Summary
Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol om arrays van 3D menselijke skeletspierenmicrotissues en minimaal invasieve downstream in situ assays van functie te produceren, inclusief contractiele kracht en calciumbehandelingsanalyses.
Abstract
Driedimensionale (3D) in vitro modellen van skeletspieren zijn een waardevolle vooruitgang in biomedisch onderzoek omdat ze de mogelijkheid bieden om skeletspierreformatie en -functie te bestuderen in een schaalbaar formaat dat vatbaar is voor experimentele manipulaties. 3D-spierkweeksystemen zijn wenselijk omdat ze wetenschappers in staat stellen om skeletspieren ex vivo te bestuderen in de context van menselijke cellen. 3D in vitro modellen bootsen aspecten van de inheemse weefselstructuur van volwassen skeletspieren na. Hun universele toepassing wordt echter beperkt door de beschikbaarheid van platforms die eenvoudig te fabriceren, kosten- en gebruiksvriendelijk zijn en relatief grote hoeveelheden menselijke skeletspierweefsels opleveren. Bovendien, aangezien skeletspieren een belangrijke functionele rol spelen die in de loop van de tijd in veel ziektetoestanden wordt aangetast, is een experimenteel platform voor microtissue-studies het meest praktisch wanneer minimaal invasieve calciumtransiënte en contractiele krachtmetingen direct binnen het platform zelf kunnen worden uitgevoerd. In dit protocol wordt de fabricage van een 96-well platform dat bekend staat als 'MyoTACTIC', en de massale productie van 3D menselijke skeletspiermicrotissues (hMMTs) beschreven. Bovendien worden de methoden voor een minimaal invasieve toepassing van elektrische stimulatie gerapporteerd die herhaalde metingen van de skeletspierkracht en calciumbehandeling van elke microtissue in de loop van de tijd mogelijk maakt.
Introduction
Skeletspieren zijn een van de meest voorkomende weefsels in het menselijk lichaam en ondersteunen belangrijke lichaamsfuncties zoals voortbeweging, warmtehomeostase enmetabolisme 1. Historisch gezien zijn diermodellen en tweedimensionale (2D) celkweeksystemen gebruikt om biologische processen en ziektepathogenese te bestuderen, evenals voor het testen van farmacologische verbindingen bij de behandeling van skeletspierziekten2,3. Hoewel diermodellen onze kennis van skeletspieren in gezondheid en ziekte sterk hebben verbeterd, is hun translationele impact belemmerd door hoge kosten, ethische overwegingen en verschillen tussen soorten2,4. Bij het wenden tot menselijke celgebaseerde systemen om skeletspieren te bestuderen, zijn 2D-celkweeksystemen gunstig vanwege hun eenvoud. Er is echter een beperking. Dit formaat slaagt er vaak niet in om de cel-cel en cel-extracellulaire matrixinteracties samen te vatten die van nature in het lichaam voorkomen5,6. In de afgelopen jaren zijn driedimensionale (3D) skeletspiermodellen naar voren gekomen als een krachtig alternatief voor hele diermodellen en conventionele 2D-kweeksystemen door de modellering van fysiologisch en pathologisch relevante processen ex vivo7,8mogelijk temaken. Inderdaad, een overvloed aan studies hebben strategieën gerapporteerd om menselijke skeletspieren te modelleren in een bioartificiaal 3D-cultuurformaat1. Een beperking voor veel van deze studies is dat actieve kracht wordt gekwantificeerd na het verwijderen van de spierweefsels van de kweekplatforms en de hechting aan een krachtomvormer, die destructief is en daarom beperkt is tot het dienen als eindpunttest9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Anderen hebben kweeksystemen ontworpen die niet-invasieve methoden voor het meten van actieve kracht mogelijk maken, maar niet alle zijn geschikt voor toepassingen voor het testen van moleculen met een hoog gehalte7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27,28 ,29.
Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode om menselijke spiermicrotissues (hMMCT's) te fabriceren in het skeletspieren (Myo) microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC) platform; een 96 well plate apparaat dat de bulkproductie van 3D skeletspier microtissuesondersteunt 30. De MyoTACTIC-plaatfabricagemethode maakt het mogelijk om in één gietstap een 96-put polydimethylsiloxaan (PDMS) kweekplaat en alle bijbehorende putkenmerken te genereren, waarbij elke put een relatief klein aantal cellen nodig heeft voor microtissuevorming. Microtissues gevormd binnen MyoTACTIC bevatten uitgelijnde, gestreepte en multinucleated myotubes die reproduceerbaar zijn van goed naar put van het apparaat, en bij rijping kunnen reageren op chemische en elektrische stimuli in situ30. Hierin worden de techniek om een PDMS MyoTACTIC-cultuurplaatapparaat te vervaardigen uit een replica van polyurethaan (PU), een geoptimaliseerde methode om onsterfelijke menselijke myogene voorlopercellen te implementeren om hMMT's te fabriceren, en de functionele beoordeling van gemanipuleerde hMMT-krachtgeneratie en calciumbehandelingseigenschappen geschetst en besproken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PDMS MyoTACTIC plaat fabricage
OPMERKING: PDMS MyoTACTIC plaat fabricage vereist een PU negatieve mal, die kan worden vervaardigd zoals eerder beschreven30. Het computer-aided design (CAD) SolidWorks-bestand voor het MyoTACTIC-plaatontwerp is beschikbaar gesteld op GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file).
- Bereid ~ 110 g PDMS-polymeeroplossing in een plastic wegwerpbeker in een verhouding van 1:15 monomeer tot uithardingsmiddel met behulp van de componenten in de siliconenelastomeerkit. Roer de polymeeroplossing gedurende 2-3 minuten met behulp van een serologische wegwerppipet van 5 ml totdat deze volledig gemengd en homogeen is.
LET OP: Vermijd contact met PDMS-polymeeroplossing met huid en ogen; en vermijd inademing. Draag altijd een laboratoriumjas en wegwerphandschoenen bij het hanteren van het vloeibare PDMS-mengsel en raadpleeg het veiligheidsinformatieblad (SDS) voor specifieke veiligheidsprotocollen.
OPMERKING: Bescherm oppervlakken van apparatuur (bijv. Weegschaal, tafelblad, enz.) met een wegwerpbedekking in geval van morsen van PDMS-polymeeroplossingen. - Ontgas het mengsel bij kamertemperatuur door de beker gedurende ~ 30 minuten in een vacuümkamer op een tafel te plaatsen die is aangesloten op een standaard droge vacuümpomp, of totdat alle bubbels zijn verwijderd. Breek het vacuüm elke 5-10 minuten om te helpen bij het ontgassen. Gebruik een leeg spuitvat van 50 ml om lucht te dopen en blaas eventuele resterende bellen op het oppervlak van het polymeermengsel indien nodig uit.
OPMERKING: Een stuk ID-buis van 6,35 mm kan worden gebruikt voor het aansluiten van een P1250-pipetpunt op het vat om de snelheid en nauwkeurigheid van de luchtstroom te verbeteren. - Terwijl de PDMS-polymeeroplossing ontgasst, verwijdert u alle overgebleven stukjes PDMS die aan de PU-negatieve mal zijn gehecht door de randen en het oppervlak voorzichtig af te vegen met een droge papieren handdoek. Gebruik standaard perslucht, ingesteld op 70-100 kPag om resterende fijne deeltjes te verwijderen.
OPMERKING: Bescherm de PU-negatieve mal tegen schade en deeltjesophoping door deze in een afsluitbare plastic zak te plaatsen en op te bergen in een lade die is beschermd tegen laboratoriumverkeer. - Plaats de PU-mal in een chemische kap die is beschermd met een wegwerpbedekking. Zet de mal horizontaal op ~75° en spuit het actieve oppervlak met een gelijkmatige laag lossingsmiddel. Spuit de mal van boven naar beneden, dan van links naar rechts, terwijl je het blik 15-20 cm van de mal houdt en een vloeiende heen en weer veegbeweging gebruikt. Draai de mal 180° en herhaal de sprays en laat de PU-mal vervolgens 10-15 minuten in de chemische kap zitten om te drogen.
