Summary
Her presenterer vi en protokoll for kryogen prøvepreparering og overføring av krystaller til vakuumsluttstasjonen på beamline I23 ved Diamond Light Source, for makromolekylære røntgenkrystallografieksperimenter med lang bølgelengde.
Abstract
Langbølgelengde makromolekylær krystallografi (MX) utnytter de uregelmessige spredningsegenskapene til elementer, som svovel, fosfor, kalium, klor eller kalsium, som ofte er innfødt til stede i makromolekyler. Dette muliggjør direkte strukturløsning av proteiner og nukleinsyrer via eksperimentell fasing uten behov for ytterligere merking. For å eliminere den betydelige luftabsorpsjonen av røntgenstråler i dette bølgelengderegimet, utføres disse forsøkene i et vakuummiljø. Beamline I23 hos Diamond Light Source, Storbritannia, er det første synkrotroninstrumentet i sitt slag, designet og optimalisert for MX-eksperimenter i det lange bølgelengdeområdet mot 5 Å.
For å gjøre dette mulig omslutter et stort vakuumfartøy alle endstationkomponenter i prøvemiljøet. Nødvendigheten av å opprettholde prøver ved kryogeniske temperaturer under lagring og datainnsamling i vakuum krever bruk av termisk ledende prøveholdere. Dette muliggjør effektiv varmefjerning for å sikre prøvekjøling til ca. 50 K. Gjeldende protokoll beskriver prosedyrene som brukes for prøvepreparering og overføring av prøver til vakuum på bjelkelinje I23. For å sikre ensartethet i praksis og metoder som allerede er etablert i det makromolekylære krystallografisamfunnet, kan prøvekjøling til flytende nitrogentemperatur utføres i alle laboratorieinnstillinger utstyrt med standard MX-verktøy.
Kryogen lagring og transport av prøver krever bare standard kommersielt tilgjengelig utstyr. Spesialisert utstyr er nødvendig for overføring av kryogenisk avkjølte krystaller fra flytende nitrogen til vakuumendenstasjonen. Skreddersydde prøvehåndteringsverktøy og et dedikert kryogent overføringssystem (CTS) er utviklet internt. Diffraksjonsdata samlet inn på prøver utarbeidet ved hjelp av denne protokollen viser utmerket sammenslåingsstatistikk, noe som indikerer at kvaliteten på prøvene er uendret under prosedyren. Dette åpner unike muligheter for in-vacuum MX i et bølgelengdeområde utover standard synkrotronbjelker.
Introduction
Røntgendiffraksjon med lang bølgelengde brukes til å utnytte de uregelmessige spredningsegenskapene til spesifikke lysatomer som er innfødt tilstede i makromolekyler. Dette bidrar til å løse det krystallografiske faseproblemet og å entydig bekrefte identiteten og plasseringen av slike elementer innen makromolekyler. Mens i de tidlige dagene av makromolekylær krystallografi, de novo strukturer ble løst ved flere isomorfe erstatning1, med advent av justerbare røntgen strålelinjer på synkrotroner, eksperimentell fasing basert på multi-bølgelengde og en-bølgelengde (SAD) uregelmessige diffraksjonsteknikker har blitt de dominerende metodene2 . Begge metodene har historisk stolt på det isomorfe eller uregelmessige signalet fra tungmetaller, som må kunstig introduseres i krystallene ved co-krystallisering eller krystall soaking3. Prøve-og-feil-tilnærmingen og det uforutsigbare resultatet kan gjøre disse eksperimentene frustrerende tidkrevende. Inkorporering av seleno-metionin under proteinuttrykk4 er en veldig elegant måte å overvinne disse begrensningene og utnytte uregelmessig diffraksjon ved korte bølgelengder, selv om det kan være svært utfordrende i eukaryote proteinuttrykkssystemer.
Langbølgelengde MX er ekstremt tiltalende for strukturbestemmelse ved innfødte SAD-eksperimenter5,6 på grunn av bekvemmeligheten av å bruke krystaller direkte fra en vellykket krystalliseringsstudie uten videre behandling. I tillegg åpner tilgang til absorpsjonskantene av elementer av høy biologisk betydning, som kalsium, kalium, klor, svovel og fosfor, muligheten til å identifisere posisjonene til disse elementene direkte i makromolekyler7,8,9,10. Ved middels og lav oppløsning kan elementoppgave basert på 2Fo-Fc elektrontetthet og kjemisk miljø være vanskelig, spesielt for elementer med lignende antall elektroner eller svakt bundne ioner med delvis belegg. Disse tvetydighetene kan løses ved å samle inn data under og over absorpsjonskanten av elementet av interesse og tolkning av den resulterende modellfasede uregelmessige forskjellen Fourier kart11,12. Plassering av svovelatomer i disse kartene kan også hjelpe modellbygging til lavoppløselige elektrontetthetskart13. Absorpsjonskantene til disse lyselementene observeres ved bølgelengder mellom λ = 3 og 6 Å (se figur 1, topp). Dette bølgelengdeområdet har vært langt utover mulighetene til enhver synkrotron MX-strålelinje, og effektiv drift i dette området krever å overvinne flere tekniske utfordringer, som beskrevet nedenfor.
