Summary
Vi har udviklet en ny tab-af-funktion tilgang, der involverer introduktion og genomisk integration af kunstige mikro-RNA-sekvenser i kyllingembryoner ved hjælp af i ovo-elektroporation og Tol2-transposonsystemet. Denne teknik giver en robust og stabil genknockdown-metode til undersøgelser af genfunktion under udvikling.
Abstract
Kyllingens nethinden har længe været et vigtigt modelsystem inden for udviklingsneurobiologi med fordele, herunder dens store størrelse, hurtige udvikling og tilgængelighed til visualisering og eksperimentelle manipulationer. Den største tekniske begrænsning havde imidlertid været manglen på robuste tab-af-funktion-tilgange til genfunktionsanalyser. Denne protokol beskriver en metode til genhæmning i den udviklende chick retina, der involverer transgen ekspression af kunstige mikroRNA'er (miRNA'er) ved hjælp af Tol2 transposonsystemet. I denne tilgang indføres et Tol2-transposonplasmid, der indeholder en ekspressionskassette til EmGFP-markøren (smaragdgrønt fluorescerende protein) og kunstige præ-miRNA-sekvenser mod et målgen i den embryonale chick retina med en Tol2-transposaseekspressionskonstruktion ved in ovo-elektroporation . I de transfekterede retinale celler katalyserer transposasen udskæringen af ekspressionskassetten fra transposonvektoren og dens integration i værtskromosomer, hvilket fører til den stabile ekspression af miRNA'er og EmGFP-proteinet. I vores tidligere undersøgelse har vi vist, at ekspressionen af Nel, et glycoprotein, der udøver flere funktioner i neural udvikling, kan undertrykkes signifikant i den udviklende chick nethinden ved hjælp af denne teknik. Vores resultater indikerer, at denne metode inducerer en stabil og robust undertrykkelse af genekspression og dermed giver en effektiv tab-af-funktion tilgang til studier af retinal udvikling.
Introduction
Hvirveldyrets nethinde er et vigtigt modelsystem til at studere neural udvikling. På trods af sin perifere placering er nethinden anatomisk og udviklingsmæssigt en forlængelse af centralnervesystemet, og synsnerven, der består af axoner af retinale ganglionceller, repræsenterer en kanal i centralnervesystemet. Kyllingens nethinden har betydelige fordele som modelsystem til at studere den molekylære mekanisme for neural udvikling: Den er stor og udvikler sig hurtigt; det har strukturelle og funktionelle ligheder med den menneskelige nethinden; Det er meget tilgængeligt for visualisering og eksperimentelle manipulationer. Molekylære mekanismer for celleproliferation og differentiering, morfogenese og axonvejledning under neural udvikling er blevet grundigt undersøgt ved hjælp af kyllingens nethinden.
I ovo er elektroporation blevet anvendt med succes i løbet af de sidste to årtier til at indføre ektopiske gener i celler i det udviklende kyllingembryo. Denne teknik muliggør mærkning af udviklende celler, sporing af celleskæbne og sporing af cellemigration og axonkanaler samt ektopisk genekspression til in vivo-analyse af genfunktion. Betingelserne for in ovo elektroporation for effektiv ektopisk genekspression i kyllingembryoner er veletablerede 1,2,3.
På trods af disse fordele havde manglen på en stabil tab-af-funktion-teknik til undersøgelser af genfunktion været en stor teknisk begrænsning af kyllingeembryoet. Mens kyllingeembryoner elektroporeret med små interfererende RNA'er (siRNA'er)4 eller ekspressionsvektorer for korte hårnåle-RNA'er (shRNA'er)5 viser knockdown af det målrettede gen, er genundertrykkelse i disse tilgange forbigående, fordi virkningerne forsvinder, når cellerne mister de indførte RNA'er eller DNA'er. En mere stabil genundertrykkelse kan opnås ved at levere siRNA'er i kyllingembryoner af et RCAS (R-eplikation Competent Avian sarkom-leukosevirus (ASLV) lang terminal gentagelse (LTR) med en S-plice-acceptor) retrovirussystem6. Den virale vektor integreres i værtsgenomet, og de ektopiske gener udtrykkes stabilt. Imidlertid kan retrovirus kun integreres i genomet af delende celler under den mitotiske (M) fase af cellecyklussen, hvilket kan pålægge en begrænsning på udviklingsstadierne og / eller celletyperne, for hvilke denne tab-af-funktion-tilgang kan anvendes. Desuden forekommer ekspression af transgener ved RCAS langsommere og mindre robust end den, der induceres af in ovo elektroporation7.
