Summary
Artikkelen introduserer μTongue (mikrofluidics-on-a-tongue) enheten for funksjonell smak celle avbildning in vivo ved å integrere mikrofluidikk i et intravitalt bildevindu på tungen.
Abstract
Intravital fluorescensmikroskopi er et verktøy som brukes mye til å studere multicellulær dynamikk i et levende dyr. Det har imidlertid ikke blitt brukt i smakssensorisk organ. Ved å integrere mikrofluidikk i det intravitale tungeavbildningsvinduet, gir μTongue pålitelige funksjonelle bilder av smaksceller in vivo under kontrollert eksponering for flere smaksstoffer. I dette dokumentet presenteres en detaljert trinnvis prosedyre for å bruke μTongue-systemet. Det er fem underavsnitt: forberedelse av tastantløsninger, oppsett av en mikrofluidisk modul, prøvemontering, anskaffelse av funksjonelle bildedata og dataanalyse. Noen tips og teknikker for å løse de praktiske problemene som kan oppstå når du bruker μTongue, presenteres også.
Introduction
Det intravitale fluorescensmikroskopet brukes mye til å studere den romlige dynamikken på levende vev. Forskere utvikler raskt genetisk kodede sensorer som gir spesifikke og sensitive transformasjoner av de biologiske prosessene til fluorescenssignaler - som lett kan registreres ved hjelp av fluorescensmikroskoper som er allment tilgjengelige1,2. Selv om de fleste indre organer i gnagere har blitt undersøkt ved hjelp av mikroskopet, har den vellykkede applikasjonen til tungen ennå ikke vært vellykket3.
Tidligere studier på kalsiumavbildning av smaksceller ble utført ex vivo ved tynnseksjon av et tungevev for å oppnå circumvallate smaksløker4,5,6 eller ved å skrelle av smaksepitelet for å oppnå soppform smaksløk7,8. Utarbeidelsen av disse prøvene var uunngåelig invasiv, og dermed ble de naturlige mikromiljøene som nerver innervasjon, permeabilitetsbarrierer og blodsirkulasjon i stor grad forstyrret. Det første intravitale tungeavbildningsvinduet ble rapportert i 2015 av Choi et al., men pålitelig funksjonelt opptak var ikke oppnåelig på grunn av bevegelsen og optiske gjenstander forårsaket av fluidiske tastant stimuli9.
Nylig ble mikrofluidikk-på-en-tunge (μTongue) introdusert10. Denne enheten integrerer et mikrofluidisk system med et bildevindu på musetungen. Ved å oppnå en kvasi-steady-state strøm av tastant stimuli gjennom bildeperioden, kan artefakter fra fluidisk bevegelse minimeres (Figur 1). Inngangsporten mates av en rekke flerkanals trykkregulatorer, mens utgangsporten er koblet til en sprøytepumpe, som opprettholder 0,3 ml/ min. I tillegg ble optiske artefakter forårsaket av forskjellen i brytningsindekser av tastantløsninger minimert ved at rasjonmetrisk analyse introduserte en kalsiumfølsom indikator (tdTomato) samt kalsiumindikatoren (GCaMP6)11. Denne designen ga mikroskopisk stabilitet av smaksceller in vivo selv med brå veksling mellom fluidiske kanaler. Følgelig implementerer μTongue en pålitelig funksjonell screening av flere smaksstoffer til musens smaksløker in vivo.
I denne protokollen forklares de eksperimentelle prosedyrene i detalj for kalsiumavbildning av mussvampform smaksløkene in vivo ved hjelp av μTongue. For det første er utarbeidelsen av kunstig spytt og tastantløsninger beskrevet. For det andre innføres oppsettet av mikrofluidisk system for å oppnå kvasi-steady-state-strømmen. For det tredje avgrenses prosedyrene som brukes til å montere musetungen på μTongue for å tillate bildeanskaffelse. Til slutt angis hvert trinn for bildeanalyse, inkludert korrigering av laterale bevegelsesartefakter og rasjonmetri. Denne protokollen kan enkelt tilpasses ethvert forskningslaboratorium med et museanlegg og et to-foton mikroskop eller tilsvarende utstyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle kirurgiske prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Sungkyunkwan University og Seoul National University.