Beamline I23 hos Diamond Light Source, Storbritannia, er et unikt instrument, spesielt designet for å lette MX-eksperimenter med lang bølgelengde, justerbar i et bølgelengdeområde mellom λ = 1,13 og 5,9 Å (energiområde mellom E = 2,1 og 11 keV). Ved å operere i et høyvakuummiljø14 elimineres luftabsorpsjon og spredning, og dermed forbedre effektiviteten til diffraksjonseksperimenter og signal-til-støy-forholdet. En stor vakuum-endestasjon omslutter alle komponentene i prøvemiljøet, inkludert den halvsylindriske Pilatus 12M-detektoren, et multiakse-goniometer, online visnings- og sammenlikningssystemer, samt skreddersydd utstyr for prøveoverføring og lagring (figur 2). Hvert utstyr er optimalisert for å sikre at langbølgelengdedataene av beste kvalitet kan samles inn. Den buede Pilatus 12M-detektoren kan samle seg til diffraksjonsvinkler på 2θ = ±100°, noe som resulterer i tilstrekkelig høyoppløselige diffraksjonsdata selv ved lengste bølgelengder (figur 1, bunn). De 120 detektormodulene er spesielt valgt for lavenergikompatibilitet, og kalibreringer for en ekstra ultrahøy forsterkningsmodus er gitt.
Den lavest mulige detektorterskelen er 1,8 keV, noe som fører til økte hjørne- og kanteffekter for energier lavere enn 3,6 keV og kompromittert datakvalitet ved de lengste bølgelengdene, spesielt for krystaller med lav mosaikk, kan observeres. Denne effekten i kombinasjon med reduksjonen i detektorens kvanteeffektivitet15 må tas i betraktning ved planlegging av et eksperiment. Goniometeret med flere akser gjør det mulig å reorientere krystaller for å muliggjøre datainnsamlingsstrategier som maksimerer kvaliteten og styrken til det uregelmessige signalet, samt fullstendigheten av de uregelmessige dataene som samles inn. Prøveabsorpsjon er en begrensende faktor for forsøkene, spesielt ved lengste bølgelengder. Absorpsjonskorreksjoner, som implementert i ofte brukte MX-prosesseringsprogramvarepakker16,17, fungerer godt for å bølgelengder rundt 3 Å. Lengre bølgelengder vil kreve analytiske absorpsjonskorreksjoner basert på tomografiske rekonstruksjoner18 eller laserablasjon for å fjerne ikke-diffracting materiale og kutte krystallene i veldefinerte former19. Sistnevnte vil også bidra til å redusere størrelsen på større krystaller ettersom røntgendiffraksjonseksperimenter ved lengre bølgelengder er mer effektive for mindre krystaller14. Utfordringen med å holde prøver ved kryogeniske temperaturer under datainnsamling adresseres ved ledende kjøling, da bruk av kaldt gassstrømsenheter med åpen strømning ikke er kompatibelt med et vakuummiljø. Derfor er termisk ledende materialer, som kobber, nødvendig for å koble prøven til en pulsrørkryoooler. SPINE-standardpinnene i rustfritt stål som brukes i hele MX, samt andre kommersielt tilgjengelige prøvefester, er ikke egnet for MX med lang bølgelengde i vakuum på grunn av dårlig termisk ledningsevne.
Prøveholderne (SH-ene) for in-vacuum MX må være en viktig del av varmefjerningsbanen (figur 3A). Som sådan består de av en termisk ledende kobberkropp og pinne og inkluderer to viktige funksjoner: en sterk magnetbase for å sikre en tilstrekkelig termisk kobling til det kalde goniometerhodet, og en prøvemontering, laget av polyimid, for å minimere røntgenabsorpsjon og spredning20. Det ble gjort en innsats for å sikre at brukeropplevelsen av krystallhøsting og blitskjøling er nesten identisk med den som er forbundet med standard MX-praksis. Siden de dedikerte I23 SH-ene ikke er direkte kompatible med andre synkrotronstrålelinjer, brukes en adapter i rustfritt stål til kompatibilitet med de krystallhøstingsmagnetiske stavene og eksisterende goniometergrensesnitt på andre MX-bjelkelinjer (figur 3B). Adapteren er også viktig for å benytte automatiseringsanleggene på andre Diamond MX-bjelkelinjer, som er basert på ALS-type robotgriperhoder21 og baseoppsett i unipuck-stil22, hvis prøvevariasjon krever rask forhåndsscreening for valg av de beste diffracting-krystallene. Prøveforberedelses- og lasteprotokollen kan deles inn i to trinn:
Trinn 1: Høsting av krystaller og flash-frysing utført av brukere i egne laboratorier
Etter vurdering av prosjektets egnethet for I23-datainnsamling sendes prøveholdere med løkker som samsvarer med krystallstørrelsene (forhåndsmontert med adaptere) til brukerlaboratorier for krystallhøsting. For å unngå skade, bør SHs og adaptere ikke skilles og skal brukes som en enhet med det formål å fiske krystaller med passende størrelse løkker ved hjelp av standard krystallhøsting magnetiske staver. Som vanlig i MX, utføres denne oppgaven manuelt under mikroskopet, og krystaller blir umiddelbart flashkjølt i en skumdewar med flytende nitrogen23. På grunn av manglende samsvar mellom magnetiske krefter er SH-ene for øyeblikket ikke kompatible med unipucks. Lagring og frakt realiseres ved hjelp av kamipucks (se materialtabellen), som er tilgjengelig for brukere på forespørsel, sammen med kompatible tørrskipsinnsatser (figur 3C). Disse puckene deler den samme grunnplaten med de mye brukte unipucks og tillater rask forhåndsscreening av prøver på andre Diamond MX-bjelker. Å låne ut dette utstyret til brukere er for tiden den beste ordningen, til de skreddersydde prøveholderne er kommersielt tilgjengelige. Transport til bjelkelinjen krever standard tørre avsendere som brukes i MX-samfunnet.
