Summary
CTCを培養することで、特定のマーカー発現をアッセリングし、薬剤耐性や肝臓を植民地化する能力を評価することによって、癌のより深い機能的特徴付けが可能になります。全体的に、CTC培養は、患者の転帰を改善するためのパーソナライズされた医療のための有望な臨床ツールである可能性があります。
Abstract
転移は癌死の主な原因である。治療戦略の改善にもかかわらず、転移性癌は予後が悪い。そこで、転移のメカニズムを理解し、進行癌に対して効率的な治療法を提案することが急務に直面する。転移性癌は、生検が侵襲的でアクセス不能であるため、治療が困難である。近年、末梢血から細胞を含まない循環性デオキシリボ核酸(DNA)と循環腫瘍細胞の両方を含む液体生検に大きな関心があり、転移性大腸癌患者からいくつかの循環腫瘍細胞株を確立し、その特性評価に参加しています。確かに、これらの稀で十分に記述されていない細胞を機能的に特徴付けるためには、重要なステップはそれらを拡大することです。一旦確立されると、循環腫瘍細胞(CTC)株は、懸濁または付着状態で培養することができる。分子レベルでは、CTCラインは、免疫蛍光または細胞測定分析による関心のある特定のマーカー(分化、上皮、癌幹細胞など)の発現を評価するためにさらに使用することができる。さらに、CTCラインは、ゴールドスタンダード化学療法および標的療法に対する薬物感受性を評価するために使用することができる。腫瘍を開始するCTCラインの能力は、免疫不全マウスにおけるCTCの皮下注射によっても試験することができる。
最後に、短いヘアピンリボ核酸(shRNA)またはCrispr/Cas9によってCTC遺伝子を編集することによって、癌の播種に関与する可能性のある特定の関心遺伝子の役割をテストすることが可能である。このようにして修飾CTCを免疫不全マウス脾臓に注入することができ、 インビボにおける転移開発プロセスの一部を実験的に模倣することができる。
結論として、CTCラインは、将来の研究とパーソナライズされた医療のための貴重なツールであり、もともと転移を担っている細胞を使用して治療効率を予測することができます。
Introduction
早期癌診断および治療戦略における最近の改善にもかかわらず、癌罹患率の90%以上は転移によるものである。転移過程は、原発腫瘍からの細胞の局所剥離と、それらが循環腫瘍細胞(CTC)となる血流への入り口から始まり、最終的に肝臓および肺などの遠方部位を植民地化する多段階カスケードである、大腸癌(CRC)2の場合。最近では、患者の血液サンプルからCTCを検出して列挙するための非侵襲的なツールである液体生検への注目が高まっています。腫瘍内の遺伝的不均一性は薬剤耐性の主要な原因である;したがって、代表的な細胞を腫瘍材料から分離することは、個別化医療3のための有望なツールを構成する。
血液中のCTCの低頻度(106-10 7白血球あたり1CTC)4にもかかわらず、CTCと血液5の他の成分との間の特性の違いに基づいていくつかの検出および分離技術が開発された。患者の血液サンプル中のCTCの数は、単独で、悪性腫瘍の段階、治療応答および疾患進行に関する情報を提供することができる6、7。したがって、CTC単離は、遺伝的不均一性を評価したり、薬物スクリーニングを行ったりするための翻訳研究や、転移誘導8,9の主要なアクターであるこれらの侵襲性細胞を特徴付けるための基礎的研究にとって重要なツールである。実際、時間の経過とともに何千もの突然変異を蓄積した商業的に確立された癌細胞株と比較して、新鮮なCTCは転移する強力な能力を含む元の原発性腫瘍の主な特徴を共有し、疾患のより良い反映である。これらの特徴は、特に転移に関与する予測された重要な要因のノックアウト実験において、基礎研究のための堅牢なツールです。これらの実験の結果は、以下に説明されるように、マウス上でインビボで検証することができる。
CTCが単離されると、それらは非接着性培養条件で拡大することができ、その後、それらは利用可能な癌細胞株と同じように操作することができ、すなわち、科学的な質問10に応じて、同じように接着状態で培養またはマトリゲルに埋め込むことができる。例えば、目的のタンパク質の発現および局在を試験するために、CTC球体を懸濁状態で増殖させ、ヒストゲルに埋め込んで球部に免疫蛍光を行うことができる。また、タンパク質が膜状であれば、生細胞に対するその発現は細胞測定によって測定することができる。
機能研究のために、肝コロニー形成に役割を果たす可能性のある目的のタンパク質の役割を試験するために、遺伝子を編集したCTCは、shRNAまたはCRISPR/Cas9によって、免疫不全マウスの脾臓に注入することができる。この後者の実験は、肝転移コロニー形成11を模倣する強力なモデルである。