Transposoner er genetiske elementer, der bevæger sig fra et sted på genomet til et andet. Tol2-elementet er medlem af hAT-transponerbar elementfamilie og indeholder et internt gen, der koder for en transposase, der katalyserer transposonreaktionen af Tol2-elementet8. Når en plasmidvektor, der bærer en genekspressionskassette flankeret af sekvenserne i venstre og højre ende af Tol2-elementerne (henholdsvis 200 bp og 150 bp) indføres i hvirveldyrceller med en Tol2-transposaseekspressionskonstruktion, udskæres ekspressionskassetten fra plasmidet og integreres i værtsgenomet, hvilket understøtter en stabil ekspression af det ektopiske gen (figur 1). Det har vist sig, at det transponerbare Tol2-element kan inducere gentransponering meget effektivt i forskellige hvirveldyrarter, herunder zebrafisk9,10, frøer 11, kyllinger 12 og mus 13, og dermed er en nyttig metode til transgenese og insertionel mutagenese. Tol2-transposonsystemet er med succes blevet anvendt til betinget knockdown af et målgen ved genomisk integration af siRNA, der behandles fra langt dobbeltstrenget RNA14.
Denne protokol beskriver en tab-af-funktion tilgang i kyllingembryoet, der involverer introduktion af kunstige mikroRNA'er (miRNA'er) af Tol2-transposonsystemet15,16. I denne tilgang klones en ekspressionskassette til EmGFP-markøren (smaragdgrønt fluorescerende protein) og kunstige miRNA'er mod et målgen til en Tol2-transposonvektor. Tol2-transposonkonstruktionen introduceres derefter i den embryonale chick retina med en Tol2 transposaseekspressionskonstruktion ved in ovo elektroporation. I de transfekterede retinale celler katalyserer transposasen udskæringen af ekspressionskassetten fra transposonvektoren og dens integration i værtskromosomer, hvilket fører til den stabile ekspression af miRNA'er og EmGFP-proteinet. I vores tidligere undersøgelser lykkedes det os at slå ekspressionen af Nel, et ekstracellulært glycoprotein, der overvejende udtrykkes i nervesystemet, ned i den udviklende chick retina (se repræsentative resultater). Vores resultater indikerer, at stabil og effektiv genundertrykkelse kan opnås i ovo ved denne teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Konstruktion af miRNA-ekspressionsvektorer
BEMÆRK: Procedurerne til konstruktion af miRNA-ekspressionsvektorer (trin 1.1-1.3, 1.5-1.6.) er optimeret til miRNA-ekspressionssættet, Block-iT Pol II miR RNA-ekspressionssæt med EmGFP, som tidligere beskrevet15,16. Sættet indeholder ekspressionsvektoren designet til at tillade miRNA-ekspression (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), en kontrolvektor (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativ kontrolplasmid), tilbehørsreagenser og instruktioner til fremstilling af miRNA-ekspressionsvektorer (se materialetabel)17.
- Design af enkeltstrengede DNA-oligoer, der koder for pre-miRNA'er mod målgenet: Design enkeltstrengede DNA-oligoer ("topstrengede" oligoer (målpræ-miRNA'er) og "bundstrengede" oligoer (komplementærer af topstrengoligoer)) ved hjælp af onlineværktøjet, RNAi Designer (se materialetabel). Se figur 2 for de krævede egenskaber ved de enkeltstrengede oligoer (figur 2A) og eksempler på målsekvenser (figur 2B).
BEMÆRK: Det anbefales, at der genereres 5-10 pre-miRNA-sekvenser for et givet målgen og screenes for knockdown-aktiviteter in vitro (trin 1.4). - Udglødning af top- og bundstrengede oligoer for at generere en dobbeltstrenget oligo
- Følgende udglødningsreaktion (tabel 1) indstilles i et sterilt 0,5 ml mikrocentrifugeglas.