Trinn 2: Overføring av kryokjølte prøver til vakuumendenstasjonen
Når prøvene kommer på strålelinjen, er de forberedt på overføring til vakuumsluttstasjonen. Dette innebærer fjerning av SHs fra kamipucks og separasjon fra adaptere. Innføring av biologiske prøver for vakuum utføres rutinemessig innen kryo-elektronmikroskopi. Noen av de veletablerte konseptene ble tilpasset I23-prøveoverføringen. Kort sagt overføres SH-er under flytende nitrogen til overføringsblokker (figur 3D). Disse blokkene har utmerket termisk ledningsevne og en betydelig termisk masse, og forhindrer krystallene i å nå glassovergangstemperaturen når de er i vakuum. Opptil fire blokker, med en kapasitet på fire prøver hver, lastes under flytende nitrogen i en blokkpuck (figur 3H), som brukes enten til å overføre prøver til Cryogenic Transfer System (CTS) eller for lagring i flytende nitrogendewars mellom eksperimenter.
Cryogenic Transfer System utviklet ved Diamond Light Source består av to undersamlinger, prøvestasjonen og shuttle (figur 4A). Prøvestasjonen består av et flytende nitrogenbad for midlertidig lagring av proteinkrystaller og har spesifikke funksjoner for å sikre sikkerhet og gi en brukervennlig opplevelse (figur 5). CTS styres av en programmerbar logikkkontroller via et brukervennlig berøringsskjermgrensesnitt. Prøvestasjonen har lysemitterende dioder innebygd for bedre visualisering og et sett med varmeovner kontrollert i tett sløyfe for å automatisere tørking av flytende nitrogenbad når prøvene er overført. Den har også en rekke sensorer for å sikre sikkerhet og effektiv funksjon av systemet. Prøvestasjonen har skreddersydd maskinvare for å gi et pålitelig elektrisk grensesnitt for å samhandle med romfergen for operasjoner, for eksempel pumping ned til grovt vakuum for prøveoverføring, samt overvåking av flytende nitrogennivåer og temperaturen inne i romfergen.
Shuttle (figur 6) er en bærbar enhet som brukes til å plukke opp en overføringsblokk fra samplestasjonen flytende nitrogenbad og overføre den inne i et kryogent og vakuummiljø til endestasjonen. Det inkluderer en flytende nitrogen dewar for å holde prøvene kalde under overføring, overvåking av flytende nivå i dewar, og en rekke sensorer for drift og brukersikkerhet. Overføringsarmen er utstyrt med en magnetisk stasjon og inkluderer maskinerte spor for å veilede brukere i sikker lasting og lossing av overføringsblokker inn i endestasjonen. Overføring fra skyttelbussen til vakuumbeholderen utføres via en luftsluse. Luftslusen er et grensesnitt for skyttelbussen på endestasjonen som brukes til å evakuere mellomrommet mellom skyttelbussen og endestasjonen, før du åpner skyttel- og sluttstasjonsvakuumventilene. Pumpe- og ventilasjonssekvensene er helautomatiske og kan betjenes via en stor berøringsskjerm med et brukervennlig grensesnitt (figur 4C). Den nåværende protokollen brukes til å overføre en thaumatinkrystall til vakuumsluttstasjonen for datainnsamling.
Protocol
1. Krystall høsting
MERK: Bruk egnet personlig verneutstyr: vernebriller og hansker der det er mulig.
- Når SH-ene ankommer brukerlaboratoriet i kamipucker (figur 3C), skiller du lokket fra bunnen av kamipucken slik at SH-ene forblir festet til basen, og hetteglassene beholdes i lokket.
- Senk lokket med hetteglass i flytende nitrogen. Fest en SH + adapter (figur 3B, høyre) til en magnetisk tryllestav, og høst krystaller som vanlig.
- Flash-cool hver prøve direkte inn i kamipucken, og noter prøveposisjonen. For å lukke pucken, bruk en puck tryllestav for å feste basen til lokket.
- Overfør kamipucken fra flytende nitrogen til tørr avsender eller flytende nitrogenlagringsdewar. Send den tørre avsenderen til Diamond (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Common/Common-Manual/Shipping-Samples.html).
2. Prøveoverføring til vakuum
- Lasting av SH fra kamipuck til overføringsblokk
- Plasser bunnen av blokkpucken (figur 3H) som allerede er befolket med tomme overføringsblokker (figur 3D) på støttebasen inne i det flytende nitrogenet i en skumbeholder (figur 3J-b).
MERK: Retningen på overføringsblokkene er viktig for nøyaktigheten av prøveoverføringen inne i vakuumbeholderen. Blokkene skal derfor plasseres på blokkpuckbasen og sørge for at pinnen som er merket med en pil i figur 3D , er til venstre for blokken. - Plasser hetteglasspucken i skumbeholderen fylt med flytende nitrogen, og pass på at puckens base er festet til den magnetiske holderen inne i skumbeholderen (figur 3J-a).
