Summary
Здесь мы представляем протокол криогенной пробоподготовки и переноса кристаллов в вакуумную конечную станцию на лучевой линии I23 в Diamond Light Source, для длинноволновых макромолекулярных рентгеновских кристаллографических экспериментов.
Abstract
Длинноволновая макромолекулярная кристаллография (MX) использует аномальные свойства рассеяния элементов, таких как сера, фосфор, калий, хлор или кальций, которые часто присутствуют в макромолекулах. Это позволяет получить прямое структурное решение белков и нуклеиновых кислот с помощью экспериментальной фазы без необходимости дополнительной маркировки. Чтобы исключить значительное поглощение воздуха рентгеновскими лучами в этом режиме длин волны, эти эксперименты проводят в вакуумной среде. Beamline I23 в Diamond Light Source, Великобритания, является первым синхротронным прибором такого рода, разработанным и оптимизированным для экспериментов MX в длинноволновом диапазоне до 5 Å.
Чтобы сделать это возможным, большой вакуумный сосуд охватывает все компоненты конечной станции среды образца. Необходимость поддержания образцов при криогенных температурах при хранении и сборе данных в вакууме требует использования термопроводящих держателей образцов. Это способствует эффективному отводу тепла для обеспечения охлаждения образца примерно до 50 К. Текущий протокол описывает процедуры, используемые для пробоподготовки и передачи образцов в вакуум на лучевой линии I23. Обеспечивая единообразие в практиках и методах, уже установленных в сообществе макромолекулярной кристаллографии, охлаждение образца до температуры жидкого азота может быть выполнено в любых лабораторных условиях, оснащенных стандартными инструментами MX.
Для криогенного хранения и транспортировки образцов требуется только стандартное коммерчески доступное оборудование. Для переноса криогенно охлажденных кристаллов из жидкого азота в вакуумную конечную станцию требуется специализированное оборудование. На месте были разработаны специальные инструменты для обработки образцов и специальная криогенная система переноса (CTS). Дифракционные данные, собранные на образцах, подготовленных с использованием этого протокола, показывают отличную статистику слияния, указывающую на то, что качество образцов не изменяется во время процедуры. Это открывает уникальные возможности для вакуумного MX в диапазоне длин волн за пределами стандартных линий синхротронного пучка.
Introduction
Длинноволновая рентгеновская дифракция используется для использования аномальных свойств рассеяния конкретных атомов света, изначально присутствующих в макромолекулах. Это помогает решить проблему кристаллографической фазы и однозначно подтвердить идентичность и расположение таких элементов внутри макромолекул. В то время как в первые дни макромолекулярной кристаллографии структуры de novo решались путем множественной изоморфной замены1, с появлением перестраиваемых рентгеновских лучевых линий на синхротронах экспериментальная фаза на основе методов многоволновой и одноволновой (SAD) аномальной дифракции стала доминирующим методом2 . Оба метода исторически опирались на изоморфный или аномальный сигнал от тяжелых металлов, которые необходимо искусственно вводить в кристаллы путем кокристаллизации или замачивания кристаллов3. Метод проб и ошибок и непредсказуемый результат могут сделать эти эксперименты разочаровывающе трудоемкими. Включение селено-метионина во время экспрессии белка4 является очень элегантным способом преодоления этих ограничений и использования аномальной дифракции на коротких длинах волн, хотя это может быть очень сложно в системах экспрессии эукариотического белка.
Длинноволновый MX чрезвычайно привлекателен для определения структуры с помощью нативных экспериментов SAD5,6 из-за удобства использования кристаллов непосредственно из успешного испытания кристаллизации без дальнейшего лечения. Кроме того, доступ к границам поглощения элементов высокой биологической значимости, таких как кальций, калий, хлор, сера и фосфор, открывает возможность непосредственно идентифицировать положения этих элементов в макромолекулах7,8,9,10. При среднем и низком разрешении назначение элементов на основе электронной плотности 2Fo-Fc и химической среды может быть затруднено, особенно для элементов с аналогичным количеством электронов или слабо связанных ионов с частичным заполнением. Эти неясности могут быть разрешены путем сбора данных ниже и выше края поглощения интересующего элемента и интерпретации результирующих аномальных разностных карт Фурье с фазой модели11,12. Определение местоположения атомов серы на этих картах также может помочь в построении моделей на картах электронной плотности с низким разрешением13. Края поглощения этих световых элементов наблюдаются на длинах волн между λ = 3 и 6 Å (см. Рисунок 1, вверху). Этот диапазон длин волн был далеко за пределами возможностей любой синхротронной линии луча MX, и эффективная работа в этом диапазоне требует преодоления нескольких технических проблем, как описано ниже.