- Reaktionsblandingen inkuberes ved 95 °C i 4 min. Anneal top- og bundstrengede oligoer for at generere en dobbeltstrenget oligo ved at lade reaktionsblandingen afkøle til stuetemperatur (RT) i 5-10 min. Centrifuger prøven kort (~5 s).
BEMÆRK: De udglødede oligoer kan opbevares ved -20 °C uden nedbrydning i mindst et år.
- Kloning af de dobbeltstrengede oligoer i miRNA-ekspressionsvektoren (pcDNA6.2-GW / EmGFP-miRNA (leveret i miRNA-ekspressionssættet)): Klon individuelle dobbeltstrengede oligoer i den lineariserede miRNA-ekspressionsvektor i henhold til producentens manual17.
- Evaluering af knockdown-effekter
BEMÆRK: Det anbefales, at individuelle miRNA-sekvenser testes for genundertrykkelseseffektivitet in vitro , før de anvendes i ovo. Knockdown-effektivitet kan testes ved at transfektere miRNA-ekspressionsplasmider til en cellelinje, der udtrykker målgenet. Alternativt kan individuelle miRNA-ekspressionsplasmider co-transfekteres til cellelinjer med en ekspressionskonstruktion for målgenet. For målgener, der koder for proteiner, der ikke er membranforankrede i deres oprindelige tilstand (f.eks. opløselige proteiner), kan et alkalisk fosfatase (AP) fusionsprotein anvendes til overvågning af ekspressionen af målproteinet. En cDNA-sekvens, der koder for målproteinet, kan smeltes sammen i ramme til human placenta alkalisk fosfatase i AP-tagvektorer (APtag-1- APtag-5; se materialetabel) og indføres i celler18. Når det udtrykkes i dyrkningsceller (f.eks. HEK293T celler), udskilles det AP-mærkede målprotein i høje niveauer i dyrkningsmedier, og dermed kan knockdown-effekter af miRNA-sekvenser evalueres ved at måle faldet i AP-aktivitet i kulturmediet i miRNA-transfekterede celler (undertrin 1.4.1-1.4.4).- Dyrkning HEK293T celler i en plade med 24 brønde (8 x 104 celler / brønd) natten over. Transfekterer forbigående cellerne med individuelle miRNA-ekspressionskonstruktioner med et ekspressionsplasmid af et AP-mærket målprotein. Brug pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativt kontrolplasmid (leveres i miRNA-ekspressionssættet) som kontrol. (Hvis der anvendes cellelinjer, der stabilt udtrykker et AP-mærket målprotein, transfekteres cellerne kun med individuelle miRNA-ekspressionskonstruktioner.)
BEMÆRK: Et konventionelt lipofektionsreagens (se materialetabel) anvendes til transfektion. - Det konditionerede medium opsamles 48-72 timer efter transfektionen, og varmen inaktiverer den endogene AP-aktivitet i et 65 °C vandbad i 5 minutter. Spinout-affald i en desktop mikrocentrifuge ved maksimal hastighed i 5 min.
- Supernatanten buffer med 10 mM HEPES, pH 7,0 og ledes gennem et 0,45 μm filter.
- Der udtages 100 μL (til måling i en pladelæser) eller 500 μL (til et spektrofotometer) af supernatanten, og der tilsættes en tilsvarende mængde 2x AP-substratbuffer (tabel 2). Kontroller AP-aktiviteten ved at måle OD405 i en pladelæser eller et spektrofotometer.
BEMÆRK: Hvis AP-aktiviteten af det konditionerede substrat er for høj til nøjagtig måling, fortyndes det med HBAH-buffer (Hanks' afbalancerede saltopløsning (HBSS), 0,5 mg/ml bovint serumalbumin, 20 mM HEPES (pH 7,0)) eller en anden buffer, der indeholder et bærerprotein. Brug ikke fosfatholdige buffere (f.eks. PBS), fordi uorganisk fosfat virker som en kompetitiv hæmmer af AP.
- Dyrkning HEK293T celler i en plade med 24 brønde (8 x 104 celler / brønd) natten over. Transfekterer forbigående cellerne med individuelle miRNA-ekspressionskonstruktioner med et ekspressionsplasmid af et AP-mærket målprotein. Brug pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativt kontrolplasmid (leveres i miRNA-ekspressionssættet) som kontrol. (Hvis der anvendes cellelinjer, der stabilt udtrykker et AP-mærket målprotein, transfekteres cellerne kun med individuelle miRNA-ekspressionskonstruktioner.)