- Forkjøl alle nødvendige verktøy i flytende nitrogen. Bruk puckseparatorverktøyet vist i figur 3G på den høye innstillingen H for å skille lokket fra basen, slik at basen forblir festet til magnetholderen og SH-ene er eksponert inne i det flytende nitrogenet.
- For å fjerne hver SH fra adapteren, bruk separatorstaven (figur 3F) til å plukke opp SH fra kamipuckbasen, og plasser den i riktig posisjon av overføringsblokken i den horisontale posisjonen til karusellen i figur 3J-b.
- Plasser separatorstaven over SH + adapteren så langt ned som mulig, og sørg for at staven er vertikal, for å unngå å berøre prøven.
- Beveg den lille spaken på separatorstaven ned med tommelen til den klikker, for å feste SH-innsiden og trekke SH fra adapteren.
- Senk separatoren over ønsket blokkposisjon, og pass på at en av de tre pinnene passer inne i det sentrale hullet i blokken.
- Slipp SH ved å flytte spaken opp igjen. Gjenta disse trinnene for hver SH.
- Hvis du vil laste inn prøver i neste prøveblokk, bruker du karusellnøkkelverktøyet (figur 3E) til å rotere en tom blokk i horisontal posisjon.
- Fest puckseparatorverktøyet som vises i figur 3G , ved hjelp av den lave innstillingen L til lokket på blokkpucken ved å skru med klokken.
- Når alle SH-ene er overført, for å lukke blokkpucken, legg lokket i flytende nitrogen og vent på at temperaturen skal likevekte, og monter deretter lokket over basen som i figur 3I. Når separatorverktøyet er festet, løfter du forsiktig for å løsne fra karusellen.
- På dette stadiet kan blokkpucken overføres til CTS (figur 4B) eller til en flytende nitrogenlagringsdewar.
- Plasser bunnen av blokkpucken (figur 3H) som allerede er befolket med tomme overføringsblokker (figur 3D) på støttebasen inne i det flytende nitrogenet i en skumbeholder (figur 3J-b).
- Lasting av overføringsblokker inn i vakuumbeholderen
- Sørg for at skyttelbussen er godt festet til stasjonen. Åpne nitrogengass- og luftventilene, og sørg for at gassene strømmer. Slå på CTS.
- Hvis det ikke vises noen advarsler på displayet, fortsett med å kjøle ned både badekaret og romfergen med flytende nitrogen. Plasser den medfølgende trakten i påfyllingsporten på romfergen, og hell sakte flytende nitrogen i trakten mens du overvåker nivået på skjermen. Stopp når indikatoren skifter fra rødt til blått.
MERK: Romfergen er klar til bruk når temperaturen på det kalde setet som vises på berøringsskjermen er under 100 K. Prøvestasjonsbadet kan fylles samtidig ved hjelp av riktig trakt til nivået som er merket på badekarets vegg eller 100% på det flytende nitrogennivådisplayet. Flytende nitrogennivåer og temperatursensorer bør overvåkes kontinuerlig under drift; flere påfyllinger vil være nødvendig. - Når romfergens kalde setetemperatur er under 100 K og flytende nitrogennivåer på romfergen og badekaret stabiliserer seg, overfør en blokkpuck fra flytende nitrogen til CTS-badet ved hjelp av det vedlagte puckseparatorverktøyet. Fjern lokket på blokkpucken, og lukk lokket på CTS-badekaret.
- For å introdusere en blokk i romfergen, åpne CTS-ventilen, hvis den ikke allerede er åpen, ved å trykke på Open Shuttle Valve-knappen på displayet. Lås opp skyttelhåndtaket ved å rotere 90° med klokken, og før det mot badekaret slik at det styrte sporet på håndtaket håndhever riktig kjørebane mot badekaret. Når blokkdekselet er synlig inne i badekaret, la dekselet avkjøles. Etter at boblen av flytende nitrogen rundt dekselet har stoppet, går du videre til overføringsblokken.
- For å låse overføringsblokken på skyttelbussen, drei håndtaket 180° med klokken.
- Trekk håndtaket tilbake til den opprinnelige bakposisjonen, og 'Lås' det på plass ved å rotere 90° mot urviseren.
- Trykk på Lukk shuttleventilen og pumpen på displayskjermen for å starte evakuering av skyttelbussen.
- Når meldingen Shuttle klar til å løsne vises på berøringsskjermen, trykker du på spaken under romfergen og løfter den forsiktig ved hjelp av håndtaket øverst.
- Bær romfergen til luftslusen på vakuumendenstasjonen i oppreist stilling.
- Fest romfergen til luftslusen på vakuumenden.
MERK: Når berøringsskjermen er godt festet, bekrefter berøringsskjermen på endestasjonen statusen til skyttelbussen og låsen. - Velg en tom blokkposisjon i fartøyet ved å trykke på den tilsvarende knappen på berøringsskjermen og flytte prøvehotellet til riktig lasteposisjon.
- Når prøvehotellet er på plass, blir Åpne-knappen aktiv. Trykk på denne knappen for å starte vakuumlåssekvensen.