Beamline I23 в Diamond Light Source, Великобритания, является уникальным инструментом, специально разработанным для облегчения длинноволновых экспериментов MX, настраиваемым в диапазоне длин волн между λ = 1,13 и 5,9 Å (диапазон энергий между E = 2,1 и 11 кэВ). При работе в условиях высокого вакуума14 исключается поглощение и рассеяние воздуха, что повышает эффективность дифракционных экспериментов и отношение сигнал/шум. Большая вакуумная конечная станция включает в себя все компоненты среды отбора проб, включая полуцилиндрический детектор Pilatus 12M, многоосевой гониометр, системы онлайн-просмотра и коллимации, а также специальное оборудование для передачи и хранения образцов (рисунок 2). Каждая единица оборудования была оптимизирована для обеспечения сбора высококачественных длинноволновых данных. Изогнутый детектор Pilatus 12M может собирать углы дифракции 2θ = ±100°, что приводит к получению дифракционных данных достаточно высокого разрешения даже на самых длинных длинах волн (рисунок 1, внизу). 120 детекторных модулей были специально отобраны для совместимости с низким энергопотреблением, и были предоставлены калибровки для дополнительного режима сверхвысокого коэффициента усиления.
Минимально возможный порог детектора составляет 1,8 кэВ, что приводит к увеличению угловых и краевых эффектов для энергий ниже 3,6 кэВ и ухудшению качества данных на самых длинных длинах волн, особенно для кристаллов с низкой мозаичностью. Этот эффект в сочетании со снижением квантовой эффективности детектора15 необходимо учитывать при планировании эксперимента. Многоосевой гониометр позволяет переориентировать кристаллы, чтобы обеспечить стратегии сбора данных, которые максимизируют качество и силу аномального сигнала, а также полноту собранных аномальных данных. Поглощение образца является ограничивающим фактором для экспериментов, особенно на самых длинных волнах. Коррекции поглощения, реализованные в широко используемых пакетах программного обеспечения для обработки MX16,17, хорошо работают на длинах волн около 3 Å. Более длинные волны потребуют аналитической коррекции поглощения на основе томографических реконструкций18 или лазерной абляции для удаления недифракционного материала и разрезания кристаллов на четко определенные формы19. Последнее также поможет уменьшить размер более крупных кристаллов, поскольку эксперименты по дифракции рентгеновских лучей на более длинных волнах более эффективны для меньших кристаллов14. Проблема удержания образцов при криогенных температурах во время сбора данных решается путем проводящего охлаждения, поскольку использование устройств с открытым потоком холодного газа несовместимо с вакуумной средой. Следовательно, теплопроводящие материалы, такие как медь, необходимы для подключения образца к криоохлеру с импульсной трубкой. Стандартные штифты SPINE из нержавеющей стали, используемые в MX, а также любые другие коммерчески доступные крепления для образцов, не подходят для вакуумных длинноволновых MX из-за их плохой теплопроводности.
Держатели образцов (SHs) для вакуумного MX должны быть неотъемлемой частью теплового пути отвода тепла (рисунок 3A). Таким образом, они состоят из теплопроводящего медного корпуса и штифта и включают в себя две важные особенности: сильное магнитное основание для обеспечения адекватной тепловой связи с головкой холодного гониометра и крепление для образца, изготовленное из полиимида, для минимизации поглощения и рассеяния рентгеновского излучения20. Были предприняты усилия для обеспечения того, чтобы пользовательский опыт сбора кристаллов и мгновенного охлаждения был почти идентичен тому, который связан со стандартными методами MX. Поскольку выделенные SH I23 напрямую не совместимы с другими линиями синхротронного излучения, адаптер из нержавеющей стали используется для совместимости с магнитными палочками для сбора кристаллов и существующими интерфейсами гониометра на других линиях луча MX (рисунок 3B). Адаптер также важен для использования средств автоматизации на других линиях луча Diamond MX, которые основаны на головках захвата роботов типа ALS21 и базовых компоновках в стиле unipuck22, если вариация образца требует быстрого предварительного скрининга для выбора лучших дифракционных кристаллов. Протокол подготовки и загрузки образцов можно разбить на два этапа:
Этап 1: Сбор кристаллов и мгновенная заморозка, выполняемая пользователями в их собственных лабораториях
После оценки пригодности проекта для сбора данных I23 держатели образцов с петлями, соответствующими размерам кристаллов (предварительно собранные с адаптерами), отправляются в пользовательские лаборатории для сбора кристаллов. Чтобы предотвратить любые повреждения, SH и адаптеры не должны быть разделены и должны использоваться как одно целое для целей ловли кристаллов с петлями соответствующего размера с использованием стандартных магнитных палочек для сбора кристаллов. Как это принято в MX, эта задача выполняется вручную под микроскопом, и кристаллы сразу же мгновенно охлаждаются в пене дьюара с жидким азотом23. Из-за несоответствия магнитных сил SHs в настоящее время не совместимы с unipucks. Хранение и отгрузка осуществляются с использованием комбипуков (см. Таблицу материалов), которые доступны пользователям по запросу, вместе с совместимыми сухими вставками грузоотправителя (рисунок 3C). Эти шайбы имеют одну и ту же базовую пластину с широко используемыми унипуками и позволяют быстро проводить предварительный скрининг образцов на других линиях луча Diamond MX. Предоставление этого оборудования пользователям в настоящее время является лучшим соглашением, пока изготовленные на заказ держатели образцов не будут коммерчески доступны. Транспортировка на линию луча требует стандартных сухих грузоотправителей, используемых в сообществе MX.