- Sammenkædning af miRNA-sekvens
BEMÆRK: Knockdown-effekter kan forbedres ved at kæde forskellige miRNA'er mod det samme målgen eller gentage det samme miRNA. miRNA-ekspressionsvektoren understøtter sammenkædning af flere pre-miRNA-sekvenser og deres co-cistroniske ekspression17.- Kæde to forskellige pre-miRNA-sekvenser (mod det samme målgen), der viser de højeste knockdown-aktiviteter i in vitro-assays (trin 1.4) i henhold til producentens anvisninger17.
- Evaluere gensuppressionseffektiviteten af de kædede konstruktioner ved hjælp af in vitro-assays som beskrevet i trin 1.4. Hvis tre eller flere pre-miRNA-sekvenser viser lignende høje knockdown-aktiviteter, skal du teste forskellige kombinationer af to sekvenser og bruge de kombinationer, der viser den højeste knockdown-aktivitet (se Repræsentative resultater).
- Overførsel af EmGFP-pre-miRNA-ekspressionskassetten til Tol2-transposonvektoren
BEMÆRK: Ekspressseksitetten indeholdende EmGFP cDNA og to pre-miRNA-sekvenser overføres til Tol2-transposonvektoren (pT2K-CAGGS-vektor, se materialetabel). Til dette formål PCR-amplificeres ekspressionskassetten (der omfatter fra 3'-enden af CMV-promotoren til miRNA-omvendt sekventeringsprimerstedet for miRNA-ekspressionsvektoren) ved anvendelse af primere med et kunstigt restriktionsenzymsted, og PCR-produktet klones ind i Tol2-transposonvektoren. Tol2-transposonvektoren indeholder den allestedsnærværende CAGGS-promotor, som driver udtrykket af den indsatte udtrykskassette. CAGGS-promotoren og ekspressionskassetten flankeres af Tol2-sekvenserne (figur 1).- PCR-amplifikation af EmGFP-pre-miRNA-ekspressionskassetten: Følg reaktionsopsætningen og termocykelbetingelserne beskrevet i tabel 3.
- Det gelrensede PCR-produkt (ca. 1,3 kb) fyldes ind i restriktionsenzymfordøjet Tol2-transposonvektor. Elektroporat plasmidet i kompetente E. coli-celler (se materialetabel) og vælg rekombinanterne (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA-konstruktioner).
- Forbered plasmidet ved hjælp af et konventionelt maxiprep-sæt (se materialetabel). Kontroller plasmidets struktur og sekvens ved henholdsvis restriktionskortlægning og ved hjælp af de primere, der anvendes til PCR.
2. Ægopbevaring og inkubation
- Køb befrugtede hvide leghorn (Gallus gallus) æg fra lokale gårde eller kommercielle leverandører.
BEMÆRK: Æg kan opbevares ved 12-16 °C eller ved 4 °C i op til 1 uge før inkubation uden signifikant tab af levedygtighed eller forsinkelse i udviklingen under inkubation. - Mærk æggene med startdatoen for inkubationen og markér oversiden af ægget (hvor embryoet vil blive placeret). De befrugtede æg udruges vandret ved 38 °C, indtil embryonerne har nået stadie 10 (33-38 timer) -11 (40-45 timer)19.
3. I ovo elektroporation
- Forberedelse til in ovo elektroporation
- Fremstilling af 0,25% hurtig grøn opløsning: Opløs 25 mg Fast Green FCF i 10 ml PBS. Opløsningen filtreres ved hjælp af et 0,2 μm sprøjtefilter. Løsningen kan opbevares hos RT.
- DNA-cocktail: Forbered injektionsopløsningen ved at blande de individuelle pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA-plasmider (subtrin 1.6.3) med Tol2-transposaseekspressionsplasmidet (pCAGGS-T2TP-vektor; se materialetabel) (5 μg/μL hver) i forholdet 2:1. Tilføj 1/10 volumen 0,25% hurtig grøn opløsning for at visualisere det injicerede område.