LET OP: Zorg ervoor dat lossingsmiddel wordt gebruikt in een chemische zuurkast, vermijd contact met huid en ogen en raadpleeg het veiligheidsinformatieblad (SDS) voor specifieke veiligheidsprotocollen
OPMERKING: Een dunne film moet het actieve oppervlak volledig bedekken, maar overmatige coating kan in de volgende stap worden overgebracht naar het PDMS, wat op zijn beurt een negatieve invloed kan hebben op hMMT-zaaien. Het oppervlak moet glad aanvoelen, maar niet nat zijn. - Giet 100 g PDMS gelijkmatig in de PU-mal en plaats in een vacuümkamer die is aangesloten op een draaischuifvacuümpomp. Ontgas de PDMS-gevulde mal gedurende ~ 45 minuten en breek de vacuümafdichting elke 5-10 minuten gedurende de eerste 20 minuten om het proces te versnellen. Laat in de vacuümkamer staan totdat het PDMS-mengsel volledig vrij is van alle bubbels.
OPMERKING: Een draaischuifvacuümpomp wordt gebruikt om een lager vacuüm te bereiken en de tijd die nodig is voor deze stap te verkorten. Ontgassing van de PDMS-gevulde mal kan worden uitgevoerd met behulp van de benchtop vacuümkamer en de standaard droge vacuümpomp, maar de tijd om het mengsel van alle bubbels leeg te maken zal langer zijn. Wat essentieel is, is het verwijderen van alle bubbels uit de PDMS-polymeeroplossing, vooral in die regio's die bestemd zijn om hMMT-verankeringspalen te worden. Bubbels in deze regio zullen resulteren in ankerpostbreuk, het verlies van cultuurputten en op hun beurt resulteren in een klein stukje PDMS dat in de mal blijft zitten. - Breng de ontgaste PDMS-gevulde PU-vorm over in een oven van 65 °C en broed een nacht om het vloeibare rubber uit te harden.
- Haal de uitgeharde PDMS-positieve plaat uit de oven en koel de plaat minstens 30 min op kamertemperatuur.
- Maak met een mesloos scalpel de uitgeharde PDMS voorzichtig los van de PU-mal door de achterkant van het handvat tussen het PDMS en de wanden van de mal te laten lopen. Begin langs de bovenrand en scheid alle 4 de zijden, voordat je naar de basis van de mal duwt en dit gedeelte losmaakt. Deze stap is voltooid wanneer de achterkant van het handvat soepel loopt tussen het PDMS en alle 4 de wanden van de PU-mal.
OPMERKING: Werk langzaam en voorzichtig met het scalpel zonder mes om te voorkomen dat de PU-mal barst of de PDMS scheurt. Deze stap duurt 15-20 minuten. - Gebruik vanaf het ene uiteinde het mesloze scalpel om de rand van de PDMS op te tillen en vingers tussen de uitgeharde PDMS-cultuurplaat en PU-mal te werken. Duw vervolgens met beide handen de vingers verder onder de plaat en schilfert langzaam op en uit de PU-mal.
OPMERKING: Werk langzaam en gebruik beide handen om het bord gelijkmatig te schillen. Minimaliseer het buigen om de kans op breuk van de ankerpaal te verkleinen. Deze stap duurt 5-10 minuten. - Gebruik een scheermesje met één rand om de plaat in groepen van 6 ± 2 MyoTACTIC-putten(figuur 1)te snijden voor weefselzaaidoeleinden. Plaats volledige MyoTACTIC-platen, of plaatporties, in een instrumentsterilisatiezak en autoclaaf gedurende een droge cyclus van 25 minuten (20 minuten sterilisatietijd en 5 minuten droogtijd) bij 120 °C en 100-140 kPag.
2. Cultuur van vereeuwigde menselijke myoblast voorlopercellen
OPMERKING: De vereeuwigde myoblasten die in dit protocol worden gebruikt, zijn verkregen van het Institut de Myologie (Parijs, Frankrijk)31.
- Haal één injectieflacon met bevroren cellen uit de vloeibare stikstof dewar en ontdooi de injectieflacon snel in een waterbad van 37 °C (in minder dan 1 minuut). Cellen worden ingevroren met een dichtheid van 7,5 x10 5 cellen per 1 ml vriesmedia bestaande uit 90% foetaal runderserum (FBS) en 10% dimethylsulfoxide (DMSO).
- Breng de inhoud van de injectieflacon voorzichtig over naar een conische buis van 15 ml met 9 ml voorverwarmd wasmedium bestaande uit 89% DMEM 1x, 10% FBS en 1% Pen/Strep om de DMSO te verdunnen. Draai de conische buis van 15 ml gedurende 10 minuten op 400 x g en zuig vervolgens de media weg om de celkorrel te vermijden.
- Resuspend de pellet in 1 ml groeimedia bestaande uit 84% skeletspiercel basaal medium met skeletspier cel groeimedium supplementmix, 15% FBS en 1% pen / streptokokken en breng vervolgens over naar een conische buis van 50 ml met 29 ml groeimedia.
- Breng 10 ml media met ongeveer 2,5 x 105 cellen over in een celkweekschaal van 100 mm x 20 mm. Herhaal deze stap met de resterende 20 ml van de celoplossing. Breng vervolgens celkweekschalen over naar een bevochtigde celkweekincubator die is ingesteld op 37 °C en 5% CO2.
- Fris de cultuurmedia om de dag op. Kweek de cellen totdat ze ~ 70% -80% confluentie bereiken (meestal 4-5 dagen), waarna de cellen worden voorbereid op zaaien. 1,5 x 105 cellen zijn nodig om elke hMMT te genereren. Passeer daarom de cellen als dat nodig is om het vereiste aantal cellen te bereiken.
OPMERKING: De vereeuwigde myoblastvoorlopercellijnen mogen nooit meer dan 80% samenvloeiing bedragen voordat cellen in MyoTACTIC-putten worden gezaaid, de cellen worden doorgegeven of diepvriesvoorraden worden voorbereid. hMMT's vervaardigd uit cellen die de confluentie van 80% hebben overschreden, bereiken vaak geen contractiele rijpheid. Passaging-procedures zijn identiek aan methoden die hieronder in stap 3 worden beschreven.
3. Seeding engineered hMMTs met MyoTACTIC
- Voorbereiding van MyoTACTIC kweekputten en reagentia voor hMMT-zaaien.
OPMERKING: Dit protocol biedt specifieke details om 6 hMMTs te produceren.- Plaats 2-3 uur voor het zaaien van de cel een 6-put MyoTACTIC-plaatgedeelte in een celkweekschaal van 10 cm. Bereid elke individuele MyoTACTIC-cultuur goed voor door 100 μL van een 5% Pluronic F-127-oplossing aan elke put toe te voegen. Plaats het deksel op de kweekschaal van 10 cm, breng paraffine aan om de ruimte tussen de schaal en het deksel van 10 cm af te sluiten en plaats vervolgens de plaat van 10 cm met het MyoTACTIC-gedeelte in een centrifuge uitgerust met een platenspinneradapter.
OPMERKING: Als er geen centrifugeplaatspinneradapter beschikbaar is, kan een p20-pipetpunt worden gebruikt om voorzichtig bubbels van achter de palen te verwijderen, zodat het hele kweekoppervlak gelijkmatig is gecoat. - Centrifugeer 1.550 x g gedurende 1 minuut om alle bubbels in kweekputten te verwijderen, vooral achter de palen. Bewaar de celkweekschaal van 10 cm met het MyoTACTIC-plaatgedeelte met Pluronic F-127-oplossing bij 4 °C totdat de cellen klaar zijn voor zaaien.
OPMERKING: Pluronic F-127-coating kan worden aangebracht voor slechts 2 uur tot wel 24 uur. Putten kunnen bijvoorbeeld aan het einde van de dag worden gevuld met Pluronic F-127-oplossing voor gebruik de volgende dag. Overschrijd niet 24 uur, omdat dit een negatieve invloed zal hebben op de hMMT-remodellering en geen gezonde weefsels vormt die contractiele volwassenheid bereiken. - Ontdooi langzaam één 50 μL keldermembraanextract aliquot en één 10 μL trombine aliquot (100 U/ml stockoplossing) op ijs in de kweekkap.
OPMERKING: Bevries keldermembraanextract aliquots niet opnieuw. Ze zijn voor eenmalig gebruik. Trombine aliquots zijn herbruikbaar, daarom opnieuw invriezen tot 5 keer na gebruik. - Weeg ~7 mg fibrinogeen in poedervorm af in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en breng vervolgens over naar de celkweekkap. Voeg 700 μL van 0,9% (wt/vol) NaCl-oplossing toe aan water (of zoutoplossing) om tot een eindconcentratieoplossing van 10 mg/ml te komen. Vortex fibrinogeen niet om op te lossen, plaats de buis in plaats daarvan gedurende 3-5 minuten in een celkweekincubator van 37 °C.
