Summary
培养CTC可以通过测定特异性标志物表达，评估耐药性和定植肝脏的能力以及其他可能性，对癌症进行更深层次的功能表征。总体而言，CTC培养可能是个性化医疗改善患者预后的良好临床工具。
Abstract
转移是癌症死亡的主要原因。尽管治疗策略有所改善，但转移性癌症的预后较差。因此，我们迫切需要了解转移发展背后的机制，从而为晚期癌症提出有效的治疗方法。转移性癌症很难治疗，因为活检是侵入性的和不可接近的。最近，人们对液体活检产生了相当大的兴趣，包括无细胞循环脱氧核糖核酸（DNA）和来自外周血的循环肿瘤细胞，我们已经建立了来自转移性结直肠癌患者的几种循环肿瘤细胞系，以参与其表征。事实上，为了在功能上表征这些罕见且描述不佳的细胞，关键步骤是扩增它们。一旦建立，循环肿瘤细胞（CTC）系就可以在悬浮或粘附条件下培养。在分子水平上，CTC谱系可以进一步用于通过免疫荧光或细胞术分析评估感兴趣的特定标志物（如分化，上皮或癌症干细胞）的表达。此外，CTC线可用于评估药物对金标准化疗以及靶向治疗的敏感性。CTC系启动肿瘤的能力也可以通过在免疫缺陷小鼠中皮下注射CTC来测试。
最后，可以通过编辑CTC基因，通过短发夹核糖核酸（shRNA）或Crispr / Cas9来测试可能参与癌症传播的特定基因的作用。因此，可以将修饰的CTC注射到免疫缺陷小鼠脾脏中，以实验方式模拟 体内转移发育过程的一部分。
总之，CTC线是未来研究和个性化医疗的宝贵工具，它们将允许使用最初负责转移的细胞来预测治疗效率。
Introduction
尽管最近在早期癌症诊断和治疗策略方面有所改善，但超过90%的癌症发病率仍然是由于转移1。转移过程是一个多步骤级联反应，从细胞从原发肿瘤的局部脱离开始，并进入血液，在那里它们成为循环肿瘤细胞（CTC），最终定植于远处的部位，如肝脏和肺部，在结直肠癌（CRC）的情况下2。最近，人们越来越关注液体活检，液体活检是一种非侵入性工具，可以显着检测和枚举患者血液样本中的CTC。肿瘤内遗传异质性是耐药性的主要原因;因此，从肿瘤材料中分离代表性细胞构成了个性化医疗的有前途的工具3。
尽管血液中CTC的频率较低（1 CTC/106 -10 7白细胞）4，但基于CTC与血液其他成分之间的性质差异，开发了几种检测和分离技术5。单独使用患者血液样本中的CTC数量可以提供有关恶性肿瘤分期，治疗反应和疾病进展的信息6，7。因此，CTC分离是转化研究评估遗传异质性或进行药物筛选的重要工具，也是表征这些侵入性细胞的基础研究的重要工具，因为它们是转移诱导的关键参与者8，9。事实上，与随着时间的推移积累了数千个突变的商业建立的癌细胞系相比，新鲜的CTC具有原始原发性肿瘤的主要特征，包括强大的转移能力，并且它们更好地反映了这种疾病。这些特征使它们成为基础研究的有力工具，特别是在转移所涉及的预测关键因素的敲除实验中。这些实验的结果可以在体内验证，在小鼠身上，如下所述。
一旦 CTC 被分离出来，它们就可以在非粘附培养条件下扩增，然后，它们可以像任何可用的癌细胞系一样纵，即它们同样可以在粘附条件下培养或嵌入在 Matrigel 中，这取决于科学问题10。例如，为了测试目标蛋白质的表达和定位，CTC球可以在悬浮状态下生长并嵌入组织凝胶中以对球体切片进行免疫荧光。此外，如果蛋白质是膜性的，则可以通过细胞术测量其在活细胞上的表达。
对于功能研究，为了测试可能在肝脏定植中起作用的感兴趣蛋白质的作用，可以将具有由shRNA或CRISPR / Cas9编辑的基因的CTC注射到免疫缺陷小鼠的脾脏中。后一个实验是模拟肝转移定植的强大模型11。
