Summary
Hier demonstreren we een geoptimaliseerde techniek voor het beoordelen van wondherstel met behulp van ex vivo menselijke huid in combinatie met een whole-mount kleuringsbenadering. Deze methodologie biedt een preklinisch platform voor de evaluatie van mogelijke wondtherapieën.
Abstract
Chronische niet-genezende wonden, die voornamelijk ouderen en diabetici treffen, zijn een belangrijk gebied van klinische onvervulde behoefte. Helaas zijn de huidige chronische wondbehandelingen ontoereikend, terwijl beschikbare preklinische modellen de klinische werkzaamheid van nieuwe therapieën slecht voorspellen. Hier beschrijven we een preklinisch model met hoge doorvoer om meerdere aspecten van de reactie op het herstel van de menselijke huid te beoordelen. Gedeeltelijke dikte wonden werden gemaakt in menselijke ex vivo huid en gekweekt over een helende tijd cursus. Huidwondbiopten werden verzameld in fixatief voor de hele mount kleuringsprocedure. Vaste monsters werden geblokkeerd en geïncubeerd in primair antilichaam, waarbij detectie werd bereikt via fluorescerend geconjugeerd secundair antilichaam. Wonden werden tegengehouden en afgebeeld via confocale microscopie voordat het percentage wondsluiting (re-epithelialisatie) in elke biopsie werd berekend. Door dit protocol toe te passen, onthullen we dat 2 mm excisionele wonden die zijn gecreëerd in een gezonde donorhuid volledig opnieuw worden geëpithelialiseerd tegen dag 4-5 na het verwonden. Integendeel, de sluitingspercentages van diabetische huidwonden worden aanzienlijk verminderd, vergezeld van verstoorde barrièrehervorming. Door menselijke huidwonden te combineren met een nieuwe whole-mount kleuringsbenadering, kan een snelle en reproduceerbare methode worden gebruikt om ex vivo wondherstel te kwantificeren. Gezamenlijk biedt dit protocol een waardevol menselijk platform om de effectiviteit van potentiële wondtherapieën te evalueren, waardoor preklinische tests en validatie worden getransformeerd.
Introduction
Chronische, niet-genezende wonden, die zeer vaak voorkomen bij ouderen en diabetici, zijn een belangrijk ongewaardeerd gebied van klinische onvervulde behoefte. Deze wonden vormen een grote fysieke en psychologische belasting voor patiënten en kosten zorgverleners miljarden per jaar om1te behandelen . Ondanks een beter begrip van wondbiologie en vooruitgang in technologie, kan tot 40% van de chronische wonden nog steeds niet genezen na de beste standaardzorg2. 14-26% van de patiënten met diabetische voetzweren heeft vervolgens amputatie nodig3, terwijl het sterftecijfer na amputatie na 5 jaar ongeveer 70%4bedraagt . Als gevolg hiervan is er een dringende vereiste om effectieve nieuwe therapieën te ontwikkelen om de kwaliteit van leven van patiënten te verbeteren en tegelijkertijd de aanzienlijke gezondheidslast te verminderen die wordt opgelegd door slecht genezende wonden. Slecht voorspellende preklinische modellen blijven een belangrijke hindernis voor de ontwikkeling van effectieve nieuwe therapieën.
Wondherstel is een dynamisch en veelzijdig proces met een divers scala aan celtypen, talloze communicatieniveaus en een weefselomgeving die tijdelijk wordt geremodelleerd. Huidgenezing wordt ondersteund door vier belangrijke herstelfasen: hemostase, ontsteking, proliferatie en matrixremodellering. Deze stadia werken uiteindelijk om bloedverlies en infectie te voorkomen, het wondoppervlak te sluiten (een proces dat re-epithelialisatie wordt genoemd) en de huid terug te brengen naar een niet-gewonde toestand5. Chronische wonden worden geassocieerd met diverse etiologie en wijdverspreide verstoring van genezingsprocessen6, wat de identificatie van therapeutische doelen verder bemoeilijkt. Niettemin is een breed scala aan modellen ontwikkeld om zowel de moleculaire als cellulaire drijfveren van wondpathologie op te helderen en nieuwe therapeutische benaderingen te testen7.
Het meest gebruikte wondherstelmodel is acute wondwonden bij de muis. Muizen zijn zeer goed verhandelbaar voor mechanistische studies en bieden gevalideerde modellen van veroudering en diabetes8. Ondanks de algemene overeenkomsten tussen muis en menselijke genezing, blijven verschillen tussen soorten in huidstructuur en genezingsdynamiek bestaan. Dit betekent dat het meeste muriene wondonderzoek zich niet gemakkelijk vertaalt naar de kliniek9. Bijgevolg is er een verschuiving geweest naar menselijke in vitro en ex vivo systemen met een hoge toepasbaarheid en vertaalbaarheid10,11.
Hier bieden we een diepgaand protocol voor het uitvoeren van excisionele wonden met gedeeltelijke dikte in ex vivo menselijke huid. We schetsen ook onze whole-mount kleuringsbenadering als een zeer reproduceerbare methode om ex vivo menselijke huidgenezing te evalueren. We tonen het traject van epidermale reparatie (re-epithelialisatie) en daaropvolgende barrièrevorming, waarbij we de snelheid van wondsluiting bij een gezonde versus diabetische menselijke huid evalueren. Ten slotte laten we zien hoe whole-mount kleuring kan worden aangepast voor gebruik met een reeks antilichamen om verschillende aspecten van de genezingsrespons te beoordelen.
Protocol
De menselijke huid werd verkregen van patiënten die een reconstructieve operatie ondergingen in het Castle Hill Hospital en de Hull Royal Infirmary (Hull, VK) onder volledig geïnformeerde, schriftelijke toestemming van de patiënt, institutionele richtlijnen en ethische goedkeuring (LRECs: 17/SC/0220 en 19/NE/0150). Niet-diabetische huid werd verzameld bij patiënten die routinechirurgie ondergingen (gemiddelde leeftijd = 68). Diabetische huid werd geselecteerd uit donoren die diabetes type II hadden vastgesteld en een voorgeschiedenis van ulceratie (gemiddelde leeftijd = 81). Monsters van chirurgie werden vervoerd in holdingmedia en onmiddellijk bij aankomst in het laboratorium verwerkt. Alle experimentele stappen met ongefixeerd menselijk weefsel werden uitgevoerd op Biosafety Level-2 (BSL-2) in een klasse II laminaire flow bioveiligheidskast.
1. Bereiding van huidkweekmedia en kleuringsreagentia
OPMERKING: Alle reagens- en verbruiksdetails zijn opgenomen in de tabel met materialen. Zorg ervoor dat alle reagentia en apparatuur die worden gebruikt voor de verwerking en kweek van menselijk weefsel steriel zijn. Steriliseer instrumenten voorafgaand aan het gebruik en ontsmet met ontsmettingsmiddel na contact met het weefsel. Decontinaat afvalproducten in 1% ontsmettingsmiddel voor verwijdering.
