Summary
यहां, हम क्रायोजेनिक नमूना तैयारी और डायमंड लाइट सोर्स पर बीमलाइन I23 पर वैक्यूम एंडस्टेशन में क्रिस्टल के हस्तांतरण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, लंबे तरंग दैर्ध्य मैक्रोमोलेक्यूलर एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी प्रयोगों के लिए।
Abstract
लंबी तरंग दैर्ध्य मैक्रोमोलेक्यूलर क्रिस्टलोग्राफी (एमएक्स) तत्वों के असंगत प्रकीर्णन गुणों का शोषण करता है, जैसे कि सल्फर, फास्फोरस, पोटेशियम, क्लोरीन, या कैल्शियम, जो अक्सर मैक्रोमोलेक्यूल्स में मूल रूप से मौजूद होते हैं। यह अतिरिक्त लेबलिंग की आवश्यकता के बिना प्रयोगात्मक चरणबद्धता के माध्यम से प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड की प्रत्यक्ष संरचना समाधान को सक्षम बनाता है। इस तरंग दैर्ध्य शासन में एक्स-रे के महत्वपूर्ण वायु अवशोषण को खत्म करने के लिए, ये प्रयोग एक वैक्यूम वातावरण में किए जाते हैं। डायमंड लाइट सोर्स, यूके में बीमलाइन I23, अपनी तरह का पहला सिंक्रोट्रॉन उपकरण है, जिसे 5 Å की ओर लंबी तरंग दैर्ध्य सीमा में MX प्रयोगों के लिए डिज़ाइन और अनुकूलित किया गया है।
इसे संभव बनाने के लिए, एक बड़ा वैक्यूम पोत नमूना वातावरण के सभी एंडस्टेशन घटकों को घेरता है। वैक्यूम में भंडारण और डेटा संग्रह के दौरान क्रायोजेनिक तापमान पर नमूनों को बनाए रखने की आवश्यकता के लिए थर्मल रूप से प्रवाहकीय नमूना धारकों के उपयोग की आवश्यकता होती है। यह लगभग 50 K के लिए नमूना शीतलन सुनिश्चित करने के लिए कुशल गर्मी हटाने की सुविधा प्रदान करता है। वर्तमान प्रोटोकॉल नमूना तैयारी और बीमलाइन I23 पर वैक्यूम में नमूनों के हस्तांतरण के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रियाओं का वर्णन करता है। मैक्रोमोलेक्यूलर क्रिस्टलोग्राफी समुदाय के भीतर पहले से ही स्थापित प्रथाओं और तरीकों में एकरूपता सुनिश्चित करना, तरल नाइट्रोजन तापमान के लिए नमूना शीतलन मानक एमएक्स उपकरणों से सुसज्जित किसी भी प्रयोगशाला सेटिंग में किया जा सकता है।
क्रायोजेनिक भंडारण और नमूनों के परिवहन के लिए केवल मानक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों की आवश्यकता होती है। वैक्यूम एंडस्टेशन में तरल नाइट्रोजन से क्रायोजेनिक रूप से ठंडा क्रिस्टल के हस्तांतरण के लिए विशेष उपकरण की आवश्यकता होती है। बेस्पोक नमूना हैंडलिंग उपकरण और एक समर्पित क्रायोजेनिक ट्रांसफर सिस्टम (सीटीएस) घर में विकसित किया गया है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके तैयार किए गए नमूनों पर एकत्र किए गए विवर्तन डेटा उत्कृष्ट विलय आंकड़े दिखाते हैं, यह दर्शाता है कि प्रक्रिया के दौरान नमूनों की गुणवत्ता अपरिवर्तित है। यह मानक सिंक्रोट्रॉन बीमलाइनों से परे एक तरंग दैर्ध्य सीमा में इन-वैक्यूम एमएक्स के लिए अद्वितीय अवसर खोलता है।
Introduction
दीर्घ-तरंगदैर्ध्य एक्स-रे विवर्तन का उपयोग मैक्रोमोलेक्यूल्स में मूल रूप से मौजूद विशिष्ट प्रकाश परमाणुओं के असंगत प्रकीर्णन गुणों का दोहन करने के लिए किया जाता है। यह क्रिस्टलोग्राफिक चरण की समस्या को हल करने और मैक्रोमोलेक्यूल्स के भीतर ऐसे तत्वों की पहचान और स्थान की स्पष्ट रूप से पुष्टि करने में मदद करता है। जबकि मैक्रोमोलेक्यूलर क्रिस्टलोग्राफी के शुरुआती दिनों में, डे नोवो संरचनाओं को कई आइसोमोर्फस प्रतिस्थापन 1 द्वारा हल किया गया था, सिंक्रोट्रॉन पर ट्यूनेबल एक्स-रे बीमलाइनों के आगमन के साथ, बहु-तरंग दैर्ध्य और एकल-तरंग दैर्ध्य (एसएडी) पर आधारित प्रयोगात्मक चरणबद्धता विषम विवर्तन तकनीक प्रमुख तरीके बन गए हैं2 . दोनों विधियों ने ऐतिहासिक रूप से भारी धातुओं से आइसोमोर्फस या असंगत संकेत पर भरोसा किया है, जिसे सह-क्रिस्टलीकरण या क्रिस्टल भिगोने 3 द्वारा क्रिस्टल में कृत्रिम रूप से पेश करने की आवश्यकता होती है। परीक्षण-और-त्रुटि दृष्टिकोण और अप्रत्याशित परिणाम इन प्रयोगों को निराशाजनक रूप से समय लेने वाला बना सकते हैं। प्रोटीन अभिव्यक्ति 4 के दौरान सेलेनो-मेथिओनिन का समावेश इन सीमाओं को दूर करने और छोटी तरंग दैर्ध्य पर असंगत विवर्तन का शोषण करने का एक बहुत ही सुरुचिपूर्ण तरीका है, हालांकि यह यूकेरियोटिक प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणालियों में बहुत चुनौतीपूर्ण हो सकता है।
लंबी तरंग दैर्ध्य एमएक्स देशी एसएडी प्रयोगों द्वारा संरचना निर्धारण के लिए बेहद आकर्षक है5,6 आगे के उपचार के बिना एक सफल क्रिस्टलीकरण परीक्षण से सीधे क्रिस्टल का उपयोग करने की सुविधा के कारण। इसके अतिरिक्त, उच्च जैविक महत्व के तत्वों के अवशोषण किनारों तक पहुंच, जैसे कि कैल्शियम, पोटेशियम, क्लोरीन, सल्फर और फास्फोरस, मैक्रोमोलेक्यूल्स 7,8,9,10 में इन तत्वों की स्थिति को सीधे पहचानने का अवसर खोलता है। मध्यम और निम्न रिज़ॉल्यूशन पर, 2Fo-Fc इलेक्ट्रॉन घनत्व और रासायनिक वातावरण के आधार पर तत्व असाइनमेंट मुश्किल हो सकता है, विशेष रूप से इलेक्ट्रॉनों की समान संख्या वाले तत्वों या आंशिक अधिभोग के साथ कमजोर रूप से बाध्य आयनों वाले तत्वों के लिए। इन अस्पष्टताओं को ब्याज के तत्व के अवशोषण किनारे के नीचे और ऊपर डेटा एकत्र करके हल किया जा सकता है और परिणामी मॉडल-चरणबद्ध असंगत अंतर फूरियर मैप्स 11,12 की व्याख्या की जा सकती है। इन मानचित्रों में सल्फर परमाणु पदों का पता लगाना भी कम-रिज़ॉल्यूशन इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र 13 में मॉडल-निर्माण में सहायता कर सकता है। इन प्रकाश तत्वों के अवशोषण किनारों को तरंग दैर्ध्य पर π = 3 और 6 Å के बीच देखा जाता है (चित्र 1, शीर्ष देखें)। यह तरंग दैर्ध्य सीमा किसी भी सिंक्रोट्रॉन एमएक्स बीमलाइन की क्षमताओं से परे है, और इस सीमा में कुशल संचालन के लिए कई तकनीकी चुनौतियों पर काबू पाने की आवश्यकता होती है, जैसा कि नीचे उल्लिखित है।
