Summary
Die Kultivierung von CTCs ermöglicht eine tiefere funktionelle Charakterisierung von Krebs, unter anderem durch die Untersuchung der spezifischen Markerexpression und die Bewertung der Arzneimittelresistenz und der Fähigkeit, die Leber zu besiedeln. Insgesamt könnte die CTC-Kultur ein vielversprechendes klinisches Werkzeug für die personalisierte Medizin sein, um das Patientenergebnis zu verbessern.
Abstract
Metastasierung ist eine der Hauptursachen für Krebstod. Trotz Verbesserungen der Behandlungsstrategien hat metastasierender Krebs eine schlechte Prognose. Wir stehen daher vor der dringenden Notwendigkeit, die Mechanismen hinter der Metastasenentwicklung zu verstehen und somit effiziente Behandlungen für fortgeschrittenen Krebs vorzuschlagen. Metastasierende Krebsarten sind schwer zu behandeln, da Biopsien invasiv und unzugänglich sind. In jüngster Zeit besteht ein erhebliches Interesse an Flüssigbiopsien, die sowohl zellfreie zirkulierende Desoxyribonukleinsäure (DNA) als auch zirkulierende Tumorzellen aus peripherem Blut umfassen, und wir haben mehrere zirkulierende Tumorzelllinien von patienten mit metastasierendem Dickdarmkrebs etabliert, um an ihrer Charakterisierung teilzunehmen. Um diese seltenen und schlecht beschriebenen Zellen funktionell zu charakterisieren, besteht der entscheidende Schritt darin, sie zu erweitern. Einmal etabliert, können zirkulierende Tumorzelllinien (CTC) dann in Suspensions- oder Adhärenzbedingungen kultiviert werden. Auf molekularer Ebene können CTC-Linien weiter verwendet werden, um die Expression spezifischer Marker von Interesse (wie Differenzierungs-, Epithel- oder Krebsstammzellen) durch Immunfluoreszenz- oder Zytometrieanalyse zu bewerten. Darüber hinaus können CTC-Linien verwendet werden, um die Arzneimittelempfindlichkeit gegenüber Goldstandard-Chemotherapien sowie gegenüber zielgerichteten Therapien zu beurteilen. Die Fähigkeit von CTC-Linien, Tumore zu initiieren, kann auch durch subkutane Injektion von CTCs in immundefiziente Mäuse getestet werden.
Schließlich ist es möglich, die Rolle spezifischer Gene von Interesse zu testen, die an der Krebsverbreitung beteiligt sein könnten, indem CTC-Gene, kurzhaarige Ribonukleinsäure (shRNA) oder Crispr/Cas9 bearbeitet werden. Modifizierte CTCs können somit in immundefiziente Mausmilzen injiziert werden, um einen Teil des metastatischen Entwicklungsprozesses in vivoexperimentell nachzuahmen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CTC-Linien ein wertvolles Werkzeug für die zukünftige Forschung und für die personalisierte Medizin sind, wo sie eine Vorhersage der Behandlungseffizienz mit genau den Zellen ermöglichen, die ursprünglich für die Metastasierung verantwortlich sind.
Introduction
Trotz jüngster Verbesserungen in der Krebsfrüherkennung und in der therapeutischen Strategie sind immer noch mehr als neunzig Prozent der Krebsmorbidität auf Metastasen zurückzuführen1. Der metastatische Prozess ist eine mehrstufige Kaskade, die mit der lokalen Ablösung von Zellen aus dem Primärtumor und ihrem Eintritt in den Blutkreislauf beginnt, wo sie zu zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) werden, um schließlich entfernte Stellen wie Leber und Lunge zu besiedeln, im Falle von Darmkrebs (CRC)2. In letzter Zeit wächst die Aufmerksamkeit für Flüssigbiopsien, die ein nicht-invasives Werkzeug sind, um INSbesondere CTCs aus Patientenblutproben zu erkennen und aufzuzählen. Intratumor genetische Heterogenität ist eine Hauptursache für Arzneimittelresistenzen; Somit stellt die Isolierung repräsentativer Zellen aus Tumormaterial ein vielversprechendes Werkzeug für die personalisierte Medizin dar3.