BEMÆRK: Den optimale DNA-koncentration kan variere afhængigt af konstruktionerne. - Opsætning af mikroinjektionsapparatet (figur 3A, B): Mikroinjektionsapparatet består af følgende (se materialetabel): Hamilton sprøjte, 18 G nål (nålelængde = 2"), PVC (polyvinylchlorid) slange (2 cm længde), mikropipettenål (kan fremstilles ved at trække kapillarrør med omega dot fiber (1 mm O.D. X 0,75 mm I.D) med en mikropipettetrækker).
- Fyld en Hamilton-sprøjte med tung mineralolie. Sæt en 18 G kanyle på sprøjten og fyld kanylens indre rum med olie ved at trykke sprøjtestemplet ned.
- Fastgør et stykke 2 cm lang PVC-slange til enden af kanylen og fyld slangen med olien.
- Sæt en trukket mikropipettekanyle på slangen. Afbryd spidsen af mikropipettenålen til en diameter på 10-20 μm med fine pincet for at lave en lille åbning. Fyld hele nålen med olie.
BEMÆRK: Man skal passe på ikke at fange luftbobler i systemet, da de ville hæmme strømmen af DNA-opløsningen.
- Kom 5 μL af den farvede DNA-cocktail (undertrin 3.1.2) på en steril petriskål. Under dissekeringsmikroskopet placeres spidsen af mikropipettenålen i DNA-opløsningen på den sterile petriskål og trækker langsomt opløsningen ind i nålen.
- Vent, indtil trykket er i ligevægt inde i og uden for nålen (for at undgå, at der kommer luft ind i nålen), og tag spidsen af nålen ud af DNA-opløsningen. Hold kanylespidsen nedsænket i sterilt PBS i et lille bægerglas indtil injektion.
- Opstilling af elektroporationsapparatet (figur 3A,C):
- Indstil et par platinelektroder med en elektrodeholder på en mikromanipulator. Afstanden mellem spidsen af elektroderne justeres til 2 mm (figur 3C, E).
- Tilslut elektroderne til en kvadratbølgepulsgenerator med kabler (se materialetabel).
- Mikroinjektion af DNA-opløsning (figur 3D)
- Fjern et kyllingæg fra inkubatoren og tør æggets overflade med et silkepapir gennemblødt i 70% ethanol.
- Sæt en 18 G kanyle på en 10 ml sprøjte. Stik kanylen ind gennem den stumpe ende af ægget, vinklet nedad (45°) for at undgå at beskadige æggeblommen.
- Træk 2-3 ml albumin ud af ægget. Forsegl hullet med et stykke skotsk tape. Bekræft, at embryoet og vitellinmembranen løsnes fra skallen ved at "gennemlyse" ægget med lys.
- Fjern et stykke æggeskal (cirkel med en diameter på 2-3 cm) fra toppen af ægget ved hjælp af saks og tang for at udsætte embryoet. Vinduet må ikke være mere end fem æg ad gangen for at forhindre udtørring af embryoner under elektroporation.
BEMÆRK: Hvis det er svært at åbne et vindue uden at revne ægget, kan hele toppen af ægget dækkes med Sellotape eller Scotch tape, før du fjerner et stykke æggeskal. - Indsæt spidsen af nålen i den optiske vesikel fra dens proksimale side i en vinkel på 45°, og injicer DNA-cocktailen ved langsomt at trykke (eller banke på) stemplet, indtil den blåfarvede opløsning fylder lumen (figur 3D).
BEMÆRK: Alternativt kan et trykmikroinjektionssystem (se materialetabellen) anvendes til injektion af DNA-opløsninger. - Træk kanylen ud og sæt spidsen tilbage i PBS.
- Elektroporation (figur 3E)
- Indstil pulsparametre for elektroporatoren som følger: Spænding: 15 V, Pulslængde: 50 ms, Pulsinterval: 950 ms, Pulsnummer: 5
- Tilsæt et par dråber HBSS på vitellinmembranen over embryoet. Sænk elektroderne ned i HBSS ved hjælp af mikromanipulatoren, vinkelret på embryoets forreste bageste akse.
BEMÆRK: Alternativt kan denne procedure udføres uden at tilføje HBSS, da albumin er en god elektrisk leder, der muliggør effektiv elektroporation. - Placer elektroderne på hver side (forreste (nasal) side og bageste (tidsmæssige) side) af den optiske vesikel (figur 3E). Sørg for, at elektroderne ikke berører embryoet eller blodkarrene. Anvend pulserende elektriske felter.