- Holding media: Vul hoge glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aan met 2 mM L-glutamine en 4% (v/v) antibioticum-antimycotische oplossing.
- Hank's uitgebalanceerde zoutoplossing (HBSS) met antibiotica: Voeg 4% (v/v) antibiotica-antimycotische oplossing toe aan HBSS. Bewaren bij 4 °C tot gebruik.
- Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS): Bereid DPBS voor door 9,6 g DPBS poeder per liter gedestilleerd water (dH2 O)op te lossen. Autoclaaf te steriliseren en bewaren bij 4 °C tot gebruik.
- Menselijke huidgroeimedia: Vul dmem met hoge glucose aan met 2 mM L-glutamine, 1% (v/v) antimycotische antimycotische oplossing voor antibiotica en 10% (v/v) foetale runderserum. Bewaren bij 4 °C tot gebruik.
- Huidfixatief: Voeg aan 450 ml dH2O 40 ml formaldehydeoplossing, 10 ml ijsazijn, 4,5 g natriumchloride en 0,25 g alkyltrimethylammoniumbromide toe. Bewaren bij kamertemperatuur (RT) en binnen enkele dagen gebruiken.
LET OP: Fixatief is gevaarlijk (irriterend en ontvlambaar). Voorzichtig hanteren en via een geschikte route afvoeren. - Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS): Bereid PBS voor op kleuring in de hele reeks door 6 g natriumchloride toe te voegen aan 100 ml fosfaatbufferoplossing en 900 ml dH2O.
- Kleuring wasbuffer: Los 0,5% (v/v) Triton X-100 op in PBS.
- Blokkeerbuffer: Voeg 0,2% (m/v) natrium azide en 2% (v/v) dierenserum toe aan de kleuringswasbuffer. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal twee weken.
OPMERKING: Blokkeer in het serum van de secundaire antilichaamgastheersoort. Natrium azide voorkomt bacteriegroei tijdens de incubatie. - DAPI-werkoplossing: Bereid een voorraad van 5 mg/ml van 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) in dimethylsulfoxide. Verdun de bouillon 1:1.000 in de kleuringswasbuffer om een DAPI-werkoplossing van 5 μg/ml te geven.
- Peroxidaseblok: Voeg 0,3% (v/v) waterstofperoxide toe aan de kleuringswasbuffer. Bewaren bij 4 °C tot gebruik. Blijf in het donker om ontbinding te voorkomen.
- ABC-HRP-kit:
- HRP-geconjugeerd secundair antilichaam: 1 druppel biotinylated konijn anti-geit IgG in 5 ml kleuringsbuffer. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal twee weken.
OPMERKING: De gebruikte kit/secundaire is afhankelijk van de gastheersoort van het primaire antilichaam. - Avidin-biotine complex (ABC) reagens: 2 druppels reagens A en 2 druppels reagens B in 5 ml kleuringswasbuffer. ABC-reagens moet ten minste 30 minuten voor gebruik worden bereid. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal twee weken.
- HRP-geconjugeerd secundair antilichaam: 1 druppel biotinylated konijn anti-geit IgG in 5 ml kleuringsbuffer. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal twee weken.
- Peroxidasesubstraat: 3 druppels reagens 1, 2 druppels reagens 2, 2 druppels reagens 3 en 2 druppels waterstofperoxide in 5 ml dH2O. Peroxidasesubstraat moet onmiddellijk voor gebruik vers worden bereid en kan niet worden opgeslagen.
2. Voorbereiding van de huid voor het verwonden
OPMERKING: Deze stappen moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast van klasse II laminaire stroom.
- Verzamel de huid in de media en transporteer deze naar de BSL-2 kast.
- Plaats de huidhuidzijde naar beneden in een steriele petrischaal van 90 mm en verwijder vetweefsel met een steriele schaar.
- Plaats de huid in een buisje van 50 ml met 25 ml HBSS met antibiotica gedurende 10 minuten bij RT. Schud met tussenpozen om eventueel restbloed en vetweefsel te verwijderen.
- Herhaal stap 2.3 met een nieuwe buis van 50 ml.
- Plaats de huid in een verse tube van 50 ml met 25 ml HBSS, dit keer zonder antibiotica gedurende 10 minuten bij RT. Schud zoals in stap 2.3.
- Voer een laatste huidspoeling uit door de huid in een nieuwe tube met 25 ml DPBS te plaatsen. De huid is nu klaar om te verwonden.
3. Het creëren van ex vivo menselijke huidwonden
OPMERKING: Deze stappen moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast van klasse II laminaire stroom.
- Bereid de huidkweekgerechten voor het verwonden. Stapel in een petrischaal van 60 mm twee steriele absorberende pads en voeg 4 ml menselijke huidmedia toe via de zijkant van de schaal. Plaats een steriel nylon filtermembraan op de absorberende padstack.
OPMERKING: Huidmedia kunnen worden gewijzigd, afhankelijk van de vereiste behandelingsomstandigheden. Op elke stapel mogen maximaal drie wondverplantingen worden gekweekt. - Droog de huidzijde op steriel gaas in een petrischaaltje van 90 mm om de resterende DPBS te verwijderen.
OPMERKING: Dit voorkomt dat de huid rondschuift tijdens het verwonden. - Plaats de huid dermis kant naar beneden op een schone 90 mm Petri schaal deksel en dep de epidermis droog met vers steriel gaas.
OPMERKING: Het is gemakkelijker om de huid in een petrischaaldeksel te verwonden dan in de basis. Latere werkzaamheden moeten snel worden uitgevoerd om uitdroging van de huid te voorkomen. - Houd de huid strak, druk een 2 mm biopsie punch tegen de huid en draai zachtjes. Niet helemaal door de huid slaan.
OPMERKING: Gedeeltelijke dikte wonden zijn ontworpen om te slaan door de epidermis en gedeeltelijk in de dermis. Er kan sprake zijn van donor-naar-donor en site-to-site variabiliteit in de kracht die nodig is om de gedeeltelijke diktewond te creëren. - Gebruik gebogen getande weefsel tang om elke kant van de 2 mm wond op te pakken en haak gebogen irisschaar onder de 2 mm wond om het gelijkmatig uit te snijden.
- Biopsie rond de centrale 2 mm wond met behulp van een 6 mm biopsie punch om een 6 mm explant te creëren met een gedeeltelijke dikte 2 mm wond in het midden.
OPMERKING: Een biopsiestoot van 6 mm kan worden gebruikt om de huid te scoren om aan te geven waar elke wond van 2 mm moet zijn. Zorg ervoor dat u het weefsel niet volledig doorboort. Maak wond explants in een honingraatpatroon om verspilling te verminderen. - Plaats wond explants epidermis kant omhoog op de nylon filter membraan stack (voorbereid in stap 3.1).