MERK: Pumpen starter, og fremdriften vises på skjermen. Dette kan ta opptil to minutter å fullføre. - Etter at sekvensen er fullført, endres statusen til Airlock åpen, overføring pågår. Vri håndtaket 90° med urviseren for å låse opp stangen, og skyv stangen forsiktig inn i fartøyet slik at den guidede banen igjen håndhever riktig kjørebane mot prøvehotellposisjonen. Bruk videofeeden som vises på skjermen for veiledning, og sett sakte blokken inn i hotellet, og sørg for at blokkposisjonslyset på berøringsskjermen er aktivert. Når håndtaket er aktivert, roterer du det 180° mot klokken for å løsne blokken, og trekker stangen ut av karet. Når håndtaket er trukket helt inn, roterer du det 90° mot klokken for å låse stangen.
- Når stangen er låst, blir Lukk-knappen aktiv. Trykk på denne for å lukke endestasjonsvakuumventilen, og ventiler rommet mellom skyttelbussen og fartøyet til atmosfærisk trykk, og vent i opptil 20 s for ferdigstillelse.
- Vent til displayet viser statusen ok å fjerne shuttle når sekvensen er fullført. På dette tidspunktet fjerner du skyttelbussen og går tilbake til CTS for å gjenta prosessen for neste blokk.
- For å forberede neste blokk for overføring, roterer du blokkpucken inne i badekaret. Skyv den innebygde rotasjonsnøkkelen på toppen av akryllokket ned i låsen midt på blokkpucken. Mens du holder den nede, dreier du tasten for å plassere ønsket blokk i henteposisjon.
- Når alle blokkene er overført, må du kontrollere at shuttleventilen er åpen mens den er montert på CTS. Trykk på bakeknappen på berøringsskjermen, og velg både bad og shuttle, og trykk deretter på bake.
MERK: Dette varmer opp både skyttelbussen og badet for å koke av det flytende nitrogenet og deretter fordampe eventuell akkumulert is/kondens før neste bruk. Når steken har startet, kan gassen og luften slås av.
Representative Results
En thaumatinkrystall ble introdusert til vakuumsluttstasjonen ved hjelp av protokollen som er skissert ovenfor. Diffraksjonsdata ble samlet inn ved en bølgelengde på 2,7552 Å (E = 4500 eV) som 3600 bilder med en rotasjonsøkning på 0,1° og 0,1 s eksponering per bilde. Strålestørrelsen ble justert til 150 μm x 150 μm og redusert til 10% overføring, med en tilsvarende fluxmåling på 7,1 x 109 fotoner / s. Valget av λ = 2.7552 Å er basert på et kompromiss mellom økningen i uregelmessige signal- og prøveabsorpsjonseffekter og reduksjonen i oppløsningen til lengre bølgelengder. Selv om det ikke er i nærheten av den teoretiske absorpsjonskanten av svovel (λ = 5.0095 Å), ved denne bølgelengden, er det imaginære bidraget til spredningsfaktoren til svovel f" 1,57 e- , en faktor på 1,6-2,1 større sammenlignet med bølgelengder mellom 1,7 og 2 Å. De resulterende sterkere uregelmessige signalene gir vellykket S-SAD-innfasing for mer utfordrende prosjekter.
En rekke vanskelige innfasingsforsøk er allerede utført på strålelinje I2324,25,26,27, med data samlet inn ved denne bølgelengden. Mens innfasing av S-SAD er mulig ved hjelp av mye kortere bølgelengder, krever dette ofte å bygge opp uregelmessig signal gjennom sammenslåing av data fra mange isomorfe krystaller for å nå multiplisitetsverdier over 10028. På grunn av det forbedrede uregelmessige signalet ved lengre bølgelengder, krevde de fleste fasingprosjekter som ble løst på I23 bare data fra en krystall. Et representativt diffraksjonsbilde vises i figur 7, venstre. Databehandling ved hjelp av Xia2-3dii29 ga utmerket sammenslåingsstatistikk, som beskrevet i tabell 1. Figur 7 viser en del av et representativt diffraksjonsbilde fra thaumatin-datasettet og illustrerer den lave bakgrunnen rundt Bragg-refleksjonene, som bidrar til de store I/σ(I)-verdiene som vanligvis observeres i vakuumoppsettet, slik at bare røntgenstråler spredt av prøven når detektoren.
Den maksimale oppnåelige oppløsningen på 1,8 Å skyldes detektorgeometrien og den valgte bølgelengden til røntgenstrålingen. Datasettet ga svært sterkt uregelmessig signal, reflektert i midtskråningen av uregelmessig normal sannsynlighetsparameter på 2,677, noe som letter strukturløsningen ved den automatiske fasingrørrøret CRANK2. Den høye kvaliteten på det resulterende elektrontetthetskartet gjorde det mulig med vellykket automatisk modellbygging av Buccaneer30-modulen i CRANK231, med riktig plassering for 100% av aminosyresekvensen av thaumatin. Den fasede uregelmessige forskjellen Fourier kart, beregnet med ANODE11, avslører 16 meget godt bestilte svovelatomer og ett svovelatom fra Cys159 med to alternative konformasjoner, som bekreftet av de 18 signifikante høydene på toppene ved posisjonene til de uregelmessige scattere i tabell 2. De 16 cysteinrester i thaumatin form 8 disulfidbroer, som alle er tydelig synlige i 2Fo-Fc kartet (figur 8).