Этап 2: Передача криоохлаждаемых образцов на вакуумную конечную станцию
Как только образцы поступают на линию пучка, они готовятся к передаче на вакуумную конечную станцию. Это включает в себя удаление SHs из комбипуков и отделение от адаптеров. Введение биологических образцов в вакуум обычно выполняется в области криоэлектронной микроскопии. Некоторые из устоявшихся концепций были адаптированы для переноса образца I23. Короче говоря, SHs переносятся под жидким азотом на блоки переноса (рисунок 3D). Эти блоки обладают отличной теплопроводностью и значительной тепловой массой, не позволяя кристаллам достигать температуры стеклования в вакууме. До четырех блоков, вместимостью четыре образца каждый, загружаются под жидкий азот в блок шайбу (рисунок 3H), которая используется либо для передачи образцов в Криогенную систему переноса (CTS), либо для хранения в жидких азотных дьюарах между экспериментами.
Криогенная система переноса, разработанная в Diamond Light Source, состоит из двух подсборок: Пробоотборочной станции и Шаттла (рисунок 4А). Пробоотборная станция состоит из ванны с жидким азотом для временного хранения кристаллов белка и имеет специфические особенности для обеспечения безопасности и обеспечения удобного для пользователя опыта (рисунок 5). CTS управляется программируемым логическим контроллером через удобный интерфейс сенсорного экрана. Станция отбора проб имеет встроенные светодиоды для лучшей визуализации и набор нагревателей, управляемых в замкнутом контуре, для автоматизации сушки ванны с жидким азотом после передачи образцов. Он также имеет различные датчики для обеспечения безопасности и эффективного функционирования системы. Пробоотборная станция имеет специальное оборудование для обеспечения надежного электрического интерфейса для взаимодействия с шаттлом для таких операций, как перекачка в грубый вакуум для передачи проб, а также мониторинг уровня жидкого азота и температуры внутри шаттла.
Шаттл (рисунок 6) представляет собой портативное устройство, используемое для сбора блока переноса из ванны с жидким азотом станции отбора проб и передачи его внутри криогенной и вакуумной среды на конечную станцию. Он включает в себя жидкий азот дьюар для поддержания проб холодными во время переноса, мониторинг уровня жидкости в дьюаре и различные датчики для работы и безопасности пользователя. Передаточный рычаг оснащен магнитным приводом и включает в себя обработанные канавки для безопасной загрузки и разгрузки передаточных блоков на конечную станцию. Переход от шаттла к вакуумному сосуду осуществляется через воздушный шлюз. Воздушный шлюз представляет собой интерфейс для шаттла на конечной станции, используемый для эвакуации межпространственного пространства между шаттлом и конечной станцией перед открытием вакуумных клапанов шаттла и конечной станции. Последовательности прокачки и вентиляции полностью автоматизированы и могут управляться через большой сенсорный экран с удобным интерфейсом (рисунок 4C). Текущий протокол используется для передачи кристалла тауматина на вакуумную конечную станцию для сбора данных.
Protocol
1. Сбор кристаллов
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты: очки и перчатки, где это возможно.
- После того, как SHs прибудут в пользовательскую лабораторию в комбипуках (рисунок 3C), отделите крышку от основания комбипука таким образом, чтобы SHs оставались прикрепленными к основанию, а флаконы сохранялись в крышке.
- Погрузите крышку флаконами в жидкий азот. Прикрепите адаптер SH + (рисунок 3B, справа) к магнитной палочке и собирайте кристаллы, как обычно.
- Мгновенно охлаждайте каждый образец непосредственно в комбинезон, отмечая положение образца. Чтобы закрыть шайбу, используйте палочку для шайбы, чтобы прикрепить основание к крышке.
- Перенесите комбипук из жидкого азота в сухой грузоотправитель или хранилище жидкого азота dewar. Отправьте сухого грузоотправителя в Diamond (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Common/Common-Manual/Shipping-Samples.html).
2. Перенос образца в вакуум
- Загрузка SH из комбинезона в передаточный блок
- Поместите основание шайбы блока (рисунок 3H), уже заполненное пустыми передаточными блоками (рисунок 3D), на его опорное основание внутри жидкого азота в пенопластовом контейнере (рисунок 3J-b).
ПРИМЕЧАНИЕ: Ориентация блоков переноса важна для точности переноса образца внутри вакуумного сосуда. Таким образом, блоки должны быть размещены на основании шайбы блока, убедившись, что булавка, отмеченная стрелкой на рисунке 3D , находится слева от блока. - Поместите флакон в контейнер для пены, заполненный жидким азотом, убедившись, что основание шайбы закреплено на магнитном держателе внутри пенопластового контейнера (рисунок 3J-a).
- Предварительно охладите все необходимые инструменты жидким азотом. Используйте инструмент сепаратора шайбы, показанный на рисунке 3G на высокой настройке H , чтобы отделить крышку от основания, так что основание остается прикрепленным к магнитному держателю, а SHs подвергаются воздействию внутри жидкого азота.