OPMERKING: Let er bij het hanteren van wonduitplantingen op dat u de centrale wond niet beschadigt. Gebruik een kleine tang en pak elke explant aan tegenovergestelde kanten op. - Incubeer wonden bij 32-37 °C en 5% CO2 in een bevochtigde atmosfeer (90-95%) gedurende 1-7 dagen. Vervang de media elke 2-3 dagen.
4. Whole-mount kleuring van ex vivo wonden
OPMERKING: Deze sectie beschrijft immunofluorescentie- en immunoperoxidasekleuringsmethoden. Meng alle reagentia goed voor gebruik.
- Fluorescerende kleurmethode
- Verzamel wondverplantingen in microcentrifugebuizen van 1,5 ml met 500 μL huidfixatief en incubeer 's nachts bij 4 °C.
OPMERKING: Het fixatief dat in dit protocol wordt gebruikt, werkt goed voor de beschreven antilichamen. Optimalisatie is vereist voor andere antilichamen. Weefselfixatie langer dan 24 uur kan leiden tot overfixatie. - Verwijder de volgende dag het fixatief en vervang door 1 ml kleuringswasbuffer. Biopten kunnen tot 2 weken voor het kleuren worden bewaard in de wasbuffer bij 4 °C.
OPMERKING: Gebruik voor alle wasbufferstappen een serologische pipet of pipettip, waarbij u ervoor zorgt dat de wond niet wordt beschadigd. - Aspireer de kleuringswasbuffer en spoel nog een keer met 1 ml kleuringswasbuffer.
- Bereken de hoeveelheid blokkeerbuffer die nodig is voor stap 4.1.5-4.1.6 (aantal monsters x 300 μL = hoeveelheid blokkeerbuffer in μL). Maak indien nodig extra buffer.
- Voeg 150 μL blokkeerbuffer toe aan elk monster en incubeer gedurende 1 uur bij RT. Zorg er voor alle kleurstappen voor dat elk monster voldoende bedekt is en dat er geen bellen zijn die het wondoppervlak van de biopsie bedekken.
OPMERKING: Deze stap kan worden uitgevoerd in microcentrifugebuizen van 1,5 ml of in een plaat van 48 putjes. Als u een plaat van 48 put gebruikt, incubeer dan de wonden met de voorkant naar beneden in elke put. - Verdun het primaire antilichaam in de resterende blokkeerbuffer.
OPMERKING: Antimuis keratine 14 (K14) verdund 1:1.000 in blokkeerbuffer werkt goed. Optimaliseer deze stap voor gebruik met andere antilichamen of meerdere sondes. - Aspireer de blokkerende buffer en voeg 150 μL primair antilichaam per put/microcentrifugebuis toe. Incubeer wond explants in primaire antilichamen bij 4 °C 's nachts.
- Aspireer de volgende dag het primaire antilichaam en spoel af in de kleuringswasbuffer met 0,2% natrium azide gedurende 1 uur bij RT (500 μL per monster).
- Voer nog drie spoelstappen uit met behulp van een wasbuffer (30 minuten per wasbeurt, 500 μL per monster).
- Verdun het fluorescerend geconjugeerde secundaire antilichaam in de wasbuffer voor kleuring (bijv. geitenantimuis 488 bij 1:400 verdunning).
- Bereken de vereiste hoeveelheid secundair antilichaam (aantal monsters x 150 μL = hoeveelheid in μL).
- Voeg 150 μL secundair antilichaam toe aan elke put/microcentrifugebuis. Incubeer gedurende 1 uur bij RT. Voer incubatiestappen 4.1.10 - 4.1.16 uit in het donker, omdat het secundaire antilichaam lichtgevoelig is.
OPMERKING: Deze stap kan indien nodig 's nachts bij 4 °C worden uitgevoerd. Optimaliseer de concentratie secundair antilichaam die nodig is voor voldoende signaal en beperkte achtergrondkleuring. - Verwijder het secundaire antilichaam en voer 3 x 30 minuten spoelen uit met een wasbuffer (500 μL per monster).
- Gooi de overgebleven wasbuffer weg en bereken de benodigde hoeveelheid DAPI-werkoplossing (volgens stap 4.1.11).
- Counterstain elke explant met 150 μL DAPI-werkoplossing gedurende 10 minuten bij RT.
OPMERKING: DAPI zal celkernen blauw kleuren. Hoechst kleurstof kan worden gebruikt als alternatief voor DAPI. - Voer twee laatste wasbeurten van 30 minuten uit met een wasbuffer (500 μL per monster). Biopten kunnen tot twee weken voor beeldvorming worden bewaard in de kleuringswasbuffer bij 4 °C in het donker.
- Verzamel wondverplantingen in microcentrifugebuizen van 1,5 ml met 500 μL huidfixatief en incubeer 's nachts bij 4 °C.
- Brightfield kleurmethode.
- Voer stap 4.1.1 - 4.1.3 uit.
- Blus endogene peroxidaseactiviteit met peroxidaseblok bij 4 °C 's nachts.
OPMERKING: Deze stap is belangrijk bij het gebruik van een HRP-geconjugeerd antilichaam om niet-specifieke achtergrondkleuring uit het weefsel te verminderen. Sterk gevasculariseerd weefsel zal meer endogene peroxidase activiteit bevatten. - Gooi het peroxidaseblok weg en spoel twee keer gedurende 30 minuten in de wasbuffer.
- Voer stap 4.1.4 - 4.1.8 uit.
OPMERKING: Wasbeurten na stap 4.1.7 zijn bijzonder belangrijk om natrium azide uit de monsters te verwijderen. Als natrium azide niet voldoende wordt verwijderd, zal het de HRP inactiveren en de kleuringsdetectie verstoren. - Voeg 150 μL HRP-geconjugeerd secundair antilichaam toe aan elke put/microcentrifugebuis en incubeer 's nachts bij 4 °C of 1 uur bij RT.
- Verwijder het secundaire antilichaam en voer 3 x 30 minuten wasbeurten uit in de wasbuffer voor vlekken.
- Voeg 150 μL ABC-reagens toe aan elke put/microcentrifugebuis en incubeer 's nachts bij 4 °C of 1 uur bij RT.
- Aspireer het ABC-reagens en voer 3 x 30 minuten wasbeurten uit in de wasbuffer voor kleuring.
- Voeg 150 μL peroxidasesubstraat toe aan één explant en bepaal de tijd die nodig is om een merkbare kleurverandering te detecteren.
OPMERKING: Kies een monster waar sterke vlekken worden verwacht. In dit geval een rode ring om de migrerende epidermis (K14) weer te geven. 3,3'-diaminobenzidine-4, of een ander geschikt chromogene substraat, kan worden gebruikt als vervanging voor dit peroxidasesubstraat. - Zodra een kleurverandering is waargenomen, verwijdert u het peroxidasesubstraat en vervangt u het door 1 ml dH2O.