Trotz der geringen Häufigkeit von CTCs im Blut (1 CTC pro 106 - 107 Leukozyten)4wurden mehrere Nachweis- und Isolationstechniken entwickelt, die auf Eigenschaftsunterschieden zwischen CTCs und anderen Bestandteilen des Blutes basieren5. Allein die Anzahl der CTCs in Patientenblutproben kann Aufschluss über das Stadium der Malignität, das Ansprechen auf die Behandlung und den Krankheitsverlauf geben6,7. Daher ist die CTC-Isolierung ein entscheidendes Instrument für translationale Studien zur Beurteilung der genetischen Heterogenität oder zur Durchführung von Arzneimittelscreenings sowie für grundlegende Studien zur Charakterisierung dieser invasiven Zellen, da sie die Schlüsselakteure der metastatischen Induktion sind8,9. Im Vergleich zu kommerziell etablierten Krebszelllinien, die im Laufe der Zeit Tausende von Mutationen angesammelt haben, teilen frische CTCs die Hauptmerkmale des ursprünglichen Primärtumors, einschließlich einer starken Fähigkeit zur Metastasierung, und sie spiegeln die Krankheit besser wider. Diese Eigenschaften machen sie zu einem robusten Werkzeug für grundlegende Studien, insbesondere in Knockout-Experimenten mit vorhergesagten Schlüsselfaktoren, die an der Metastasierung beteiligt sind. Das Ergebnis dieser Experimente kann in vivoan Mäusen validiert werden, wie unten beschrieben.
Sobald CTCs isoliert sind, können sie unter nicht-adhärenten Kulturbedingungen expandiert werden und dann können sie wie jede verfügbare Krebszelllinie manipuliert werden, d.h. sie können auch unter adhärenten Bedingungen kultiviert oder in Matrigel eingebettet werden, abhängig von der wissenschaftlichen Frage10. Um beispielsweise die Expression und Lokalisation eines interessierenden Proteins zu testen, können CTC-Kugeln in Suspensionszustand gezüchtet und in Histogel eingebettet werden, um Immunfluoreszenz auf Kugelabschnitten durchzuführen. Wenn das Protein membranös ist, kann seine Expression auf lebenden Zellen durch Zytometrie gemessen werden.
Um die Rolle eines interessierenden Proteins zu testen, das bei der Besiedlung der Leber eine Rolle spielen könnte, können CTCs mit Genen, die durch shRNA oder CRISPR/Cas9 bearbeitet wurden, in die Milz von immundefizienten Mäusen injiziert werden. Dieses letztgenannte Experiment ist ein leistungsfähiges Modell zur Nachahmung der Lebermetastasenkolonisation11.
Die Fähigkeit von CTCs, Tumore zu initiieren, kann beurteilt werden, indem eine sehr kleine Anzahl von Zellen in immundefiziente Mäuse injiziert wird. Da die Tumorinitiierung ein Kennzeichen von Krebsstammzellen (CSCs) ist, zeigt dieser Assay den Prozentsatz der CSCs innerhalb der CTC-Linien an. Dieser Stammzellphänotyp macht zirkulierende Tumorzelllinien resistent gegen einige Goldstandard-Krebstherapien. Erweiterte CTCs können daher verwendet werden, um Medikamente zu screenen und die beste potenzielle effiziente Behandlung für den Patienten zu ermitteln. Das Ansprechen von CTC auf die Behandlung kann in vitro beispielsweise mit einem Lumineszenz-Lebensfähigkeitstest getestet werden.