1. Tilberedning av løsninger: kunstig spytt og smakstoffer
- Forbered kunstig spytt ved å oppløse 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3, 3 mM KHCO3,0,25 mM CaCl2,0,25 mM MgCl2,0,12 mM K2HPO4, 0,12 mM KH2PO4og 1,8 mM HCl i destillert vann (>1 L), og juster pH-en til løsningen til 7 (se Materialtabell)12.
- Forbered tastanter, som sur: 10 mM sitronsyre; salt: 400 mM NaCl, eventuelt med 50 μM amilorid; søt: 40 mM acesulfame K; bitter: en blanding av 5 mM kinin, 5 mM denatonium og 20 μM cycloheximid, ved å oppløse smakskjemikaliet i kunstig spytt tilberedt i trinn 1.1.
2. Forberedelse av det mikrofluidiske systemet
MERK: Tastants ble levert til musetungen ved hjelp av et trykksatt multikanals fluidisk leveringssystem (se figur 1 og Materialfortegnelse).
- Fyll reservoarene i det trykksatte strømningsperfusjonssystemet med kunstig spytt og smakstoffer.
- Koble trykkluftledningen til regulatorinngangen og still inn lufttrykket mellom 30 og 50 psi i det fluidiske leveringssystemet.
- Sett regulatorens utgangstrykk på 0,4 psi og kontroller om væske kommer ut av røret under dette trykket.
- Koble manifolden fra reservoarene til inngangsporten til μTongue.
- Koble utgangsporten til μTongue til en sprøytepumpe og trekk ut væske med ~ 300 μL∙min-1 for å etablere steady-state-tilstanden. Vær oppmerksom på det konstante volumet av en hengende dråpe under μTongue. Juster verdien for innstillingsparameteren avhengig av prøvehøyden.
- Koble fra trykkluftledningen og stopp sprøytepumpen til protokolltrinn 3 er fullført.
3. Klargjøring av mus for in vivo-avbildning (figur 2).
MERK: Alle dyrepreparater ble utført på dagtid under aseptiske forhold på en laboratoriearbeidsbenk.
- Musebedøvelse
- Forbered en 7 uker gammel eller eldre mus av begge kjønn. Bruk en genmodifisert muselinje som uttrykker kalsiumsenkende fluorescensproteiner i smakscellene.
- Musen er begrenset for anestesi. En blanding av 100 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazin injiseres intraperitonealt i musen13.
- TRITC-dextran (500 kDa) i 2,5% W/V fosfatbuffer saltvanns sallin administreres intravenøst inn i musen gjennom en retro-orbital rute for å observere blodsirkulasjonen under en bildeøkt.
- Fest en hodefikser på museskallen for å minimere bevegelsesartefakter.
- Musehodet sprøytes med 70% ETOH mens musen er plassert i en liggende stilling. Løft hodehuden lett med tang og klipp av ca. 7 mm2 med saks.
- Rengjør håret rundt hodebunnen, fjern periosteum under huden, påfør et øyeblikkelig lim på skallen og fest en tilpasset hodefikser.
- Etter at det umiddelbare limet er herdet, påfør tannlim rundt hodefikseren og belys med et blått lys for å størkne tannlim.
- Plasser musetungen på den nederste enheten av μTongue.
- Fest underleppen av musen til den nederste enheten av μTongue med et øyeblikkelig lim.
- Plasser musen på brettet (musforberedelsesbrett i figur 1B) og sett den nederste enheten av μTongue til stolpene (μTongue hold post i figur 1B). Pass på at hullene på kanten av den nederste enheten er justert etter stiften.