Figur 1: Difffraksjonsdata med høy oppløsning fra MX-eksperimenter med lang bølgelengde. (A) Plotting av f"-verdier mot energi, noe som indikerer absorpsjonskanter av lyselementer som er tilgjengelige på bjelkelinje I23. (B) Maksimal oppløsning oppnåelig i hjørnene av P12M-detektoren mot energi. Forkortelse: MX = makromolekylær krystallografi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Horisontal seksjon gjennom vakuumbeholderen med alle komponentene i endestasjonen. Forkortelse: OAV = visningssystem på akse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Prøvehåndteringsverktøy. (A) I23 Prøveholder. (B) MX ryggradsstandardpinne (venstre) ved siden av en I23-prøveholder med adapter (høyre). (C) Kamipucklokk og base med I23 prøveholdere (blå). Blokker pucklokk og base med to overføringsblokker (gull). En tørr skiperstokk, kompatibel med både kamipucks og blokkpucker, er synlig på baksiden. (D) Overføringsblokk med fire I23-prøveholdere. (E) Nøkkelverktøy som brukes til rotasjon av blokkpuckbasen. (F) Separator tryllestav. (G) Puck separator verktøy med to piler som viser høye og lave innstillinger. (H) Blokker puckbasen med fire tomme Cu-blokker. (I) Lokk til blokkpucken. (J) Skumbeholder med alle nødvendige verktøy for overføring av prøveholdere fra kamipuckbaser til kobberblokker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Kryogene overføringssystem. (A) CTS Prøvestasjon med shuttle festet og traktene som brukes til fylling. (B) En blokkpuck med to overføringsblokker plassert inne i CTS. (C) CTS-kontrollprogramvarens berøringsskjerm. Forkortelse: CTS = Kryogene overføringssystem. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Cryogenic Transfer System Sample Station. Forkortelser: lysdioder = lysemitterende dioder; LN2 = flytende nitrogen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Kryogene overføringssystem shuttle. Forkortelser: lysdioder = lysemitterende dioder; LN2 = flytende nitrogen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Diffraksjonsbilder. Venstre, et diffraksjonsbilde fra datasettet samlet inn på thaumatinkrystallen. Høyre, et diffraksjonspunkt omgitt av bakgrunnsbilder med lavt antall. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Strukturløsning av Thaumatin med automatisk rørledning CRANK2 (standardinnstillinger, ingen etterfølgende raffinement). (A) Oversikt over thaumatin med 2Fo-Fc-kart ved 1,6σ (blå) og faset uregelmessig forskjell Fourier kart ved 5σ beregnet i ANODE (grønn). (B) Oversikt over thaumatin som bare viser den fasede uregelmessige forskjellen Fourier kart ved 5σ. (C) Nærbilde av en disulfidbro til stede i thaumatin med 2Fo-Fc kart på 1,6σ (blå) og faset uregelmessig forskjell Fourier kart ved 5σ. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Navn | Thaumatin |
| Bølgelengde for datainnsamling (Å) (energi (eV)) | 2.7552 (4500) |
| Antall bilder x kilestørrelse (°) | 3600 x 0,1 |
| Områdegruppe | P 41212 |
| Enhetscellekonstanter | |
| (a = b, c) (Å) | 57.8, 150.2 |
| (α = β = γ) (°) | 90 |
| Oppløsning (Å) | 150.22–1.80 (1.84–1.80) |
| Fullstendighet | 96.3 (81.1) |
| Isa | 36.48 |
| Rmeas | 0.042 (0.118) |
| Rpim | 0.01 (0.049) |
| Kopi1/2 | 1 (0.989) |
| I/σ(I) | 57.9 (14.7) |
| Mangfold | 15.0 (5.4) |
| Midt i skråningen | 2.677 |
Tabell 1: Datainnsamlings- og prosesseringsstatistikk for Thaumatin på 2.755 Å bølgelengde ved beamline I23, DLS. For oppløsning, fullstendighet, Rmerge, Rmeas, Rpim, CC1/2, I/σ(I) og multiplisitet vises høyoppløselige skall i parentes. Forkortelse: DLS = Diamant lyskilde.
| Nærmeste atom | Topp høyde (sigma) |
| CYS9 | 25.83 |
| CYS56 | 25.03 |
| MØTTE112 | 24.54 |
| CYS149 | 24.37 |
| CYS126 | 24.21 |
| CYS145 | 24.2 |
| CYS134 | 23.6 |
| CYS177 | 23.48 |
| CYS204 | 23.43 |
| CYS66 | 23.17 |
| CYS164 | 22.54 |
| CYS193 | 22.15 |
| CYS158 | 21.51 |
| CYS77 | 21.21 |
| CYS121 | 20.8 |
| CYS71 | 19.17 |
| CYS159_1 | 12.27 |
| CYS159_2 | 8.34 |
Tabell 2: Uregelmessig forskjell Fourier kart topphøyder som beregnet av ANODE ved hjelp av den fasede og automatisk bygde modellen fra CRANK2.