Langfristig könnte das Arzneimittelscreening auf frisch isolierten und amplifizierten CTCs als neues Werkzeug für die personalisierte Medizin eingesetzt werden, um bei der Auswahl der effizientesten und am besten angepassten Behandlung für Patienten zu helfen.
In der vorliegenden Arbeit werden Protokolle zur Kultivierung von CTC-Linien, zur Färbung spezifischer Proteine mittels Immunfärbung und Zytometrie, zur Durchführung von Zytotoxizitätsassays sowie in vivo Xenograft-Experimenten mit CTC detailliert beschrieben.
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Protocol
Alle In-vivo-Protokolle wurden von den Tierethikbehörden genehmigt.
1. CTC-Amplifikation unter 3D-Kulturbedingungen
- Um CTCs in Suspension zu kultivieren, säen sie zuerst CTCs in Vertiefungen einer Ultra-Low Attachment (ULA) 24-Well-Platte bei der maximalen Konzentration von 5 Zellen / μL und in 1 ml M12-Medium (dh fortgeschrittenes DMEM-F12, ergänzt mit 2 mM l-Glutamin, 100 Einheit / ml Penicillin und Streptomycin, N2-Ergänzung, 20 ng / ml epidermalem Wachstumsfaktor und 10 ng / ml Fibroblastenwachstumsfaktor10).
- Um die Kugelbildung und Zellexpansion zu ermöglichen, inkubieren Sie die Zellen unter hypoxischen Bedingungen(2% O2)zwischen 6 und 10 Tagen.
- Sobald die Kugeln groß genug sind (100 μm), um Nekrose zu verhindern, dissoziieren Sie sie zur Verstärkung.
- Die Zellsuspension in ein 2-ml-Röhrchen oder ein 15-ml-Röhrchen geben und 5 Minuten lang bei 300 x g zentrifugieren.
- Entfernen Sie den Überstand und geben Sie 500 μL sanftes Dissoziationsreagenz (z. B. Accumax) in das Pellet.
- Vorsichtig vorwirbeln und die Zellsuspension mit schonendem Dissoziationsreagenz für 20 bis 30 Minuten bei 37 °C inkubieren.
HINWEIS: Die Überschreitung der Inkubationszeit im sanften Dissoziationsreagenz (Accumax) kann zu einer abnormal erhöhten Zellsterblichkeit führen. - 1,5 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) zugeben und das Röhrchen 5 Minuten lang bei 300 x g zentrifugieren.
- Gießen Sie den Überstand ab und resuspenieren Sie das Pellet in frischem M12-Medium, um die Dichte von 1-5 Zellen pro μL zu erreichen.
- Säen Sie die Zellsuspension in neue Vertiefungen einer Ultra-Low Attachment-Platte: 10 ml für T75-Kolben, 2 ml für 6 Well-Platten und 100 μL für 96 Well-Platten
2. Immunfluoreszenz (IF) Färbung auf CTC-Kugelschnitten
- Zentrifugieren Sie CTC-Kugeln in ein 15-ml-Röhrchen bei 300 x g für 5 min, saugen Sie den Überstand ab und waschen Sie das Pellet zweimal mit PBS.
- Resuspendieren Sie das Pellet mit 500 μL 4% Paraformaldehyd (PFA) und inkubieren Sie es für 20 min auf Eis. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 300 x g und waschen Sie sie zweimal mit 5 ml PBS.
- Resuspendieren Sie das Pellet mit (d.h. 15 bis 20 μL) heißem und flüssigem Histogel. Nehmen Sie mit einer Pipette die gesamte Suspension und machen Sie einen Tropfen auf einer vorgekühlten Oberfläche bei 4 ° C und lassen Sie sie 5 bis 10 Minuten polymerisieren.
HINWEIS: Arbeiten Sie schnell, um die Polymerisation der Suspension in die Spitze zu vermeiden. - Lösen Sie den festen Tropfen mit der Klinge eines Skalpells und führen Sie ihn in eine unterteilte Einbettungskassette ein.