- Verwijder en veeg voorzichtig aan de buis, pulseer vervolgens de opgeloste oplossing in een minicentrifuge op de tafel (microfuge) en keer terug naar de kweekkap. Filtreer de fibrinogeenoplossing met een spuit van 1 ml uitgerust met een spuitfilter van 0,22 μm. Breng de opgeloste fibrinogeenoplossing over op ijs naast het keldermembraanextract en trombine aliquots.
- Bereid ten slotte de hMMT-zaaimedia voor die na het zaaien van de weefsels in de kweekputten worden geïntroduceerd. Dit medium bevat skeletspiercel basaal medium aangevuld met 20% FBS, 1% P/S en 3% 6-aminocapronzuur (ACA; 1,5 mg/ml eindconcentratie wordt bereikt door verdunning uit een 50 mg/ml stamoplossing; % wordt uitgedrukt als v/v). Verwarm de media voor gebruik bij 37 °C.
- Plaats 2-3 uur voor het zaaien van de cel een 6-put MyoTACTIC-plaatgedeelte in een celkweekschaal van 10 cm. Bereid elke individuele MyoTACTIC-cultuur goed voor door 100 μL van een 5% Pluronic F-127-oplossing aan elke put toe te voegen. Plaats het deksel op de kweekschaal van 10 cm, breng paraffine aan om de ruimte tussen de schaal en het deksel van 10 cm af te sluiten en plaats vervolgens de plaat van 10 cm met het MyoTACTIC-gedeelte in een centrifuge uitgerust met een platenspinneradapter.
- Voorbereiding van cellen voor hMMT-zaaien.
- Verzamel de celkweekplaten uit de kweekincubator. Zuig de media van elke plaat aan en was de cellen eenmaal met D-PBS door 5 ml D-PBS aan elke kweekplaat toe te voegen. Zuig vervolgens de D-PBS op en maak de cellen los door 1 ml 0,25% Trypsine-EDTA toe te voegen aan elke kweekschaal. Plaats in de celkweekincubator gedurende 3 minuten.
- Stop de trypsine door 3 ml wasmedium (89% dmem + 10% FBS + 1% pen/streptokokken) toe te voegen aan de kweekschaal. Breng de celoplossing over in een conische buis van de juiste grootte en pelleteer de cellen vervolgens door gedurende 10 minuten bij 400 x g te centrifugeren. Aspirateer de media en zorg ervoor dat de celkorrel wordt vermeden. Resuspend de celkorrel vervolgens in 1 ml van het wasmedium.
- Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en trypan blauwe kleurstof onder brightfield microscopie.
Bij gebruik van meerdere platen van cellen zal deze celsuspensie zeer geconcentreerd zijn. Verdun celsuspensies voorafgaand aan het tellen indien nodig. - Aangezien elk weefsel 150.000 cellen nodig heeft die zijn geresuspendeerd in 15 μL van het extracellulaire matrix (ECM) mengsel, is 900.000 cellen in 90 μL ECM-mengsel nodig voor 6 weefsels. Om rekening te houden met het verlies van cel-ECM-oplossing dat optreedt tijdens het bereidingsproces als gevolg van bubbelvorming of pipetverlies, bereidt u extra cel-ECM-mengsel voor (d.w.z. 8 weefsels of 1.200.000 cellen in 120 μL ECM). Breng het volume van de celsuspensie met 1.200.000 cellen over in een nieuwe conische buis. Verhoog het volume tot 10 ml met wasmedium en draai gedurende 10 minuten op 400 x g.
- Terwijl de cellen naar beneden draaien, bereidt u 150 μL ECM-mengsel in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met behulp van het volgende recept. Voeg eerst 60 μL DMEM (40% volume) toe, voeg vervolgens 60 μL Fibrinogeen 10 mg/ml oplossing (40% volume) toe en voeg ten slotte 30 μL keldermembraanextract (20% volume) toe. Bewaar het ECM-mengsel op ijs tot gebruik.
OPMERKING: Gebruik altijd tips die voorgekoeld zijn bij -20 °C bij het werken met oplossingen die keldermembraanextract bevatten. ECM-mengsel bevat 4 mg/ml fibrinogeen.
- Zaaien hMMTs
- Verzamel de conische buis met de gesponnen cellen en zuig de media aan om de celkorrel te vermijden. Veeg krachtig met een gehandschoende vinger aan het uiteinde van de buis om de pellet los te maken en blijf flikkeren totdat de pellet verschijnt als een celbrij.
OPMERKING: Het is belangrijk om zoveel mogelijk wasmedia aan te zuigen om ervoor te zorgen dat de cel-ECM-suspensie de gewenste verdunning heeft. Gebruik indien nodig een pipet om de resterende wasmedia te verwijderen. - Breng 120 μL van de ECM-oplossing over in de buis met de celkorrel. Pipetteer op en neer om de cellen in de ECU grondig te resuspenderen om een enkele celsuspensie te genereren. Pipetteer langzaam en voorzichtig om te voorkomen dat er bubbels worden geïntroduceerd, wat het werkvolume zou verminderen. Plaats vervolgens de cel-ECM-oplossing op ijs tot gebruik.
- Haal MyoTACTIC plaatporties met Pluronic F-127 gecoate MyoTACTIC-putten uit de koelkast van 4 °C en plaats de 10 cm schaal met de MyoTACTIC-putten bovenop een ijspakking in de celkweekkap.
- Zuig de Pluronic F-127-oplossing uit elke put. Het PDMS is poreus en zal de Pluronic F-127-oplossing opnemen, vooral als platen met een centrifuge zijn afgesponnen. Laat de resterende Pluronic F-127-oplossing los en bezinken op de bodem van de put door putten 5 minuten te laten zitten en vervolgens opnieuw op te zuigen.
OPMERKING: Gebruik een Pasteur pipet met een p1250 tip bevestigd aan het uiteinde, en een p200 tip over de p1250 tip bij het aanzuigen van de Pluronic F-127 oplossing. Dit zal de precisie verbeteren om onbedoelde aspiratie van de paalstructuren te voorkomen. Vermijd het schrapen van het ovale zwembadvormige celzaaigebied op de bodem van de put met de pipet, omdat dit de Pluronic F-127-coating verstoort en het hMMT-zelforganisatieproces verstoort. De juiste techniek is om de pipetpunt net over het ovale zwembad te laten zweven terwijl je de Pluronic F-127-oplossing aanzuigt. - Pipetteer de cel-ECM-suspensie zorgvuldig om eventuele cellen die mogelijk naar de bodem van de buis zijn verzonken, opnieuw te suspenderen. Breng vervolgens 105 μL cel-ECM-suspensie over in een verse, voorgekoelde buis van 1,5 ml. Zorg ervoor dat u de buis dicht bij de bovenkant vastpakt om te voorkomen dat de oplossing opwarmt.
- Voeg 0,84 μL van de 100 E/ml trombinevoorraadoplossing toe aan de 105 μL cel-ECM-suspensie om tot een eindconcentratie van 0,2 E/mg fibrinogeen te komen. Pipetteer snel, voorzichtig en grondig om te mengen, terwijl het inbrengen van bubbels wordt vermeden.
OPMERKING: Trombine initieert de snelle omzetting van fibrinogeen in een fibrinestolsel. Als zodanig is er beperkte tijd om de weefsels te zaaien bij toevoeging van trombine. Om voortijdige stolling te voorkomen voordat het cel-ECM-mengsel in de kweekputten wordt overgebracht, stelt u een p20-pipet in op 15 μL voordat u het trombine toevoegt. Gebruik voorgekoelde uiteinden of dompel het pipetpunt een paar seconden in ijskoude DMEM voordat u 15 μL van het cel-ECM-mengsel in elke put verzamelt en overbrengt. Het is een best practice om cel-ECM-mengsels zodanig te bereiden dat er niet meer dan 6 hMMT's tegelijk worden gezaaid. - Om de weefsels te zaaien, voegt u 15 μL cel-ECM-mengsel (d.w.z. 150.000 cellen) toe aan elke individuele put. Voeg voorzichtig cel-ECM-mengsel toe aan het midden van het ovale zwembad en druk de pipetpunt niet in de bodem van de put. Spreid vervolgens met twee lichte bewegingen de celsuspensie achter elke paal in de put. Zodra het oppervlak gelijkmatig is gecoat in de cel-ECM-suspensie, gaat u verder naar de volgende put.