- Stram festeren for musehodet til hodefikserholderen på brettet. Juster deretter avstanden mellom musehodet og enheten. Roter musehodet jevnt ca. 45° ved hjelp av hodefikserholderen. Denne prosessen forhindrer fysisk kontakt av musens nese med mikroskop mål.
- Tegn musetungen forsiktig med plast pinsett og fest den ventrale siden av tungen til oversiden av den nederste enheten i μTongue. Tørk deretter overflaten av musetungen med en våt bomullspinne.
- Bløtlegg et stykke papir i kunstig spytt og legg det på den eksponerte overflaten av musetungen for å opprettholde en våt tilstand.
- Plasser de buede skivene på stolpene som holder begge ender av den nederste delen av μTongue.
- Plasser musens forberedelse på mikroskopstadiet. Plasser den eksponerte musetungen under det omtrentlige midtpunktet i mikroskopets objektivområde. Pass på at du ikke avviker fra det dynamiske området på scenen. Stram deretter musebrettet på scenen med skruer.
- Plasser varmeputen under musekroppen og hold temperaturen ved 36,5 °C-37,5 °C. Overvåk musens kroppstemperatur med en temperatursensor og kontroller temperaturen på varmeputen ved hjelp av et tilbakemeldingssignal fra temperatursensoren.
- Vri et tynt stykke papir og plasser det ved musens munn for å forhindre at væske kommer inn i musens luftrør.
- Fjern det våte vevet fra musetungen og plasser den forberedte μTongue på musetungen. Sett en mikrofluidisk kanal på tungen og juster posisjonen for å observere overflaten av tungen gjennom bildevinduet.
- Fest μTongue ved å skru forsiktig på begge ender med minimalt kompressivt trykk.
4. Imaging oppkjøp
- Slå på 920 nm to-foton laser og mikroskopet før bruk.
- Monter målet om vanninnlevelse (16x, NA 0,80 eller 25x, NA 1.1) på mikroskopet. Slipp det destillerte vannet på bildevinduet i μTongue og senk målet.
- I kameramodus slår du på lyset med kvikksølvlampe og lyser opp overflaten på tungen.
- Ved å justere Z-aksen, søk autofluorescent signalet fra filiform papillae for å finne omtrentlig fokalplan. Deretter finner du en smaksløk ved hjelp av X- og Y-justeringsknappen.
- Bytt til multifotonmodus. Angi betingelsene for bildeanskaffelse på følgende måte: eksitasjonsbølgelengde: 920 nm; utslipp filter sett: 447/60 nm, 525/50 nm, og 607/70 nm; toveis rasterskanningsmodus, bildestørrelse: 512 x 512.
- Juster X- og Y-posisjonene for å plassere smaksløken midt i bildevinduet.
- Søk blodkarene rundt smaksløken i omtrent to tredjedels høyde på smaksløken. Visualiser blodsirkulasjonen ved TRITC-dextran (500 kDa) injeksjon fra protokoll trinn 3.2. Hvis blodstrømmen tetter seg, løsne festeskruene litt for å tillate blodstrøm.
- Juster Z-aksen og finn Z-planet med smaksløk som inneholder et tilstrekkelig antall smaksceller.
- Fortsett kalsiumavbildning med 2-6 Hz i 80 s. Gi en smaksløsning på 20 s ved å slå på reservoaret i det fluidiske systemet etter at avbildningen har startet. Etter 20 s smakstimulering, bytt reservoaret tilbake til kunstig spytt.
- Når sekvensiell avbildning er fullført, venter du i ca. 3-4 minutter på forhånd til neste bildebehandlingsøkt. Hold den kunstige spytt flyter til musen tungen for å vaske bort tastant remanent fra forrige bildebehandling økt. Avhengig av utformingen av eksperimentet, gjenta økten etter behov.
- Når in vivo kalsiumavbildning er fullført, euthanize musen i henhold til IACUC prosedyren. Musen under anestesi ofres i CO2-kammeret.
