Summary
Artikeln introducerar μTongue (mikrofluidik-på-en-tunga) enheten för funktionell smak cell imaging in vivo genom att integrera mikrofluidik i ett intravitalt bildfönster på tungan.
Abstract
Intravital fluorescensmikroskopi är ett verktyg som används i stor utsträckning för att studera multicellulär dynamik hos ett levande djur. Det har dock inte framgångsrikt använts i smaksensoriska organet. Genom att integrera mikrofluidik i det intravitala bildframställningsfönstret för tunga ger μTongue tillförlitliga funktionella bilder av smakceller in vivo under kontrollerad exponering för flera smakämnen. I detta dokument presenteras ett detaljerat steg-för-steg-förfarande för att använda μTongue-systemet. Det finns fem underavsnitt: förberedelse av tastantlösningar, inrättande av en mikrofluidisk modul, provmontering, förvärv av funktionella bilddata och dataanalys. Några tips och tekniker för att lösa de praktiska problem som kan uppstå när du använder μTongue presenteras också.
Introduction
Intravital fluorescensmikroskop används ofta för att studera spatiotemporal dynamiken på levande vävnader. Forskare utvecklar snabbt genetiskt kodade sensorer som ger specifika och känsliga omvandlingar av de biologiska processerna till fluorescenssignaler - som lätt kan registreras med fluorescensmikroskop som är allmänttillgängliga 1,2. Även om de flesta inre organ hos gnagare har undersökts med hjälp av mikroskopet, har dess framgångsrika tillämpning på tungan ännu inte varit framgångsrik3.
Tidigare studier på kalciumavbildning av smakceller genomfördes ex vivo genom att tunndela en tungvävnad för att erhålla circumvallatesmaklökar 4,5,6 eller genom att skala av smakepitelet för att erhålla svampformsmaklökar 7,8. Beredningen av dessa prover var oundvikligen invasiv, så de naturliga mikromiljöerna såsom nerver inrevation, permeabilitet hinder och blodcirkulation, var till stor del störd. Det första intravitala tunga bildframställning fönstret rapporterades 2015 av Choi et al., men tillförlitliga funktionella inspelning var inte uppnåelig på grund av rörelsen och optiska artefakter orsakas av fluidic tastant stimuli9.
Nyligen introducerades mikrofluidik-på-en-tunga (μTongue)10. Den här enheten integrerar ett mikrofluidiskt system med ett bildfönster på mustungan. Genom att uppnå ett kvasi-steady-state flöde av tastant stimuli under hela bildperioden, artefakter från fluidisk rörelse kunde minimeras (Figur 1). Ingångsporten matas av en serie flerkanalstryckregulatorer, medan utgångsporten är ansluten till en sprutpump, som håller 0,3 ml/min. Dessutom minimerades optiska artefakter som orsakas av skillnaden i brytningsindex för tastantlösningar genom ratiometric analys införa en kalcium-okänslig indikator (tdTomato) samt kalciumindikatorn (GCaMP6)11. Denna design gav mikroskopisk stabilitet hos smakceller in vivo även med abrupt växling mellan flytande kanaler. Följaktligen implementerar μTongue en tillförlitlig funktionell screening av flera smakämnen till musens smaklökar in vivo.
I detta protokoll förklaras de experimentella förfarandena i detalj för kalciumavbildning av mussvampforma smaklökar in vivo med μTongue. För det första beskrivs beredningen av konstgjorda saliv- och tastantlösningar. För det andra införs inrättandet av det mikrofluidiska systemet för att uppnå flödet mellan kvasi-steady-state. För det tredje avgränsas de procedurer som används för att montera mustungan på μTongue för att möjliggöra bildförvärv. Slutligen anges varje steg för bildanalys, inklusive korrigering av laterala rörelseartefakter och ratiometry. Detta protokoll kan enkelt anpassas till alla forskningslaboratorier med en musanläggning och ett mikroskop med två fotoner eller motsvarande utrustning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla kirurgiska ingrepp godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Sungkyunkwan University och Seoul National University.
1. Beredning av lösningar: konstgjord saliv och smakämnen
- Förbered artificiellt saliv genom att lösa upp 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3,3 mM KHCO3,0,25 mM CaCl2,0,25 mM MgCl2, 0,12 mM K2HPO24, 0,12 mM KH2PO4och 1,8 mM HCl i destillerat vatten (>1 L) och justera lösningens pH-kort till 7 (se Materialförteckning)12.