CTC启动肿瘤的能力可以通过将非常少量的细胞注射到免疫缺陷小鼠中来评估。由于肿瘤起始是癌症干细胞（CSCs）的标志，因此该测定将指示CTC系内CSC的百分比。这种干细胞表型使循环肿瘤细胞系对一些金标准癌症疗法具有抗药性。因此，扩展的CTC可用于筛查药物并为患者确定最佳的潜在有效治疗;例如，CTC对治疗的反应可以使用发光活力测定法在体外进行测试。
从长远来看，对新鲜分离和扩增的CTC进行药物筛选可以用作个性化医疗的新工具，以帮助为患者选择最有效和最合适的治疗方法。
在本文中，详细介绍了培养CTC系，通过免疫染色和细胞术染色特定蛋白质，进行细胞毒性测定以及CTC体内异种移植实验的方案。
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Protocol
所有体内方案均由动物伦理机构批准。
1. CTC在3D培养条件下的扩增
- 为了在悬浮液中培养CTC，首先将CTC以5个细胞/μL的最大浓度接种在超低依附（ULA）24孔板的孔中，并接种到1mL的M12培养基中（即，补充有2mM l-谷氨酰胺，100单位/ mL青霉素和链霉素，N2补充剂，20ng / mL表皮生长因子和10ng / mL成纤维细胞生长因子10的高级DMEM-F12）。
- 为了允许球体形成和细胞扩增，在缺氧条件下（2%O2）孵育细胞6至10天。
- 一旦球体足够大（100μm），以防止坏死，将它们解离以进行扩增。
- 将细胞悬浮液置于2 mL管或15 mL管中，并以300×g离心5分钟。
- 除去上清液并向沉淀中加入500μL温和解离试剂（例如Accumax）。
- 轻轻涡旋并用温和的解离试剂在37°C下孵育细胞悬浮液20至30分钟。
注意：超过温和解离试剂（Accumax）的孵育时间可能导致细胞死亡率异常增加。 - 加入1.5mL磷酸盐缓冲盐水（PBS），并在300×g下离心管5分钟。
- 倒出上清液并将沉淀重悬于新鲜的M12培养基中，以达到每μL1-5个细胞的密度。
- 将细胞悬浮液接种在超低连接板的新孔中：T75培养瓶为10 mL，6孔板为2 mL，96孔板为100μL
2. CTC球体切片的免疫荧光（IF）染色
- 将CTC球体以300×g离心到15mL管中5分钟，吸出上清液，并用PBS洗涤沉淀两次。
- 用500μL4%多聚甲醛（PFA）重悬沉淀，并在冰上孵育20分钟。以300×g离心悬浮液，并用5mL PBS洗涤两次。
- 用（即15至20μL）热和液体组织凝胶重悬沉淀。用移液器取出所有悬浮液，在4°C的预冷表面上形成一滴，让它聚合5到10分钟。
注意：快速工作以避免悬浮液聚合到尖端。 - 用手术刀的刀片分离固体液滴，然后将其插入分隔的嵌入盒中。
- 执行以下步骤：石蜡包涵体、石蜡切片、切片补液、抗原检索和抗体孵育。这些步骤与嵌入石蜡中并处理用于免疫荧光染色的任何肿瘤或器官相同12。
注意：盒可以在4°C下储存在70%乙醇中，直到石蜡包埋。
3. 细胞术分析
- 将CTC球体以300×g离心到15mL管中5分钟，并用PBS洗涤沉淀两次。
- 吸出上清液并将500μL温和解离试剂加入沉淀中。
- 轻轻涡旋并用温和的解离试剂在37°C下孵育细胞悬浮液20至30分钟。
注意：在温和解离试剂（Accumax）中孵育超过40分钟可能导致细胞死亡率异常增加。 - 以300×g离心细胞悬浮液5分钟，除去上清液并将沉淀重悬于5mL封闭缓冲液（即PBS与1%牛血清白蛋白（BSA））中。
- 将细胞悬浮液通过40μm细胞过滤器以消除剩余的球体。
- 计数后，将200，000个细胞放入三个荧光激活的细胞分选（FACS）管中，以300×g离心5分钟并除去上清液。使用三个FACS管中的一个作为对照，不会接受任何染色试剂。