- Чтобы удалить каждый SH из его адаптера, используйте палочку-разделитель (рисунок 3F), чтобы поднять SH из основания гребня и поместить в соответствующее положение передаточного блока в горизонтальном положении карусели на рисунке 3J-b.
- Поместите палочку сепаратора над адаптером SH + как можно дальше вниз, убедившись, что палочка вертикальна, чтобы избежать прикосновения к образцу.
- Переместите небольшой рычаг на палочке сепаратора вниз большим пальцем, пока он не щелкнет, чтобы закрепить SH внутри и вытащить SH из адаптера.
- Опустите сепаратор в нужное положение блока, убедившись, что один из трех зубцов помещается внутри центрального отверстия блока.
- Отпустите SH, переместив рычаг обратно вверх. Повторите эти шаги для каждого SH.
- Чтобы загрузить образцы в следующий блок образцов, используйте инструмент ключа кольцевой галереи (рисунок 3E), чтобы повернуть пустой блок в горизонтальное положение.
- Прикрепите инструмент для разделения шайбы, показанный на рисунке 3G , используя низкую настройку L к крышке шайбы блока, прикрутив по часовой стрелке.
- После того, как все SH будут переданы, чтобы закрыть шайбу блока, поместите крышку в жидкий азот и подождите, пока температура уравновесится, затем установите крышку над основанием, как показано на рисунке 3I. С прикрепленным сепараторным инструментом осторожно поднимите, чтобы освободиться от карусели.
- На этом этапе блок-шайба может быть перенесена в ЦТС (рисунок 4В) или в хранилище жидкого азота Дьюара.
- Поместите основание шайбы блока (рисунок 3H), уже заполненное пустыми передаточными блоками (рисунок 3D), на его опорное основание внутри жидкого азота в пенопластовом контейнере (рисунок 3J-b).
- Загрузка передаточных блоков в вакуумный сосуд
- Убедитесь, что шаттл надежно прикреплен к станции. Откройте газовые азотные и воздушные клапаны и убедитесь, что газы текут. Включите CTS.
- Если на дисплее не видно предупреждающих сообщений, продолжайте охлаждать ванну и шаттл жидким азотом. Поместите прилагаемую воронку в заправочное отверстие на шаттле и медленно налейте жидкий азот в воронку, контролируя уровень на экране. Остановитесь, когда индикатор превратится с красного на синий.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаттл готов к использованию, когда температура холодного сиденья, отображаемого на сенсорном экране, ниже 100 К. Ванна Sample Station может быть заполнена одновременно с помощью правильной воронки до уровня, отмеченного на стенке ванны или 100% на дисплее уровня жидкого азота. Датчики уровня жидкого азота и температуры должны постоянно контролироваться на протяжении всей работы; потребуется несколько пополнений. - Как только температура холодного сиденья шаттла станет ниже 100 К и уровень жидкого азота на шаттле и ванне стабилизируется, перенесите блочную шайбу из жидкого азота в ванну CTS с помощью прилагаемого инструмента для разделения шайбы. Снимите крышку блок-шайбы, и закройте крышку ванны CTS.
- Чтобы ввести блок в шаттл, откройте клапан CTS, если он еще не открыт, нажав кнопку «Открыть клапан шаттла» на дисплее. Разблокируйте ручку шаттла, повернув на 90° по часовой стрелке, и переместите ее к ванне, чтобы направляющаяся дорожка на ручке обеспечивала правильный путь движения к ванне. Как только крышка блока будет видна внутри ванны, дайте крышке остыть. После того, как пузырьки жидкого азота вокруг крышки прекратились, переходите к передаточному блоку.
- Чтобы зафиксировать передаточный блок на шаттле, поверните ручку на 180° по часовой стрелке.
- Втяните ручку в исходное заднее положение, а затем «заблокируйте» ее на месте, повернув на 90° против часовой стрелки.
- Нажмите Close Shuttle Valve & Pump на экране дисплея, чтобы начать эвакуацию шаттла.
- Как только сообщение Shuttle ready to detach отобразится на сенсорном экране, нажмите на рычаг под шаттлом и осторожно поднимите его, используя ручку наверху.
- Отнесите шаттл к шлюзу на вакуумной конечной станции в вертикальном положении.
- Прикрепите шаттл к шлюзу на вакуумной конечной станции.
ПРИМЕЧАНИЕ: После надежного крепления сенсорный экран на конечной станции подтвердит состояние шаттла и блокировки. - Выберите положение пустого блока внутри судна, нажав соответствующую кнопку на сенсорном экране и переместив образец отеля в правильное положение загрузки.
