidgeler eller kapillärelektrofores lösa alleler som skiljer sig med en till några upprepade enheter eller mikrovarianter12,23,24,25,26. De senare teknikerna är dock mindre lämpliga för grundutbildningsklasser eftersom de har många nackdelar, inklusive användning av farliga föreningar, komplex förberedelse och brist på utrustning. Vid bestämning av fragmentstorlek måste särskild försiktighet vidtas vid mätning av avståndet mellan de migrerade DNA-fragmenten. Om banden är för diffusa för att mätas exakt kan beräkningen av D1S80-allelfragmentstorleken genom linjär regression vara felaktig, vilket resulterar i fel uppskattning av upprepade enhetsnummer. I så fall är en omkörning av agarose gel elektrofores efter optimering av gelförhållandena tillrådligt som tidigare beskrivits av Lorenz och medarbetare22.
Hela D1S80 VNTR analys förfarande presenteras här, från buccal epitelial cell skörd till fragment längd utvärdering, kan slutföras i en enda arbetsdag. Detta protokoll är en robust, kostnadseffektiv och lättanvänd metod som lämpar sig för grundutbildning av praktiska laboratorieklasser.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Kevin Graham för hans berättarröst och alla deltagare som donerade prover för detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72,706 | autoclaved |
| 2 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 7,26,95,500 | autoclaved |
| 2-propanol | Fisher chemical | PI7508/17 | |
| 5x PCR buffer | Promega | M7845 | |
| Acetic acid | Sigma/Merck | A6283-500ML | |
| Agarose | BioBudget | 10-35-1020 | |
| Buccal swabs | BioBudget | 57-BS-05-600 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Combs | BioRad | ||
| dNTPs (10 mM) | Invitrogen | R0192 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.1 | |
| Ethanol | Honeywell | 32221-2.5L | |
| Gel caster | BioRad | ||
| Gel chamber | BioRad | SubCell GT | |
| Gel Doc XR+ | BioRad | ||
| Geltray | BioRad | SubCell GT | |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0371 | |
| Go-Taq Polymerase | Promega | M7845 | |
| Heating block | Eppendorf | Thermomixer | 1.5 mL and 2 mL |
| Microwave | Sharp | R-941STW | |
| peqGreen | VWR | 732-3196 | |
| Pipettes | Gilson | 1000 µL, 200 µL, 20 µL, 2 µL | |
| Potassium acetate | Arcos Organics | 217100010 | |
| PowerPac power supply | BioRad | 100-120/220-240V | |
| Primers | Sigma/Merck | ||
| Scale | Kern | PCB 2.5 kg | |
| SDS | Arcos Organics | 218591000 | |
| Shaker | IKA labortechnik | IKA RH basic | |
| Tabletop centrifuge | myFuge | ||
| Thermal Cycler | BioRad | C100 Touch | |
| Tris | VWR | 103156x | |
| Vortex mixer | LMS | VTX-3000L |
References
- Jeffreys, A. J., Wilson, V., Thein, S. L. Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA. Nature. 314 (6006), 67-73 (1985).
- Kasai, K., Nakamura, Y., White, R. Amplification of a variable number of tandem repeats (VNTR) locus (pMCT118) by the polymerase chain reaction (PCR) and its application to forensic science. Journal of Forensic Science. 35 (5), 1196-1200 (1990).
- Balamurugan, K., Tracey, M. L., Heine, U., Maha, G. C., Duncan, G. T. Mutation at the human D1S80 minisatellite locus. The Scientific World Journal. 2012 (917235), (2012).
- Herrera, R. J., Adrien, L. R., Ruiz, L. M., Sanabria, N. Y., Duncan, G. D1S80 single-locus discrimination among African populations. Human Biology. 76 (1), 87-108 (2004).
- Lauritzen, S. L., Mazumder, A. Informativeness of genetic markers for forensic inference - An information theoretic approach. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 1 (1), 652-653 (2008).
- Budowle, B., Chakraborty, R., Giusti, A. M., Eisenberg, A. J., Allen, R. C. Analysis of the VNTR locus D1S80 by the PCR followed by high-resolution PAGE. American Journal of Human Genetics. 48 (1), 137 (1991).