MERK: Kontroller dybden på anestesi ved hjelp av en tåklemmet refleks. Under en bildeøkt bør kunstig spytt fra reservoarene gis konsekvent. Hvis det vises bobler i bildevinduet i μTongue, fjerner du boblene ved å skyve dem gjennom inngangen eller utgangen av μTongue ved hjelp av sterkt væsketrykk.
5. Bildeanalyse (figur 3)
- Konvertering av bilder
- Åpne raw-bildefilene ved hjelp av Fiji14 eller en lignende bildeanalyseprogramvare.
- Konverter bildefilen til en RGB-stakkfil for å bruke NPL Bud Analyzer-koden.
- Bilde > farge > delte kanaler
- Bilde > Farge > Slå sammen kanaler, og velg bildet fra trinn 5.2.1.
- Bilde > farge > stakk til RGB
- Registrering av bilder
MERK: Bruk den egendefinerte koden for dataanalyse. Se https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer.- Kjør koden med navnet Taste_GUI.m; et GUI-vindu kalt NPL Bud Analyzer dukker opp. Klikk på Ny analyse-knappen øverst til høyre, og last deretter inn det konverterte bildet fra trinn 5.1. Angi bildefrekvensen over det lastede bildet.
- Tegn interesseområdet (ROI) over det lastede bildet for registrering. Dobbeltklikk på den valgte avkastningen, og en automatisk beregnet registrering starter.
- Få de relative fluorescensintensitetsendringene (ΔF/F)
- Gå tilbake til NPL Bud Analyzer-vinduet for å vise det registrerte bildet automatisk fra trinn 5.2. Hvis brukeren allerede har en reg-fil, klikker du på Last inn data-knappen og velger den _reg.tif filen.
- Klikk på CIRCLE- eller POLYGON-knappen og plasser ROI av smakscellen over smaksløkbildet.
- Dette presenterer den rå fluorescensintensiteten og kalsiumsporet (ΔF/F) til den valgte smakscellen automatisk under smaksløkbildet.
- Klikk på Lagre spor for å presentere kalsiumsporet (ΔF/F) på høyre side av GUI, mens AVKASTNING vises over smaksløkbildet. Gjenta trinn 5.3.2-5.3.4 til avkastningsvalget er fullført.
MERK: Klikk på Slett spor-knappen hvis avkastningen er feilvalgt for å eliminere den sist valgte avkastningen og kalsiumsporet. - Når avkastningen er fullført, skriver du filnavnet nederst til høyre, og klikker på Fullfør-knappen for å eksportere ΔF/F kalsiumspor som et .xls-format, og tase bud-bildet med ROIer i et .bmp-format.
- Analyse av kalsiumsporet
- Analyser kalsiumsporet oppnådd fra trinn 5.3. Tenk på at smaksceller har reagert på tastant når fluorescensintensiteten stiger mer enn to standardavvik fra grunnlinjen etter at tastanten er levert4, og p-verdiene er mindre enn 0,01, ved hjelp av parvise eller ikke-sammenkoblede t-tester10.
- Tenk på smakscellen som en respondercelle, hvis den reagerer på en bestemt tastant mer enn to ganger av tre forsøk (~ 60%)15.
- Oppnå de representative kalsiumsporene ved å beregne gjennomsnittlige individuelle kalsiumspor kjøpt fra trinn 5.4.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pirt-GCaMP6f-tdTomato-musen ble brukt til å få et smaksløkbilde. Overflaten på musetungen var dekket med autofluorescent filiform papillae. Smaksløkene spres sparsomt over tungens overflate (Figur 4A). Bildene av smaksløken og dens struktur ble anskaffet ved hjelp av tre forskjellige filterdetektorer. Ved hjelp av filtersettet 607/70 nm ble tdTomato-signalet fra smakscellene oppnådd for forholdsmetrisk analyse (figur 4B). Ved hjelp av 525/50 nm filtersettet ble GCaMP-signalet fra smakscellene og blodkarene som omgir smaksløken anskaffet (Figur 4B). Ved hjelp av 447/60 nm filtersettet ble kollagen bindevevet, som strukturelt støtter smaksløken, anskaffet (Figur 4B).