- Как только образец отеля будет в положении, кнопка Открыть станет активной. Нажмите эту кнопку, чтобы инициировать последовательность вакуумной блокировки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Насос запустится, и прогресс будет отображаться на мониторе. Это может занять до двух минут. - После завершения последовательности состояние изменится на Airlock open, передача выполняется. Поверните рукоятку на 90° по часовой стрелке, чтобы разблокировать стержень, и осторожно протолкните стержень в сосуд, чтобы направляющаяся дорожка снова обеспечивала правильный путь движения к выборочному положению отеля. Используя видеопоток, отображаемый на экране для наведения, медленно вставьте блок в отель, убедившись, что индикатор положения блока на сенсорном дисплее активирован. После активации поверните ручку на 180° против часовой стрелки, чтобы освободить блок, и вытащите стержень из сосуда. После полного втягивания поверните ручку на 90° против часовой стрелки, чтобы зафиксировать стержень.
- Как только стержень будет заблокирован, кнопка Закрыть станет активной. Нажмите на него, чтобы закрыть вакуумный клапан конечной станции, и выведите пространство между шаттлом и сосудом под атмосферное давление, ожидая завершения до 20 с.
- Подождите, пока дисплей покажет состояние «нормально», чтобы удалить шаттл после завершения последовательности. На этом этапе снимите шаттл и вернитесь в CTS, чтобы повторить процесс для следующего блока.
- Чтобы подготовить следующий блок к передаче, поверните шайбу блока внутрь ванны. Нажмите встроенный ключ вращения на верхней части акриловой крышки вниз в замок в центре блок-шайбы. Удерживая его, поверните ключ , чтобы расположить нужный блок в положении подборщика.
- После того, как все блоки будут перенесены, убедитесь, что челночный клапан открыт, пока он установлен на CTS. Нажмите кнопку выпечки на сенсорном экране и выберите ванну и шаттл, затем нажмите «Выпекать».
ПРИМЕЧАНИЕ: Это нагревает как шаттл, так и ванну, чтобы выкипятить жидкий азот и впоследствии испарить любой накопленный лед / конденсацию перед следующим использованием. Как только выпечка начнется, газ и воздух могут быть отключены.
Representative Results
Кристалл тауматина был введен на вакуумную конечную станцию с использованием протокола, описанного выше. Дифракционные данные собирались на длине волны 2,7552 Å (E = 4500 эВ) в виде 3600 изображений с шагом поворота 0,1° и экспозицией 0,1 с на изображение. Размер пучка был скорректирован до 150 мкм х 150 мкм и уменьшен до 10% пропускания с соответствующим измерением потока 7,1 х 109 фотонов/ с. Выбор λ = 2,7552 Å основан на компромиссе между увеличением аномальных эффектов поглощения сигнала и образца и уменьшением разрешения до более длинных волн. Хотя это и не близко к теоретическому краю поглощения серы (λ= 5,0095 Å), на этой длине волны воображаемый вклад в коэффициент рассеяния серы f" составляет 1,57 e- , что в 1,6-2,1 раза больше по сравнению с длинами волн между 1,7 и 2 Å. Полученные в результате более сильные аномальные сигналы позволяют успешно проводить фазирование S-SAD для более сложных проектов.
На линии пучка I2324,25,26,27 уже были проведены различные сложные поэтапные эксперименты с данными, собранными на этой длине волны. Хотя фазирование S-SAD возможно с использованием гораздо более коротких длин волн, это часто требует создания аномального сигнала путем слияния данных из многих изоморфных кристаллов для достижения значений кратности в течение 10028 года. Из-за усиленного аномального сигнала на более длинных волнах большинство поэтапных проектов, решаемых на I23, требовали данных только от одного кристалла. Репрезентативное дифракционное изображение показано на рисунке 7 слева. Обработка данных с использованием Xia2-3dii29 дала отличные статистические данные о слиянии, как показано в таблице 1. На рисунке 7 справа показана часть репрезентативного дифракционного изображения из набора данных тауматина и проиллюстрирован низкий фон, окружающий отражения Брэгга, что способствует большим значениям I/σ(I), обычно наблюдаемым в вакуумной установке, гарантируя, что только рентгеновские лучи, рассеянные образцом, достигают детектора.
Максимально достижимое разрешение 1,8 Å обусловлено геометрией детектора и выбранной длиной волны рентгеновского излучения. Набор данных дал очень сильный аномальный сигнал, отраженный в среднем наклоне аномального нормального параметра вероятности 2,677, что облегчило структурное решение автоматическим фазовым трубопроводом CRANK2. Высокое качество полученной карты электронной плотности позволило успешно построить автоматическую модель модулем Buccaneer30 в CRANK231 с правильным размещением 100% аминокислотной последовательности тауматина. Фазированная аномальная разностная карта Фурье, рассчитанная с помощью ANODE11, показывает 16 очень хорошо упорядоченных атомов серы и один атом серы из Cys159 с двумя альтернативными конформациями, что подтверждается 18 значительными высотами пиков в положениях аномальных рассеивателей в таблице 2. 16 остатков цистеина в тауматине образуют 8 дисульфидных мостиков, которые хорошо видны на карте 2Fo-Fc (рисунок 8).