OPMERKING: Werk efficiënt om voortijdige gelation van het cel-ECM-mengsel in de buis te voorkomen voordat alle weefsels worden gezaaid. Bij het zaaien van de putten is het uiterst belangrijk om te voorkomen dat bubbels worden overgedragen, omdat de bel de verbouwing van de hMMT zal verstoren, waardoor de hMMT onbruikbaar wordt. - Plaats het deksel op de kweekplaat van 10 cm met de gezaaide putjes en breng het gedurende ongeveer 5 minuten over naar een weefselkweekincubator van 37 °C.
OPMERKING: Plaats de microcentrifugebuis met restcel-ECM-mengsel in de incubator als bevestiging van het gelpolymerisatieproces. - Nadat het cel-ECM-mengsel is gepolymeriseerd, voegt u 200 μL voorgewarmde hMMT-zaaimedia toe aan elke MyoTACTIC-put. Plaats het deksel van de 10 cm schaal terug en breng myoTACTIC-plaatporties in de schaal van 10 cm terug naar de couveuse. Dit tijdstip wordt dag -2 genoemd. Verstoor de weefsels niet tot de volgende stap.
- Verzamel de conische buis met de gesponnen cellen en zuig de media aan om de celkorrel te vermijden. Veeg krachtig met een gehandschoende vinger aan het uiteinde van de buis om de pellet los te maken en blijf flikkeren totdat de pellet verschijnt als een celbrij.
- HMMT's onderscheiden
- Verwijder na 2 dagen incubatie de hMMT-zaaimedia zorgvuldig met behulp van een pipet en vervang door 200 μL voorgewarmde differentiatiemedia met 2% paardenserum, 1% Pen/Strep, 4% ACA (d.w.z. 2 mg/ml eindconcentratie uit een stamconcentratie van 50 mg/ml; % wordt uitgedrukt als v/v) en 10 μg/ml humane recombinante insuline in DMEM. Dit tijdstip wordt dag 0 van differentiatie genoemd.
- Wissel daarna om de dag de helft van de media uit met verse differentiatiemedia tot dag 12 van differentiatie, de laatste dag van cultuur (Figuur 2a).
OPMERKING: Protocoldetails voor het fabriceren van hMMTs met behulp van primaire menselijke myoblasten zijn elders gepubliceerd30. Als er zorgen zijn over de levensvatbaarheid van cellen na het zaaien, incubeer dan hMMTs met calceïne en propidiumjodide om de levensvatbaarheid te kwantificeren.
4. Elektrische stimulatie en analyse van hMMT-geïnduceerde post-deflectie
- Plaats een heldere glazen bodem of plastic podiumbevestiging op een omgekeerde microscoop en bevestig een smartphonecamera aan het microscoopoculair met behulp van een microscoopcamerabevestiging. Fasecontrastmicroscopie bij 10x vergroting zal worden gebruikt(figuur 3a).
OPMERKING: Elke omgekeerde fasecontrastmicroscoop uitgerust met een 10x vergrotingsobjectief is geschikt. De PDMS-putconstructies worden van de 10 cm schotel verwijderd en direct op de heldere onderste trapbevestiging geplaatst en dus opengesteld voor de lucht. Steriliseer alle oppervlakken en apparatuur met 70% ethanol en minimaliseer het verkeer in het gebied tijdens experimenten. - Om de elektroden voor elektrische stimulatie voor te bereiden, snijdt u ~ 30 cm met tincoating koperdraad. Wikkel vervolgens, beginnend bij de naaf van een 25 G gewone kegelnaald, ~ 10 cm van de draad strak rond de bovenste helft, waardoor ~ 20 cm overtollige draad overblijft. Herhaal dit voor een tweede naald en snijd vervolgens de naaf van elke naald af.
OPMERKING: De draad moet strak rond de naald zitten om ervoor te zorgen dat deze niet beweegt en het met draad omwikkelde deel van de elektrode mag het PDMS niet raken, omdat dit de vorming van elektrische velden kan belemmeren. - Bevestig BNC aan de connectorkabel van de alligatorclip aan een uitgangskanaal op de golfvormgenerator en stel het kanaal in voor vierkante pulsen met een inschakelcyclus van 20%, een amplitude van 5 V (elektrische veldsterkte van 10 V / cm). De frequentie zal veranderen tussen 0,5 Hz en 20 Hz voor respectievelijk twitch- en tetanuscontracties.
OPMERKING: Instellingen van golfvormgeneratoren vereisen mogelijk experimentspecifieke optimalisatie - Plaats een MyocTACTIC-plaatgedeelte met hMMTs op het microscoopstadium en plaats voorzichtig elk uiteinde van de elektrode in het PDMS direct achter elke paal in het ovale zwembad. Plak de 20 cm overtollige draad voorzichtig af op de microscooptrap, zodat de naalden verticaal blijven en ~ 10 cm van elke draad vrij blijft voor verbinding(figuur 3a).
LET OP: Plaats nooit een blote vinger over een van beide uiteinden van de elektrode. Zorg ervoor dat een vingerhoed op de wijsvinger wordt gedragen om lichte druk uit te oefenen op de elektrode bij het inbrengen in het PDMS. - Richt het gezichtsveld van de microscoop op een van de twee palen, zodat de scherpstelling scherp is op de rand van de paal die zich het dichtst bij de elektrode bevindt. Vergrendel vervolgens de focus van de smartphonecamera op het duidelijkste gebied van de paal. Dit is belangrijk voor de downstream-analyse omdat een verandering in focus tijdens het opnemen de analyse zal verstoren.
- Sluit de vrije uiteinden van de getapete draden aan op de golfvormgenerator via alligatorklemmen(figuur 3a).
- Start de video-opname op de smartphonecamera en schakel vervolgens de kanaaluitgang in om de stimulatie te starten. Laat de hMMT 3 twitch- en 3 tetanuscontracties ondergaan, met 2 minuten rust tussen de twitch- en tetanusstimulatiereeksen.
- Schakel de kanaaluitgang uit, maak alligatorclips los van de met tin beklede koperdraden, verwijder de tape van de draden en veeg elke elektrode af met 70% ethanol voordat deze in de volgende hMMT-putten wordt ingebracht. Herhaal de procedure uit stap 4.5 voor alle hMMT's.
OPMERKING: Beperk de tijd die hMMTs buiten de couveuse doorbrengen door niet meer dan 3 weefsels tegelijk te stimuleren. Als er nog extra hMMT's in het MyoTACTIC-plaatgedeelte moeten worden geanalyseerd, breng de plaat dan gedurende 10 minuten terug naar de incubator om hMMTs terug te laten keren naar 37 °C. - Als u post-deflection wilt analyseren om de hMMT-krachtgeneratie te berekenen, gebruikt u het aangepaste script, dat beschikbaar is gesteld op GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/myoTACTIC). Volg de instructies in README.md om het script in te stellen en te starten en open vervolgens elke video voor het volgen van berichten om de krachtanalyse uit te voeren.
- Selecteer een interessegebied (ROI) langs de rand van de post die moet worden bijgehouden voor verplaatsing na verplaatsing. Druk op Enter om de ROI te bevestigen en druk nogmaals op Enter om het script uit te voeren ( Aanvullendevideo 1).
OPMERKING: Grote ombuigingen zorgen ervoor dat de tracker faalt. Als de tracker faalt tijdens de krimp, kan de ROI-grootte worden verhoogd om de tracking minder gevoelig te maken, maar het volgen van grote afbuigingen mogelijk te maken. De code bevat drie formaten die kunnen worden afgestemd door de scriptopmerkingen aan te passen. - Het script eindigt met twee invoervereisten. Voer eerst y in om te bevestigen dat de video meerdere weeën bevatte. Voer ten tweede y (ja) of n (nee) in voor het exporteren van resultaten naar een . CSV-bestand (Aanvullende video 1).
- Zorg ervoor dat de resultaten na afbuiging worden gerapporteerd als verplaatsing in pixels voor elke contractie. Converteer pixels naar μm-waarden voor de microscoop 10x vergrotingsinstelling. Converteer vervolgens postverplaatsingsgetallen naar absolute contractiele krachten (μN) door waarden (μm) te vermenigvuldigen met de krachtverplaatsingsconversiefactor van 2,36 μN / μm, wat overeenkomt met de verhouding 1:15 uithardingsmiddel tot monomeer van het PDMS dat wordt gebruikt in MyoTACTIC-fabricage30.