- Führen Sie die folgenden Schritte aus: Paraffineinschluss, Paraffinschnitt, Abschnittsrehydratation, Antigengewinnung und Antikörperinkubation. Diese Schritte sind die gleichen wie bei jedem Tumor oder Organ, der in Paraffin eingebettet und für die Immunfluoreszenzfärbung verarbeitet wird12.
HINWEIS: Die Kassette kann in 70% Ethanol bei 4 °C bis zur Paraffineinbettung gelagert werden.
3. Zytometrische Analyse
- Zentrifugieren Sie CTC-Kugeln in ein 15-ml-Röhrchen bei 300 x g für 5 min und waschen Sie das Pellet zweimal mit PBS.
- Den Überstand absaugen und 500 μL des schonenden Dissoziationsreagenzes in das Pellet geben.
- Vorsichtig wirbeln und die Zellsuspension mit dem schonenden Dissoziationsreagenz für 20 bis 30 min bei 37 °C inkubieren.
HINWEIS: Mehr als 40 Min Inkubation im sanften Dissoziationsreagenz (Accumax) kann zu einer abnormal erhöhten Zellmortalität führen. - Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 5 min bei 300 x g, beseitigen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Pellet in 5 mL Blocking-Puffer (dh PBS mit 1% Rinderserumalbumin (BSA)).
- Führen Sie die Zellsuspension durch ein 40 μm Zellsieb, um die verbleibenden Kugeln zu eliminieren.
- Nach der Zählung 200.000 Zellen in drei fluoreszenzaktivierte Zellsortierröhrchen (FACS) geben, 5 min bei 300 x g zentrifugieren und den Überstand entfernen. Verwenden Sie eines der drei FACS-Röhrchen als Kontrolle, die keine Färbereagenzien erhält.
- Fügen Sie dem Datenblatt zufolge den entsprechenden Antikörper in die beiden verbleibenden FACS-Röhrchen hinzu (d. H. Ein konjugierter Antikörper gegen das interessierende Protein, eine konjugierte Isotypkontrolle).
- Nach der empfohlenen Inkubationszeit 300 μL des Blockierenden Puffers hinzufügen, um die Zellen zu waschen, die 3 Röhrchen bei 300 x g zu zentrifugieren und den Überstand abzusaugen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Dann resuspendieren Sie das Pellet mit dem blockierenden Puffer mit einem Zelllebensfähigkeit färbenden Reagenz (mit Ausnahme der FACS-Röhrchenkontrolle ohne Färbung).
- Bewahren Sie die Röhrchen bis zur FACS-Analyse auf Eis auf. Verwenden Sie zuerst die Röhre ohne Färbung, um das Tor für die Zelllebensfähigkeit und die Antikörperfärbung zu identifizieren. Analysieren Sie dann das FACS-Röhrchen mit dem konjugierten Antikörper gegen das Protein von Interesse, um den Prozentsatz des CTC zu quantifizieren, der das Protein von Interesse exprimiert. Das FACS-Röhrchen mit der konjugierten Isotypkontrolle sollte keine Verschiebung anzeigen. Dies bestätigt, dass die Verschiebung spezifisch für das zielgerichtete Protein von Interesse ist.
HINWEIS: Wenn möglich, verwenden Sie eine Zelllinie, die ein hohes Maß an Protein von Interesse als Positivkontrolle exprimiert, und eine Zelllinie, die das Protein nicht als Negativkontrolle exprimiert.
4. Lumineszenz-Lebensfähigkeitstest (CellTiter-Glo)
- Resuspend dissoziierte CTCs (wie in Abschnitt 1.4.5 beschrieben) in M12-Medium. Zählen Sie die Zellen und passen Sie die Zellkonzentration auf 200.000 Zellen/ml an.
- In einer ULA 96-Well-Platte 10.000 dissoziierte CTCs pro Vertiefung in 50 μL aussäten und die Platte bei Hypoxie (2%O2)für 24 h inkubieren.