Рисунок 1: Дифракционные данные высокого разрешения из длинноволновых экспериментов MX. (A) График значений f" по отношению к энергии, показывающий края поглощения световых элементов, доступных на линии луча I23. (B) Максимальное разрешение, достижимое в углах детектора P12M против энергии. Аббревиатура: MX = макромолекулярная кристаллография. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Горизонтальное сечение через вакуумный сосуд со всеми компонентами конечной станции. Аббревиатура: OAV = система просмотра по оси. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Инструменты для обработки образцов. (A) I23 Держатель образца. (B) Стандартный штифт MX (слева) рядом с держателем образца I23 с адаптером (справа). (C) Крышка и основание Combipuck с держателями образцов I23 (синий). Блок крышки шайбы и основания с двумя передаточными блоками (золото). Сзади видна сухая трость грузоотправителя, совместимая как с гребнями, так и с блок-шайбами. (D) Передаточный блок с четырьмя держателями образцов I23. (E) Ключевой инструмент, используемый для вращения основы блок-шайбы. F) Палочка-сепаратор. (G) Инструмент для разделения шайб с двумя стрелками, показывающими высокие и низкие настройки. (H) Блок шайбы базы с четырьмя пустыми кубиками Cu. (I) Крышка для блок-шайбы. J) Пенопластовый контейнер со всеми необходимыми инструментами для переноса держателей образцов с оснований комбинезонов на медные блоки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Криогенная система переноса. (A) Пробоотборная станция CTS с прикрепленным челноком и воронками, используемыми для наполнения. (B) Блок шайбы с двумя передающими блоками, расположенными внутри CTS. (C) Сенсорный экран программного обеспечения управления CTS. Аббревиатура: CTS = Криогенная система переноса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Станция отбора проб криогенной системы переноса. Сокращения: светодиоды = светодиоды; LN2 = жидкий азот. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Криогенная система передачи шаттлов. Сокращения: светодиоды = светодиоды; LN2 = жидкий азот. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Дифракционные изображения. Слева дифракционное изображение из набора данных, собранных на кристалле тауматина. Справа, дифракционное пятно, окруженное фоновыми пикселями с низким количеством. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Структурное решение Thaumatin с автоматическим трубопроводом CRANK2 (настройки по умолчанию, без последующей доработки). (A) Обзор тауматина с картой 2Fo-Fc при 1,6σ (синий) и фазированной аномальной разностной картой Фурье при 5σ, рассчитанной в ANODE (зеленый). (B) Обзор тауматина, показывающий только фазированную аномальную карту разности Фурье при 5σ. (C) Крупный план дисульфидного моста, присутствующего в тауматине, с картой 2Fo-Fc при 1,6σ (синий) и фазированной аномальной разностной картой Фурье при 5σ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Имя | Тауматин |
| Длина волны сбора данных (Å) (энергия (эВ)) | 2.7552 (4500) |
| Количество изображений x размер клина (°) | 3600 х 0,1 |
| Спейсгрупп | П 41212 |
| Константы ячейки единицы измерения | |
| (a = b, c) (Е) | 57.8, 150.2 |
| (α = β = γ) (°) | 90 |
| Разрешение (Å) | 150.22–1.80 (1.84–1.80) |
| Полнота | 96.3 (81.1) |
| ISa | 36.48 |
| Рмеас | 0.042 (0.118) |
| РПИМ | 0.01 (0.049) |
| СС1/2 | 1 (0.989) |
| I/σ(I) | 57.9 (14.7) |
| Многочисленность | 15.0 (5.4) |
| Средний склон | 2.677 |
Таблица 1: Статистика сбора и обработки данных по тауматину на длине волны 2,755 Å на линии луча I23, DLS. Для разрешения, полноты, Rmerge, Rmeas, Rpim, CC1/2, I/σ(I) и множественности оболочки высокого разрешения показаны в скобках. Аббревиатура: DLS = алмазный источник света.
| Ближайший атом | Пиковая высота (сигма) |
| CYS9 | 25.83 |
| CYS56 | 25.03 |
| МЕТ112 | 24.54 |
| ЦИС149 | 24.37 |
| CYS126 | 24.21 |
| CYS145 | 24.2 |
| CYS134 | 23.6 |
| ЦЮС177 | 23.48 |
| CYS204 | 23.43 |
| CYS66 | 23.17 |
| СИС164 | 22.54 |
| CYS193 | 22.15 |
| CYS158 | 21.51 |
| CYS77 | 21.21 |
| CYS121 | 20.8 |
| СИС71 | 19.17 |
| CYS159_1 | 12.27 |
| CYS159_2 | 8.34 |
Таблица 2: Аномальная разность фурье карта пиковых высот, рассчитанная ANODE с использованием поэтапной и автоматически построенной модели из CRANK2.