डायमंड लाइट सोर्स, यूके में बीमलाइन I23, एक अद्वितीय उपकरण है, जिसे विशेष रूप से लंबी तरंग दैर्ध्य एमएक्स प्रयोगों की सुविधा के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो π = 1.13 और 5.9 Å (E = 2.1 और 11 keV के बीच ऊर्जा सीमा) के बीच तरंग दैर्ध्य सीमा में ट्यूनेबल है। एक उच्च वैक्यूम वातावरण 14 में काम करके, वायु अवशोषण और प्रकीर्णन को समाप्त कर दिया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप विवर्तन प्रयोगों की दक्षता और सिग्नल-टू-शोर अनुपात में वृद्धि होती है। एक बड़ा वैक्यूम एंडस्टेशन नमूना वातावरण के सभी घटकों को संलग्न करता है, जिसमें अर्ध-बेलनाकार पिलाटस 12एम डिटेक्टर, एक बहु-अक्ष गोनियोमीटर, ऑन-लाइन देखने और कॉलिमेशन सिस्टम, साथ ही साथ नमूना हस्तांतरण और भंडारण के लिए बेस्पोक उपकरण शामिल हैं (चित्रा 2)। उपकरण के प्रत्येक टुकड़े को यह सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलित किया गया है कि सर्वोत्तम गुणवत्ता वाले लंबे तरंग दैर्ध्य डेटा को एकत्र किया जा सकता है। घुमावदार पिलाटस 12एम डिटेक्टर 20 = ±100 डिग्री के विवर्तन कोणों को इकट्ठा कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप सबसे लंबे तरंग दैर्ध्य (चित्रा 1, नीचे) पर भी पर्याप्त रूप से उच्च-रिज़ॉल्यूशन विवर्तन डेटा होता है। 120 डिटेक्टर मॉड्यूल विशेष रूप से कम ऊर्जा संगतता के लिए चुना गया है और एक अतिरिक्त अल्ट्रा उच्च लाभ मोड के लिए अंशांकन प्रदान किया गया है।
सबसे कम संभव डिटेक्टर थ्रेशोल्ड 1.8 केवी है, जिससे 3.6 केवी से कम ऊर्जा के लिए कोने और किनारे के प्रभाव में वृद्धि होती है और सबसे लंबे समय तक तरंग दैर्ध्य पर समझौता किया जाता है, विशेष रूप से कम मोज़ेक क्रिस्टल के लिए, देखा जा सकता है। डिटेक्टर क्वांटम दक्षता 15 में कमी के साथ संयोजन में इस प्रभाव को एक प्रयोग की योजना बनाते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए। बहु-अक्ष गोनोमीटर डेटा संग्रह रणनीतियों के लिए अनुमति देने के लिए क्रिस्टल के पुनर्विन्यास को सक्षम बनाता है जो विषम संकेत की गुणवत्ता और ताकत को अधिकतम करता है, साथ ही साथ एकत्र किए गए असंगत डेटा की पूर्णता भी। नमूना अवशोषण प्रयोगों के लिए एक सीमित कारक है, विशेष रूप से सबसे लंबे समय तक तरंग दैर्ध्य पर। अवशोषण सुधार, जैसा कि आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले एमएक्स प्रोसेसिंग सॉफ़्टवेयर पैकेज16,17 में लागू किया गया है, 3 Å के आसपास तरंग दैर्ध्य के लिए अच्छी तरह से काम कर रहे हैं। लंबे तरंग दैर्ध्य को गैर-विवर्तित सामग्री को हटाने और क्रिस्टल को अच्छी तरह से परिभाषित आकृतियों में काटने के लिए टोमोग्राफिक पुनर्निर्माण 18 या लेजर एब्लेशन के आधार पर विश्लेषणात्मक अवशोषण सुधारों की आवश्यकता होगी। उत्तरार्द्ध बड़े क्रिस्टल के आकार को कम करने में भी सहायता करेगा क्योंकि लंबे समय तक तरंग दैर्ध्य पर एक्स-रे विवर्तन प्रयोग छोटे क्रिस्टल 14 के लिए अधिक कुशल होते हैं। डेटा संग्रह के दौरान क्रायोजेनिक तापमान पर नमूनों को रखने की चुनौती को प्रवाहकीय शीतलन द्वारा संबोधित किया जाता है, क्योंकि ओपन-फ्लो कोल्ड गैस स्ट्रीम उपकरणों का उपयोग करना वैक्यूम वातावरण के साथ संगत नहीं है। इसलिए, थर्मल रूप से प्रवाहकीय सामग्री, जैसे कि तांबा, नमूने को पल्स ट्यूब क्रायोकूलर से जोड़ने के लिए आवश्यक है। स्टेनलेस स्टील स्पाइन मानक पिन एमएक्स भर में उपयोग किए जाते हैं, साथ ही साथ किसी भी अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नमूना माउंट, उनकी खराब थर्मल चालकता के कारण इन-वैक्यूम लंबी तरंग दैर्ध्य एमएक्स के लिए उपयुक्त नहीं हैं।
इन-वैक्यूम एमएक्स के लिए नमूना धारकों (एसएच) को गर्मी हटाने वाले थर्मल मार्ग (चित्रा 3 ए) का एक अनिवार्य हिस्सा होना चाहिए। इस प्रकार, वे एक थर्मल प्रवाहकीय तांबे के शरीर और पिन से मिलकर बनता है और इसमें दो महत्वपूर्ण विशेषताएं शामिल हैं: ठंडे गोनियोमीटर सिर के लिए पर्याप्त थर्मल लिंक सुनिश्चित करने के लिए एक मजबूत चुंबक आधार, और एक्स-रे अवशोषण और प्रकीर्णन को कम करने के लिए पॉलीमाइड से बना एक नमूना माउंट। यह सुनिश्चित करने के लिए प्रयास किए गए थे कि क्रिस्टल-हार्वेस्टिंग और फ्लैश-कूलिंग का उपयोगकर्ता अनुभव मानक एमएक्स प्रथाओं से जुड़े लगभग समान है। जैसा कि समर्पित I23 SHs अन्य सिंक्रोट्रॉन बीमलाइनों के साथ सीधे संगत नहीं हैं, एक स्टेनलेस स्टील एडेप्टर का उपयोग क्रिस्टल-हार्वेस्टिंग चुंबकीय छड़ी और अन्य एमएक्स बीमलाइनों (चित्रा 3 बी) पर मौजूदा गोनोमीटर इंटरफेस के साथ संगतता के लिए किया जाता है। एडेप्टर अन्य डायमंड एमएक्स बीमलाइनों पर स्वचालन सुविधाओं का उपयोग करने के लिए भी महत्वपूर्ण है, जो एएलएस-प्रकार रोबोट ग्रिपर हेड्स 21 और अनिपक-स्टाइल बेस लेआउट 22 पर आधारित हैं, यदि नमूना भिन्नता को सर्वश्रेष्ठ विवर्तन क्रिस्टल के चयन के लिए तेजी से पूर्व-स्क्रीनिंग की आवश्यकता होती है। नमूना तैयारी और लोडिंग प्रोटोकॉल को दो चरणों में विभाजित किया जा सकता है:
चरण 1: अपनी स्वयं की प्रयोगशालाओं में उपयोगकर्ताओं द्वारा किए गए क्रिस्टल और फ्लैश-फ्रीजिंग की कटाई
I23 डेटा संग्रह के लिए परियोजना उपयुक्तता के मूल्यांकन के बाद, क्रिस्टल आकार (एडाप्टर के साथ पूर्व-इकट्ठा) से मेल खाने वाले छोरों के साथ नमूना धारकों को क्रिस्टल कटाई के लिए उपयोगकर्ता प्रयोगशालाओं को भेजा जाता है। किसी भी क्षति को रोकने के लिए, एसएच और एडाप्टर को अलग नहीं किया जाना चाहिए और मानक क्रिस्टल-कटाई चुंबकीय छड़ी का उपयोग करके उचित आकार के छोरों के साथ मछली पकड़ने के क्रिस्टल के उद्देश्य से एक इकाई के रूप में उपयोग किया जाना चाहिए। जैसा कि एमएक्स में आम है, यह कार्य माइक्रोस्कोप के तहत मैन्युअल रूप से किया जाता है, और क्रिस्टल को तुरंत तरल नाइट्रोजन 23 के साथ फोम देवर में फ्लैश-कूल किया जाता है। चुंबकीय बलों के बेमेल होने के कारण, एसएच वर्तमान में अनिपक्स के साथ संगत नहीं हैं। भंडारण और शिपिंग को कॉम्बीपक्स ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके महसूस किया जाता है, जो अनुरोध पर उपयोगकर्ताओं के लिए उपलब्ध हैं, साथ ही संगत शुष्क शिपर आवेषण (चित्रा 3 सी)। ये पक व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले यूनिपक्स के साथ एक ही बेस प्लेट साझा करते हैं और अन्य डायमंड एमएक्स बीमलाइनों पर नमूनों की तेजी से पूर्व-स्क्रीनिंग की अनुमति देते हैं। उपयोगकर्ताओं को इस उपकरण को उधार देना वर्तमान में सबसे अच्छी व्यवस्था है, जब तक कि बेस्पोक नमूना धारक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध न हों। बीमलाइन के लिए परिवहन के लिए एमएक्स समुदाय में उपयोग किए जाने वाले मानक शुष्क शिपर्स की आवश्यकता होती है।
चरण 2: वैक्यूम एंडस्टेशन में क्रायो-कूल्ड नमूनों का स्थानांतरण
एक बार जब नमूने बीमलाइन पर आते हैं, तो वे वैक्यूम एंडस्टेशन में स्थानांतरण के लिए तैयार होते हैं। इसमें कॉम्बीपक्स से एसएच को हटाना और एडेप्टर्स से अलगाव शामिल है। वैक्यूम के लिए जैविक नमूनों को पेश करना नियमित रूप से क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के क्षेत्र में किया जाता है। कुछ अच्छी तरह से स्थापित अवधारणाओं को I23 नमूना हस्तांतरण के लिए अनुकूलित किया गया था। संक्षेप में, एसएच को तरल नाइट्रोजन के तहत ट्रांसफर ब्लॉक (चित्रा 3 डी) पर स्थानांतरित किया जाता है। इन ब्लॉकों में उत्कृष्ट थर्मल चालकता और एक महत्वपूर्ण थर्मल द्रव्यमान होता है, जो क्रिस्टल को वैक्यूम में होने पर ग्लास-संक्रमण तापमान तक पहुंचने से रोकता है। प्रत्येक चार नमूनों की क्षमता के साथ चार ब्लॉकों तक, तरल नाइट्रोजन के तहत एक ब्लॉक पक (चित्रा 3 एच) में लोड किया जाता है, जिसका उपयोग या तो क्रायोजेनिक ट्रांसफर सिस्टम (सीटीएस) में नमूनों को स्थानांतरित करने के लिए या प्रयोगों के बीच तरल नाइट्रोजन डेवर्स में भंडारण के लिए किया जाता है।
डायमंड लाइट सोर्स पर विकसित क्रायोजेनिक ट्रांसफर सिस्टम में दो उप-असेंबली, नमूना स्टेशन और शटल (चित्रा 4 ए) शामिल हैं। नमूना स्टेशन में प्रोटीन क्रिस्टल के अस्थायी भंडारण के लिए एक तरल नाइट्रोजन स्नान होता है और इसमें सुरक्षा सुनिश्चित करने और उपयोगकर्ता के अनुकूल अनुभव की अनुमति देने के लिए विशिष्ट विशेषताएं होती हैं (चित्रा 5)। CTS एक उपयोगकर्ता के अनुकूल touchscreen इंटरफ़ेस के माध्यम से एक प्रोग्राम तर्क नियंत्रक द्वारा नियंत्रित किया जाता है। नमूना स्टेशन में बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए बनाए गए प्रकाश उत्सर्जक डायोड हैं और नमूनों को स्थानांतरित करने के बाद तरल नाइट्रोजन स्नान के सूखने को स्वचालित करने के लिए क्लोज-लूप में नियंत्रित हीटर का एक सेट है। इसमें सिस्टम की सुरक्षा और कुशल कामकाज सुनिश्चित करने के लिए विभिन्न प्रकार के सेंसर भी हैं। नमूना स्टेशन ने संचालन के लिए शटल के साथ बातचीत करने के लिए एक विश्वसनीय विद्युत इंटरफ़ेस प्रदान करने के लिए हार्डवेयर को बेस्पोक किया है, जैसे कि नमूना हस्तांतरण के लिए किसी न किसी वैक्यूम को पंप करना, साथ ही साथ तरल नाइट्रोजन के स्तर और शटल के अंदर के तापमान की निगरानी करना।