- Geben Sie am nächsten Tag 50 μL des getesteten Arzneimittels zu den CTCs hinzu. Es wird zuvor empfohlen, eine Titration der Arzneimittelkonzentration durchzuführen, um die halbe maximale hemmende Konzentration (IC50) zu bestimmen. Behandeln Sie einige Brunnen nur mit Vehikel, um die Lebensfähigkeit der Basalzellen zu bestimmen.
HINWEIS: Die Anzahl der ausgesäten Zellen kann zwischen den CTC-Linien variieren, abhängig von ihrer Verdopplungszeit. Darüber hinaus sollten Zellen in Triplikaten ausgesät werden, um die Variabilität der Ergebnisse zu minimieren. - Inkubieren Sie Platten bei Hypoxie für weitere 48 h.
- Legen Sie an Tag 3 die kultivierten Platten und den Lumineszenzzelllebensfähigkeitspuffer und das Substrat auf Raumtemperatur und rekonstituieren Sie das Substrat mit einem geeigneten Puffervolumen gemäß dem Herstellerprotokoll.
- Fügen Sie 70 μL der Lumineszenzlebensfähigkeitsmischung in jede kultivierte Plattenmulde hinzu. Legen Sie die Platten für 20 Minuten auf einen Orbitalschüttler, um die Zelllyse zu induzieren, und übertragen Sie dann 100 μL der Mischung in eine undurchsichtige Multi-Well-Platte, die mit dem Luminometer kompatibel ist.
- Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur ruhen und bedecken Sie sie mit Aluminiumfolie, um das Leuchtsignal zu stabilisieren.
HINWEIS: Das Lumineszenzsignal ist bis zu 3 Stunden stabil. - Erfassen Sie die Lumineszenz mit einem Mikroplattenleser (z. B. Tecan Infinite 200 Pro).
- Berechnen Sie für die Datenanalyse den Mittelwert der dreifachen relativen Lichteinheit RLU pro Bedingung. Zur Beurteilung des Prozentsatzes der Lebensfähigkeit entsprechend jeder benötigten Wirkstoffkonzentration: (RLU der behandelten Zellen/ RLU der unbehandelten Zellen) x 100.
5. Subkutane Injektionen
- Resuspendieren Sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen Zellen in 100 μL sterilem PBS. Wenn die Anzahl der injizierten Zellen gering ist, resuspend Zellen in 1:1 PBS / Matrigel, reduziert in Wachstumsfaktoren, um Zellen zusammen zu konzentrieren und die Tumorinitiierung zu fördern.
HINWEIS: Die Zelldichte kann von 10 Zellen (um die Tumorinitiierungskapazität herauszufordern) bis zu 1 Million Zellen betragen, abhängig von der wissenschaftlichen Fragestellung und dem Ziel des Experiments. - Ziehen Sie das volle Volumen in einer Insulinspritze hoch.
- Bei einer immundefizienten Maus die Haut der Flanke zwischen Zeigefinger und Ringfinger einklemmen und die Nadel vorsichtig an der Basis der Haut einführen.
HINWEIS: Dieses Verfahren ist nicht schmerzhaft und wird bei bewussten Mäusen durchgeführt. - Injizieren Sie das Volumen langsam an derselben Stelle, um die Ausbreitung der Zellen zu verhindern. Dadurch entsteht ein kleiner Bleb unter der Haut.
- Üben Sie sanften Druck auf die Injektionsstelle aus, um den Rückfluss des Volumens zu verhindern.
- Überwachen Sie das Tumorwachstum jeden zweiten Tag mit einem Messschieber.
- Opfern Sie das Tier, wenn der Tumor 1500 mm überschreitet3. Je nach Materialverfügbarkeit werden die Mäuse durch Einatmen von Kohlendioxid oder Betäubungsgasen oder durch Zervixluxation eingeschläfert.