Discussion
Текущий протокол был разработан для соответствия требованиям к пробоподготовке для экспериментов в вакууме с длинными волнами MX на лучевой линии I23. Он использовался на линии луча в течение прошлого года и способствовал успешному завершению нескольких проектов. Как показывают представленные здесь результаты, протокол обеспечивает безопасную и надежную передачу образцов на вакуумную конечную станцию при сохранении их дифракционного качества. Это важный аспект для работы линии луча и будет сопровождаться личным обучением пользователей персоналом beamline. Некоторые из этих шагов заслуживают особого внимания как критически важные для успешного и безопасного завершения процедуры: перенос образцов из оснований комбипука в блоки образцов требует точности и внимания, с тем чтобы избежать повреждения образцов (см. этап 2.1.4); мониторинг уровня жидкого азота на всех этапах имеет важное значение для предотвращения воздействия проб на воздух или тесного контакта с частями, которые не охлаждаются должным образом (2.1.3 и 2.2.2); ожидание полного завершения последовательности Close (2.2.14), прежде чем снимать шаттл с конечной станции (2.2.15), чтобы избежать деградации вакуума конечной станции.
Концепция протокола была инициирована вместе с инженерными усилиями, направленными на разработку специализированного оборудования для переноса кристаллов белка в вакуумную среду. Конечными продуктами этого проекта были CTS и связанные с ней инструменты обработки образцов, описанные выше. CTS является значительным улучшением по сравнению со своим предшественником, Leica EM VCT10014, и устраняет многочисленные ограничения, такие как отсутствие экранирования образцов и вакуумной среды во время передачи, накопление льда внутри ванны с жидким азотом, а также отсутствие интуитивно понятного пользовательского интерфейса и функций безопасности. Дополнительными функциями CTS, которые улучшают пользовательский опыт, являются мониторинг температуры и уровня жидкого азота внутри шаттла и станции отбора проб, ванна большей емкости, вмещающая четыре блока одновременно, а не один, и самоуправляемый механизм для работы шаттла. CTS полностью интегрирован в систему управления линией луча с удобным интерфейсом сенсорного экрана и повышенной вакуумной и механической безопасностью при взаимодействии с конечной станцией.
Beamline I23 является первым длинноволновым синхротронным прибором MX в своем роде и, как таковой, введение кристаллов белка в высоковакуумную среду и хранение их при криогенных температурах потребовало значительных усилий. Продолжается совершенствование средств и протокола подготовки образцов, а также усилия по рационализации процессов. В рамках поддержки пользователей сотрудники Beamline всегда готовы помочь в устранении неполадок. Примером одного из таких сценариев могут быть проблемы, которые ставят под угрозу целостность вакуумной системы, что приводит к трудностям при подключении или снятии шаттла с / из воздушного шлюза CTS или конечной станции. Различные уровни тестов проводятся еженедельно и ежедневно, и обучение пользователей будет охватывать дополнительные проверки, чтобы избежать потенциальных сбоев, таких как визуальный осмотр O-колец на интерфейсах, к которым прикрепляется шаттл. В то время как вакуумная среда открывает возможность для проведения дифракционных экспериментов в диапазоне длин волн, недоступном на других линиях луча, дополнительный этап передачи снижает общую пропускную способность образца.
Ручная передача только с четырьмя образцами на блок переноса и до пяти блоков внутри вакуумного сосуда ограничивает общую емкость до 20 образцов. Следовательно, для проектов с большой выборкой для вариативности выборки образцы должны быть предварительно просеяны на алмазных высокопроизводительных лучевых линиях, а затем только наиболее перспективные образцы должны быть переданы для последующего оптимизированного длинноволнового эксперимента. В то время как держатели образцов и блоки передачи не изменились с момента их первоначального введения несколько лет назад, инструменты обработки, представленные здесь, являются новыми разработками. Специальные держатели образцов I23 неизменяемы из-за их роли в концепции охлаждения линии луча. Таким образом, конструкция инструментов для обработки образцов была направлена на создание связи между этим новым типом держателя и стандартными коммерчески доступными инструментами, которые сообщество пользователей MX использовало в течение длительного времени, такими как комбипуки, палочки для сбора кристаллов и система транспортировки сухих грузоотправителей. Их разработка включала в себя значительные консультации с сообществом пользователей и требовала нескольких итераций для завершения. Оборудование, инструменты и протокол, представленные здесь, представляют собой простую и надежную систему для передачи пользовательских образцов для экспериментов на линии луча I23 в Diamond Light Source. Этот прибор для вакуумной длинноволновой макромолекулярной кристаллографии открывает новые возможности для структурной биологии.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Адама Тейлора, Адама Прескотта, Кена Джонса, Арвиндера Палаху и Кевина Уилкинсона за их поддержку в разработке криогенной системы переноса образцов (CTS). Эта работа финансировалась компанией iNEXT-Discovery (Grant 871037), финансируемой программой Horizon 2020 Европейской комиссии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12M detector | Dectris, Switzerland | single-photon-counting X-ray detector | |
| CombiPuck | MiTeGen | SKU: M-CBP-P1 | Cryopucks used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples |
| Crystal-harvesting magnetic wand | Molecular Dimensions | MD7-411 | Used for harvesting crystal |
| Dry Shipper (CX100) | Molecular Dimensions | MD7-21 | Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples |
| Dry shipper insert (CombiPuck Transport Cane) | MiTeGen | SKU: M-CBP-PTC1 | Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples |
| Kapton polyimide | sample mount made of Kapton polyimide | ||
| Perpsex lid | acrylic lid with built-in rotation key | ||
| Thaumatin powder | Sigma-Aldrich | T7638 | Used for production of thaumatin crystals by vapour diffusion |
References
- Green, D. W., Ingram, V. M., Perutz, M. F. The structure of haemoglobin - IV. Sign determination by the isomorphous replacement method. Proceedings of the Royal Society of London. Series A. Mathematical and Physical Sciences. 225 (1162), 287 (1954).