5. Calciumtransiënte analyse met behulp van elektrische stimulatie
OPMERKING: Voor calciumbehandelingsexperimenten werden vereeuwigde myoblasten stabiel getransduceerd met de MHCK7-GCAMP6-verslaggever zoals eerder beschreven11,12. Getransduceerde cellen werden FACS gesorteerd voor GFP om de positieve populatie te verkrijgen en vervolgens gebruikt om hMMTs te fabriceren. Alternatieve methoden voor calciumbeeldvorming, zoals het gebruik van ratio-metrische kleurstoffen zoals Fura-2 AM en Indo-1 of fluorescentielevensduurbeeldvorming van calciumindicatoren (bijv. Fluo-4 of Oregon Green BAPTA1) kunnen vatbaar zijn voor ons systeem.
- Stel de microscooptrap en stimulatieapparatuur (elektroden, golfvormgenerator, enz.) in zoals eerder beschreven in stap 4. Gebruik voor dit experiment een vergroting van 4x.
OPMERKING: Een donkere kamer en een epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een CCD-camera zijn nodig. - Start microscoopbeeldvormingssoftware, selecteer het FITC-filterkanaal (blauw licht) en selecteer filmopnamefunctie. Ingesteld op een belichting van 500 ms en een resolutie van 680 x 510 (Binning 2x2).
OPMERKING: Beeldbewerkingssoftware kan variëren en de belichting wordt handmatig ingesteld door de gebruiker. Zorg ervoor dat hMMT te veel wordt blootgesteld voorafgaand aan de stimulatie. In rust is een donkere weefselomtrek / schaduw met spontane fluorescentie normaal, terwijl een helder weefselbeeld overbelicht is(Aanvullende video 2). Zorg ervoor dat de belichting consistent is voor alle hMMCT's binnen een experiment. - Sluit de sluiter van de microscoop en houd het FITC-kanaal uit totdat het klaar is om de calciumbehandeling te registreren.
- Wanneer alle apparatuur en software is ingesteld, haalt u het MyoTACTIC-plaatgedeelte op met de te analyseren hMMCT's en plaatst u deze rechtstreeks op het microscoopstadium. Plaats vervolgens elektroden en sluit deze aan zoals eerder beschreven in stap 4.
- Gebruik brightfield om het gezichtsveld te richten op het midden van de geselecteerde hMMT. Doe vervolgens het lampje uit.
- Open de fitc-kanaalsluiter van de microscoop, controleer of er blauw licht brandt en selecteer vervolgens Filmopname in de software.
- Schakel de uitgang van de golfvormgenerator in om de elektrische stimulatie te starten. Laat de hMMT 8 twitch en 8 tetanuscontracties ondergaan. Zorg voor 2 minuten rust tussen de twitch- en tetanusstimulatiereeks, gedurende welke tijd de FITC-sluiter in de gesloten positie staat.
OPMERKING: Houd rekening met 10 s spontane activiteit voor en na elektrische stimulatie om minimale fluorescentie te registreren voor berekenings- en gegevensanalysedoeleinden. - Schakel de kanaaluitgang uit, maak alligatorclips los van de met tin beklede koperdraden, verwijder de tape van de draden en veeg elke elektrode af met 70% ethanol voordat deze in volgende hMMT-putten wordt ingebracht. Herhaal de stimulatie- en opnameprocedure voor alle hMMT's.
- Sla films op in TIFF-bestandsindeling voor analyse in ImageJ of alternatieve beeldbewerkingssoftware.
OPMERKING: Beperk de tijd die hMMTs buiten de couveuse doorbrengen door niet meer dan 3 weefsels tegelijk te stimuleren. Als er nog extra hMMT in het MyoTACTIC-plaatgedeelte moet worden geanalyseerd, breng het apparaat dan gedurende 10 minuten terug naar de incubator om hMMTs terug te laten keren naar 37 °C. - Als u calciumgegevens van voorbijgaande aard wilt analyseren, opent u eerst ImageJ. Selecteer Analyserenen vervolgens Metingen instellen,selecteer vervolgens de gemiddelde grijswaarde en schakel alle andere opties uit. Wanneer u klaar bent, opent u een calcium (.tiff) video(Aanvullende video 2).
- Schets de rand van de microtissue met behulp van een polygoonselectietool en sla dit gebied op als de ROI(Aanvullende video 2). Selecteer onder Meer in het venster ROI-beheer de optie Multi Meten en meet de fluorescerende intensiteit voor alle bestandssegmenten in één rij per segment (Aanvullende video 2).
- Kopieer alle metingen, inclusief het segmentnummer (frame), naar een spreadsheet en vergelijk de fluorescerende intensiteit van elk segment met de minimale spontane fluorescerende intensiteit van het bestand met behulp van ΔF / F0 = (Fonmiddellijk - Fminimum)/ Fminimum (Aanvullende video 2).
- Bereken de tijd voor elk frame door de framesnelheid van de filmopname te vermenigvuldigen met het segmentnummer (frame) en plot ΔF /F0 tegen de tijd voor de hMMT calciumtransiënte respons op stimulatie(Aanvullende video 2).
- Selecteer het piek calcium transiënte signaal voor elk van de 6 opeenvolgende contracties en gemiddelde waarden om de relatieve gemiddelde piek fluorescerende intensiteitsverandering van elke hMMT te berekenen (Aanvullende video 2).
OPMERKING: Sluit gegevens die voortvloeien uit de eerste twitch-contractie altijd uit van de algehele analyse. Een spreadsheet met de titel "Calcium Handling Template.xlsx" is beschikbaar op GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/Calcium-Handling-Template-) om de hMMT calciumtransiënte analyse te vergemakkelijken. Opvulbare cellen waar waarden en invoer moeten worden ingevoerd, zijn grijs gemarkeerd. Zorg ervoor dat u piekselectienummers aanpast, omdat dit slechts een gids is om te helpen bij piekselectie(aanvullende video 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hierin worden methoden beschreven om een 96-well PDMS-gebaseerd MyoTACTIC-kweekplatform uit een PU-mal te gieten, om arrays van hMMT-replicaweefsels te fabriceren en om twee aspecten van hMMT-functie te analyseren binnen de generatie van kweekapparatuurkracht en calciumbehandeling. Figuur 1 biedt een schematisch overzicht van de bereiding van MyoTACTIC kweekputten voor hMMT-zaaien. PDMS is een veelgebruikt polymeer op siliconenbasis, dat gemakkelijk kan worden gegoten om complexe apparaten te maken32. Een PDMS-gebaseerd protocol is ontworpen om een onbeperkt aantal 96-well kweekapparaten uit een gefabriceerde negatieve PU-mal30te gieten. De uiteindelijke uitgeharde PDMS-positieve plaat is flexibel en kan eenvoudig in kleinere functionele eenheden worden gesneden met behulp van een scheermesje met één rand(figuur 1). Hierdoor kan de gebruiker het apparaat schalen om te voldoen aan de hMMT-replicabehoeften die specifiek zijn voor hun experimentele ontwerp. Deze kleinere functionele eenheden zijn ook gunstig voor het overwinnen van een beperking van het werken met een ECM-steiger die snel polymeriseert, zoals fibrinehydrogels, door het aantal putten eenvoudig af te stemmen op de celzaaisnelheid van de gebruiker. Bovendien is PDMS gemakkelijk autoclaveerbaar en kan het voor onbepaalde tijd worden bewaard. Ten slotte kan vanuit logistiek oogpunt een volledige MyoTACTIC-plaat worden bedekt door elk standaard 96-well plaatdeksel, en de afmeting en het profiel van MyoTACTIC-plaatporties zijn vatbaar voor incubatie binnen een kweekplaat van 10 cm, om de steriliteit van de hMMT-cultuur te garanderen. Pluronic F-127-oplossingscoating voorafgaand aan celzaaien dient een dubbele rol van het bieden van een extra mate van sterilisatie van kweekputten, en als een niet-ionische oppervlakteactieve stof, waardoor celhechting wordt voorkomen ten gunste van uniforme cel - ECM-remodellering (Figuur 1).