शटल (चित्रा 6) एक पोर्टेबल डिवाइस है जिसका उपयोग नमूना स्टेशन तरल नाइट्रोजन स्नान से एक स्थानांतरण ब्लॉक लेने और इसे क्रायोजेनिक और वैक्यूम वातावरण के अंदर एंडस्टेशन में स्थानांतरित करने के लिए किया जाता है। इसमें स्थानांतरण के दौरान नमूनों को ठंडा रखने के लिए एक तरल नाइट्रोजन देवर, देवर में तरल स्तर की निगरानी, और संचालन और उपयोगकर्ता सुरक्षा के लिए विभिन्न प्रकार के सेंसर शामिल हैं। स्थानांतरण हाथ एक चुंबकीय ड्राइव से सुसज्जित है और इसमें एंडस्टेशन में सुरक्षित रूप से लोड करने और अनलोडिंग ट्रांसफर ब्लॉकों में उपयोगकर्ताओं का मार्गदर्शन करने के लिए मशीनीकृत खांचे शामिल हैं। शटल से वैक्यूम पोत में स्थानांतरण एक एयरलॉक के माध्यम से आयोजित किया जाता है। एयरलॉक शटल और एंडस्टेशन वैक्यूम वाल्व खोलने से पहले शटल और एंडस्टेशन के बीच इंटरस्पेस को खाली करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंडस्टेशन पर शटल के लिए एक इंटरफ़ेस है। पंपिंग और वेंटिंग अनुक्रम पूरी तरह से स्वचालित हैं और उपयोगकर्ता के अनुकूल इंटरफ़ेस (चित्रा 4 सी) के साथ एक बड़े टचस्क्रीन के माध्यम से संचालित किए जा सकते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग डेटा संग्रह के लिए वैक्यूम एंडस्टेशन पर थौमैटिन क्रिस्टल को स्थानांतरित करने के लिए किया जाता है।
Protocol
1. क्रिस्टल कटाई
नोट: उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का उपयोग करें: चश्मे और दस्ताने, जहां संभव हो।
- एसएच के कॉम्बीपक्स (चित्रा 3 सी) में उपयोगकर्ता प्रयोगशाला में पहुंचने के बाद, ढक्कन को कॉम्बीपक के आधार से अलग करें जैसे कि एसएच आधार से जुड़े रहें, और शीशियों को ढक्कन में बनाए रखा जाए।
- तरल नाइट्रोजन में शीशियों के साथ ढक्कन विसर्जित करें। एक एसएच + एडाप्टर (चित्रा 3 बी, दाएं) को चुंबकीय छड़ी से जोड़ें, और हमेशा की तरह क्रिस्टल की कटाई करें।
- फ़्लैश-शांत प्रत्येक नमूना सीधे combipuck में, नमूना स्थिति का ध्यान देने के लिए. पक को बंद करने के लिए, ढक्कन के आधार को संलग्न करने के लिए एक पक की छड़ी का उपयोग करें।
- तरल नाइट्रोजन से कॉम्बीपक को सूखी शिपर या तरल नाइट्रोजन भंडारण देवर में स्थानांतरित करें। डायमंड (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Common/Common-Manual/Shipping-Samples.html) के लिए सूखी shipper जहाज.
2. वैक्यूम के लिए नमूना स्थानांतरण
- हस्तांतरण ब्लॉक के लिए combipuck से एसएच की लोडिंग
- ब्लॉक पक (चित्रा 3H) के आधार को पहले से ही खाली स्थानांतरण ब्लॉक (चित्रा 3 डी) के साथ एक फोम कंटेनर (चित्रा 3 जे-बी) में तरल नाइट्रोजन के अंदर अपने समर्थन आधार पर रखें।
नोट:: स्थानांतरण ब्लॉकों का अभिविन्यास वैक्यूम पोत के अंदर नमूना हस्तांतरण की सटीकता के लिए महत्वपूर्ण है। जैसे, ब्लॉकों को ब्लॉक पक बेस पर रखा जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि चित्रा 3 डी में तीर के साथ चिह्नित पिन ब्लॉक के बाईं ओर है। - तरल नाइट्रोजन से भरे फोम कंटेनर में शीशी पक रखें, यह सुनिश्चित करें कि पक का आधार फोम कंटेनर के अंदर चुंबकीय धारक को सुरक्षित किया गया है (चित्रा 3 जे-ए)।
- तरल नाइट्रोजन में सभी आवश्यक उपकरणों को पूर्व-ठंडा करें। आधार से ढक्कन को अलग करने के लिए उच्च सेटिंग एच पर चित्रा 3 जी में दिखाए गए पक विभाजक उपकरण का उपयोग करें, जैसे कि आधार चुंबकीय धारक से जुड़ा रहता है और एसएच तरल नाइट्रोजन के अंदर उजागर होते हैं।
- अपने एडेप्टर से प्रत्येक एसएच को हटाने के लिए, कॉम्बीपक बेस से एसएच लेने के लिए विभाजक छड़ी (चित्रा 3 एफ) का उपयोग करें, और चित्रा 3जे-बी में हिंडोला की क्षैतिज स्थिति में स्थानांतरण ब्लॉक की उचित स्थिति में रखें।
- एसएच + एडाप्टर पर विभाजक की छड़ी रखें जहां तक यह जा सकता है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि छड़ी ऊर्ध्वाधर है, नमूने को छूने से बचने के लिए।
- विभाजक छड़ी पर छोटे लीवर को अंगूठे के साथ नीचे ले जाएं जब तक कि यह क्लिक न हो जाए, एसएच को अंदर सुरक्षित करने और एडेप्टर से एसएच खींचने के लिए।
- वांछित ब्लॉक स्थिति पर विभाजक को कम करें, यह सुनिश्चित करें कि ब्लॉक के केंद्रीय छेद के अंदर तीन प्रोंग्स में से एक फिट बैठता है।
- लीवर वापस ऊपर ले जाने से SH जारी करें। प्रत्येक SH के लिए इन चरणों को दोहराएँ।
- अगले नमूना ब्लॉक में नमूने लोड करने के लिए, क्षैतिज स्थिति में एक खाली ब्लॉक घुमाने के लिए हिंडोला कुंजी उपकरण (चित्रा 3E) का उपयोग करें।
- चित्रा 3 जी में दिखाए गए पक विभाजक उपकरण को कम सेटिंग एल का उपयोग करके ब्लॉक पक के ढक्कन पर दक्षिणावर्त पेंच करके संलग्न करें।
- एक बार जब सभी एसएच स्थानांतरित हो जाते हैं, तो ब्लॉक पक को बंद करने के लिए, ढक्कन को तरल नाइट्रोजन में रखें और तापमान को संतुलित करने के लिए प्रतीक्षा करें, फिर आधार पर ढक्कन को फिट करें जैसा कि चित्रा 3 I में है। संलग्न विभाजक उपकरण के साथ, धीरे से लिफ्ट हिंडोला से जारी करने के लिए।
- इस स्तर पर, ब्लॉक पक को सीटीएस (चित्रा 4 बी) या तरल नाइट्रोजन भंडारण देवर में स्थानांतरित किया जा सकता है।
- ब्लॉक पक (चित्रा 3H) के आधार को पहले से ही खाली स्थानांतरण ब्लॉक (चित्रा 3 डी) के साथ एक फोम कंटेनर (चित्रा 3 जे-बी) में तरल नाइट्रोजन के अंदर अपने समर्थन आधार पर रखें।
- वैक्यूम पोत में स्थानांतरण ब्लॉकों का लोड हो रहा है
- सुनिश्चित करें कि शटल स्टेशन से सुरक्षित रूप से जुड़ा हुआ है। नाइट्रोजन गैस और हवा के वाल्व खोलें, और सुनिश्चित करें कि गैसें बह रही हैं। CTS पर स्विच करें।
- यदि प्रदर्शन पर कोई चेतावनी संदेश स्पष्ट नहीं है, तो तरल नाइट्रोजन के साथ स्नान और शटल दोनों को ठंडा करने के साथ आगे बढ़ें। शटल पर भरने के बंदरगाह में आपूर्ति की गई फ़नल रखें, और धीरे-धीरे स्क्रीन पर स्तर की निगरानी करते हुए कीप में तरल नाइट्रोजन डालें। जब संकेतक लाल से नीले रंग में बदल जाता है तो रोकें।