- Hendrickson, W. A. Anomalous diffraction in crystallographic phase evaluation. Quarterly Reviews of Biophysics. 47 (1), 49-93 (2014).
- Pike, A. C., Garman, E. F., Krojer, T., von Delft, F., Carpenter, E. P. An overview of heavy-atom derivatization of protein crystals. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (3), 303-318 (2016).
- Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): A vehicle for direct determination of three-dimensional structure. The EMBO Journal. 9 (5), 1665-1672 (1990).
- Liu, Q., Hendrickson, W. A. Contemporary use of anomalous diffraction in biomolecular structure analysis. Protein Crystallography. Methods in Molecular Biology. Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. 1607, Humana Press. New York, NY. 377-399 (2017).
- Rose, J. P., Wang, B. C., Weiss, M. S.
- Rozov, A. Importance of potassium ions for ribosome structure and function revealed by long-wavelength X-ray diffraction. Nature Communications. 10 (1), 2519 (2019).
- Rocchio, S., et al. Identifying dynamic, partially occupied residues using anomalous scattering. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75 (12), 1084-1095 (2019).
- Langan, P. S., et al. Anomalous X-ray diffraction studies of ion transport in K+ channels. Nature Communications. 9 (1), 4540 (2018).
- Lolicato, M., et al. K2p channel C-type gating involves asymmetric selectivity filter order-disorder transitions. Science Advances. 6 (44), (2020).
- Thorn, A., Sheldrick, G. M. ANODE: anomalous and heavy-atom density calculation. Journal of Applied Crystallography. 44 (6), 1285-1287 (2011).
- Handing, K. B., Niedzialkowska, E., Shabalin, I. G., Kuhn, M. L., Zheng, H., Minor, W. Characterizing metal-binding sites in proteins with X-ray crystallography. Nature Protocols. 13 (5), 1062-1090 (2018).
- Jungnickel, K. E. J., Parker, J. L., Newstead, S. Structural basis for amino acid transport by the CAT family of SLC7 transporters. Nature Communications. 9 (1), 550 (2018).
- Wagner, A., Duman, R., Henderson, K., Mykhaylyk, V.
- Wernecke, J., Gollwitzer, C., Müller, P., Krumrey, M. Characterization of an in-vacuum PILATUS 1M detector. Journal of Synchrotron Radiation. 21 (3), 529-536 (2014).
- Kabsch, W.
- Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (2), 85-97 (2018).
- Brockhauser, S., Di Michiel, M., Mcgeehan, J. E., Mccarthy, A. A., Ravelli, R. B. G. X-ray tomographic reconstruction of macromolecular samples. Journal of Applied Crystallography. 41 (6), 1057-1066 (2008).
- Kitano, H., et al. Processing of membrane protein crystal using ultraviolet laser irradiation. Journal of Bioscience and Bioengineering. 100 (1), 50-53 (2005).
- Mykhaylyk, V., Wagner, A. Towards long-wavelength protein crystallography: Keeping a protein crystal frozen in vacuum. Journal of Physics: Conference Series. 425 (1), 012010 (2013).
- Snell, G., et al. Automated sample mounting and alignment system for biological crystallography at a synchrotron source. Structure. 12 (4), 537-545 (2004).
- The universal container project. , Available from: https://smb.slac.stanford.edu/robosync/Universal_Puck/ (2020).
- Teng, T. Y., et al. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a freestanding thin-film. Journal of Applied Crystallography. 23, 387-391 (1990).
- Esposito, D., et al. Structural basis for the glycosyltransferase activity of the salmonella effector SseK3. Journal of Biological Chemistry. 293 (14), 5064-5078 (2018).
- O'Donnell, J. P., et al. The architecture of EMC reveals a path for membrane protein insertion. eLife. 9, 57887 (2020).
- Mishra, A. K., et al. Structure and characterization of crimean-congo hemorrhagic fever virus GP38. Journal of Virology. 94 (8), 02005-02019 (2020).
- Rudolf, A. F., et al. The morphogen sonic hedgehog inhibits its receptor patched by a pincer grasp mechanism. Nature Chemical Biology. 15 (10), 975-982 (2019).
- El Omari, K., et al. Pushing the limits of sulfur sad phasing: De novo structure solution of the n-terminal domain of the ectodomain of hcv e1. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 70 (8), 2197-2203 (2014).
- Winter, G. XIA2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).
- Cowtan, K. The Buccaneer software for automated model building. 1. Tracing protein chains. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 62 (9), 1002-1011 (2006).
- Skubak, P., Pannu, N. S. Automatic protein structure solution from weak X-ray data. Nature Communications. 4 (1), 2777 (2013).