6. Intrasplenische Injektion
- Vor dem Start die chirurgischen Instrumente (Schere und Pinzette) bei 124 °C für 15 min autoklavieren und alle Oberflächen des Arbeitsraums mit 70% Ethanol reinigen.
- In einem Mikrozentrifugenröhrchen resuspendieren Sie Zellen in 50 μL sterilem PBS und lagern sie auf Eis. Die Zelldichte kann von 0,5 bis 1 Million Zellen reichen. Eine größere Anzahl von Zellen kann die Entwicklung von Gerinnseln in den Blutkreislauf verursachen.
- Vor der Injektion der Zellen subkutan 100 μL 0,015 mg/ml Buprenorphin subkutan zur Schmerzlinderung injizieren.
- Legen Sie die Maus für 2-3 min in eine Induktionskammer, in der Isofluran bei 3% gehalten wird. Wenn das Tier nicht mehr auf Bewegungen anspricht, legen Sie es auf die rechte Seite auf ein Heizkissen und halten Sie die Narkose mit einer Atemschutzmaske aufrecht, die ein Gasgemisch aus O2 und Isofluran liefert.
- Tragen Sie Augengleitmittel auf jedes Auge auf, um ein Austrocknen der Augen während der Operation zu vermeiden. Desinfizieren Sie den Brustbereich mit Povidon-Jod-Lösung (z. B. Betadin).
- Machen Sie auf der dorsoventralen Seite einen kleinen Schnitt von 0,5 cm mit einer Schere unterhalb der 10. falschen Rippe.
- Heben Sie die Milz vorsichtig heraus und legen Sie sie auf sterile Gaze. Injizieren Sie mit einer Insulinspritze die 50 μL CTCs in die Milzspitze. Stellen Sie sicher, dass Sie die Spritze aufrecht halten und warten Sie 3-5 Minuten, um einen Rückfluss zu vermeiden, und entfernen Sie dann die Nadel.
- Ligatieren Sie die Milzgefäße von beiden Seiten (Arterien und Venen) und entfernen Sie die Milz, indem Sie direkt über den beiden Ligaturen schneiden. Die Milz wird entfernt, um eine unerwünschte Tumorbildung in diesem Organ zu verhindern.
- Nähen Sie das Bauchperitoneum und dann die Haut mit 5,0 abbaubaren sterilen Nähten.
- Halten Sie die Maus warm, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt hat.
- Überwachen Sie die Maus 3 Tage pro Woche auf abnormale Körperfunktionen, abnormale Bewegungen und Haltungen sowie auf Gewichtsverlust.
- Opfern Sie das Tier, wenn humane Endpunkte erreicht sind (ca. 6 Wochen nach der Operation), um Lebermetastasen zu analysieren.
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Representative Results
Sowohl EpCAM- als auch CD26-Expressionen, die von IF(Abbildung 1A rechtes Panel)bzw. FACS(Abbildung 1B)beobachtet wurden, deuten darauf hin, dass die CTC-Linie epithelial ist und eines der CSC-Kennzeichen10aufweist. Dieses epitheliale Merkmal kann durch Färbung mit Antikörpern, die gegen andere epitheliale und mesenchymale Marker gerichtet sind, weiter charakterisiert werden. Dadurch könnte es möglich sein, ungefähr zu wissen, wo sich die CTC-Linie entlang der epithelial-mesenchymalen Achse befindet. Die Expression anderer CSC-Marker könnte sowohl durch Immunfärbung als auch durch Zytometrie getestet werden. Ansonsten können funktionelle Tests wie Arzneimittelresistenz und Tumorinitiierungsassay in vivo diesen CSC-Phänotyp10validieren. Hier zeigt beispielsweise der Lumineszenz-Lebensfähigkeitstest, dass der CTC IC50 nur bei hoher Wirkstoffkonzentration erreicht wird, was die hohe Resistenz dieser Zellen unterstreicht (Abbildung 2). Darüber hinaus zeigt die subkutane CTC-Injektion, dass diese CTC-Linie eine tumorigene Fähigkeit aufweist (Abbildung 3A). Diese letzteren Ergebnisse bestätigen den CSC-Phänotyp dieser CTC-Linie. Die Herausforderung der Tumorinitiierungskapazität durch Injektion von 10 bis 10.000 Zellen kann die Abschätzung der tumorigenen Fähigkeit verfeinern. Schließlich zeigt die Bildung von Lebermetastasen durch Nachahmung der Ausbreitung durch intrasplenische Injektion, dass diese CTC-Linie in einem entfernten Organ überleben kann und ein metastatisches Potential aufweist (Abbildung 3B). Dieses metastatische Potenzial kann mit anderen Zelllinien verglichen oder durch Hemmung der spezifischen Genexpression oder bei Verabreichung einer Chemotherapie bei Mäusen nach intrasplenischer Injektion in Frage gestellt werden.