CTCが腫瘍を開始する能力は、非常に少数の細胞を免疫欠損マウスに注入することによって評価することができる。腫瘍開始は癌幹細胞(CSC)の特徴であるため、このアッセイはCTCライン内のCSCの割合を示す。この幹細胞表現型は、循環腫瘍細胞株をいくつかのゴールドスタンダード癌療法に耐性にする。拡張されたCTCは、したがって、薬物をスクリーニングし、患者のための最良の潜在的な効率的な治療を特定するために使用することができます。治療に対するCTC応答は、例えば発光生存アッセイを用いてインビトロで試験することができる。
長期的な観点から、新たに単離され増幅されたCTCの薬物スクリーニングは、患者のための最も効率的で適応された治療法を選択するのに役立つパーソナライズされた医療のための新しいツールとして使用することができます。
本論文では、CTCラインを培養するためのプロトコル、免疫染色および細胞測定を介して特定のタンパク質を染色し、CTCを用いた生体内異種移植実験と同様に細胞傷害アッセイを行う方法が詳述されている。
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Protocol
すべての生体内プロトコルは、動物倫理機関によって承認されました。
1. 3D培養条件におけるCTC増幅
- 懸濁液中のCTCを培養するには、超低添付着物(ULA)24ウェルプレートのウェル内の第1シードCTCを5細胞/μLの最大濃度で、M12培地の1mL(すなわち、 高度なDMEM-F12は、2 mM l-グルタミン、100単位/mLペニシリンおよびストレプトマイシン、N2サプリメント、20 ng/mL表皮成長因子および10 ng/mL芽線維増殖因子10を添加した。
- 球体形成と細胞増殖を可能にするために、細胞を低酸素状態(2%O2)で6~10日間インキュベートする。
- 球体が十分な大きさ(100 μm)になったら、壊死を防ぐために、増幅のためにそれらを解約する。
- 細胞懸濁液を2mLチューブまたは15mLチューブに入れ、遠心分離機を300xgで5分間置きます。
- 上清を取り除き、ペレットに500μLの穏やかな解離試薬(例えば、Accumax)を加えます。
- 37°Cで20~30分間穏やかな解離試薬で細胞懸濁液を穏やかにインキュベートします。
注:穏やかな解離試薬(Accumax)でインキュベーション時間を超えると、細胞死亡率が異常に増加する可能性があります。 - リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1.5mLを加え、300 x gで5分間チューブを遠心分離します。
- 上清を注ぎ、新鮮なM12培地でペレットを再懸濁して、μL当たり1〜5細胞の密度に達します。
- 超低い付着プレートの新しいウェルに細胞懸濁液をシード:T75フラスコ用10mL、6ウェルプレート用2mL、96ウェルプレートの場合は100 μL
2. CTC球部における免疫蛍光(IF)染色
- CTCの遠心分離機は、300 x gで15 mLチューブに5分間、上清を吸引し、ペレットをPBSで2回洗浄します。
- 4%パラホルムアルデヒド(PFA)の500 μLでペレットを再懸濁し、氷上で20分間インキュベートします。懸濁液を300xgで遠心分離し、5mLのPBSで2回洗浄する。
- ペレットを熱く液体ヒストゲル(すなわち、15~20 μL)で再懸濁します。ピペットで、すべての懸濁液を取り、4°Cで予冷した表面に液滴を作り、5〜10分間重合させます。
注:先端に懸濁液の重合を避けるために速く働きます。 - メスの刃で固体液滴を取り外し、コンパートメント埋め込みカセットに挿入します。
- パラフィン含有、パラフィン切裂、切除、抗原検索および抗体インキュベーションの手順を実行します。これらのステップは、パラフィンに埋め込まれた任意の腫瘍または器官と同様であり、免疫蛍光染色12のために処理される。
注:カセットは、パラフィン埋め込みまで4°Cで70%エタノールに保存することができます。
3. 細胞測定分析
- 遠心CTCは300 x gで15mLチューブに5分間球を入れ、ペレットをPBSで2回洗浄します。
- 上清を吸引し、ペレットに穏やかな解離試薬の500 μLを加えます。
- 37°Cで20~30分間穏やかな解離試薬で細胞懸濁液を穏やかにインキュベートします。
注:穏やかな解離試薬(Accumax)のインキュベーションの40分を超えると、異常な細胞死亡率の増加をもたらす可能性があります。 - 遠心分離細胞懸濁液を300xgで5分間、上清を除去し、ブロック緩衝液の5mL(すなわち、1%ウシ血清アルブミン(BSA)を有するPBS)の中にペレットを再懸濁させる。