- Herhaal de detectie van peroxidasesubstraat voor de andere explants en incubatie gedurende de in stap 4.2.11 bepaalde tijd.
- Spoel alle explants af met 1 ml dH2O om resterend peroxidasesubstraat te verwijderen. Hoewel explants tot een week bij 4 °C kunnen worden bewaard voordat ze worden afgebeeld, is het beter om ze zo snel mogelijk in beeld te brengen om uitspoeling van het peroxidasesubstraat in de dH2O na verloop van tijd te voorkomen.
5. Beeldvorming en kwantificering
- Fluorescerende beeldvorming
OPMERKING: Fluorescerende beeldvorming wordt uitgevoerd met behulp van een confocale laserscanmicroscoop. Een omgekeerde fluorescerende microscoop kan echter voldoende zijn voor het verkrijgen van 2D-beelden om de sluitingspercentages van wonden te kwantificeren. Let er bij het selecteren van secundaire antilichamen op dat de gekozen fluorchromen compatibel zijn met de excitatie- en emissiespectra van de beschikbare microscopieapparatuur.- Gebruik een confocale laserscanmicroscoop uitgerust met een 2,5x, 10x en 20x objectief, x-y-z gemotoriseerd podium, digitale camera en acquisitiesoftware. Schakel de lichtmelder (TPMT) in om elke biopsie eenvoudig te visualiseren en de totale wondsluiting te meten. U kunt ook elke wond meten via brightfield microscopie na fluorescentiebeeldvorming.
- Plaats een petrischaalbasis van 60 mm op het beeldplatform en voeg een dunne laag (ongeveer 1 ml) DPBS toe.
OPMERKING: Als er te veel DPBS wordt gebruikt, zal de biopsie bewegen tijdens de beeldvorming. U kunt ook een 48 putplaat gebruiken als er een plaathouder beschikbaar is. - Gebruik kleine weefselduw om wond explants over te brengen van putten/microcentrifugebuizen naar de Petrischaal die DPBS bevat. Plaats de biopsiewondzijde naar beneden in de petrischaal.
- Gebruik het oculair en de TL-lamp om de wond te lokaliseren en erop te focussen. Als bellen onder het monster in het gezichtsveld worden gevangen, pak dan de wond op met een weefseldamp en herpositioneer.
- Stel de beeldvormingssoftware in en zorg voor een gelijke pinholegrootte tussen kanalen voor optimale confocaliteit. Controleer hiervoor de waarde van één luchtige eenheid voor elk kanaal en selecteer de grootste waarde. Selecteer scansnelheid, beeldkwaliteit en middeling.
OPMERKING: De fluorchromen van de geconjugeerde secundaire antilichamen en de gekozen tegenstain (bijv. DAPI) bepalen de vereiste kanalen. - Schakel de live acquisitiesoftware in en pas het laservermogen en de versterking van elk kanaal aan op de niveaus die nodig zijn om kleuring te visualiseren. Verminder achtergrondruis door de digitale offset te verhogen.
- Plaats de wond in het midden van het beeldvlak.
OPMERKING: Als de wond niet het hele beeld vult vanwege het gebruik van een kleiner doel of het creëren van een grotere wond, neem dan een paneel met afbeeldingen en naai ze aan elkaar (handmatig of met een tegelfunctie in de relevante beeldvormingssoftware). - Verkrijg beelden van de wondbiopten. Gebruik dezelfde beeldinstellingen tussen explants.
OPMERKING: Afbeeldingen met een hoger vermogen maken het mogelijk om weefselstructuren en cellulaire markerexpressie en locatie te beoordelen. - Verzamel seriële Z-stapels door de wond, vooral wanneer het weefsel niet volledig plat is tegen de petrischaal. Gebruik analysesoftware om de Z-stack samen te vouwen in één projectiebeeld met maximale intensiteit.
- Brightfield beeldvorming
OPMERKING: Brightfield-beeldvorming van immunoperoxidase bevlekte biopsieën kan op meerdere manieren worden uitgevoerd.- Omgekeerde microscoopbeeldvorming: Bereid wond explants voor op beeldvorming door ze in een petrischaal te plaatsen/zoals beschreven in stap 5.1.2-5.1.3. Verkrijg digitale beelden onder brightfield-verlichting op een omgekeerde microscoop die is uitgerust met een digitale camera. Naai indien nodig meerdere afbeeldingen aan elkaar.
- Draadloze digitale microscoopbeeldvorming: Gebruik een draadloze digitale microscoop die is aangesloten op een telefoon of laptop om op een kosteneffectieve manier afbeeldingen van hoge kwaliteit te verkrijgen. Plaats de gewikkelde explants met de zijkant op wat weefsel en verwijder eventuele resterende dH2O (of kleuringswasbuffer) uit de monsteropslag. Plaats de wond explant in het midden van het gezichtsveld van de microscoop. Verkrijg afbeeldingen met de aangesloten camera.
- Kwantificering
OPMERKING: Percentage wondsluiting kan worden gekwantificeerd in elke software waarmee uit de vrije hand vormen kunnen worden getekend en gemeten. ImageJ kan als volgt worden gebruikt om kwantificering uit te voeren:- Open de afbeelding die moet worden gekwantificeerd in ImageJ-software.
- Gebruik het handvormgereedschap om rond de buitenkant van de opnieuw epithelialiseerde wond te tekenen waar deze de normale huid ontmoet. Druk op M (of analyseer | meten) om een "buitenste" oppervlaktemeting te verkrijgen.
OPMERKING: De opnieuw epithelialiseerde wondweefseltextuur verschilt van de normale huid. De afbeeldingen hoeven niet te worden geschaald voorafgaand aan dit type analyse. - Gebruik het handvormgereedschap om rond het open wondgebied te tekenen. Hier ontmoet de open wond de binnenrand van het re-epithelialiserende weefsel. Druk op M (of analyseer | Meten) om een 'binnen' gebiedsmeting te verkrijgen.
- Gebruik de volgende vergelijking om percentage wondherepithialisatie/sluiting af te leiden:
% sluiting = (buitenwondgebied - binnenste wondgebied) / (buitenwondgebied) x 100
OPMERKING: De dekking van het percentage van de antilichamen kan op dezelfde manier worden afgeleid (bv. K14) of als een percentage van het totale wondoppervlak. Procentuele intensiteit kan ook semi-kwantitatieve informatie bieden over de expressie op weefselniveau van markers van belang, terwijl high power imaging expressiegegevens op cellulair niveau presenteert.