- Budowle, B., et al. D1S80 population data in African Americans, Caucasians, southeastern Hispanics, southwestern Hispanics, and Orientals. Journal of Forensic Science. 40 (1), 38-44 (1995).
- Verbenko, D. A., et al. Polymorphisms at locus D1S80 and other hypervariable regions in the analysis of Eastern European ethnic group relationships. Annals of Human Biology. 33 (5-6), 570-584 (2006).
- Walsh, S. J., Eckhoff, C. Australian Aboriginal population genetics at the D1S80 VNTR locus. Annals of Human Biology. 34 (5), 557-565 (2007).
- Limborska, S. A., Khrunin, A. V., Flegontova, O. V., Tasitz, V. A., Verbenko, D. A. Specificity of genetic diversity in D1S80 revealed by SNP-VNTR haplotyping. Annals of Human Biology. 38 (5), 564-569 (2011).
- Sajib, A. A., Yeasmin, S., Akter, M., Uddin, M. A., Akhteruzzaman, S. Phylogenetic analysis of Bangladeshi population with reference to D1S80 VNTR locus. Bioresearch Communications. 2 (1), 146-151 (2016).
- Köseler, A., Atalay, A., Atalay, E. Ö Allele frequency of VNTR locus D1S80 observed in Denizli province of Turkey. Biochemical genetics. 47 (7-8), 540-546 (2009).
- Mastana, S. S., Papiha, S. S. D1S80 distribution in world populations with new data from the UK and the Indian sub-continent. Annals of Human Biology. 28 (3), 308-318 (2001).
- Okuda, H., et al. A Japanese propositus with D-- phenotype characterized by the deletion of both the RHCE gene and D1S80 locus situated in chromosome 1p and the existence of a new CE-D-CE hybrid gene. Journal of Human Genetics. 45 (3), 142-153 (2000).
- Campbell, A. M., Williamson, J. H., Padula, D., Sundby, S. Use PCR & a Single Hair to Produce a "DNA Fingerprint.". The American Biology Teacher. 59 (3), 172-178 (1997).
- Jackson, D. D., Abbey, C. S., Nugent, D. DNA profiling of the D1S80 locus: A forensic analysis for the undergraduate biochemistry laboratory. Journal of Chemical Education. 83 (5), 774 (2006).
- Mansoor, S. K., Hussein, E. F., Ibraheem, A. K. Use the Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) in DNA fingerprinting and its application biological sciences. EurAsian Journal of BioSciences. 14 (2), 2835-2839 (2020).
- Beier, K., Schnorrer, S., Hoppe, N., Lenk, C. The ethical and legal regulation of human tissue and biobank research in Europe. Proceedings of the Tiss. EU Project. , Universitätsverlag Göttingen. (2011).
- Aida, J., et al. Telomere length variations in 6 mucosal cell types of gastric tissue observed using a novel quantitative fluorescence in situ hybridization method. Human Pathology. 38 (8), 1192-1200 (2007).
- Theda, C., et al. Quantitation of the cellular content of saliva and buccal swab samples. Scientific Reports. 8 (1), 1-8 (2018).
- McMichael, G. L., et al. DNA from buccal swabs suitable for high-throughput SNP multiplex analysis. Journal of biomolecular techniques: JBT. 20 (5), 232 (2009).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Destro-Bisol, G., Capelli, C., Belledi, M. Inferring microevolutionary patterns from allele-size frequency distributions of minisatellite loci: a worldwide study of the APOB 3'hypervariable region polymorphism. Human Biology. 72 (5), 733-751 (2000).
- Chen, B., et al. Structure and function of alleles in the 3'end region of human apoB gene. Chinese Medical Journal. 112 (3), 221-223 (1999).
- Renges, H. -H., Peacock, K., Dunning, A. M., Talmud, P., Humphries, S. E. Genetic relationship between the 3 '-VNTR and diallelic apolipoprotein B gene polymorphisms: Haplotype analysis in individuals of European and South Asian origin. Annals of Human Genetics. 56 (1), 11-33 (1992).
- Kravchenko, S. A., Maliarchuk, O. S., Livshits, L. A. A population genetics study of the allelic polymorphism in the hypervariable region of the apolipoprotein B gene in the population of different regions of Ukraine. Tsitologiia i Genetika. 30 (5), 35-41 (1996).