- 40 μmのセルストレーナーを通して細胞懸濁液を通過し、残りの球を除去します。
- 計数後、200,000個の細胞を3つの蛍光活性化細胞選別(FACS)チューブに入れ、遠心分離機を300xgで5分間入れ、上清を取り除きます。3つのFACSチューブのうちの1つを、染色試薬を受け取らないコントロールとして使用してください。
- データシートによれば、残りの2つのFACSチューブに適切な抗体を加える(すなわち、目的のタンパク質に対する1つの共役抗体、1つの共役アイソタイプ対照)。
- 推奨インキュベーション時間の後、ブロッキングバッファーの300 μLを加えて細胞を洗浄し、3管を300 x gで遠心分離し、上清を吸引します。この手順を 2 回繰り返します。次いで、細胞生存性染色試薬を用いてブロッキング緩衝液を用いてペレットを再懸濁する(染色を行わないFACSチューブ制御を除く)。
- FACS分析までチューブを氷の上に置いてください。細胞生存率と抗体染色のためのゲートを識別するために、染色せずに最初のチューブを使用してください。次に、FACSチューブを対象のタンパク質に対して共役抗体で分析し、目的のタンパク質を発現するCTCの割合を定量化する。共役アイソタイプ制御を有するFACSチューブは、シフトを示すべきではない。これは、シフトが対象の標的タンパク質に特異的であることを確認します。
注:可能であれば、目的のタンパク質の高レベルを発現する細胞株を陽性対照として使用し、陰性対照としてタンパク質を発現しない細胞株を使用してください。
4. 発光の生存率アッセイ(セルテイヤーグロ)
- M12 メディアで解離された CTC (セクション 1.4.5 で説明) を再中断します。細胞を数え、細胞濃度を200,000細胞/mLに適応させます。
- ULA 96ウェルプレートでは、種子10,000の解約CTC(1ウェルあたり50μL)で、低酸素(2%O2)でプレートを24時間インキュベートします。
- 翌日、CTCに50μLの試験薬を添加する。薬物濃度の滴定を行い、半最大阻害濃度(IC50)を決定することが推奨される。基礎細胞の生存率を決定するためだけに車両でいくつかの井戸を扱います。
注: シードされるセルの数は、CTC ラインの間で、倍の時間によって異なる場合があります。また、結果の変動を最小限に抑えるために、細胞を三量体で播種する必要があります。 - さらに48時間低酸素下のプレートをインキュベートする。
- 3日目に、培養プレートと発光細胞の生存率バッファーと基板を室温に置き、メーカーのプロトコルに従って、適切な量のバッファーで基板を再構成する。
- 各培養プレートに70μLの発光生用混合を加えます。プレートを軌道シェーカーに20分間置いて細胞のリシスを誘導し、100 μLの混合を不透明な壁面のマルチウェルプレートに移し、照明メーターと互換性があります。
- プレートを室温で休ませ、発光信号を安定させるためにアルミホイルで覆います。
注:発光信号は3時間まで安定しています。 - マイクロプレートリーダー(テカン無限200 Pro)を使用して発光を記録します。
- データ解析では、条件ごとに相対光単位 RLU の三重化の平均を計算します。必要な各薬剤濃度に応じた生存率の割合を評価するには:(未処理細胞の処理細胞/RLUのRLU)x 100。
5. 皮下注射
- マイクロ遠心チューブで、100 μLの無菌PBSで細胞を再懸濁します。注入された細胞の数が少ない場合、細胞を1:1 PBS/Matrigelで再懸濁し、増殖因子で減少させ、細胞を一緒に濃縮し、腫瘍開始を促進する。
注:細胞密度は、科学的な質問と実験の目的に応じて、10個の細胞(腫瘍開始能力に挑戦する)から100万個の細胞までであり得る。 - インスリン注射器でフルボリュームを引き上げる。
- 免疫欠乏マウスで、インデックスと薬指の間の側面の皮膚をつまみ、皮膚の基部に針をそっと挿入します。
注:この手順は痛みがなく、意識的なマウスで行われます。 - 細胞の広がりを防ぐために、同じ場所にゆっくりとボリュームを注入します。これは、皮膚の下に小さなブレブを作成します。
- 注入部位に穏やかな圧力をかけ、体積の逆流を防ぎます。
- 1日おきに、キャリパーを使用して腫瘍の成長を監視する。
- 腫瘍が1500mm3を超える場合は、動物を犠牲にする。材料の可用性に応じて、二酸化炭素または麻酔ガス吸入または頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。
6. 脾臓内注射
- 開始する前に、手術器具(はさみと鉗子)を124°Cで15分間オートクレーブし、70%エタノールで作業スペースのすべての表面を清掃してください。