Representative Results
In dit rapport presenteren we een nieuwe ex vivo huidwonden en whole-mount kleuring benadering om factoren te beoordelen die de reactie van de menselijke huid herstellen. Figuur 1A toont een schema van de procedurele pijplijn, die kan worden uitgevoerd in 3-10 dagen, afhankelijk van de incubatietijden van de wond. De gedeeltelijke diktewonden worden gekweekt op membraanstapels in de lucht: membraaninterface en kunnen worden verzameld voor kleuring in de hele berg, ingebed in paraffine of OCT-medium voor algemene histologie, of bevroren in vloeibare stikstof voor biochemische analyse (figuur 1B). We creëren over het algemeen wonden van 2 mm gedeeltelijke dikte in het midden van 6 mm explants. De grootte van de wond en de omringende explant kan echter worden gewijzigd, afhankelijk van de vereisten. De whole-mount procedure is met succes aangepast voor zowel immunoperoxidase als immunofluorescentie kleuringsmethoden (Figuur 1C).
Immunofluorescentie maakt het mogelijk om weefsel met meerdere antilichamen te onderzoeken. Hiervoor adviseren we om primaire antilichamen te gebruiken die bij verschillende soorten worden gekweekt, en op soorten afgestemde fluorescerende secundaire antilichamen om de reactiviteit van verschillende soorten te beperken. Antilichaamconcentraties en incubatietijden moeten worden geoptimaliseerd. Als achtergrondkleuring wordt waargenomen, vermindert u de antilichaamconcentraties, verhoogt u de wasstappen en voegt u een blokkerende buffer toe aan het secundaire antilichaam. De levensvatbaarheid van vers weefsel kan rechtstreeks worden beoordeeld met kleurstoffen voor commerciële levensvatbaarheid (zie tabel met materialen). We laten ook zien dat weefsel kan worden gefixeerd na levensvatbaarheidskleuring en met succes kan worden afgebeeld wanneer het praktisch geschikt is (Figuur 1D).
Figuur 1: De menselijke ex vivo wond- en whole-mount kleuringsbenadering. (A) Pijpleiding die de procedurele workflow weergeeft van het verzamelen van huid en het uitvoeren van ex vivo wondjes, tot het kleuren van weefsel en het analyseren van gegevens. (B) Diagram dat het menselijke ex vivo huidwondkweeksysteem aantoont met analyses die routinematig op het weefsel worden uitgevoerd. (C) Whole-mount kleuring kan worden gebruikt met behulp van zowel immunoperoxidase als immunofluorescentietechnieken. K14 = keratine 14. (D) Levend weefsel kan worden gekleurd met kleurstoffen voor commerciële levensvatbaarheid en met succes na fixatie worden afgebeeld. Bar = 100 μm. Deze kleuring werd uitgevoerd in niet-diabetische huid. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Het meest toegepaste gebruik voor het geheel van opeengewijze kleuring van wonden is het bepalen van de wondsluitingssnelheid op een meer reproduceerbare manier dan via histologische doorsneden kan worden verstrekt. Procentuele sluiting werd gekwantificeerd als percentage re-epithelialisatie van het wondoppervlak, zoals aangetoond in figuur 2A. De dekking van het percentage van de specifieke markers kan worden gemeten vanaf het totale wondgebied of als een percentage van de opnieuw epithelialiseerde wond. We karakteriseerden genezing in een gezonde (niet-diabetische) versus diabetische huid gedurende een tijdsverloop van zeven dagen, waarbij we wonden verzamelden bij elke dag na het verwonden (representatieve afbeeldingen, figuur 2B). Gezonde huidwonden gesloten na verloop van tijd zoals verwacht, met volledige sluiting waargenomen in de meeste monsters tegen dag 4-5. Integendeel, diabetische huidwonden konden niet volledig sluiten binnen de analyseperiode van zeven dagen (figuur 2C). Een significante vertraging in wondsluiting werd waargenomen tussen gezonde en diabetische huidwonden bij het vergelijken van genezingspercentages op elk tijdstip na het letsel(P < 0,001 tot dag 6, P < 0,05 op dag 6 en P < 0,05 tot P < 0,001 op dag 7).
Na beoordeling van de totale verwondingssluitingspercentages; we hebben het percentage van het gehele wondgebied (buitengebied in figuur 2A) gemeten waar K14-positieve cellen konden worden gevisualiseerd (groene kleuring in figuur 2B). Interessant is dat we opmerkten dat bij gezonde ex vivo huidwonden K14-kleuring piekte op dag 2 en vervolgens snel afnam (significantie op elk tijdstip versus de piek van dag 2, figuur 2D). Dit is waarschijnlijk een weerspiegeling van de hervorming van de vroege epidermale barrière, met uitzondering van K14-antilichaampenetratie door gedifferentieerde epidermale lagen (zie figuur 2E schematisch). Tijdens het re-epithelialisatieproces migreren basale laag (K14+ve) keratinocyten naar binnen over de open wond, zodat de epidermis dichter bij de buitenste wondrand zich eerder vormt dan de epidermis dichter bij de binnenste wondrand (migrerende voorkant). Terwijl de voorrand van de nieuw gevormde epidermis blijft migreren om de resterende open wond te sluiten, begint de buitenste randepidermis zich te onderscheiden om de andere epidermale lagen te hervormen. Bij vroege genezing zouden we dus verwachten dat het grootste deel van het opnieuw epithelialiseerde gebied bestaat uit basale (K14+ve) cellen, terwijl bij latere reparatie K14-kleuring verloren gaat omdat de epidermis zich onderscheidt van de buitenkant naar binnen (zie afbeeldingen van de hele berg in figuur 2E). Daarom correleert de daling van de K14-kleuring in figuur 2D (neerwaartse pijlen) met een verhoogde epidermale differentiatie. Interessant is dat zichtbare K14-kleuring eerder piekte in gezonde (dag 2) versus diabetische (dag 4) wonden, wat verder aantoont dat re-epithelialisatie en daaropvolgende epidermale differentiatie worden vertraagd bij diabetische huidwonden.