- Förbered smakämnen, såsom sur: 10 mM citronsyra; salt: 400 mM NaCl, valfritt med 50 μM amilorid; söt: 40 mM acesulfam K; bitter: en blandning av 5 mM kinin, 5 mM denatonium och 20 μM cykloheximid, genom att lösa upp provsmakningskemikalien i det konstgjorda saliv som framställs i steg 1.1.
2. Förberedelse av det mikrofluidiska systemet
OBS: Tastanter levererades till mustungan med hjälp av ett trycksatt fluidtleveranssystem med flera kanaler (se figur 1 och materialförteckning ).
- Fyll reservoarerna i det trycksatta flödesperfusionssystemet med det konstgjorda saliven och smakämnena.
- Anslut tryckluftsledningen till regulatorns ingång och ställ in lufttrycket mellan 30 och 50 psi i det flytande leveranssystemet.
- Ställ in regulatorns utgångstryck på 0,4 psi och kontrollera om vätska kommer ut ur röret under detta tryck.
- Anslut grenröret från reservoarerna till μTongues ingångsport.
- Anslut μTongues utgångsport till en sprutpump och dra ut vätskan med ~300 μL▼min-1 för att fastställa steady-state-tillståndet. Observera den konstanta volymen av en hängande droppe under μTongue. Justera värdet för inställningsparametern beroende på provhöjden.
- Koppla bort tryckluftsledningen och stoppa sprutpumpen tills protokollsteg 3 är klart.
3. Muspreparat för in vivo-avbildning (figur 2).
OBS: Alla djurpreparat utfördes under dagtid under aseptiska förhållanden på en laboratoriebänk.
- Musbedövning
- Förbered en 7 veckor gammal eller äldre mus av något av könen. Använd en genetiskt modifierad muslinje som uttrycker kalciumavkännande fluorescensproteiner i smakcellerna.
- Musen är fasthållen för anestesi. En blandning av 100 mg/kg ketamin och 10 mg/kg xyzin injiceras intraperitoneally imusen 13.
- TRITC-dextran (500 kDa) i 2,5% W/V fosfatbuffert saltlösning administreras intravenöst i musen genom en retro-orbital väg för att observera blodcirkulationen under en bildbehandling session.
- Fäst en huvudfixare på musskalle för att minimera rörelseartefakter.
- Mushuvudet sprutas med 70% ETOH medan musen placeras i ett supinläge. Lyft huvudet lätt med tång och klipp av ca 7 mm2 med sax.
- Rengör håret runt hårbotten, ta bort periosteum under huden, applicera ett omedelbart lim på skallen och fäst en anpassad huvudfixare.
- När det omedelbara limet härdas, applicera dentalt lim runt huvudfixaren och tänd med ett blått ljus för att stelna tandlim.
- Placera mustungan på den nedre enheten på μTongue.
- Fäst musens underläpp på den nedre enheten av μTongue med ett omedelbart lim.
- Placera musen på brädan (musberedningsbrädan i figur 1B)och placera den nedre enheten på μTongue på stolparna (μTongue-hållstolpen i figur 1B). Se till att hålen vid kanten av den nedre enheten är i linje med stolpen.
- Dra åt mushuvudfixaren till huvudfixarhållaren på brädan. Justera sedan avståndet mellan mushuvudet och enheten. Vrid mushuvudet smidigt ca 45° med huvudfixarhållaren. Denna process förhindrar fysisk kontakt med musnäsan med mikroskopmål.
- Dra mustungan försiktigt med hjälp av plast pincett och fäst den ventrala sidan av tungan på övre sidan av den nedre enheten på μTongue. Torka sedan mustungans yta med en våt bomullspinne.
- Blötlägg ett papper i det konstgjorda salivet och placera det på mustungans exponerade yta för att upprätthålla ett vått tillstånd.
- Placera de böjda brickorna på stolparna som håller båda ändarna av den nedre delen av μTongue.
- Placera musberedningen på mikroskopstadiet. Placera den exponerade mustungan under mikroskopets ungefärliga mitt. Var noga med att inte avvika från scenens dynamiska omfång. Dra sedan åt musbrädan på scenen med skruvar.
- Placera värmedynan under muskroppen och håll temperaturen vid 36,5 °C-37,5 °C. Övervaka muskroppstemperaturen med en temperaturgivare och styr temperaturen på värmedynan med hjälp av en återkopplingssignal från temperatursensorn.