Etter å ha anskaffet bildene av smaksløken og relative strukturer, ble in vivo kalsiumavbildning utført ved hjelp av protokollen. Pirt-GCaMP6f-tdTomato-musen ble brukt til å screene på smaksceller (Figur 5A)16. Smaksceller reagerte gjentatte ganger på sine respektive smakstimuli (Figur 5B). Smaksceller ble ansett å ha reagert på tastanten da de oppfylte betingelsene presentert i protokoll 5.1.4. I denne studien reagerte celle 2 på både søte og umami-smakstoffer. Resultatet er i samsvar med tidligere forskning som observerer cellulær aktivitet ved hjelp av elektrofysiologi17. Celle 3 reagerte på både 400 mM NaCl og 400 mM NaCl under amiloride. Det innebærer at celle 3 har brukt en ENaC uavhengig vei for responsen på salt smak. Smaksløken i dette eksperimentet inkluderte ikke en celle som reagerte på sur smak. Screeningen av smaksceller ble utført under stabile bildeforhold, og hver smakscelle viste en repeterbar respons på en distinkt type smak.
Figur 1: μTongue, en mikrofluidikkbasert funksjonell bildeplattform. (A) Trykksatt fluidisk leveringssystem. (i) Trykkregulatoren til det fluidiske systemet er koblet til den eksterne luftkilden. Trykket på luftkilden justeres mellom 30-50 psi før du går inn i trykkregulatoren. (ii) Lufttrykket fra regulatoren er ca. 0,4 psi. (iii) Reservoarer som inneholder kunstig spytt og ulike smaksløsninger er koblet til utgangen av lufttrykkregulatoren. (iv) Hvert reservoar konvergerer til en manifold som er koblet til inngangsporten til μTongue. (v) En sprøytepumpe er koblet til utgangen av μTongue og styrer strømmen. (B) μTongue, en mikrofluidikkbasert funksjonell bildeplattform. Navnet på hver del er angitt i figuren. (i) Mus forberedelsesbrett. (ii) Oppsettskort for fluidisk system. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Sekvensiell beskrivelse av museforberedelse. Viktige trinn i museforberedelsene vises. (A) Retro-orbital injeksjon av TRITC-dextran. (B) Prosessen med å feste en hodefikser til museskallen vises. Hodehuden og periosteum er ryddet. Lim og tannlim brukes til vedlegg. (C) Hodefikseren på museskallen er skrudd på musens tilberedningsbrett. (D) Prosedyre for montering av en tunge på den nederste enheten i μTongue. Et øyeblikkelig lim brukes til tungefiksering. Tungen rengjøres med en våt bomullspinne og dekkes med vått papirvev for å forhindre tørrhet. (E) Buede skiver påføres begge ender av den nederste enheten i μTongue. (F) Et stykke vridd papirvev er plassert i musens munnhule. (G) Musforberedelsesbrettet er montert på mikroskopstadiet og skrudd tett for å sikre stabile bildeforhold. (H) μTongue er plassert på tungen. Et objektiv justeres over bildevinduet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Bildeanalyse. (A) Et RGB-bilde konverteres fra hvert enkeltfargebilde. Skalalinje, 10 μm. (B) Bilderegistrering ved hjelp av en utført tilpasset kode. (C) GUI for den egendefinerte koden. (i) Angi plassering for bildefrekvensen. Standard bildefrekvens er 0,16 s/ramme. (ii) Knapper for å tegne ROIer. (iii) Området der det lastede bildet vises. (iv) Kalsiumsignalet til den valgte avkastningen vises som et grønt spor, mens det kalsiumfølsomme signalet til den valgte avkastningen vises som et rødt spor. (v) Ratiometric analyse og ΔF/F beregnes automatisk. ΔF/F-grafen presenteres i magenta. (vi) Knapper for bildeinnlasting. Ny analyse er for innlasting av et RGB-konvertert bilde. Last inn data er for innlasting