Figuur 2: Whole-mount staining onthult verstoorde genezingspercentages bij een diabetische versus gezonde huid. (A) De methode die wordt gebruikt om wondsluiting te kwantificeren van buiten- en binnenwondmetingen. Brightfield afbeeldingen tonen keratine 14 (K14) kleuring in rood. Bar = 300 μm. (B) Representatieve beelden van genezing in de loop van de tijd (dag na het verwonden) bij een gezonde en diabetische huid. Bar = 500 μm. K14 = groen. DAPI = blauwe kernen. (C) Kwantificering van de wondsluitingspercentages (percentage re-epithelialisatie) waaruit blijkt dat ex vivo wonden van een gezonde huid aanzienlijk sneller sluiten dan ex vivo wonden van diabetische huid. H = gezond. Db = diabetisch. (D) Percentage K14-kleuringen piekt eerder bij een gezonde versus diabetische huid en neemt vervolgens af in lijn met verhoogde epidermale differentiatie (pijlen omlaag). (E) K14 (basale epidermale cel) kleuring gaat verloren naarmate de epidermis differentieert. D = gedifferentieerd. ND = niet gedifferentieerd. Witte stippellijnen verbeelden binnen- en buitenwondranden. Witte pijlen = migratierichting. n = 6 wonden per donor, per tijdspunt. Gemiddelde +/- SEM. * = P < 0,05, ** = P < 0,01 en *** = P < 0,001. Gezond en diabetisch vergeleken op elk genezingstijdspunt in C (P-waarde voor de minst significante vergelijking). Temporele verandering in K14-kleuring in vergelijking met piek voor elke donor in D. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Vervolgens gebruikten we whole-mount kleuring om weefselexpressie en lokalisatie van andere wondrelevante markers in de niet-diabetische huid te onderzoeken (figuur 3). Alle gebruikte antilichamen en hun werkconcentraties zijn opgenomen in de tabel met materialen. Bloedvaten in de open wond positief gekleurd met alfa glad spier actine (a-SMA) antilichaam, gebruikt in combinatie met K14 om de epidermale randen af te bakenen in afbeeldingen met een lager vermogen (Figuur 3A). De huidmatrix was gekleurd met antilichamen tegen collageen type I (COL 1) en fibronectine (Fn). Hier werd collageen waargenomen als overvloedige dikke vezels, terwijl fibronectinevezels schaars, golvend en dun waren (figuur 3A). Onze whole-mount kleuringsbenadering is ook in staat om celniveauresolutie van kleuring te bieden, zoals aangetoond voor K14-positieve keratinocyten (figuur 3B).
Ten slotte laten we zien dat menselijke ex vivo wonden ingezeten immuuncellen bezitten, waarbij Langerhans-cellen worden gedetecteerd rond nieuw gevormde epidermis op dag 3 na het verwonden (figuur 3C). Deze resultaten suggereren inderdaad dat whole-mount kleuring kan worden gebruikt om belangrijke kenmerken van de genezingsreactie te onderzoeken, waaronder ontsteking, proliferatie en de extracellulaire matrix (figuur 4A). Samen tonen onze gegevens aan dat de gecombineerde ex vivo huidwonden en whole-mount kleuringsprocedure een geldige methode is om verschillende aspecten van gezond en diabetisch (pathologisch) menselijk huidherstel te beoordelen.
Figuur 3: Optimalisatie van de whole-mount kleuringsbenadering voor gebruik met andere antilichamen. (A) Bloedvaten werden gekleurd met alfa-gladde spier actine (α-SMA, groen) en keratine 14 (K14, rood), terwijl matrixvezels werden gekleurd met collageen I (COL 1, rood) en fibronectine (Fn, groen). (B) De hele-mount procedure biedt tot celniveau resolutie van lokalisatie (K14, groen; K1, rood). (C) CD1a+ve Langerhans cellen (groen) waargenomen in nieuw gevormde epidermis. DAPI = blauwe kernen. Bar = 100 μm. Witte stippellijnen tonen binnen- en buitenwondranden en scheiden wond van epidermis. Deze kleuring werd uitgevoerd in niet-diabetische huid. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Geldigheid van de whole-mount kleuringsprocedure voor het beoordelen van wondgenezing. (A) Illustratie die laat zien hoe de whole-mount kleuringstechniek wondrelevante processen kan evalueren. Gebruikte antilichamen = rode tekst. K14 = keratine 14. COL 1 = collageen 1. Fn = fibronectine. (B) De hele montagekleuringsprocedure (blauwe pijlen) introduceert minder variabiliteit in wondsluitingsmetingen dan standaard histologische analyse (rode pijlen). S1 = deel 1. WE = wondrand. Bar = 300 μm. Deze kleuring werd uitgevoerd in niet-diabetische huid. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Discussion
In dit experimentele protocol beschrijven we een geoptimaliseerde methode voor het evalueren van wondsluiting in de menselijke ex vivo huid met behulp van whole-mount weefselkleuring. Dit is een belangrijke bron om een kritische evaluatie van mogelijke wondbehandelingen mogelijk te maken en om een beter begrip te krijgen van de respons op het herstel van de menselijke wond. We hebben genezingsbeoordeling gepubliceerd in ex vivo huidwonden eerder12,13, maar in deze rapporten werd de whole-mount kleuringsbenadering niet gebruikt om wondsluiting te meten. Whole-mount kleuring is veel gemakkelijker en vereist minder technische ervaring dan standaard histologie, waarbij paraffine of OCT-inbedding en sectie van monsters omvat. De whole-mount procedure vermindert ook de experimentele variabiliteit, waardoor kwantificering van de gehele wond mogelijk is en niet slechts een enkele dwarsdoorsnede op een gedefinieerde positie in het weefsel (zie figuur 4B voor vergelijkende illustratie). Wij staan volledig achter het belang van het kwantificeren van genezing van de gehele niet-symmetrische wondstructuur, zoals duidelijk geschetst door Rhea en Dunnwald voor muriene acute wonden14. Deze auteurs toonden het belang aan van het serieel doorsnijden van in vivo excisionele wonden voor reproduceerbare en nauwkeurige metingen van wondmorfologie. Seriële doorsneden kunnen ook worden toegepast op menselijke ex vivo wonden; voor nauwkeurige kwantificering van wondsluiting en re-epithelialisatie moet echter een hoge doorvoer van whole-mount kleuring de voorkeur hebben. We merken op dat dit hele kleuringsprotocol ook compatibel moet zijn met latere verwerking (was of OCT) voor traditionele histologische analyse.
Whole-mount vlekken zijn niet zonder nadelen. Hoewel het een hogere reproduceerbaarheid biedt in wondgenezingsexperimenten, vereist het wel het gebruik van meer weefsel voor analyse dan standaard histologische technieken. Dit kan een probleem zijn waarbij de toegang tot weefsel beperkt is, met name wanneer meerdere antilichamen moeten worden beoordeeld. Een alternatieve benadering zou zijn om een incisionele wondmethode toe te gebruiken waarbij de wondbreedte relatief uniform is en de variabiliteit wordt verminderd (zoals blijkt uit muis- en menselijke wonden15,16). Excisionele wonden blijven echter meer van toepassing op de meeste pathologische wondtypen17.
In deze studie werden wonden met een gedeeltelijke dikte van 2 mm gemaakt in het midden van 6 mm huidschillen. Deze methode kan worden geoptimaliseerd voor alternatieve excisional wond en explant maten op verschillende huiddiepten18. Bovendien zal de kracht die nodig is om wonden te genereren variëren tussen donoren, waar verouderde huid minder kracht nodig heeft om een biopsie te doen. We zouden ook vermijden het gebruik van huid met prominente striae of andere structurele veranderingen. We hebben een reeks antilichamen gevalideerd om verschillende aspecten van de ex vivo genezingsrespons te overwegen. Dit protocol kan ook worden gebruikt met andere huidrelevante antilichamen, waarbij de antilichaamconcentraties en incubatietijden moeten worden geoptimaliseerd. Desalniettemin zijn wij van mening dat ons protocol het meest geschikt is voor absolute kwantificering van de totale wondsluiting, gevolgd door een ruimtelijke beoordeling van specifieke eiwitten van belang. Hoewel whole-mount een verminderde resolutie van immunolocalisatie versus standaard histologische analyse van weefselsecties biedt, biedt het aanvullende 3D-informatie die ontbreekt in de standaard 2D-histologie.