- Vrid ett tunt papper och placera det vid musens mun för att förhindra att vätska kommer in i mustrakean.
- Ta bort den våta vävnaden från mustungan och placera den beredda μTongue på mustungan. Sätt en mikrofluidisk kanal på tungan och justera dess position för att observera tungans yta genom bildfönstret.
- Fäst μTongue genom att försiktigt skruva i båda ändarna med minimalt tryck.
4. Förvärv av bildbehandling
- Slå på 920 nm tvåfotonlaser och mikroskopet före användning.
- Montera vattensänkningsmålet (16x, NA 0,80 eller 25x, NA 1.1) på mikroskopet. Släpp det destillerade vattnet på avbildningsfönstret på μTongue och sänk ner målet.
- I kameraläge, tänd ljuset med kvicksilverlampa och lys upp tungans yta.
- Genom att justera Z-axeln söker du i den autofluorescerande signalen från filiformpapillaen för att hitta det ungefärliga fokalplanet. Leta sedan reda på en smaklök med hjälp av justeringsknappen X och Y.
- Växla till multifotonläget. Ställ in villkoren för bildförvärv enligt följande: excitation våglängd: 920 nm; Utsläppsfilter: 447/60 nm, 525/50 nm och 607/70 nm. dubbelriktat rastersökningsläge, ramstorlek: 512 x 512.
- Justera X- och Y-positionerna för att placera smaklöken i mitten av bildfönstret.
- Sök blodkärlen som omger smaklöken på ungefär två tredjedelars höjd av smaklöken. Visualisera blodcirkulationen genom TRITC-dextran (500 kDa) injektion från protokoll steg 3.2. Om blodflödet täpper till, lossa fästskruvarna något för att tillåta blodflöde.
- Justera Z-axeln och hitta Z-planet av smakknopp som innehåller ett tillräckligt antal smakceller.
- Fortsätt kalciumavbildning med 2-6 Hz i 80 s. Ge en smaklösning på 20 s genom att slå på behållaren i det flytande systemet efter avbildningsstart. Efter 20 s smakstimulering, byt reservoaren tillbaka till konstgjord saliv.
- När sekventiell avbildning är klar, vänta i ca 3-4 min i förväg till nästa bildbehandlingssession. Håll det konstgjorda salivflödet till mustungan för att tvätta bort den tastanta remanenten från föregående bildbehandlingssession. Upprepa sessionen efter behov beroende på experimentets utformning.
- När kalciumavbildningen in vivo är klar avlivar du musen enligt IACUC-proceduren. Musen under anestesi offras i CO2-kammaren.
OBS: Kontrollera anestesins djup med en tå-nypa reflex. Under en avbildningssession bör artificiellt saliv från reservoarerna tillhandahållas konsekvent. Om bubblor visas vid avbildningsfönstret på μTongue, ta bort bubblorna genom att trycka dem genom ingången eller utgången av μTongue med starkt vätsketryck.
5. Bildanalys (Figur 3)
- Bildkonvertering
- Öppna de råa bildfilerna med Fiji14 eller en liknande bildanalysprogramvara.
- Konvertera bildfilen till en RGB-stackfil för att använda NPL Bud Analyzer-koden.
- Bild > färg > delade kanaler
- Bild > Färg > Sammanfoga kanaler och välj bilden från steg 5.2.1.
- Bild > färg > stack till RGB
- Bildregistrering
OBS: Använd den specialskrivna koden för dataanalys. Se https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer.- Kör koden med namnet Taste_GUI.m; ett GUI-fönster med namnet NPL Bud Analyzer dyker upp. Klicka på knappen Ny analys i det övre högra hörnet och läs sedan in den konverterade bilden från steg 5.1. Ställ in bildhastigheten ovanför den inlästa bilden.
- Rita intresseområdet (ROI) över den inlästa bilden för registrering. Dubbelklicka på den valda AVKASTNINGEN så startar en automatiskt beräknad registrering.
- Få de relativa fluorescensintensitetsändringarna (ΔF/F)
- Gå tillbaka till fönstret NPL Bud Analyzer för att visa den registrerade bilden från steg 5.2 automatiskt. Om användaren redan har en reg-fil klickar du på knappen Läs in data och väljer _reg.tif filen.
- Klicka på knappen CIRKEL eller POLYGON och placera SMAKCELLENS ROI över smaklökens bild.