नोट:: शटल का उपयोग करने के लिए तैयार है जब टचस्क्रीन पर प्रदर्शित ठंडी सीट का तापमान 100 K से नीचे है। नमूना स्टेशन स्नान स्नान की दीवार पर चिह्नित स्तर या तरल नाइट्रोजन स्तर के प्रदर्शन पर 100% के लिए सही फ़नल का उपयोग करके एक साथ भरा जा सकता है। तरल नाइट्रोजन के स्तर और तापमान सेंसर को पूरे ऑपरेशन के दौरान लगातार निगरानी की जानी चाहिए; कई टॉप-अप की आवश्यकता होगी। - एक बार शटल कोल्ड सीट का तापमान 100 K से नीचे है और शटल और स्नान पर तरल नाइट्रोजन का स्तर स्थिर हो जाता है, तो संलग्न पक विभाजक उपकरण का उपयोग करके सीटीएस स्नान के लिए तरल नाइट्रोजन से एक ब्लॉक पक स्थानांतरित करें। ब्लॉक पक के ढक्कन को हटा दें, और सीटीएस स्नान के ढक्कन को बंद करें।
- शटल में एक ब्लॉक पेश करने के लिए, सीटीएस वाल्व खोलें, यदि पहले से ही खुला नहीं है, तो डिस्प्ले पर ओपन शटल वाल्व बटन दबाकर। 90 ° दक्षिणावर्त घूर्णन करके शटल हैंडल को अनलॉक करें, और इसे स्नान की ओर आगे बढ़ाएं ताकि हैंडल पर निर्देशित ट्रैक स्नान की ओर यात्रा के सही मार्ग को लागू कर सके। एक बार ब्लॉक कवर स्नान के अंदर दिखाई देता है, तो कवर को ठंडा होने दें। कवर के चारों ओर तरल नाइट्रोजन की बुदबुदाहट बंद हो जाने के बाद, स्थानांतरण ब्लॉक में अग्रिम।
- शटल पर स्थानांतरण ब्लॉक को लॉक करने के लिए, हैंडल को 180 ° दक्षिणावर्त घुमाएं।
- हैंडल को मूल बैक स्थिति में वापस ले लें, और फिर 90 ° एंटी-क्लॉकवाइज घुमाकर इसे जगह में 'लॉक' करें।
- शटल निकासी शुरू करने के लिए डिस्प्ले स्क्रीन पर क्लोज शटल वाल्व और पंप दबाएं।
- एक बार जब संदेश शटल को अलग करने के लिए तैयार किया जाता है, तो टचस्क्रीन पर प्रदर्शित होता है, शटल के नीचे लीवर दबाएं, और शीर्ष पर हैंडल का उपयोग करके इसे ध्यान से उठाएं।
- एक ईमानदार स्थिति में वैक्यूम एंडस्टेशन पर एयरलॉक के लिए शटल ले जाएँ।
- वैक्यूम एंडस्टेशन पर एयरलॉक के लिए शटल संलग्न करें।
नोट:: एक बार सुरक्षित रूप से अनुलग्न होने के बाद, एंडस्टेशन पर टचस्क्रीन शटल और इंटरलॉक की स्थिति की पुष्टि करेगा। - टचस्क्रीन पर संबंधित बटन दबाकर और नमूना होटल को सही लोडिंग स्थिति में ले जाकर पोत के भीतर एक खाली ब्लॉक स्थिति का चयन करें।
- एक बार नमूना होटल स्थिति में है, खुला बटन सक्रिय हो जाएगा। वैक्यूम इंटरलॉक अनुक्रम प्रारंभ करने के लिए इस बटन को दबाएँ।
नोट:: पंप प्रारंभ हो जाएगा, और प्रगति मॉनिटर पर प्रदर्शित किया जाएगा। इसे पूरा करने में दो मिनट तक का समय लग सकता है। - अनुक्रम पूरा होने के बाद, स्थिति एयरलॉक ओपन में बदल जाएगी, प्रगति में स्थानांतरण। रॉड को अनलॉक करने के लिए हैंडल को 90 डिग्री दक्षिणावर्त घुमाएं, और धीरे से रॉड को जहाज में धक्का दें ताकि निर्देशित ट्रैक फिर से नमूना होटल की स्थिति की ओर यात्रा के सही मार्ग को लागू करे। मार्गदर्शन के लिए स्क्रीन पर प्रदर्शित वीडियो फ़ीड का उपयोग करके, धीरे-धीरे ब्लॉक को होटल में डालें, यह सुनिश्चित करते हुए कि टच डिस्प्ले पर ब्लॉक स्थिति प्रकाश सक्रिय है। एक बार सक्रिय होने के बाद, ब्लॉक को छोड़ने के लिए हैंडल को 180 डिग्री एंटी-क्लॉकवाइज घुमाएं, और रॉड को जहाज से बाहर निकालें। एक बार पूरी तरह से वापस ले लिया, रॉड लॉक करने के लिए 90 डिग्री एंटी-क्लॉकवाइज हैंडल घुमाएं।
- एक बार रॉड लॉक होने के बाद, बंद करें बटन सक्रिय हो जाएगा। अंत स्टेशन वैक्यूम वाल्व को बंद करने के लिए इसे दबाएं, और शटल और पोत के बीच की जगह को वायुमंडलीय दबाव में वेंट करें, पूरा होने के लिए 20 सेकंड तक इंतजार कर रहे हैं।
- एक बार अनुक्रम पूरा होने के बाद शटल को हटाने के लिए स्थिति ठीक दिखाने के लिए प्रदर्शन की प्रतीक्षा करें। इस बिंदु पर, शटल को निकालें, और अगले ब्लॉक के लिए प्रक्रिया को दोहराने के लिए CTS पर वापस जाएं।
- स्थानांतरण के लिए अगले ब्लॉक को तैयार करने के लिए, स्नान के अंदर ब्लॉक पक को घुमाएं। एक्रिलिक ढक्कन के शीर्ष पर अंतर्निहित रोटेशन कुंजी को ब्लॉक पक के केंद्र में लॉक में नीचे पुश करें। इसे नीचे रखते हुए, पिक-अप स्थिति में वांछित ब्लॉक की स्थिति के लिए कुंजी को चालू करें।
- एक बार जब सभी ब्लॉक स्थानांतरित हो जाते हैं, तो सुनिश्चित करें कि शटल वाल्व खुला है जबकि यह सीटीएस पर लगाया गया है। टचस्क्रीन पर बेक बटन दबाएं , और स्नान और शटल दोनों का चयन करें, फिर बेक दबाएं।
नोट: यह तरल नाइट्रोजन को उबालने के लिए शटल और स्नान दोनों को गर्म करता है और बाद में अगले उपयोग से पहले किसी भी संचित बर्फ / संक्षेपण को वाष्पित करता है। एक बार बेक शुरू हो जाने के बाद, गैस और हवा को बंद किया जा सकता है।
Representative Results
ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके वैक्यूम एंडस्टेशन में एक थौमैटिन क्रिस्टल पेश किया गया था। विवर्तन डेटा को 2.7552 Å (E = 4500 eV) की तरंग दैर्ध्य पर 3600 छवियों के रूप में एकत्र किया गया था, जिसमें प्रति छवि 0.1° और 0.1 s एक्सपोजर की रोटेशन वृद्धि हुई थी। बीम आकार को 150 μm x 150 μm में समायोजित किया गया था और 7.1 x 109 फोटॉनों / s के इसी फ्लक्स माप के साथ 10% संचरण तक कम कर दिया गया था। π = 2.7552 Å का विकल्प असंगत संकेत और नमूना अवशोषण प्रभावों में वृद्धि और लंबे तरंग दैर्ध्य के लिए संकल्प में कमी के बीच एक समझौते पर आधारित है। हालांकि सल्फर के सैद्धांतिक अवशोषण किनारे के करीब नहीं है (π = 5.0095 Å), इस तरंग दैर्ध्य पर, सल्फर f के प्रकीर्णन कारक में काल्पनिक योगदान 1.57 e- है, जो 1.7 और 2 Å के बीच तरंग दैर्ध्य की तुलना में 1.6-2.1 का एक कारक बड़ा है। परिणामस्वरूप मजबूत असंगत संकेत अधिक चुनौतीपूर्ण परियोजनाओं के लिए सफल एस-एसएडी चरणबद्धता की अनुमति देते हैं।
इस तरंग दैर्ध्य पर एकत्र किए गए डेटा के साथ बीमलाइन I2324,25,26,27 पर विभिन्न प्रकार के कठिन चरणबद्ध प्रयोग पहले ही किए जा चुके हैं। जबकि एस-एसएडी द्वारा चरणबद्ध करना बहुत कम तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके संभव है, इसके लिए अक्सर 10028 से अधिक बहुलता मूल्यों तक पहुंचने के लिए कई आइसोमोर्फस क्रिस्टल से डेटा विलय करने के माध्यम से असंगत संकेत बनाने की आवश्यकता होती है। लंबे तरंग दैर्ध्य पर बढ़े हुए असंगत संकेत के कारण, I23 पर हल की गई अधिकांश चरणबद्ध परियोजनाओं को केवल एक क्रिस्टल से डेटा की आवश्यकता होती है। एक प्रतिनिधि विवर्तन छवि चित्र 7, बाएं में दिखाया गया है। Xia2-3dii29 का उपयोग करके डेटा प्रोसेसिंग ने उत्कृष्ट विलय के आंकड़ों का उत्पादन किया, जैसा कि तालिका 1 में उल्लिखित है। चित्रा 7, दाएं, थौमैटिन डेटा सेट से एक प्रतिनिधि विवर्तन छवि का हिस्सा दिखाता है और ब्रैग प्रतिबिंबों के आसपास की कम पृष्ठभूमि को दर्शाता है, जो आमतौर पर वैक्यूम सेटअप में देखे जाने वाले बड़े आई / σ (आई) मूल्यों में योगदान देता है, यह सुनिश्चित करता है कि नमूना द्वारा बिखरे हुए केवल एक्स-रे डिटेक्टर तक पहुंचते हैं।
1.8 Å का अधिकतम प्राप्त करने योग्य रिज़ॉल्यूशन डिटेक्टर ज्यामिति और एक्स-रे विकिरण के चुने हुए तरंग दैर्ध्य के कारण होता है। डेटासेट ने बहुत मजबूत असंगत संकेत प्राप्त किया, जो 2.677 के असंगत सामान्य प्रायिकता पैरामीटर के मध्य-ढलान में परिलक्षित होता है, जो स्वचालित चरणबद्ध पाइपलाइन क्रैंक 2 द्वारा संरचना समाधान की सुविधा प्रदान करता है। परिणामी इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र की उच्च गुणवत्ता ने CRANK231 के भीतर Buccaneer30 मॉड्यूल द्वारा सफल स्वचालित मॉडल निर्माण को सक्षम किया, जिसमें थौमैटिन के अमीनो एसिड अनुक्रम के 100% के लिए सही प्लेसमेंट था। चरणबद्ध असंगत अंतर फूरियर मानचित्र, ANODE11 के साथ गणना की, दो वैकल्पिक संरचनाओं के साथ Cys159 से 16 बहुत अच्छी तरह से आदेशित सल्फर परमाणुओं और एक सल्फर परमाणु को प्रकट करता है, जैसा कि तालिका 2 में असंगत प्रकीर्णकों के पदों पर चोटियों की 18 महत्वपूर्ण ऊंचाइयों द्वारा पुष्टि की गई है। थौमैटिन के भीतर 16 सिस्टीन अवशेष 8 डाइसल्फ़ाइड पुल बनाते हैं, जो सभी 2Fo-Fc मानचित्र (चित्रा 8) में स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं।
चित्रा 1: लंबी तरंग दैर्ध्य एमएक्स प्रयोगों से उच्च-रिज़ॉल्यूशन विवर्तन डेटा। (ए) ऊर्जा के खिलाफ एफ "मूल्यों का प्लॉट, बीमलाइन I23 पर सुलभ प्रकाश तत्वों के अवशोषण किनारों को दर्शाता है। (बी) ऊर्जा के खिलाफ P12M डिटेक्टर के कोनों पर प्राप्त करने योग्य अधिकतम संकल्प। संक्षिप्त नाम: MX = macromolecular crystallography. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: एंडस्टेशन के सभी घटकों के साथ वैक्यूम पोत के माध्यम से क्षैतिज अनुभाग। संक्षिप्त नाम: OAV = ऑन-अक्ष देखने की प्रणाली। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: नमूना हैंडलिंग उपकरण. (A) I23 नमूना धारक. (बी) एमएक्स स्पाइन-मानक पिन (बाएं) एडाप्टर (दाएं) के साथ एक आई 23 नमूना धारक के बगल में। (सी) I23 नमूना धारकों (नीला) के साथ Combipuck ढक्कन और आधार। दो स्थानांतरण ब्लॉकों (सोने) के साथ पक ढक्कन और आधार को ब्लॉक करें। एक सूखी शिपर बेंत, दोनों combipucks और ब्लॉक पक के साथ संगत, पीछे दिखाई दे रहा है। (d) चार I23 नमूना धारकों के साथ स्थानांतरण ब्लॉक। (ई) ब्लॉक पक बेस के रोटेशन के लिए उपयोग किया जाने वाला कुंजी उपकरण। (च) विभाजक छड़ी। (जी) उच्च और निम्न सेटिंग्स दिखा दो तीर के साथ पक विभाजक उपकरण. (एच) चार खाली Cu ब्लॉकों के साथ ब्लॉक पक आधार. (I) ब्लॉक पक के लिए ढक्कन। (जे) कॉपर ब्लॉकों के लिए combipuck ठिकानों से नमूना धारकों को स्थानांतरित करने के लिए सभी आवश्यक उपकरणों के साथ फोम कंटेनर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: क्रायोजेनिक स्थानांतरण प्रणाली। (ए) शटल संलग्न और भरने के लिए उपयोग किए जाने वाले फ़नल के साथ सीटीएस नमूना स्टेशन। (B) CTS के अंदर स्थित दो स्थानांतरण ब्लॉकों के साथ एक ब्लॉक पक। (C) CTS नियंत्रण सॉफ़्टवेयर टचस्क्रीन। संक्षिप्त नाम: CTS = क्रायोजेनिक स्थानांतरण प्रणाली। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: क्रायोजेनिक स्थानांतरण प्रणाली नमूना स्टेशन. संक्षेप: एलईडी = प्रकाश उत्सर्जक डायोड; LN2 = तरल नाइट्रोजन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 6: क्रायोजेनिक स्थानांतरण प्रणाली शटल. संक्षेप: एलईडी = प्रकाश उत्सर्जक डायोड; LN2 = तरल नाइट्रोजन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 7: विवर्तन छवियों. बाएं, थाउमैटिन क्रिस्टल पर एकत्र किए गए डेटासेट से एक विवर्तन छवि। सही, कम गिनती पृष्ठभूमि पिक्सेल से घिरा एक विवर्तन स्थान. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 8: स्वचालित पाइपलाइन CRANK2 (डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स, कोई बाद के शोधन) के साथ Thaumatin की संरचना समाधान. (A) 1.6π (नीले) पर 2Fo-Fc मानचित्र के साथ thaumatin का सिंहावलोकन और चरणबद्ध असंगत अंतर ANODE (हरे रंग) में गणना की 5π पर फूरियर मानचित्र। (बी) थौमैटिन का अवलोकन केवल चरणबद्ध असंगत अंतर फूरियर मानचित्र को 5π पर दिखा रहा है। (C) 2Fo-Fc मानचित्र के साथ थौमैटिन में मौजूद एक डाइसल्फ़ाइड पुल का क्लोज-अप दृश्य 1.6π (नीला) और चरणबद्ध असंगत अंतर फूरियर मानचित्र 5π पर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| नाम | थौमैटिन |
| डेटा संग्रह तरंग दैर्ध्य (Å) (ऊर्जा (eV)) | 2.7552 (4500) |
| छवियों की संख्या x वेज आकार (°) | 3600 x 0.1 |
| स्पेसग्रुप | P 41212 |
| इकाई सेल स्थिरांक | |
| (a = b, c) (Å) | 57.8, 150.2 |
| (α = β = γ) (°) | 90 |
| संकल्प (Å) | 150.22–1.80 (1.84–1.80) |
| संपूर्णता | 96.3 (81.1) |
| ISa | 36.48 |
| Rmeas | 0.042 (0.118) |
| Rpim | 0.01 (0.049) |
| CC1/2 | 1 (0.989) |
| I/σ(I) | 57.9 (14.7) |
| बहुलता | 15.0 (5.4) |
| मध्य ढलान | 2.677 |
तालिका 1: डेटा संग्रह और प्रसंस्करण आँकड़े Thaumatin के लिए 2.755 Å तरंग दैर्ध्य पर beamline I23, DLS पर. संकल्प, पूर्णता, Rmerge, Rmeas, Rpim, CC1/2, I/σ(I), और बहुलता के लिए, कोष्ठक में उच्च-रिज़ॉल्यूशन गोले दिखाए जाते हैं। संक्षिप्त नाम: DLS = डायमंड लाइट स्रोत.
| निकटतम परमाणु | शिखर ऊंचाई (सिग्मा) |
| CYS9 | 25.83 |
| CYS56 | 25.03 |
| MET112 | 24.54 |
| CYS149 | 24.37 |
| CYS126 | 24.21 |
| CYS145 | 24.2 |
| CYS134 | 23.6 |
| CYS177 | 23.48 |
| CYS204 | 23.43 |
| CYS66 | 23.17 |
| CYS164 | 22.54 |
| CYS193 | 22.15 |
| CYS158 | 21.51 |
| CYS77 | 21.21 |
| CYS121 | 20.8 |
| CYS71 | 19.17 |
| CYS159_1 | 12.27 |
| CYS159_2 | 8.34 |
तालिका 2: असंगत अंतर फूरियर मानचित्र शिखर ऊंचाइयों के रूप में ANODE द्वारा गणना चरणबद्ध और स्वचालित रूप से CRANK2 से निर्मित मॉडल का उपयोग कर.
Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल बीमलाइन I23 पर इन-वैक्यूम लंबी तरंग दैर्ध्य एमएक्स प्रयोगों के लिए नमूना तैयारी आवश्यकताओं का अनुपालन करने के लिए विकसित किया गया है। यह पिछले एक साल से बीमलाइन पर उपयोग में है और कई परियोजनाओं के सफल समापन में योगदान दिया है। जैसा कि यहां प्रस्तुत परिणामों से संकेत मिलता है, प्रोटोकॉल उनकी विवर्तन गुणवत्ता को संरक्षित करते हुए वैक्यूम एंड-स्टेशन में नमूनों के एक सुरक्षित और विश्वसनीय हस्तांतरण को सक्षम बनाता है। यह बीमलाइन ऑपरेशन के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू है और बीमलाइन कर्मचारियों द्वारा इन-पर्सन उपयोगकर्ता प्रशिक्षण के साथ होगा। कुछ चरणों को प्रक्रिया के सफल और सुरक्षित समापन के लिए महत्वपूर्ण के रूप में हाइलाइट किया जा रहा है: कॉम्बीपक ठिकानों से नमूना ब्लॉकों में नमूनों के हस्तांतरण के लिए हानिकारक नमूनों से बचने के लिए सटीकता और ध्यान देने की आवश्यकता होती है (चरण 2.1.4 देखें); सभी चरणों में तरल नाइट्रोजन स्तर की निगरानी नमूनों को हवा के संपर्क में आने या उन हिस्सों के करीब संपर्क में होने से रोकने के लिए महत्वपूर्ण है जो ठीक से ठंडा नहीं हैं (2.1.3 और 2.2.2); जब तक बंद अनुक्रम (2.2.14) पूरी तरह से समाप्त हो जाता है, तब तक इंतजार कर रहा है, एंडस्टेशन वैक्यूम (2.2.15) से शटल को हटाने से पहले, एंडस्टेशन वैक्यूम के क्षरण से बचने के लिए।
प्रोटोकॉल की अवधारणा को वैक्यूम वातावरण में प्रोटीन क्रिस्टल के हस्तांतरण के लिए उद्देश्य-निर्मित उपकरण विकसित करने के उद्देश्य से एक इंजीनियरिंग प्रयास के साथ शुरू किया गया था। इस परियोजना के अंतिम उत्पाद सीटीएस और ऊपर वर्णित संबंधित नमूना हैंडलिंग उपकरण थे। सीटीएस अपने पूर्ववर्ती, Leica EM VCT10014 पर एक महत्वपूर्ण सुधार है, और कई सीमाओं को हटा देता है, जैसे कि स्थानांतरण के दौरान नमूना परिरक्षण और वैक्यूम वातावरण की कमी, तरल नाइट्रोजन स्नान के अंदर बर्फ का निर्माण, और एक सहज ज्ञान युक्त उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस और सुरक्षा सुविधाओं की अनुपस्थिति। सीटीएस की अतिरिक्त विशेषताएं जो उपयोगकर्ता अनुभव में सुधार करती हैं, शटल और नमूना स्टेशन के अंदर तापमान और तरल नाइट्रोजन स्तर की निगरानी, एक बड़ी क्षमता वाले स्नान में एक साथ चार ब्लॉकों को समायोजित किया जाता है, बजाय एक, और शटल ऑपरेशन के लिए एक स्व-निर्देशित तंत्र। CTS पूरी तरह से एक उपयोगकर्ता के अनुकूल touchscreen इंटरफ़ेस और बढ़ाया वैक्यूम और यांत्रिक सुरक्षा के साथ बीमलाइन नियंत्रण प्रणाली में एकीकृत है जब endstation के साथ interfacing.