- 根据数据表，将适当的抗体添加到剩余的两个FACS管中（即，一个针对目标蛋白质的偶联抗体，一个偶联同种型对照）。
- 在推荐的孵育时间后，加入300μL封闭缓冲液以洗涤细胞，以300×g离心3管并吸出上清液。重复此步骤两次。然后，用细胞活力染色试剂（除了FACS管对照，没有任何染色）用封闭缓冲液重悬沉沉淀。
- 将管子放在冰上，直到FACS分析。首先使用不染色的管子来鉴定细胞活力和抗体染色的门。然后用针对目标蛋白的偶联抗体分析FACS管，以量化表达目标蛋白的CTC的百分比。具有共轭同种型对照的FACS管不应指示偏移。这证实了这种转变是针对目标蛋白的特异性的。
注意：如果可能，使用表达高水平目标蛋白的细胞系作为阳性对照，使用不表达蛋白质的细胞系作为阴性对照。
4. 发光活力测定（细胞滴定-Glo）
- 在M12培养基中重悬解解的CTC（如第1.4.5节所述）。计数细胞并使细胞浓度调整为200，000个细胞/ mL。
- 在ULA 96孔板中，每孔接种10，000个解离的CTC，在50μL中，并将板在缺氧（2%O2）中孵育24小时。
- 第二天，将50μL测试药物加入CTC中。以前建议对药物浓度进行滴定，以确定最大抑制浓度的一半（IC50）。仅用载体处理一些孔以确定基底细胞活力。
注意：接种的细胞数量在CTC系之间可能有所不同，具体取决于它们的倍增时间。此外，细胞应一式三份接种，以尽量减少结果的变异性。 - 将板在缺氧中再孵育48小时。
- 在第3天，将培养的板和发光细胞活力缓冲液和底物置于室温下，并根据制造商协议用适当体积的缓冲液重建底物。
- 将70μL发光活力混合物加入每个培养板孔中。将板放在轨道振荡器上20分钟以诱导细胞裂解，然后将100μL混合物转移到与光度计兼容的不透明壁多孔板中。
- 让板在室温下静止，用铝箔覆盖，以稳定发光信号。
注：发光信号稳定长达3小时。 - 使用酶标仪（即 Tecan Infinite 200 Pro）记录发光。
- 对于数据分析，计算每个条件一式三份的相对光单位 RLU 的平均值。根据所需的每种药物浓度评估活力百分比：（处理细胞的RLU / 未处理细胞的RLU）x 100。
5. 皮下注射
- 在微量离心管中，将细胞重悬于100μL无菌PBS中。如果注射的细胞数量低，则将细胞重悬在1：1 PBS / Matrigel中，减少生长因子，以将细胞聚集在一起并促进肿瘤发生。
注意：细胞密度可以从10个细胞（挑战肿瘤起始能力）到100万个细胞，具体取决于科学问题和实验目的。 - 在胰岛素注射器中拉起全部体积。
- 在免疫缺陷小鼠身上，捏住食指和无名指之间侧翼的皮肤，并将针头轻轻插入皮肤根部。
注意：这个过程并不痛苦，是在有意识的老鼠身上完成的。 - 将体积缓慢注入同一位置，以防止细胞扩散。这将在皮肤下产生一个小的气泡。
- 在注射部位施加轻柔的压力，以防止体积回流。
- 每隔一天使用卡尺监测肿瘤生长。
- 如果肿瘤超过1500毫米3，则处死动物。根据材料的可用性，通过二氧化碳或麻醉气体吸入或宫颈脱位对小鼠实施安乐死。
6. 脾内注射
- 在开始之前，将手术器械（剪刀和镊子）在124°C下高压灭菌15分钟，并用70%乙醇清洁工作空间的所有表面。
- 在微量离心管中，将细胞重悬于50μL无菌PBS中并将其储存在冰上。细胞密度可以从0.5到1百万个细胞。大量细胞可导致血栓发展到血液循环中。
- 在注射细胞之前，皮下注射100μL0.015mg / mL丁丙诺啡，以缓解疼痛。
- 将小鼠置于诱导室中，其中异氟醚保持在3%，持续2-3分钟。当动物不再对运动有反应时，将其放在加热垫的右侧，并使用呼吸回路面罩保持麻醉，该面罩提供O2 和异氟醚的气体混合物。