Abbildung 1: Mikroskopische und durchflusszytometrische Analysen von CTC-Kugeln zeigen, dass sie sowohl epitheliale als auch CSC-Marker exprimieren. (A) Linkes Feld: CTC-Kugeln, die vor dem Einbetten 6 Tage lang kultiviert wurden. Rechtes Panel: Epifluoreszenzmikroskopische Analyse von eingebetteten CTC-Kugeln in Histogel. 5 μm-Abschnitte eingebetteter CTC-Kugeln wurden durch einen Antikörper gegen den Epithelmarker Epithelzelladhäsionsmolekül (EPCAM) (in rot) gefärbt und der Kern ist mit DAPI (in blau) markiert. Der Maßstabsbalken beträgt 20 μm. (B) Durchflusszytometrieanalyse von lebenden einzelnen CTCs. Oben links zeigt FACS-Diagramm CTCs ohne Markierung, um Zellen basierend auf ihrer Größe und Granularität zu markieren. Das FACS-Diagramm oben rechts zeigt CTCs mit einem Lebensfähigkeitsmarker, um nur lebende Zellen zu schützen. Das FACS-Diagramm unten links zeigt CTCs, die mit APC-konjugierter Isotypkontrolle gekennzeichnet sind, um positiv markierte Zellen zu schützen. Das FACS-Diagramm unten rechts zeigt CTCs, die durch APC-konjugierte CD26-Antikörper markiert wurden, um den Prozentsatz der Zellen zu bestimmen, die diesen CSC-Marker exprimieren (67%). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentatives Ergebnis des Zellwachstumsassays unter Verwendung eines Lumineszenz-Lebensfähigkeitstests. Pro Vertiefung wurden 10.000 CTCs ausgesät und anschließend 72 Stunden lang mit einer steigenden Konzentration des interessierenden Moleküls behandelt. Der IC50 wird bei x μM erreicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: CTCs haben ein tumorigenes und metastatisches Potential. (A) Subkutane Injektion von 200.000 CTCs auf die rechte Flanke von Nacktmäusen. Die Fotos wurden 1 Monat nach der Injektion aufgenommen und die Tumorgröße wurde 3 Mal pro Woche gemessen. (B) Intrasplenische Injektion von CTCs zur Nachahmung der metastasierenden Besiedlung der Leber. Rechtes Panel: repräsentatives Foto der Mausleber, seziert 4 Wochen nach intrasplenischer Injektion von 300.000 CTCs. Linkes Panel: Mausleber seziert 4 Wochen nach intrasplenischer Injektion von PBS. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das oben beschriebene Protokoll wurde ursprünglich für die funktionelle Charakterisierung der kolorektalen CTC verwendet, kann jedoch für andere Krebsarten wie Brustkrebs verwendet und für Mausmodelle angepasst werden.