- Detta presenterar den råa fluorescensintensiteten och kalciumspåret (ΔF/F)i den valda smakcellen automatiskt under smakknoppsbilden.
- Klicka på Spara spår för att presentera kalciumspåret (ΔF/F)på höger sida av GUI, medan ROI visas över smakknoppsbilden. Upprepa steg 5.3.2-5.3.4 tills ROI-markeringen är klar.
OBS: Klicka på knappen Ta bort spårning om ROI är felaktigt vald för att eliminera den senast valda ROI- och kalciumspårningen. - När ROI-markeringen är klar skriver du filnamnet längst ner till höger och klickar på knappen Slutför för att exportera kalciumspårningen ΔF/F som ett .xls-format och taseknoppbilden med ROI i ett .bmp-format.
- Analys av kalciumspåret
- Analysera kalciumspåret från steg 5.3. Tänk på att smakceller har reagerat på tastant när fluorescensintensiteten stiger mer än två standardavvikelser av baslinjen efter att tastanten har levererats4, och p-värdena är mindre än 0,01, med hjälp av parade eller oparade t-tester10.
- Betrakta smakcellen som en respondercell, om den svarar på en viss tastant mer än två gånger av tre försök (~ 60%)15.
- Få de representativa kalciumspåren genom att i genomsnitt använda enskilda kalciumspår som förvärvats från steg 5.4.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pirt-GCaMP6f-tdTomato musen användes för att få en smakknopp bild. Ytan på mus tungan var täckt med autofluorescent filiform papillae. Smaklökarna sprids glest över tungans yta (figur 4A). Bilderna av smaklöken och dess struktur förvärvades med hjälp av tre olika filterdetektorer. Med hjälp av filteruppsättningen 607/70 nm erhölls tdTomato-signalen från smakcellerna för ratiometrisk analys (figur 4B). Med hjälp av filteruppsättningen 525/50 nm förvärvades GCaMP-signalen från smakcellerna och blodkärlen som omger smaklöken (figur 4B). Med hjälp av filteruppsättningen 447/60 nm förvärvades kollagenbinväven, som strukturellt stöder smaklöken, (figur 4B).
Efter att ha förvärvat bilderna av smakknoppen och relativa strukturer utfördes in vivo kalcium imaging med hjälp av protokollet. Pirt-GCaMP6f-tdTomato-musen användes för att screena på smakceller (Figur 5A)16. Smakceller reagerade upprepade gånger på sina respektive smakstimulanser (Figur 5B). Smakceller ansågs ha reagerat på tastanten när de uppfyllde villkoren i protokoll 5.1.4. I denna studie svarade cell 2 på både söta och umami tastants. Resultatet överensstämmer med tidigare forskning som observerar cellulär aktivitet med hjälp av elektrofysiologi17. Cell 3 svarade på både 400 mM NaCl och 400 mM NaCl under amilorid. Det innebär att cell 3 har använt en ENaC oberoende väg för att svara på salt smak. Smaklöken i detta experiment inkluderade inte en cell som svarade på sura smaker. Screening av smakceller utfördes under stabila bildframställning förhållanden, och varje smak cell visade ett repeterbart svar på en distinkt typ av smak.