- マイクロ遠心チューブでは、50 μLの無菌PBSで細胞を再懸濁し、氷の上に保管します。細胞密度は0.5から100万の細胞に行くことができます。より多くの細胞が血行に血栓の発達を引き起こす可能性があります。
- 細胞を注入する前に、痛みを軽減するために、0.015 mg/mLブプレノルフィンを皮下に100μL注入します。
- イオブルランが3%で維持される誘導室にマウスを2〜3分間置きます。動物が動きに反応しなくなったら、加熱パッドの右側に置き、O2 とイソフルランのガス混合物を送達する呼吸回路フェイスマスクを使用して麻酔を維持します。
- 手術中の眼の乾燥を避けるために、各目の上に目の潤滑剤を塗布してください。ポビドネ-ヨウ素溶液(すなわちベタジン)で胸部領域を消毒する。
- ドーソベントラル側で、10番目の偽の肋骨の下のはさみを使用して0.5cmの小さな切開を行います。
- 脾臓をそっと持ち上げ、滅菌ガーゼの上に置きます。インスリン注射器を使用して、脾臓の先端に50μLのCTCを注入する。シリンジを直立状態に保ち、3~5分待って逆流を防ぎ、針を外します。
- 両側(動脈と静脈)から脾臓の血管をリゲートし、2つの合字の真上を切断することによって脾臓を取り除きます。脾臓は、この器官の不要な腫瘍形成を防ぐために除去される。
- 腹部腹膜を縫い合わせ、5.0分解性の無菌縫合糸を使用して皮膚をステッチします。
- 麻酔から完全に回復するまで、マウスを暖かく保ちます。
- 異常な身体機能、異常な動きや姿勢、体重減少のために週3日マウスを監視します。
- ヒトの終点が到達したときに動物を犠牲にする (手術後約 6 週間) 肝臓転移を分析します。.
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Representative Results
IF(図1A右パネル)およびFACS(図1B)で観察されたEpCAMおよびCD26の両方の式は、CTC線が上皮であることを示し、CSCの特徴10の1つを表示する。この上皮形質は、他の上皮および間葉系マーカーに対する抗体による染色によってさらに特徴付けることができる。それにより、上皮間葉軸に沿ってCTC線がどこであるかをほぼ知ることができる。他のCSCマーカーの発現は、免疫染色およびサイトメトリーの両方によっても試験することができた。さもなければ、生体内での薬剤耐性および腫瘍の起点アッセイとしての機能試験は、このCSC表現型10を検証することができる。ここで、発光生用アッセイは、CTC IC50が高い薬剤濃度で到達するだけで、これらの細胞の高抵抗性を強調することを示している(図2)。また、皮下CTC注射は、このCTCラインが腫瘍形成能を有することを示す(図3A)。これらの後者の結果は、このCTC線のCSC表現型を確認する。10~10,000個の細胞を注入することで腫瘍開始能力に挑戦することで、腫瘍発生能の推定を改良できる。最後に、脾臓内注射による播体化を模倣した肝臓転移形成は、このCTC線が遠くの器官で生き残ることができ、転移性ポテンシャルを有することを示している(図3B)。この転移電位は、他の細胞株と比較するか、特定の遺伝子発現を阻害することによって、または、脾臓内注射後のマウスにおける化学療法投与によって挑戦することができる。
図1CTC球の顕微鏡とフローサイトメトリー解析は、上皮マーカーとCSCマーカーの両方を発現していることを示している。(A)左パネル:埋め込む前に6日間培養したCTC球体。右パネル:ヒストゲル中の埋め込みCTC球体の蛍光顕微鏡分析埋め込まれたCTC球の5μmのセクションは上皮マーカー上皮細胞接着分子(EPCAM)に対する抗体によって染色された(赤で)、核はDAPI(青色)で標識されている。スケールバーは20μm(B)生きている単一のCTCのフローサイトメトリー分析である。左上のFACSプロットは、そのサイズと粒度に基づいてゲートセルにラベルを付けることなくCTCを示す。右上のFACSプロットは、生存細胞のみをゲートする生存マーカーを持つCTCを示しています。左下のFACSプロットは、正に標識された細胞をゲートするAPC共役アイソタイプ制御で標識されたCTCを示しています。右下のFACSプロットは、このCSCマーカーを発現する細胞の割合を評価するためにAPC結合CD26抗体によって標識されたCTCを示す(67%)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:発光生用アッセイを用いた細胞増殖アッセイの代表的な結果は 、10,000個のCTCをウェルあたり播種し、その後、関心のある分子の濃度を72時間増加させて処理した。IC50はx μMで 到達します。