Discussion
Den nåværende protokollen er utviklet for å overholde prøveforberedelseskravene for MX-eksperimenter med lang bølgelengde på strålelinje I23. Den har vært i bruk på bjelkelinjen det siste året og har bidratt til vellykket gjennomføring av flere prosjekter. Som angitt av resultatene som presenteres her, muliggjør protokollen en sikker og pålitelig overføring av prøver til vakuumsluttstasjonen samtidig som deres diffraksjonskvalitet bevares. Det er et viktig aspekt for strålelinjeoperasjonen og vil bli ledsaget av personlig brukeropplæring av beamline-ansatte. Noen av trinnene er verdt å bli fremhevet som kritiske for vellykket og sikker fullføring av prosedyren: overføring av prøver fra kamipuckbaser til prøveblokker krever nøyaktighet og oppmerksomhet for å unngå skadelige prøver (se trinn 2.1.4); overvåking av flytende nitrogennivå i alle stadier er viktig for å forhindre at prøver blir utsatt for luft eller er i nær kontakt med deler som ikke er ordentlig avkjølt (2.1.3 og 2.2.2); vente til Lukkingssekvensen (2.2.14) er helt ferdig, før du fjerner skyttelbussen fra endestasjonen (2.2.15), for å unngå nedbrytning av endestasjonsvakuumet.
Oppfatningen av protokollen ble initiert sammen med en ingeniørinnsats for å utvikle spesialbygget utstyr for overføring av proteinkrystaller til vakuummiljøet. De endelige produktene i dette prosjektet var CTS og de tilhørende prøvehåndteringsverktøyene beskrevet ovenfor. CTS er en betydelig forbedring på forgjengeren, Leica EM VCT10014, og fjerner flere begrensninger, for eksempel mangel på prøveskjerming og vakuummiljø under overføring, isoppbygging inne i det flytende nitrogenbadet og fraværet av et intuitivt brukergrensesnitt og sikkerhetsfunksjoner. Ytterligere funksjoner i CTS som forbedrer brukeropplevelsen er overvåking av temperatur og flytende nitrogennivå inne i skyttel- og prøvestasjonen, et bad med større kapasitet som imøtekommer fire blokker samtidig, i stedet for en, og en selvstyrt mekanisme for skytteloperasjonen. CTS er fullt integrert i strålelinjekontrollsystemet med et brukervennlig berøringsskjermgrensesnitt og forbedret vakuum og mekanisk sikkerhet ved grensesnitt med endestasjonen.
Beamline I23 er det første langbølgelengde MX-synkrotroninstrumentet i sitt slag, og som sådan har det krevd betydelig innsats å introdusere proteinkrystaller til et høyvakuummiljø og lagre dem ved kryogeniske temperaturer. Forbedringer av prøveforberedelsesverktøyene og protokollen, samt innsats for å effektivisere prosesser, pågår. Som en del av brukerstøtten er beamlinepersonalet alltid tilgjengelig for å hjelpe deg med feilsøking. Et eksempel på et slikt scenario vil være problemer som kompromitterer integriteten til vakuumsystemet, noe som fører til vanskeligheter med å feste eller fjerne skyttelbussen til / fra enten CTS- eller sluttstasjonsluftslusen. Ulike nivåer av tester utføres på ukentlig og daglig basis, og brukeropplæring vil dekke ytterligere kontroller for å unngå potensielle feil, som visuell inspeksjon av O-ringene på grensesnittene skyttelbussen kobles til. Mens vakuummiljøet åpner muligheten til å utføre diffraksjonseksperimenter i et bølgelengdeområde som ikke er tilgjengelig ved andre bjelkelinjer, reduserer det ekstra overføringstrinnet den totale prøvegjennomstrømningen.
Den manuelle overføringen med bare fire prøver per overføringsblokk og opptil fem blokker inne i vakuumbeholderen begrenser den totale kapasiteten til 20 prøver. Derfor, for prosjekter med en stor prøve for å prøvevariabilitet, bør prøver forhåndsscreenes på Diamond high-throughput beamlines, og da bør bare de mest lovende prøvene overføres for det påfølgende optimaliserte langbølgelengdeeksperimentet. Mens prøveholderne og overføringsblokkene er uendret fra den første introduksjonen for noen år siden, er håndteringsverktøyene som presenteres her alle nye utviklinger. I23 dedikerte prøveholdere er uforanderlige på grunn av deres rolle i kjølekonseptet for strålelinjen. Som sådan hadde utformingen av prøvehåndteringsverktøyene som mål å skape en kobling mellom denne nye typen holder og standard kommersielt tilgjengelige verktøy som MX-brukersamfunnet hadde vedtatt i lang tid, for eksempel kamipucks, krystallhøstingsstaver og det tørre avsendertransportsystemet. Deres design innebar betydelig konsultasjon med brukersamfunnet og krevde flere gjentakelser å fullføre. Utstyret, verktøyene og protokollen som presenteres her representerer et enkelt og robust system for overføring av brukerprøver for eksperimenter ved beamline I23 hos Diamond Light Source. Dette instrumentet for makromolekylær krystallografi med lang bølgelengde åpner nye muligheter for strukturbiologi.