Wanneer de vereeuwigde myogene voorlopercelpopulatie klaar is voor experimenten, worden de cellen vervolgens ingekapseld in een hydrogel bestaande uit fibrinogeen en keldermembraanextract. Het cel-ECM-mengsel wordt vervolgens gelijkmatig afgezet in de ovale pool op de bodem van elke MyoTACTIC-put, en vervolgens gedurende een kweekperiode van 14 dagen organiseren de cellen zich ruimtelijk over deze twee verticale palen om een 3D-microtissue te vormen die wordt bevolkt met een bed van uitgelijnde, multinucleated, dwarsgestreepte myotubes die lijken op aspecten van inheemse weefselorganisatie (Figuur 2a, g,h). Tijdens het remodelleringsproces wordt uniaxiale spanning gegenereerd tussen de twee verankeringspunten, en dit begeleidt het weefselzelforganisatieproces om op zijn beurt de vorming van een compact weefsel te stimuleren. Tijdens de differentiatieperiode blijft de breedte van de hMMCT's opgebouwd uit myoblasten afgeleid van gezonde patiënten redelijk consistent. In het geval van fouten die de hMMT-remodellering verstoren, gaat deze uniformiteit echter verloren(figuur 2a-f),waardoor deze eenvoudige metriek nuttig is bij de beoordeling van de hMMT-kwaliteitscontrole. Overijverig mengen van de cel - ECM-suspensie kan bijvoorbeeld resulteren in de vorming van bubbels. Bubbels die naar de MyoTACTIC worden overgebracht, belemmeren de hMMT-verbouwing. In dergelijke gevallen verplaatsen bellen sommige of alle myoblasten uit het gebied dat door de bel wordt ingenomen en vormen uiteindelijk een spleet in de laatste hMMT (figuur 2b; zie rode pijl). Een ander voorbeeld betreft de integriteit van de Pluronic F-127 coating in de putten. Pluronic F-127 is een niet-ionische oppervlakteactieve stof die voorkomt dat cellen zich goed hechten aan de MyoTACTIC. Als de coating tijdens het aspirateren wordt afgeschraapt, zullen myoblasten zich hechten aan het oppervlak van de MyoTACTIC-putten, waardoor nieuwe verankeringspunten worden gevormd en myotubes ontstaan die niet over de twee palen zijn uitgelijnd(figuur 2c). Extra fouten kunnen ook leiden tot afwijkende hMMT-verbouwingen, zoals te zien is in figuur 2d-f. Celvitaliteit na het zaaien kan ook worden geëvalueerd met behulp van op calceïne / propidiumjodide gebaseerde kleuringstests. Wanneer deze technische fouten worden vermeden, worden hMMT's bevolkt door een bed van uitgelijnde en multinucleated myotubes die zich uitstrekken over de lengte van elke hMMT (Figuur 2g). De myotubes zijn vrij uniform in grootte over hun lengte en tussen verschillende hMMTs (Figuur 2h-i). Myotubes worden gekenmerkt door de aanwezigheid van sarcomere strepen die worden gevisualiseerd door immunostaining voor sarcomerische α - actinine (SAA; Figuur 2h).
Functionele eigenschappen kunnen ook worden onderzocht in hMMTs die beginnen rond 7 dagen differentiatie. De experimentele opzet om deze functionele studies te voltooien wordt geïllustreerd in figuur 3a. De microscopie-opstelling is afgebeeld bovenop een vibraplane-tafel; dit is echter niet vereist om functioneel onderzoek te voltooien. In functionele studies worden elektroden gegenereerd zoals beschreven in de sectie elektrische stimulatie van het protocol in het PDMS ingebracht, zodat elektroden zich achter de palen bevinden. Het is belangrijk om een goede visualisatie van het postgebied te hebben voordat u de elektrode inbrengt, omdat de noodzaak om opnieuw te plaatsen kan leiden tot verplaatsing van het weefsel van de post. Het goed inbrengen van de elektroden is ook belangrijk om een scherpe focus van de paal te verkrijgen, zodat post-deflectie vervolgens kan worden gevolgd met het python-script. Figuur 3b toont een representatieve verplaatsing van de MyoTACTIC putplaatpaal als reactie op lage (twitch, 0,5 Hz) en hoge (tetanus, 20Hz) frequentie hMMT elektrische stimulatie. Kwantificering van postverplaatsing kan worden gebruikt om de geïnduceerde contractiele kracht van hMMTs te berekenen (figuur 3c). Wanneer deze informatie wordt gecombineerd met hMMT-doorsnede, kan specifieke kracht worden bepaald30. Bovendien spelen calciumtransiënten een belangrijke rol bij spiercontractie. Stabiele transductie van skeletspiermyoblasten met een genetisch gecodeerde calciumindicator zoals GCaMP612,30,33,34,maakt live bewaking van calciumtransiënten12,30,34mogelijk. Calciumtransiënten werden geanalyseerd met behulp van de eerder beschreven elektrische stimulatie-opstelling om dag 12 hMMTs te stimuleren die werden gegenereerd met onsterfelijke myoblasten die de MHCK7-GCAMP6-reporter tot expressie brengen(figuur 4a),en gekwantificeerd als gemiddelde piek fluorescerende intensiteit tijdens lage (twitch, 0,5 Hz) en hoge (tetanus, 20Hz) frequentie elektrischestimulatie (figuur 4b). Er wordt waargenomen dat de eigenschappen van hMMT-calciumbehandeling, gemeten in verschillende experimenten, relatief consistent zijn(figuur 4b). Kwantificeringsmethoden voor post-deductie en calciumbehandeling worden beschreven in aanvullende video 1 en aanvullende video 2.
Figuur 1: Voorbereiding van MyoTACTIC PDMS-plaat voorafgaand aan hMMT-zaaien. Het 96-well platform dat MyoTACTIC wordt genoemd, wordt vervaardigd door eerst polydimethylsiloxaan (PDMS) uit te harden in een negatieve polyurethaan (PU) mal. Het op PDMS gebaseerde kweekplatform wordt vervolgens zorgvuldig uit de negatieve PU-mal geschild. In een academische setting wordt het PDMS-apparaat vervolgens in kleinere eenheden gesneden met 6 ± 2 functionele putten. Deze putjes worden vervolgens in een sterilisatiezakje geplaatst, geautoclaveerd en bewaard tot gebruik. Tot één dag voor gebruik wordt het gewenste aantal apparaatporties in een kweekplaat van 10 cm geplaatst en wordt Pluronic F-127 aan elke put toegevoegd. Het 10 cm schoteldeksel wordt toegevoegd, de rand wordt afgedicht met parafilm voordat de plaat 2-24 uur op 4° wordt geïncubeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: MyoTACTIC ondersteunt hMMT-zelforganisatie en vorming van uitgelijnde myotubes. (a) (boven) Schematische tijdlijn van hMMT-zelforganisatie en daaropvolgende myotube-rijping gedurende een cultuurperiode van 14 dagen. (onder) Representatieve 4x fasecontrastbeelden om de kinetiek van vereeuwigde myoblasten zelforganisatie over de twee verticale palen te illustreren die resulteren in de vorming van een 3D hMMT. Schaalbalk, 500 μm. (b-f) Representatieve 4x fasecontrastbeelden van hMMT's op dag 12 van differentiatie met hMMT-uitkomsten veroorzaakt door (b) een bel in de cel - ECM op het moment van zaaien (rode pijl wijst naar bel induceren hMMT-schade), (c) onjuiste aspiratie van de Pluronic F-127-oplossingscoating en (d-f ) hMMT-overremodellering die kan wijzen op onjuiste ECM-gelation, gebrek aan ACA-activiteit in cultuurmedia, onjuiste zorg voor myoblast-ouderlijke lijn, enz. Schaalbalk, 500 μm. (g) Representatief betegeld en afgeplat confocale beeld van een dag 12 hMMT genomen bij 10x vergroting. hMMTs worden direct in de PDMS-mal bevestigd, vervolgens zorgvuldig verwijderd en in een 96 well-cultuurplaat geplaatst voor kleuring. Sarcomerische α-actinine (SAA) getoond in magenta, en Hoechst 33342 nucleaire counterstain getoond in cyaan. Schaalbalk, 500 μm. (h) Representatief confocale beeld van een dag 12 hMMT bij 40x vergroting. hMMT myotubes en kernen worden gevisualiseerd door immunostaining voor SAA (magenta) en counterstaining met Hoechst 33342 (cyaan). Schaalbalk, 50 μm. (i) Dot plot grafiek van de gemiddelde hMMT myotube diameter op dag 12 van differentiatie. Waarden worden gerapporteerd als gemiddelde ± SEM. n = 8 hMMTs uit 3 biologische replicaties, onderscheiden door symboolvormen, waarbij minimaal 30 myotubes per hMMT worden geanalyseerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: In situ meting van de contractiele kracht binnen het MyoTACTIC-platform. (a) Weergave van de elektrische stimulatie-opstelling (links). Hoewel afgebeeld in deze opstelling, is een vibraplane-tafel niet vereist. Een smartphonecamera en een houder werden uitgerust met het oculair van een omgekeerde microscoop uitgerust met een fluorescentielamp voor de video-opnames van hMMTs elektrische stimulatie na verplaatsingen (links). 