av et bilde som allerede har gjennomgått registrering. (vii) Lagre spor-knappen er å holde ΔF/F-grafen og avkastningen valgt på viii. Slett sporing-knappen er å fjerne ΔF/F-grafen fra viii. (viii) Lagrede kalsiumspor vises. (ix) Område for å fylle ut filnavnet. Fullfør-knappen er å trekke ut data og lagre dem i samme katalog med koden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Overflaten på musetungen og en smaksløk i soppform papillen. (A) Overflaten på musetungen er fanget i et stort felt. En smaksløk keratinisert filiform papille, og kollagenstrukturen er vist. Hver struktur er indikert ved hjelp av forskjellige farger: henholdsvis magenta, gul og grønn. Skalastang, 100 μm. (B) En smaksløk fra (A) forstørres og fanges opp ved hjelp av tre forskjellige utslippsfilterdetektorer. Den filiform papille, i gult, er fanget ved hjelp av en 525/50 nm detektor. Denne strukturen observeres fra selve overflaten av tungen opp til ~ 25 μm i dybden. GCaMP-signaler i grønne og tdTomato-signaler i rødt representerer smakscellene. Disse signalene oppdages av henholdsvis 525/50 og 607/70 nm detektorer. Rhodamine dextran som representerer blodsirkulasjonen er fanget på både 525/50 og 607/70 nm detektorer. Kollagenstrukturen vist i cyanblå er anskaffet av 447/60 nm detektorer. Det siste bildet viser alle tidligere bilder slått sammen. Skalalinje, 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Smak screening av en Pirt-GCaMP6f-tdTomato mus in vivo. (A) En representativ smaksløk av Pirt-GCaMP6f-tdTomato musen. Bildet vises som en intensitetsbasert pseudofarge. Stiplede linjer avgrenser hver smakscelle. Lysstyrken til hver smakscelle avhenger av uttrykket av det fluorescerende proteinet og dybden av smakscelleplasseringen. Skala bar, 10 μm. (B) Kalsiumsporet til hver smakscelle for de fem grunnleggende smakstimuliene. Hver gjentatte prøveperiode vises i grått på baksiden, og den gjennomsnittlige sporingen presenteres over hver prøve. Fargede spor defineres som responsive, mens svarte spor defineres som ikke-responsive. Hver farge representerer en annen smak. Salt (L) representerer lav salt, med en blanding av 400 mM NaCl og 50 μM amilorid som brukes til smakstimulering. Salt (H) representerer høy salt, med 400 mM NaCl som brukes til stimulering. Smakstimulering vises som en grå boks på baksiden av hvert kalsiumspor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrevet her er en detaljert protokoll for å bruke μTongue til undersøkelse av funksjonelle aktiviteter av smaksceller in vivo. I denne protokollen utføres funksjonell avbildning på smakscellene ved hjelp av genetisk kodede kalsiumindikatorer. I tillegg til bruk av transgene mus kan elektroforetisk lasting av kalsiumfargestoffer (eller spenningssensorfarger) på smakscellene være et alternativ.
Alle smaksløsningene mindre enn 1.336 av brytningsindeksen ble brukt i dette eksperimentet. Selv om μTongue gir en stabil fluidisk tilførsel og den rasjonsmetriske analysen ameliorates bildeartefakter, vil det være utfordrende for forskerne å bruke en høyere konsentrasjon av tastant (f.eks. >100 mM sukrose med brytningsindeks i 1.338). Den store forskjellen i brytningsindeks mellom kunstig spytt og smaksløsning forskyver bildefokalplanet mer enn kompensasjonsområdet etter bildeprosessen. Empirisk oppnås et visst utvalg av brytningsindeks for smaksløsning (mindre enn 1.336) som tillater stabil cellulær avbildning i sanntid.