Der wirklich limitierende Faktor ist die Anzahl der in der Blutprobe vorhandenen CTCs und die Effizienz der Technik, mit der sie isoliert und expandiert werden. Mehrere CTC-Isolationstechniken wurden auf der Grundlage spezifischer CTC-Eigenschaften beschrieben, wie z.B. parsortix, ein mikrofluidisches Gerät, das die Isolierung von CTCs basierend auf der Zellgröße und ihrer Kompressibilitätermöglicht 13. Darüber hinaus gibt es den CellSearch, einen immunobead-basierten Assay, der die einzige von der FDA zugelassene Methode zur Aufzählung von CTCs in Blutproben auf der Grundlage einer negativen CD45-Markierung ist, um kontaminierende Lymphozyten in Kombination mit einer positiven Epithelmarkierung wie EpCAM und Cytokeratin 8/18/1914zu eliminieren. Der iChip ist eine weitere größenbasierte Technologie, aber er kombiniert auch die CTC-Anreicherung entweder mit einer EpCAM-basierten positiven Selektion oder einer CD45-negativen Depletion15,16. Schließlich haben wir kürzlich das schnelle und einfache Immundichteverfahren Rosette Sep Kit verwendet, um CTC aus den Blutproben von Darmkrebspatienten zu isolieren und zu amplifizieren10.
Wenn Sie an einem Mausmodell arbeiten, ist es auch möglich, Mausblutproben aus derselben Kohorte zu sammeln, um die Anzahl der CTCs und die Chance, sie in Kultur zu verstärken, zu erhöhen. Im Falle von murinen CTCs ist es nicht zwingend erforderlich, immundefiziente Mäuse zu verwenden, um die Leberkolonisation durch intrasplenische Injektion zu testen. Kontrollmäuse mit dem gleichen genetischen Hintergrund können als Empfängermäuse ohne Einfluss der Immunantwort verwendet werden.
Sobald CTCs in Suspension amplifiziert sind, können sie mit jeder hier beschriebenen Technik mit anderen Krebszelllinien der gleichen Krebsart verglichen werden. In diesem Fall müssen verschiedene Krebszelllinien unter den gleichen Bedingungen kultiviert werden. Besonderes Augenmerk muss auf die angeborene Autofluoreszenz für die Immunfluoreszenzfärbung und zytometrische Analyse gelegt werden. Die CTCs und jede verwendete Krebszelllinie müssen ohne Färbung in den verschiedenen Fluoreszenzkanälen getestet werden.
Wenn die untersuchten CTCs unter adhärenten Bedingungen wie jede klassische Zelllinie haften und sich vermehren können, können die oben beschriebenen Techniken für Zellen angepasst werden, die unter diesen Bedingungen erweitert wurden. Die resultierenden Messwerte werden daher wahrscheinlich relevanter sein, wenn die Zellen aus differenzierteren Krebszellenpopulationen stammen, da Zellen in der Regel weniger in der Suspension differenziert sind.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CTC-Linien sehr wertvolle Werkzeuge sind, um Mechanismen, die an metastatischen Prozessen beteiligt sind, die zur Krebsletalität führen, tief zu charakterisieren, und in Zukunft, wenn sich die Erfolgsraten der Kultur verbessern, könnten CTCs verwendet werden, um die beste therapeutische Strategie vorzuschlagen, die an jeden Patienten angepasst ist.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen offenzulegen.
Acknowledgments
Dieses Forschungsprojekt im Pannequin-Labor wurde durch ein Forschungsstipendium des SIRIC unterstützt: Grant « INCa-DGOS-Inserm 6045 ». Die Doktorarbeiten von Guillaume Belthier und Zeinab Homayed wurden von der Anti-Krebs-Liga/Ligue contre le Cancer unterstützt. Das Gehalt von Céline Bouclier wurde von der "Region Okzitanien" finanziert. Danke an Julian Venables für die englische Bearbeitung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumax solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, | Corning | 3473 | |
| Histiogel Specimen Medium | LabStorage | HG-4000 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-751 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-564 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| N-2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070063 |
References
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