Acknowledgments
Vi vil takke Adam Taylor, Adam Prescott, Ken Jones, Arvinder Palaha og Kevin Wilkinson for deres støtte i utviklingen av Cryogenic Sample Transfer System (CTS). Dette arbeidet ble finansiert av iNEXT-Discovery (Grant 871037) finansiert av Horisont 2020-programmet til Eu-kommisjonen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12M detector | Dectris, Switzerland | single-photon-counting X-ray detector | |
| CombiPuck | MiTeGen | SKU: M-CBP-P1 | Cryopucks used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples |
| Crystal-harvesting magnetic wand | Molecular Dimensions | MD7-411 | Used for harvesting crystal |
| Dry Shipper (CX100) | Molecular Dimensions | MD7-21 | Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples |
| Dry shipper insert (CombiPuck Transport Cane) | MiTeGen | SKU: M-CBP-PTC1 | Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples |
| Kapton polyimide | sample mount made of Kapton polyimide | ||
| Perpsex lid | acrylic lid with built-in rotation key | ||
| Thaumatin powder | Sigma-Aldrich | T7638 | Used for production of thaumatin crystals by vapour diffusion |
References
- Green, D. W., Ingram, V. M., Perutz, M. F. The structure of haemoglobin - IV. Sign determination by the isomorphous replacement method. Proceedings of the Royal Society of London. Series A. Mathematical and Physical Sciences. 225 (1162), 287 (1954).
- Hendrickson, W. A. Anomalous diffraction in crystallographic phase evaluation. Quarterly Reviews of Biophysics. 47 (1), 49-93 (2014).
- Pike, A. C., Garman, E. F., Krojer, T., von Delft, F., Carpenter, E. P. An overview of heavy-atom derivatization of protein crystals. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (3), 303-318 (2016).
- Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): A vehicle for direct determination of three-dimensional structure. The EMBO Journal. 9 (5), 1665-1672 (1990).
- Liu, Q., Hendrickson, W. A. Contemporary use of anomalous diffraction in biomolecular structure analysis. Protein Crystallography. Methods in Molecular Biology. Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. 1607, Humana Press. New York, NY. 377-399 (2017).
- Rose, J. P., Wang, B. C., Weiss, M. S.
- Rozov, A. Importance of potassium ions for ribosome structure and function revealed by long-wavelength X-ray diffraction. Nature Communications. 10 (1), 2519 (2019).
- Rocchio, S., et al. Identifying dynamic, partially occupied residues using anomalous scattering. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75 (12), 1084-1095 (2019).
- Langan, P. S., et al. Anomalous X-ray diffraction studies of ion transport in K+ channels. Nature Communications. 9 (1), 4540 (2018).
- Lolicato, M., et al. K2p channel C-type gating involves asymmetric selectivity filter order-disorder transitions. Science Advances. 6 (44), (2020).
- Thorn, A., Sheldrick, G. M. ANODE: anomalous and heavy-atom density calculation. Journal of Applied Crystallography. 44 (6), 1285-1287 (2011).
- Handing, K. B., Niedzialkowska, E., Shabalin, I. G., Kuhn, M. L., Zheng, H., Minor, W. Characterizing metal-binding sites in proteins with X-ray crystallography. Nature Protocols. 13 (5), 1062-1090 (2018).
- Jungnickel, K. E. J., Parker, J. L., Newstead, S. Structural basis for amino acid transport by the CAT family of SLC7 transporters. Nature Communications. 9 (1), 550 (2018).
- Wagner, A., Duman, R., Henderson, K., Mykhaylyk, V.
- Wernecke, J., Gollwitzer, C., Müller, P., Krumrey, M. Characterization of an in-vacuum PILATUS 1M detector. Journal of Synchrotron Radiation. 21 (3), 529-536 (2014).
- Kabsch, W.
- Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (2), 85-97 (2018).
- Brockhauser, S., Di Michiel, M., Mcgeehan, J. E., Mccarthy, A. A., Ravelli, R. B. G. X-ray tomographic reconstruction of macromolecular samples. Journal of Applied Crystallography. 41 (6), 1057-1066 (2008).
- Kitano, H., et al. Processing of membrane protein crystal using ultraviolet laser irradiation. Journal of Bioscience and Bioengineering. 100 (1), 50-53 (2005).
- Mykhaylyk, V., Wagner, A. Towards long-wavelength protein crystallography: Keeping a protein crystal frozen in vacuum. Journal of Physics: Conference Series. 425 (1), 012010 (2013).
- Snell, G., et al. Automated sample mounting and alignment system for biological crystallography at a synchrotron source. Structure. 12 (4), 537-545 (2004).
- The universal container project. , Available from: https://smb.slac.stanford.edu/robosync/Universal_Puck/ (2020).
- Teng, T. Y., et al. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a freestanding thin-film. Journal of Applied Crystallography. 23, 387-391 (1990).
- Esposito, D., et al. Structural basis for the glycosyltransferase activity of the salmonella effector SseK3. Journal of Biological Chemistry. 293 (14), 5064-5078 (2018).
- O'Donnell, J. P., et al. The architecture of EMC reveals a path for membrane protein insertion. eLife. 9, 57887 (2020).
- Mishra, A. K., et al. Structure and characterization of crimean-congo hemorrhagic fever virus GP38. Journal of Virology. 94 (8), 02005-02019 (2020).
- Rudolf, A. F., et al. The morphogen sonic hedgehog inhibits its receptor patched by a pincer grasp mechanism. Nature Chemical Biology. 15 (10), 975-982 (2019).
- El Omari, K., et al. Pushing the limits of sulfur sad phasing: De novo structure solution of the n-terminal domain of the ectodomain of hcv e1. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 70 (8), 2197-2203 (2014).
- Winter, G. XIA2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).
- Cowtan, K. The Buccaneer software for automated model building. 1. Tracing protein chains. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 62 (9), 1002-1011 (2006).
- Skubak, P., Pannu, N. S. Automatic protein structure solution from weak X-ray data. Nature Communications. 4 (1), 2777 (2013).