Figur 1: μTongue, en mikrofluitisk baseradfunktionell bildplattform. i) Tryckregulatorn i det fluidiska systemet är ansluten till den externa luftkällan. Luftkällans tryck justeras mellan 30-50 psi innan tryckregulatorn går in. ii) Lufttrycket från regulatorn är cirka 0,4 psi. iii) Reservoarer som innehåller konstgjord saliv och olika smaklösningar är anslutna till lufttrycksregulatorns uteffekt. iv) Varje behållare konvergerar till ett grenrör som är anslutet till μTongues ingångsport. v) En sprutpump ansluts till μTongues utgång och styr flödet. (B) μTongue, en mikrofluidikbaserad funktionell bildplattform. Namnet på varje del anges i figuren. i) Musberedningskort. ii) Fluidic system setup board. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Sekventiell beskrivning av musberedning. Viktiga steg i musberedningen visas. A)Retro-orbital injektion av TRITC-dextran. (B) Processen att fästa en huvudfixare på musskalle visas. Huvudhuden och periosteum rensas. Lim och dentalt lim används för fastsättning. (C) Huvudfixaren på musskalle skruvas fast på musens beredningsbräda. D)Förfarande för montering av en tunga på μTongues nedre enhet. Ett omedelbart lim används för tungfixering. Tungan rengörs med en våt bomullspinne och är täckt med våta pappersvävnader för att förhindra torrhet. (E) Böjda brickor appliceras på båda ändarna av μTongues nedre enhet. (F) En bit tvinnad pappersvävnad placeras i musens munhåla. (G) Musberedningsbrädan är monterad på mikroskopsteget och skruvas fast ordentligt för att säkerställa stabila bildförhållanden. (H) μTongue placeras på tungan. En objektivlins justeras över bildfönstret. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3: Bildanalys. (A) En RGB-bild konverteras från varje enfärgsbild. Skalstreck, 10 μm. (B) Bildregistrering med hjälp av en utförd anpassad kod. (C)GUI för den anpassade koden. i) Inmatningsplats för bildhastigheten. Standardbildhastigheten är 0,16 s/ram. ii) Knappar för att rita ROI. iii) Det område där den inlästa bilden visas. iv) Kalciumsignalen för den valda avkastningen på sysselsatt ut visas som ett grönt spår, medan den kalciumokänsliga signalen från den valda avkastningen på sysselsatt ut visas som ett rött spår. v) Ratiometrisk analys och ΔF/F beräknas automatiskt. ΔF/F-diagrammet presenteras i magenta. vi) Knappar för bildinläsning. Ny analys är till för att läsa in en RGB-konverterad bild. Inläsningsdata är till för att läsa in en avbildning som redan har genomgått registrering. (vii) Knappen Spara spår är att behålla ΔF/F-diagrammet och roi valt vid viii. Knappen Ta bort spårning är att ta bort ΔF/F-grafen från viii. viii) Sparade kalciumspår visas. (ix) Område för att fylla i filnamnet. Knappen Slutför är att extrahera data och spara dem i samma katalog för koden. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 4: Mustungans yta och en smaklök i den svampforma papillaen. En smakknopp keratiniserad filiform papillae, och kollagenstrukturen visas. Varje struktur indikeras med olika färger: magenta, gul respektive grön. Skalstång, 100 μm. (B) En smakknopp från (A) förstoras in och fångas in med hjälp av tre olika utsläppsfilterdetektorer. Filiform papillae, i gult, fångas med en 525/50 nm detektor. Denna struktur observeras från själva ytan av tungan upp till ~ 25 μm i djup. GCaMP-signaler i grönt och tdTomato-signaler i rött representerar smakcellerna. Dessa signaler detekteras av 525/50 respektive 607/70 nm detektorer. Rhodamindextran som representerar blodcirkulationen fångas vid både 525/50 och 607/70 nm detektorer. Kollagenstrukturen som visas i cyanblått förvärvas av 447/60 nm detektorer. Den sista bilden visar alla tidigare bilder som slagits samman. Skalbar, 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Smakscreening av en Pirt-GCaMP6f-tdTomato mus in vivo. (A) En representativ smaklök av Pirt-GCaMP6f-tdTomato musen. Bilden visas som en intensitetsbaserad pseudofärg. Streckade linjer avgränsar varje smakcell. Ljusstyrkan hos varje smakcell beror på uttrycket av det fluorescerande proteinet och djupet på smakcellens läge. Skala stången, 10 μm. (B) Kalciumspåret för varje smakcell för de fem grundläggande smakstimulanserna. Varje upprepad studie visas i grått på baksidan och den genomsnittliga spårningen presenteras ovanför varje försök. Färgade spår definieras som responsiva medan svarta spår definieras som icke-responsiva. Varje färg representerar en annan smak. Salt(L) representerar låg salt, med en blandning av 400 mM NaCl och 50 μM amilorid som används för smakstimulering. Salt(H) representerar hög salt, med 400 mM NaCl används för stimulering. Smakstimulering visas som en grå låda på baksidan av varje kalciumspår. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrivs här är ett detaljerat protokoll för att tillämpa μTongue på undersökningen av funktionella aktiviteter av smakceller in vivo. I detta protokoll utförs den funktionella avbildningen på smakcellerna med hjälp av genetiskt kodade kalciumindikatorer. Förutom användning av transgena möss kan den elektroforesiska belastningen av kalciumfärgämnen (eller spänningsavkännande färgämnen) på smakcellerna vara ett alternativt alternativ.