- 在每只眼睛上涂抹眼部润滑剂，以避免在手术过程中眼睛干燥。用聚维酮碘溶液（即倍他丁）消毒胸部区域。
- 在背侧，在第10根假肋骨下方用剪刀做一个0.5厘米的小切口。
- 轻轻地将脾脏抬起，放在无菌纱布上。使用胰岛素注射器，将50μLC注射到脾脏尖端。确保注射器保持直立，等待3-5分钟以避免回流，然后取出针头。
- 从两侧（动脉和静脉）固定脾脏血管，并通过直接在两个结扎体上方切割来切除脾脏。切除脾脏以防止该器官中不必要的肿瘤形成。
- 缝合腹膜，然后使用5.0可降解的无菌缝合线缝合皮肤。
- 保持小鼠温暖，直到从麻醉中完全恢复。
- 每周监测小鼠3天的身体功能异常，运动和姿势异常以及体重减轻。
- 当人道终点达到（手术后约6周）时牺牲动物以分析肝转移。
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Representative Results
分别由IF（图1A右图）和FACS（图1B）观察到的EpCAM和CD26表达都表明CTC线是上皮性的，并显示出CSC标志之一10。这种上皮性状可以通过用针对其他上皮和间充质标志物的抗体染色来进一步表征。因此，可以大致知道CTC线沿着上皮 - 间充质轴的位置。其他CSC标志物的表达也可以通过免疫染色和细胞术进行测试。否则，作为耐药性和体内肿瘤起始测定的功能测试可以验证这种CSC表型10。例如，在这里，发光活力测定表明CTC IC50仅在高药物浓度下达到，突出了这些细胞的高电阻（图2）。此外，皮下注射CTC表明该CTC线具有致瘤能力（图3A）。后一种结果证实了该CTC系的CSC表型。通过注射10至10，000个细胞来挑战肿瘤起始能力可以优化致瘤能力的估计。最后，通过模仿通过脾内注射播散形成的肝转移表明，该CTC线可以在远处器官中存活并具有转移潜力（图3B）。这种转移潜力可以与其他细胞系进行比较，也可以通过抑制特定基因表达或在脾内注射后在小鼠中化疗给药来挑战。
图1：对CTC球的显微镜和流式细胞术分析表明，它们表达上皮和CSC标志物。（A）左图：CTC球体在嵌入前培养6天。右图：组织凝胶中嵌入的CTC球的落射荧光显微镜分析。用针对上皮标志物上皮细胞粘附分子（EPCAM）（红色）的抗体对嵌入的CTC球的5μm切片进行染色，并且细胞核用DAPI（蓝色）标记。比例尺为20μm.（B）活的单个CTC的流式细胞术分析。左上角的FACS图显示了CTC，没有根据它们的大小和粒度标记到门细胞。右上方的 FACS 图显示 CTC 仅具有检测活细胞的存活标记。左下角的 FACS 图显示用 APC 偶联同种型对照标记的 CTC 对准正标记的细胞。右下角的 FACS 图显示由 APC 偶联的 CD26 抗体标记的 CTC，以评估表达该 CSC 标志物的细胞百分比 （67%）。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：使用发光活力测定法进行细胞生长测定的代表性结果。 每孔接种10，000个CTC，然后用增加浓度的目标分子处理72小时。IC50的测量值为x μM， 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：CTC具有致瘤性和转移潜力。（A）在裸鼠的右侧皮下注射200，000个CTC。注射后1个月拍摄照片，每周测量肿瘤大小3次。（B）脾内注射CTC以模仿肝转移定植。右图：300，000 CTC的脾内注射4周后解剖小鼠肝脏的代表性照片。左图：脾内注射PBS后4周解剖的小鼠肝脏。请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