For forskere med erfaring innen fluorescensavbildning og dyrehåndtering, kan denne protokollen læres lett over gjentatt praksis. Den inneholder imidlertid kritiske trinn, noe som ofte hindrer vellykket datainnsamling. For det første, når den er eksternisert fra den orale høfligheten, bør tungen holdes fuktig med kunstig spytt for å bevare det naturlige mukosale mikromiljøet. For det andre bør blodsirkulasjonen rundt smaksløken være intakt, for å opprettholde en fysiolog tilførsel av oksygen, næringsstoffer og blodbårne faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer konkurrerende økonomiske interesser: J. Han og M. Choi er oppfinnere av den patenterte μTongue-teknologien som er beskrevet i denne artikkelen, og μTongue-systemet er kommersielt tilgjengelig via SciTech Korea.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Institute of Basic Science (IBS-R015-D1), National Research Foundation of Korea (NRF) stipend finansiert av Korea-regjeringen (MSIT) (Nei. 2019M3A9E2061789), og av National Research Foundation of Korea (NRF) stipend finansiert av Korea regjeringen (MSIT) (No. 2019M3E5D2A01058329). Vi er takknemlige til Eunsoo Kim og Eugene Lee for deres tekniske assistanse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acesulfame K | Sigma Aldrich | 04054-25G | Artificial saliva / tastant |
| calcium chloride solution | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Artificial saliva / tastant |
| citric acid | Sigma Aldrich | C0759-100G | Artificial saliva / tastant |
| cycloheximide | Sigma Aldrich | 01810-5G | Artificial saliva / tastant |
| denatonium | Sigma Aldrich | D5765-5G | Artificial saliva / tastant |
| Dental glue | Denkist | P0000CJT-A2 | Animal preparation |
| Image J | NIH | ImageJ | Data analysis |
| IMP | Sigma Aldrich | 57510-5G | Artificial saliva / tastant |
| Instant adhesive | Loctite | Loctite 4161, Henkel | Animal preparation |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P3786-100G | Artificial saliva / tastant |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | Artificial saliva / tastant |
| Ketamine | Yuhan | Ketamine 50 | Animal preparation |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P0662-25G | Artificial saliva / tastant |
| KHCO3 | Sigma Aldrich | 237205-500G | Artificial saliva / tastant |
| MATLAB | Mathwork | MATLAB | Data analysis |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100G | Artificial saliva / tastant |
| MPG | Sigma Aldrich | 49601-100G | Artificial saliva / tastant |
| Mutiphoton microscope | Thorlab | Bergamo II | Microscope |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014-500G | Artificial saliva / tastant |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | 792519-500G | Artificial saliva / tastant |
| Objective | Nikon | N16XLWD-PF | Microscope |
| Octaflow | ALA Scientific Instruments | OCTAFLOW II | Fluidic control |
| PC | LG | Lg15N54 | Fluidic control |
| PH meter | Thermoscientific | ORION STAR AZ11 | Artificial saliva / tastant |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | 806562 | Artificial saliva / tastant |
| quinine | Sigma Aldrich | Q1125-5G | Artificial saliva / tastant |
| Syringe pump | Havard Apparatus | PHD ULTRA 4400 | Fluidic control |
| TRITC-dextran | Sigma Aldrich | 52194-1G | Animal preparation |
| Ultrafast fiber laser | Toptica | FFultra920 01042 | Microscope |
| Xylazine | Bayer Korea | Rompun | Animal preparation |
References
- Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).
- Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment. Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).
- Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells. Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).
- Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).
- Dando, R., Roper, S. D. Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels. The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).
- Chandrashekar, J., et al. The cells and peripheral representation of sodium taste in mice. Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).
- Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
- Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation. Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).
- Han, J., Choi, M. Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo. bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).
- Thestrup, T., et al. Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes. Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).
- Danilova, V. Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice. BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tan, H. E., et al. The gut-brain axis mediates sugar preference. Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).
- Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds. The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).
- Kusuhara, Y., et al. Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1. Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).