Alla smaklösningar mindre än 1.336 av brytning index användes i detta experiment. Även om μTongue ger en stabil fluidisk leverans och den ratiometriska analysen smälter avbildningsartefakter, kommer det att vara utmanande för forskarna att använda en högre koncentration av tastant (t.ex. >100 mM sackaros med brytningsindex i 1.338). Den stora skillnaden i brytningsindex mellan artificiellt saliv och smaklösning flyttar bildfokusplanet mer än kompensationsområdet genom post-image-processen. Empiriskt erhålls ett visst utbud av brytningsindex för smaklösning (mindre än 1,336) som möjliggör stabil cellulär avbildning i realtid.
För forskare med erfarenhet av fluorescensavbildning och djurhantering kan detta protokoll läras lätt över upprepad praxis. Den innehåller dock kritiska steg, vilket ofta hindrar framgångsrik datainsamling. Först, när den har externaliserats från den muntliga hövligheten, bör tungan hållas fuktig med konstgjord saliv för att bevara den naturliga mucosal microenvironment. För det andra bör blodcirkulationen runt smaklöken vara intakt, för att upprätthålla en fysiologisk tillförsel av syre, näringsämnen och blodburna faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar konkurrerande ekonomiska intressen: J. Han och M. Choi är uppfinnare av den patenterade μTongue-tekniken som beskrivs i denna artikel, och μTongue-systemet är kommersiellt tillgängligt via SciTech Korea.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Institute of Basic Science (IBS-R015-D1), National Research Foundation of Korea (NRF) bidrag finansierat av Koreas regering (MSIT) (nr. 2019M3A9E2061789) och av National Research Foundation of Korea (NRF) bidrag finansierat av Koreas regering (MSIT) (nr 2019M3E5D2A01058329). Vi är tacksamma mot Eunsoo Kim och Eugene Lee för deras tekniska hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acesulfame K | Sigma Aldrich | 04054-25G | Artificial saliva / tastant |
| calcium chloride solution | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Artificial saliva / tastant |
| citric acid | Sigma Aldrich | C0759-100G | Artificial saliva / tastant |
| cycloheximide | Sigma Aldrich | 01810-5G | Artificial saliva / tastant |
| denatonium | Sigma Aldrich | D5765-5G | Artificial saliva / tastant |
| Dental glue | Denkist | P0000CJT-A2 | Animal preparation |
| Image J | NIH | ImageJ | Data analysis |
| IMP | Sigma Aldrich | 57510-5G | Artificial saliva / tastant |
| Instant adhesive | Loctite | Loctite 4161, Henkel | Animal preparation |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P3786-100G | Artificial saliva / tastant |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | Artificial saliva / tastant |
| Ketamine | Yuhan | Ketamine 50 | Animal preparation |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P0662-25G | Artificial saliva / tastant |
| KHCO3 | Sigma Aldrich | 237205-500G | Artificial saliva / tastant |
| MATLAB | Mathwork | MATLAB | Data analysis |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100G | Artificial saliva / tastant |
| MPG | Sigma Aldrich | 49601-100G | Artificial saliva / tastant |
| Mutiphoton microscope | Thorlab | Bergamo II | Microscope |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014-500G | Artificial saliva / tastant |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | 792519-500G | Artificial saliva / tastant |
| Objective | Nikon | N16XLWD-PF | Microscope |
| Octaflow | ALA Scientific Instruments | OCTAFLOW II | Fluidic control |
| PC | LG | Lg15N54 | Fluidic control |
| PH meter | Thermoscientific | ORION STAR AZ11 | Artificial saliva / tastant |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | 806562 | Artificial saliva / tastant |
| quinine | Sigma Aldrich | Q1125-5G | Artificial saliva / tastant |
| Syringe pump | Havard Apparatus | PHD ULTRA 4400 | Fluidic control |
| TRITC-dextran | Sigma Aldrich | 52194-1G | Animal preparation |
| Ultrafast fiber laser | Toptica | FFultra920 01042 | Microscope |
| Xylazine | Bayer Korea | Rompun | Animal preparation |
References
- Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).
- Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment. Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).
- Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells. Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).
- Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).
- Dando, R., Roper, S. D. Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels. The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).
- Chandrashekar, J., et al. The cells and peripheral representation of sodium taste in mice. Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).
- Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
- Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation. Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).
- Han, J., Choi, M. Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo. bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).
- Thestrup, T., et al. Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes. Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).
- Danilova, V. Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice. BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tan, H. E., et al. The gut-brain axis mediates sugar preference. Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).
- Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds. The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).
- Kusuhara, Y., et al. Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1. Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).