上述方案最初用于结直肠CTC功能表征，但它可用于其他类型的癌症，如乳腺癌，并且可以适用于小鼠模型。
真正的限制因素是血液样本中存在的CTC的数量以及用于分离和扩增它们的技术的效率。已经根据特定的CTC特性描述了几种CTC分离技术，例如Parsortix，一种微流体装置，它允许根据细胞大小及其可压缩性分离CTC13。此外，还有CellSearch，这是一种基于免疫珠的测定，是唯一一种FDA批准的方法，用于根据阴性CD45标记在血液样品中枚举CTC，以消除污染淋巴细胞与阳性上皮标志物标记（如EpCAM和细胞角蛋白）相结合 8/18/1914。iChip是另一种基于大小的技术，但它也结合了CTC富集，使用基于EpCAM的正选择或CD45负耗竭15，16。最后，我们最近使用快速简便的免疫密度程序Rosette sep试剂盒，从结直肠癌患者血液样本中分离和扩增CTC10。
如果研究小鼠模型，也可以汇集来自同一队列的小鼠血液样本，以增加CTC的数量和在培养物中扩增它们的机会。在小鼠CTC的情况下，使用免疫缺陷小鼠通过脾内注射来测试肝脏定植不是强制性的。具有相同遗传背景的对照小鼠可以用作受体小鼠，而不受免疫反应的任何影响。
一旦CTC在悬浮液中扩增，就可以使用此处描述的每种技术将它们与来自同一类型癌症的其他癌细胞系进行比较。在这种情况下，必须在相同的条件下培养不同的癌细胞系。必须特别注意先天自动荧光，用于免疫荧光染色和细胞术分析。必须在不同的荧光通道中测试CTC和所使用的每种癌细胞系，而不进行任何染色。
如果所研究的CTC可以像任何经典细胞系一样在贴壁条件下粘附和增殖，那么上述技术可以适用于在这些条件下扩增的细胞。因此，当细胞来自更多分化的癌细胞群时，所得到的读数可能更相关，因为细胞在悬浮液中的分化程度较低。
总之，CTC线是非常宝贵的工具，可以深入表征导致癌症致死的转移过程所涉及的机制，并且在未来随着培养成功率的提高，CTC可用于提出适合每位患者的最佳治疗策略。
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Disclosures
作者没有竞争利益可披露。
Acknowledgments
Pannequin实验室的这个研究项目得到了SIRIC的研究资助：授予« INCa-DGOS-Inserm 6045 »。Guillaume Belthier和Zeinab Homayed的博士论文得到了抗癌联盟/法甲联盟的支持。Céline Bouclier的薪水由"Occitanie地区"资助。感谢Julian Venables的英文编辑。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumax solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, | Corning | 3473 | |
| Histiogel Specimen Medium | LabStorage | HG-4000 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-751 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-564 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| N-2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070063 |
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