Een voorbehoud bij het beoordelen van genezing in ex vivo huid versus in vivo modellen is dat het een systemische respons mist. Een belangrijk aspect van wondherstel is ontsteking en daaropvolgende weefselgranulatie, die wordt veroorzaakt door een toestroom van ontstekingscellen en endotheelcellen uit de vasculatuur19. Ondanks deze beperking biedt ex vivo huid nog steeds een betere recapitulatie van klinische genezing dan celgebaseerde wondtesten. In vitro experimenten in het algemeen omvatten monolagen van het eencellige type of coculturen gekweekt op weefselkweekplastic, terwijl ex vivo huid een inheemse omgeving biedt om celgedrag te verkennen. Meer recentelijk zijn een aantal huidequivalentensystemen ontstaan, waarbij de huid wordt gekweekt in een laboratoriumomgeving van kunstmatige matrix en geïsoleerde huidcellen20,21. Hoewel deze modellen de menselijke huid beter nabootsen dan de meeste in vitro benaderingen, simuleren ze nog steeds niet volledig de inheemse weefselomgeving en zijn ze over het algemeen te fragiel om reproduceerbaar te verwonden. Bovendien hebben wij (en anderen) aangetoond dat ex vivo menselijk huidweefsel ingezeten immuuncellen behoudt, wat ongetwijfeld zal bijdragen aan herstel22,23. De toekomstige werkzaamheden moeten nu gericht zijn op de uitbreiding van de levensvatbaarheid en immunocompetentie van het ex vivo-model voor de beoordeling van genezing in een laat stadium24. Een optie is verdere vooruitgang van veelbelovende organ-on-a-chip-technologieën die de levensvatbaarheid van weefsels kunnen verlengen en de inheemse huidarchitectuur tot twee weken in cultuur kunnen behouden25. Ex vivo-modellen zijn ook begonnen het belang van de huidontstekingsreactie te overwegen door met succes immuuncellen, zoals neutrofielen, in het gastheerweefsel26 op te nemen of gastheerweefsel te injecteren met antilichamen om een immuunreactie uit te lokken27. We verwachten dat deze bevindingen de weg zullen effenen voor de ontwikkeling van meer verfijnde en vertaalbare methoden in de toekomst.
Een groot voordeel van het gebruik van ex vivo huid om wondsluiting te meten is de mogelijkheid om genezingspercentages te vergelijken in gezond (bijv. niet-diabetisch) versus pathologisch (bijv. diabetisch of verouderd) weefsel. Hier toonden we aan dat re-epithelialisatie en barrièrevorming inderdaad worden aangetast bij diabetische versus gezonde ex vivo wonden. Dit biedt inderdaad een route voor preklinische beoordeling van pathologisch herstel, waarbij veroudering en diabetes belangrijke risicofactoren zijn voor het ontwikkelen van chronische wonden1. Terwijl in vitro pathologische modellen bestaan, zoals cellen geïsoleerd uit verouderd en diabetisch weefsel, of cellen gekweekt in hoge glucose om hyperglykemie na te bootsen28,29, kunnen deze cellen snel hun fenotype verliezen zodra ze uit de in vivo micro-omgeving zijn verwijderd. Een belangrijk onderdeel van de extrinsieke pathologische genezingsomgeving is de huidmatrix, die wordt gewijzigd bij zowel veroudering als diabetes30. Inderdaad, deze verstoorde matrix beïnvloedt het gedrag van ingezetene en naïeve fibroblasten31,32. Het belang van het bestuderen van cellen in hun gastheerweefselomgeving kan dus niet worden onderschat.
Samengevat biedt ons protocol een belangrijk platform om re-epithelialisatie van menselijke wonden te kwantificeren, regulerende factoren te onderzoeken en de geldigheid en werkzaamheid van potentiële therapieën te testen12,13. Hoewel preklinische tests nog steeds in vivo benaderingen vereisen, zou een gecombineerde strategie met ex vivo menselijk weefsel en in vivo muriene wondwonden het preklinische traject moeten verfijnen, waardoor het gebruik van dieren wordt verminderd en de vertaalbaarheid tussen soorten wordt verhoogd.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Wij willen de heren Paolo Matteuci en George Smith bedanken voor het verstrekken van patiëntenweefsel. We zijn miss Amber Rose Stafford ook dankbaar voor haar hulp bij het verzamelen van weefsel en de Daisy Appeal voor het leveren van laboratoriumfaciliteiten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Falcon Tubes | Falcon | 352070 | For skin washing |
| 1.5 ml TubeOne Microcentrifuge Tubes, Natural (Sterile) | Starlab | S1615-5510 | For whole-mount staining |
| 48-Well CytoOne Plate, TC-Treated | Starlab | CC7682-7548 | For whole-mount staining |
| Acetic Acid Glacial | Fisher Chemical | A/0400/PB15 | Part of fixative |
| Alkyltrimethylammonium Bromide | Sigma-Aldrich | M7635 | Part of fixative |
| Anti-Alpha Smooth Muscle Actin Antibody [1A4] | Abcam | ab7817 | Stains blood vessels |
| Anti-Collagen I Antibody | Abcam | ab34710 | Stains collagen |
| Anti-Cytokeratin 14 Antibody [LL002] | Abcam | ab7800 | Stains epidermis |
| CD1A Antibody (CTB6) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5265 | Stains Langerhans cells |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 62247 | Counterstain for cell nuclei |
| Falcon 60mm Petri dishes | Falcon | 353004 | Human ex vivo culture |
| Fibronectin Antibody (EP5) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8422 | Stains fibronectin |
| Formaldehyde, Extra Pure, Solution 37-41%, SLR | Fisher Chemical | F/1501/PB17 | Part of fixative |
| Gauze Swabs | Medisave | CS1650 | To clean skin |
| Gibco™ Antibiotic-Antimycotic Solution | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Human ex vivo culture |
| Gibco DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960044 | Human ex vivo culture |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Human ex vivo culture |
| Gibco HBSS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14170088 | Human ex vivo culture |
| Gibco L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Human ex vivo culture |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | For immunoperoxidase staining |
| ImageJ Software | National Institutes of Health | N/A | For image analysis |
| Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody |
| Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A11012 | Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody |
| Invitrogen LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher Scientific | L3224 | For viability assessment of tissue |
| Iris Forceps, 10 cm, Curved, 1x2 teeth | World Precision Instruments | 15917 | To create wounds |
| Iris Scissors, 11 cm, Curved, SuperCut, Tungsten Carbide | World Precision Instruments | 501264 | To create wounds |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, SuperCut, Tungsten Carbide | World Precision Instruments | 501263 | To remove adipose tissue |
| Keratin 1 Polyclonal Antibody, Purified | Biolegend | 905201 | Stains epidermis |
| Keratin 14 Polyclonal Antibody, Purified | Biolegend | 905301 | Stains epidermis |
| LSM 710 Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | Discontinued | For fluorescent imaging |
| Merck Millipore Absorbent pads | Merck Millipore | AP10045S0 | Human ex vivo culture |
| Merck Millipore Nylon Hydrophilic Membrane Filters | Merck Millipore | HNWP04700 | Human ex vivo culture |
| Normal Goat Serum Solution | Vector Laboratories | S-1000-20 | Animal serum used depends on secondary antibody |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P3619 | For wash buffer |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | For blocking buffer |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-212 | Part of fixative |
| Sterilisation Pouches | Medisave | SH3710 | To sterilise instruments |
| Stiefel 2mm biopsy punches | Medisave | BI0500 | For partial thickness wound |
| Stiefel 6mm biopsy punches | Medisave | BI2000 | For outer explant |
| Thermo Scientific Sterilin Standard 90mm Petri Dishes | Thermo Fisher Scientific | 101VR20 | To prepare skin |
| Triton X-100 | Fisher Chemical | T/3751/08 | For wash buffer |
| VECTASTAIN Elite ABC-HRP Kit, Peroxidase (Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | For immunoperoxidase staining; HRP kit used depends on primary antibody |
| Vector NovaRED Substrate Kit, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories | SK-4800 | For immunoperoxidase staining |
| Wireless Digital Microscope | Jiusion | N/A | For brightfield imaging |
References
- Lindholm, C., Searle, R. Wound management for the 21st century: combining effectiveness and efficiency. International Wound Journal. 13, 5-15 (2016).