बीमलाइन I23 अपनी तरह का पहला लंबा-तरंग दैर्ध्य एमएक्स सिंक्रोट्रॉन उपकरण है और, जैसे, प्रोटीन क्रिस्टल को उच्च-वैक्यूम वातावरण में पेश करना और उन्हें क्रायोजेनिक तापमान पर संग्रहीत करना, काफी प्रयासों की आवश्यकता है। नमूना तैयारी उपकरण और प्रोटोकॉल में सुधार, साथ ही साथ प्रक्रियाओं को सुव्यवस्थित करने के प्रयास, चल रहे हैं। उपयोगकर्ता समर्थन के हिस्से के रूप में, बीमलाइन कर्मचारी हमेशा समस्या निवारण में सहायता करने के लिए उपलब्ध होते हैं। इस तरह के एक परिदृश्य का एक उदाहरण ऐसे मुद्दे होंगे जो वैक्यूम सिस्टम की अखंडता से समझौता करते हैं, जिससे शटल को सीटीएस या एंडस्टेशन एयरलॉक से / से संलग्न करने या हटाने में कठिनाइयों का सामना करना पड़ता है। परीक्षणों के विभिन्न स्तरों को साप्ताहिक और दैनिक आधार पर किया जाता है, और उपयोगकर्ता प्रशिक्षण संभावित विफलताओं से बचने के लिए अतिरिक्त जांच को कवर करेगा, जैसे कि शटल द्वारा संलग्न इंटरफेस पर ओ के छल्ले का दृश्य निरीक्षण। जबकि वैक्यूम वातावरण एक तरंग दैर्ध्य रेंज में विवर्तन प्रयोगों को करने का अवसर खोलता है जो अन्य बीमलाइनों पर सुलभ नहीं है, अतिरिक्त स्थानांतरण चरण समग्र नमूना थ्रूपुट को कम कर देता है।
हस्तांतरण ब्लॉक प्रति केवल चार नमूनों के साथ मैनुअल स्थानांतरण और वैक्यूम पोत के अंदर पांच ब्लॉकों तक कुल क्षमता को 20 नमूनों तक सीमित करता है। इसलिए, नमूना परिवर्तनशीलता के लिए एक बड़े नमूने के साथ परियोजनाओं के लिए, नमूनों को डायमंड उच्च-थ्रूपुट बीमलाइनों पर पूर्व-स्क्रीन किया जाना चाहिए, और फिर बाद में अनुकूलित लंबे तरंग दैर्ध्य प्रयोग के लिए केवल सबसे आशाजनक नमूनों को स्थानांतरित किया जाना चाहिए। जबकि नमूना धारकों और स्थानांतरण ब्लॉककुछ साल पहले अपने प्रारंभिक परिचय से अपरिवर्तित हैं, यहां प्रस्तुत हैंडलिंग उपकरण सभी नए विकास हैं। I23 समर्पित नमूना धारकों बीमलाइन के लिए शीतलन अवधारणा में उनकी भूमिका के कारण अपरिवर्तनीय हैं। जैसे, नमूना हैंडलिंग टूल के डिजाइन का उद्देश्य इस नए प्रकार के धारक और मानक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों के बीच एक लिंक बनाना है जिसे एमएक्स उपयोगकर्ता समुदाय ने लंबे समय तक अपनाया था, जैसे कि कॉम्बीपक्स, क्रिस्टल हार्वेस्टिंग वैंड्स, और सूखी शिपर परिवहन प्रणाली। उनके डिजाइन में उपयोगकर्ता समुदाय के साथ महत्वपूर्ण परामर्श शामिल था और इसे पूरा करने के लिए कई पुनरावृत्तियों की आवश्यकता थी। यहां प्रस्तुत उपकरण, उपकरण और प्रोटोकॉल डायमंड लाइट सोर्स पर बीमलाइन I23 पर प्रयोगों के लिए उपयोगकर्ता के नमूनों के हस्तांतरण के लिए एक सरल और मजबूत प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं। इन-वैक्यूम लंबी तरंग दैर्ध्य मैक्रोमोलेक्यूलर क्रिस्टलोग्राफी के लिए यह उपकरण संरचनात्मक जीव विज्ञान के लिए नए अवसर खोलता है।
Acknowledgments
हम क्रायोजेनिक नमूना स्थानांतरण प्रणाली (सीटीएस) के विकास में उनके समर्थन के लिए एडम टेलर, एडम प्रेस्कॉट, केन जोन्स, अरविंदर पलाहा और केविन विल्किंसन को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को यूरोपीय आयोग के क्षितिज 2020 कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित iNEXT-Discovery (अनुदान 871037) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12M detector | Dectris, Switzerland | single-photon-counting X-ray detector | |
| CombiPuck | MiTeGen | SKU: M-CBP-P1 | Cryopucks used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples |
| Crystal-harvesting magnetic wand | Molecular Dimensions | MD7-411 | Used for harvesting crystal |
| Dry Shipper (CX100) | Molecular Dimensions | MD7-21 | Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples |
| Dry shipper insert (CombiPuck Transport Cane) | MiTeGen | SKU: M-CBP-PTC1 | Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples |
| Kapton polyimide | sample mount made of Kapton polyimide | ||
| Perpsex lid | acrylic lid with built-in rotation key | ||
| Thaumatin powder | Sigma-Aldrich | T7638 | Used for production of thaumatin crystals by vapour diffusion |
References
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