25 G naalden werden omwikkeld met vertinde koperdraden (rechtsonder), aangesloten op een BNC naar alligator clip connector kabel (rechtsboven) en werden bevestigd aan een willekeurige golfvormgenerator. Plaatsing van elektroden tijdens elektrische stimulatie wordt rechtsonder weergegeven. (b) Representatieve snapshots genomen van video's na afbuiging die op dag 12 van differentiatie van hMMST's zijn verkregen. Video's werden vastgelegd met een vergroting van 10x. Effen witte verticale lijnen tonen postplaatsing wanneer hMMTs ontspannen zijn, terwijl gestippelde witte verticale lijnen postverplaatsing laten zien na hoge (tetanus 20 Hz) of lage (0,5 Hz) frequentiestimulatie. Schaalbalk, 100 μm. (c) Dot plot grafiek van gemiddelde hMMT twitch (0,5 Hz) - en tetanus (20 Hz) -geïnduceerde contractiele kracht op dag 12 van differentiatie. Waarden worden gerapporteerd als gemiddelde ± SEM. n = 9 hMMTs van 3 biologische replicaties, onderscheiden door symboolvormen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: In situ meting van calciumbehandeling binnen het MyoTACTIC-platform. (a) Representatieve beelden van een 4x vergrotingsvideo-opname van spontane GCaMP6+ calciumtransiënten en calciumtransiënten in reactie op lage (twitch-contractie, 0,5 Hz) en hoge (tetanuscontractie, 20 Hz) frequentie elektrische stimulatie. hMMTs worden omlijnd door een gestippelde gele lijn. Schaalbalk, 200 μm. (b) Dot plot grafiek met kwantificering van de gemiddelde piek fluorescentie-intensiteit per hMMT na lage (twitch contractie, 0,5 Hz) en hoge (tetanuscontractie, 20 Hz) frequentie elektrische stimulatie. Waarden worden gerapporteerd als gemiddelde ± SEM. n = 9 hMMTs van 3 biologische replicaties, onderscheiden door symboolvormen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende video 1: Demonstratie van methoden om gegevens na afbuiging te analyseren. Een representatieve video van post-deflection analyse op dag 12 van differentiatie die wordt gevolgd door het aangepaste script tijdens tetanusstimulatie. Eerst wordt de ROI-grootte direct in het posttrackingscript geselecteerd. Vervolgens wordt de video geopend door de afspeelknop te selecteren om het script uit te voeren. Een scherp gefocust gebied van het bericht wordt geselecteerd als de ROI en het blauwe vak voor het bijhouden van berichten wordt geplaatst. Enter wordt ingedrukt om roi te vergrendelen en nogmaals ingedrukt om het script uit te voeren. "y" wordt ingevoerd als reactie op de prompt "Multiple contraction video? [J/N]", dan wordt 'n' ingevoerd als reactie op de prompt "Export post locations as .csv file? [J/N]". Post-deflection als relatieve verplaatsing in pixels is de uiteindelijke uitvoer. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende video 2: Demonstratie van methoden om GCaMP6 calcium transiënte gegevens te analyseren. Een representatieve video van analyse van de behandeling van epifluorescentiecalcium op dag 12 van differentiatie tijdens tetanusstimulatie. Eerst is een video van calciumtransiënten (opgeslagen als een reeks tiff-afbeeldingen) geopend in ImageJ en heeft de gebruiker door frames genavigeerd totdat de hMMT zichtbaar is. Vervolgens wordt de vereiste analysemeting "gemiddelde grijswaarde" bevestigd en wordt de hMMT geschetst met behulp van het veelhoekige tekengereedschap. Dit overzicht wordt opgeslagen als het interessegebied en de fluorescerende intensiteit van elk videosegment wordt geanalyseerd met behulp van meerdere metingen. Deze metingen worden gekopieerd naar de spreadsheet "Calcium Handling Template" met framegegevens en calciumtransiënte piekwaarden ingevuld en bevestigd. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit manuscript beschrijft methoden om een 3D hMMT-cultuurmodel te fabriceren en te analyseren dat kan worden toegepast op studies van elementaire spierbiologie, ziektemodellering of voor het testen van kandidaat-moleculen. Het MyoTACTIC-platform is kostenvriendelijk, eenvoudig te produceren en vereist een relatief klein aantal cellen om microtissues van skeletspieren te produceren. hMMTs gevormd binnen het MyoTACTIC-cultuurplatform bestaan uit uitgelijnde, multinucleated en dwarsgestreepte myotubes en reageren op elektrische stimuli door calciumtransiënten te initiëren die contractie veroorzaken(figuur 2, figuur 3, figuur 4). Eerdere studies toonden aan dat hMMTs een vergelijkbare respons bieden op biochemische stimuli en rijpingsniveaus kunnen bereiken die overeenkomen met die gerapporteerd in grotere 3D-skeletspiermodellen12,30.
Een cruciaal thema in de MyoTACTIC-plaatfabricage en hMMT-generatie is ervoor te zorgen dat bubbels worden voorkomen en indien gevormd, zijn verwijderd. Om het gieten in één stap van een bedienbare PDMS-mal te vergemakkelijken, was een PU-mal gegenereerd stroomafwaarts van de eerste 3D-geprinte plastic mal die eerder werd beschreven door Afshar et al.30. De PU-mal die is gegenereerd, stelt gebruikers in staat om een 96-putvoetafdruk van PDMS-mal te produceren waarbij maximaal 96 putten functioneel zijn (bevatten twee palen), zoals gedicteerd door de PU-malfabricagestap. Tijdens de fabricage van de PDMS MyoTACTIC-plaat missen nieuwe gebruikers vaak kleinere bubbels die achterblijven in het vloeibare PDMS, zelfs na ontgassing. Bubbels die zich lokaliseren naar gebieden van de PU-mal die overeenkomen met de verankerende flexibele paalstructuren, zullen resulteren in postbreuk bij scheiding van de PU-mal van de PDMS-cultuurplaat en laten daarbij een klein stukje uitgehard PDMS achter in de PU-mal. Perslucht kan worden gebruikt om deze uitgeharde PDMS-restanten te verwijderen, en als dit niet gebeurt, zal het aantal functionele putten dat beschikbaar is voor toekomstige plaatgietstukken effectief verminderen. Daarom is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat alle bubbels zijn verwijderd voordat de PDMS-plaat wordt uitgehard, omdat een voordeel van dit platform is dat het een op zichzelf staand apparaat is, waarbij alle kenmerken van de plaat in één stap worden gegoten in plaats van dat elk individueel microtissue-verankeringspunt handmatig in de kweekputten moet worden geïntroduceerd35, 36,37. De meeste academische laboratoriumstudies vereisen geen volledige MyoTACTIC-kweekplaat. Om het gebruik van elke PMDS-plaat te maximaliseren, wordt deze handmatig in groepen van 6 ± 2 MyoTACTIC-putten gesneden. Om dit proces te verbeteren, kan een PU-mal waarmee gebruikers functionele eenheden van 6 ± 2 MyoTACTIC-putten kunnen schillen, deze plaatsnijstap volledig elimineren. Bovendien zullen grote bellen die tijdens het mengen of tijdens de weefselzaaiprocedure in de cel-ECM-oplossing worden ingebracht, de juiste weefselvorming aantasten. Deze grote bellen verplaatsen cellen uit het gebied dat de bel inneemt, wat vaak resulteert in hMMCT's met gebieden met weinig myotubes die zullen bezwijken aan contractiele stress en knappen tijdens elektrische stimulatie.