- Guest, J. F., et al. Health economic burden that different wound types impose on the UK's National Health Service. International Wound Journal. 14 (2), 322-330 (2017).
- Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. Diabetic foot ulcer management in clinical practice in the UK: costs and outcomes. International Wound Journal. 15 (1), 43-52 (2018).
- López-Valverde, M. E., et al. Perioperative and long-term all-cause mortality in patients with diabetes who underwent a lower extremity amputation. Diabetes Research and Clinical Practice. 141, 175-180 (2018).
- Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. The role of estrogen in cutaneous ageing and repair. Maturitas. 103, 60-64 (2017).
- Frykberg, R. G., Banks, J.
- Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. Wound healing: cellular mechanisms and pathological outcomes. Open Biology. 10 (9), 200223 (2020).
- Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. Animal models of wound repair: Are they cutting it. Experimental Dermatology. 21 (8), 581-585 (2012).
- Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A modeling conundrum: murine models for cutaneous wound healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
- Mazio, C., et al. Pre-vascularized dermis model for fast and functional anastomosis with host vasculature. Biomaterials. 192, 159-170 (2019).
- Wilkinson, H. N., Iveson, S., Catherall, P., Hardman, M. J. A novel silver bioactive glass elicits antimicrobial efficacy against Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an ex vivo skin wound biofilm model. Frontiers in Microbiology. 9, 1450 (2018).
- Wilkinson, H. N., et al. Elevated local senescence in diabetic wound healing is linked to pathological repair via CXCR2. Journal of Investigative Dermatology. 139 (5), 1171-1181 (2019).
- Wilkinson, H. N., et al. Tissue iron promotes wound repair via M2 macrophage polarization and the chemokine (CC motif) ligands 17 and 22. The American Journal of Pathology. 189 (11), 2196-2208 (2019).
- Rhea, L., Dunnwald, M. Murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis. Journal of Visualized Experiments. 162, e61616 (2020).
- Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models. Wound Repair and Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).
- Rizzo, A. E., Beckett, L. A., Baier, B. S., Isseroff, R. R. The linear excisional wound: an improved model for human ex vivo wound epithelialization studies. Skin Research and Technology. 18 (1), 125-132 (2012).
- Olsson, M., et al. The humanistic and economic burden of chronic wounds: a systematic review. Wound Repair and Regeneration. 27 (1), 114-125 (2019).
- Mendoza-Garcia, J., Sebastian, A., Alonso-Rasgado, T., Bayat, A. Optimization of an ex vivo wound healing model in the adult human skin: Functional evaluation using photodynamic therapy. Wound Repair and Regeneration. 23 (5), 685-702 (2015).
- Brownhill, V. R., et al. Pre-clinical assessment of single-use negative pressure wound therapy during in vivo porcine wound healing. Advances in Wound Care. , (2020).
- Diekmann, J., et al. A three-dimensional skin equivalent reflecting some aspects of in vivo aged skin. Experimental Dermatology. 25 (1), 56-61 (2016).
- Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Nguyen, H., Cairns, D. M., Kaplan, D. L. Human skin equivalents demonstrate need for neuro-immuno-cutaneous system. Advanced Biosystems. 3 (1), 1800283 (2019).
- Dijkgraaf, F. E., et al. Tissue patrol by resident memory CD8+ T cells in human skin. Nature Immunology. 20 (6), 756-764 (2019).
- He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. Lymphocyte isolation from human skin for phenotypic analysis and ex vivo cell culture. Journal of Visualized Experiments. (110), e52564 (2016).
- Pupovac, A., et al.
- Ataç, B., et al. Skin and hair on-a-chip: in vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion. Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).
- Kim, J. J., et al. A microscale, full-thickness, human skin on a chip assay simulating neutrophil responses to skin infection and antibiotic treatments. Lab on a Chip. 19 (18), 3094-3103 (2019).
- Jardet, C., et al. Development and characterization of a human Th17-driven ex vivo skin inflammation model. Experimental Dermatology. 29 (10), 993-1003 (2020).
- Chen, J. L., et al. Metformin attenuates diabetes-induced tau hyperphosphorylation in vitro and in vivo by enhancing autophagic clearance. Experimental Neurology. 311, 44-56 (2019).
- Demirovic, D., Rattan, S. I. Curcumin induces stress response and hormetically modulates wound healing ability of human skin fibroblasts undergoing ageing in vitro. Biogerontology. 12 (5), 437-444 (2011).
- Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. Wound senescence: A functional link between diabetes and ageing. Experimental Dermatology. 30 (1), 68-73 (2020).
- Fisher, G. J., et al. Collagen fragmentation promotes oxidative stress and elevates matrix metalloproteinase-1 in fibroblasts in aged human skin. The American Journal of Pathology. 174 (1), 101-114 (2009).
- Quan, T., Little, E., Quan, H., Voorhees, J. J., Fisher, G. J. Elevated matrix metalloproteinases and collagen fragmentation in photodamaged human skin: impact of altered extracellular matrix microenvironment on dermal fibroblast function. Journal of Investigative Dermatology. 133 (5), 1362 (2013).