図3: CTCは腫瘍性および転移性の潜在性を有する。 写真は注射後1ヶ月後に撮影し、腫瘍サイズを週3回測定した。(B) CTCのインスプレニック注射は、肝転移性の植民地化を模倣する。右パネル:30万CTCsの脾臓内注射の4週間後にマウス肝臓を解剖したマウスの代表的な写真。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
上述のプロトコルは、最初は大腸CTC機能特性評価に使用されたが、乳癌などの他のタイプの癌に使用することができ、マウスモデルに適応することができる。
実際の制限要因は、血液サンプルに存在するCTCの数と、それらを分離および拡大するために使用される技術の効率です。いくつかのCTC分離技術は、Parsortixのような特定のCTC特性に基づいて記述されている、マイクロ流体デバイスは、細胞サイズとその圧縮性13に基づいてCTCの分離を可能にする。さらに、EpCAMおよびサイトケラチン8/18/19 14などの陽性上皮マーカー標識と組み合わせた汚染性のリンパ球を排除するために、陰性CD45標識に基づいて血液サンプル中のCTCを列挙する唯一のFDA承認の方法である免疫ビーズベースのアッセイであるCellSearchがある。iChipは別のサイズベースの技術ですが、それはまた、EpCAMベースの正の選択またはCD45負の枯渇15、16のいずれかを使用してCTC濃縮を組み合わせたものです。最後に、我々は最近、高速かつ容易な免疫密度手順、ロゼットsepキットを使用して、大腸癌患者の血液サンプル10からCTCを単離および増幅する。
マウスモデルで作業する場合、同じコホートからマウスの血液サンプルをプールして、CTCの数と培養でそれらを増幅する機会を増やすこともできます。マウスCTCの場合、免疫不全マウスを使用して、脾臓内注射による肝臓の植民地化を試験することは必須ではない。同じ遺伝的背景を有する対照マウスは、免疫応答の影響を受けることなく、レシピエントマウスとして使用することができる。
一旦CTCが懸濁液で増幅されると、ここで説明する各技術を用いて同じタイプの癌の他の癌細胞株と比較することができる。この場合、異なる癌細胞株は同じ条件で栽培されなければならない。免疫蛍光染色および細胞測定分析のためには、特に注意が必要です。使用するCTCおよび各癌細胞株は、異なる蛍光チャネルで染色することなく試験されなければならない。
研究中のCTCが、古典的な細胞株のような付着条件で接着し増殖することができれば、上記の技術は、これらの条件で拡大した細胞に適応することができる。結果として得られる読み出しは、細胞が懸濁液中で分化が少ない傾向があるため、細胞がより分化された癌細胞集団からのものである場合、より関連性が高い可能性が高い。
結論として、CTCラインは、がん致死性をリードする転移プロセスに関与するメカニズムを深く特徴付けるための非常に貴重なツールであり、将来的には培養成功率が向上するにつれて、CTCを使用して各患者に適応する最良の治療戦略を提案することができます。
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Disclosures
著者らは開示する競合する利益を持っていません。
Acknowledgments
パンヌキン研究室でのこの研究プロジェクトは、SIRICからの研究助成金によって支援されました: グラント « INCa-DGOS-Inserm 6045 » .ギヨーム・ベルトィエとゼイナブ・ホマイドの博士課程は、抗がんリーグ/リーグ・コントル・ル・ガンによって支えられました。セリーヌ・ブークリエの給与は「地域オクシタニー」によって資金提供されました。英語編集のためのジュリアン・ヴァナブルズに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumax solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, | Corning | 3473 | |
| Histiogel Specimen Medium | LabStorage | HG-4000 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-751 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-564 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| N-2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070063 |
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