Een opmerkelijk voordeel van MyoTACTIC is de mogelijkheid om actieve krachtgeneratie en calciumbehandelingseigenschappen in situ te kwantificeren. Dit is een uitdaging voor veel andere 3D-kweeksystemen, waarbij het onderzoeken van 3D-weefselcontractiele kracht wordt geïmplementeerd als een eindpunttest na verwijdering van het weefsel uit het kweekapparaat12,37. Daarom is MyoTACTIC zeer geschikt voor het ondersteunen van longitudinale studies, bijvoorbeeld het begrijpen van de temporele effecten van medicamenteuze behandeling op de skeletspieren. Een beperking van de hierin beschreven methode om actieve krachtgeneratie en calciumbehandelingseigenschappen in situ te kwantificeren, is de handmatige plaatsing van elektroden, waardoor het gebruik van dit systeem voor toepassingen voor het testen van moleculen met een hoog gehalte wordt beperkt. Een mogelijke oplossing zou zijn om een duidelijk deksel van elektroden te ontwerpen dat is opgezet als een parallel circuit dat direct kan worden ingebracht in een gestandaardiseerde set functionele putten die elektrische stimulatie van meerdere weefsels tegelijk mogelijk maken. Als alternatief zou het gebruik van een myogene voorlopercellijn die stabiel een channelrhodopsineconstruct tot expressie brengt, depolarisatie van spiercelmembraan mogelijk maken, en dus weefselcontractie geïnduceerd door blootstelling aan blauw licht. Bovendien wordt actieve kracht vastgelegd in video's, omdat post-deflectie en kwantificering van actieve contractiele kracht op een onbevooroordeelde manier kan worden uitgevoerd door een aangepast semi-geautomatiseerd python-script te gebruiken om post-afbuiging in korte video's te volgen. Daarom wordt onbevooroordeelde longitudinale beoordeling van gestimuleerde contractiele kracht mogelijk gemaakt door MyoTACTIC30. Om de efficiëntie van data-analyse te verbeteren, zijn smartphone-applicaties die zijn ontworpen om kracht te meten en tegelijkertijd video's van post-deflection vast te leggen, ideaal om de doorvoer te verhogen.
Ten slotte is de waarde van dit platform ook eerder beschreven in zijn vermogen om de respons op geneesmiddelen nauwkeurig te voorspellen. Vergelijkbaar met klinische uitkomsten, hebben we eerder gemeld dat behandeling van hMMTs (gemaakt met primaire myoblasten) met myotoxische verbindingen (dexamethason, cerivastatine) myotube-atrofie veroorzaakte en verminderde actieve contractiele kracht30. Bovendien werd de voorspellende waarde van myoTACTIC gegenereerde hMMTs gevalideerd door aan te tonen dat een klinisch relevante dosering van een chemotherapeuticum dat wordt gebruikt voor de behandeling van alvleesklierkanker, een ziekte die vaak wordt geassocieerd metcachexie 2, de hMMT-kwaliteit en contractiele kracht aanzienlijk verminderde30. Daarom toont de eenvoudige fabricage van MyoTACTIC en het gebruiksgemak bij het genereren van 3D-hMMT's veel voordelen voor het vastleggen van gegevens met een hoog gehalte, zoals blijkt uit de betrouwbaarheid met betrekking tot structurele en functionele uitgangen. Een algemene beperking van PDMS-gebaseerde celkweekapparaten is dat PDMS eiwitten adsorbeert. De hierin beschreven methode maakt gebruik van serumbevattende kweekmedia, die deze beperking overwinnen door te dienen om het apparaat te 'blokkeren' en de effecten van molecuul- en medicijnbehandelingen te observeren. Vanwege deze beperking moeten echter definitieve conclusies over molecuuldoses worden vermeden en worden dosisresponscurven aangemoedigd. Omgekeerd is dit platform niet geschikt voor serumvrije microtissuekweek, omdat de additieven zullen adsorberen aan het PDMS, waardoor de gezondheid en ontwikkeling van weefsel wordt belemmerd. In de toekomst zal de integratie van technieken zoals 3D-bioprinting en/of geautomatiseerde vloeistofbehandeling de doorvoer in de productie van hMMT-culturen verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
We willen Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli en Sadegh Davoudi bedanken voor hun bijdrage aan de uitvinding van het MyoTACTIC-cultuurplatform en het vaststellen van de fabricage- en analysemethoden die hierin worden beschreven. HL ontving financiering van een Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Training Program in Organ-on-a-Chip Engineering and Entrepreneurship Scholarship en een University of Toronto Wildcat graduate scholarships. PMG is de Canada Research Chair in Endogenous Repair en kreeg voor deze studie steun van het Ontario Institute for Regenerative Medicine, het Stem Cell Network en van Medicine by Design, een Canada First Research Excellence Program. Schematische diagrammen werden gemaakt met BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline Solution, Sterile | House Brand | 1010 | 10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C |
| 25G Needle | BD, Medstore, University of Toronto | 2548-CABD305127 | |
| 6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), Powder | Sigma - Aldrich | A2504-100G | A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| 6.35 mm ID Tubing | VWR | 60985-528 | |
| AB1167 Myoblast Cell Line | Institut de Myologie (Paris, France) | ||
| Arbitrary Waveform Generator | Rigol | DG1022Z | |
| Basement Membrane Extract (Geltrex) | Thermo Fisher Scientific | A14132-02 | Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C |
| Benchtop Vacuum Chamber | Sigma - Aldrich | D2672 | |
| BNC to Aligator Clip Cable | Ordered from Amazon | ||
| Culture Plastics | Sarstedt | Includes culture plates, serological pipettes, etc | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma - Aldrich | D8418-250ML | |
| DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21600069 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma - Aldrich | F8630-5G | Aliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C |
| Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Human Recombinant Insulin | Sigma - Aldrich | 91077C | Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C |
| Image Acquisition Software | Olympus | cellSens Dimension | |
| Image Processing Software | National Institutes of Health | ImageJ | |
| Isotemp Oven | Thermo Fisher Scientific | 201 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope - Camera Mount | Labcam | Labcam for iPhone | Ordered from Amazon |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic Disposable Syringes, 1cc | BD | 2606-309659 | |
| Plastic Disposable Syringes, 50cc | BD | 2612-309653 | |
| Pluronic F-127, Powder, BioReagent | Sigma - Aldrich | P2443-250G | A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C |
| Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit) | Dow | 4019862 | Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc. |
| Polyurethane Negative Mold | In House | ||
| Release Agent | Mann Release Technologies | 200 | |
| Rotary Vane Vacuum Pump | Edwards | A65401906 | |
| Scalpel | Almedic, Medstore, University of Toronto | 2586-M36-0100 | |
| Single Edge Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Skeletal Muscle Cell Basal Medium | Promocell | C-23260 | 30 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C. |
| Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell | C-23060 | 42 mL aliquots are generated and stored at 4°C. |
| Smartphone (iPhone) | Apple | SE | |
| Standard Duty Dry Vacuum Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Sterilization Bag | Alliance | 211-SCM2 | |
| Thimble | Igege | Ordered from Amazon | |
| Thrombin from human plasma | Sigma - Aldrich | T6884-250UN | 100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at - 20°C. |
| Tin coated copper wire | Arco | B8871K48 | Ordered from Amazon |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Thermo FIsher Scientific | 25200072 | |
| Vacuum Chamber 2 | SP Bel-Art | F42027-0000 |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal Muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy. DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).
- Young, J., et al. MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery. SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).
- DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. The price of innovation: New estimates of drug development costs. Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Vandenburgh, H., et al. Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
- Vandenburgh, H., et al. Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts. The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).
- Kim, J. H., et al. 3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration. Scientific Reports. 8 (1), 12307 (2018).
- Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Afshar Bakooshli, M., et al. A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction. eLife. 8, 1-29 (2019).
- Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).
- Urciuolo, A., et al. Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale. PLoS One. 15 (5), 0232081 (2020).
- Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units. Microsystems & Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).
- Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line. Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).
- Capel, A. J., et al. Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).
- Gholobova, D., et al. Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. 4 (10), 5847 (2018).
- Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Maffioletti, S. M., et al. Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering. Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).
- Chal, J., et al. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
- Nagashima, T., et al. In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells. Advanced Biosystems. , 2000121 (2020).
- Mills, R. J., et al. Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities. Biomaterials. 198, 217-227 (2019).
- Legant, W. R., et al. Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).
- Prüller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture. PLOS One. 13 (9), 0202574 (2018).
- Sakar, M. S., et al. Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators. Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).
- Zhang, X., et al. A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles. Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).
- Rajabian, N., et al. Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration. Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).
- Afshar, M. E., et al. A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength. Scientific Reports. 10 (1), 6918 (2020).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (1), 34 (2011).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Bakooshli, M. A., et al. A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies. BioRxiv. , 275545 (2018).
- Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel. Vitro Cellular & Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle. Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).