- Fjern elektroderne og rengør forsigtigt elektroderne med en vandgennemblødt steril vatpind for at undgå ophobning af albumin.
- Forsegl vinduet med Scotch tape og re-inkuber embryoet indtil det ønskede udviklingsstadium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konstruktion af Tol2 transposon konstruktioner til ekspression af kunstige miRNA'er mod Nel
Nel (Neural Epidermal vækstfaktor (EGF)-Like; også kendt som Nell2) er et ekstracellulært glycoprotein. Det har strukturelle ligheder med thrombospondin-1 og udtrykkes overvejende i nervesystemet20,21. Vi har tidligere vist, at Nel regulerer differentiering og overlevelse af retinale ganglionceller15 og fungerer som en hæmmende vejledning cue for retinale axoner22,23,24. I den udviklende chick retina detekteres Nel-ekspression i det formodede pigmentepitel ved HH15 (embryonal dag (E) 2,5). Ved HH20 (E3.5) observeres også Nel-ekspression i nyligt differentierede retinale ganglionceller. Stærk ekspression af Nel i pigmentepitel- og retinale ganglionceller fortsætter mindst indtil E1815.
For at undersøge funktionen af Nel i udviklingen af retinale ganglionceller blev ekspression af Nel-genet slået ned ved at indføre kunstige miRNA'er i den udviklende nethinden ved hjælp af ovo-elektroporation og Tol2-transposonsystemet15,16. For det første blev par enkeltstrengede DNA-oligonukleotider designet til 10 potentielle målsekvenser i den proteinkodende region af kyllingens Nel cDNA (GenBank-tiltrædelsesnummer: NM_001030740.1) ved hjælp af online RNAi-designværktøjet (se materialetabel). Oligonukleotidparrene blev udglødet og individuelt klonet ind i miRNA-ekspressionsvektoren. Derefter blev individuelle konstruktioner transfekteret til HEK293T celler, der stabilt udtrykker Nel-AP, og deres knockdown-effektivitet blev evalueret ved at måle AP-aktivitet i kulturmedierne. Det pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative kontrolplasmid blev anvendt som kontrol (figur 4A).
Tre Nel pre-miRNA-sekvenser, der viste de højeste knock down-effekter, blev valgt (mod henholdsvis nukleotider 482-502, 910-930 og 2461-2481 af kylling Nel cDNA), og to pre-miRNA-sekvenser blev tandemly klonet ind i miRNA-ekspressionsvektoren (pcDNA6.2-GW / EmGFP-2x Nel pre-miRNA) i henhold til producentens instruktioner17. Ekspressionskassetterne, der koder for de to pre-miRNA og EmGFP, blev forstærket af PCR med et kunstigt EcoRI-sted i begge ender (5′-GGGAATTCTCTGGCTAACTAGAGAAC-3′ og 5′-CCGAATTCCCTCTAGATCAACCACT-3′) og klonet ind i pT2K-CAGGS-vektoren (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA). Sekvensen af ekspressionskassetten blev bekræftet ved anvendelse af de primere, der blev anvendt til PCR. pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA-konstruktioner blev individuelt co-transfekteret med Tol2-transposaseekspressionsvektoren (pCAGGS-T2TP) til HEK293T celler, der stabilt udtrykker Nel-AP, og hæmmende virkninger på Nel-AP-ekspression blev evalueret ved at måle AP-aktiviteterne i kulturmedierne. Som vist i figur 4B blev knockdown-effektiviteten signifikant forbedret ved sammenkædning af to miRNA-sekvenser. Robust undertrykkelse af Nel-AP-ekspression (mere end 90%) blev observeret mindst indtil 13 dage efter transfektion (figur 4B).
Stabil undertrykkelse af Nel-ekspression i den udviklende chick retina
En pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA-konstruktion (indeholdende målsekvenser for nukleotider 482-502 og 2461-2481 af kyllingens Nel cDNA) blev co-transfekteret med transposaseekspressionsvektoren (pCAGGS-T2TP) ind i den tidsmæssige eller nasale side af kyllingens nethinde ved in ovo-elektroporation ved HH9-11 (figur 3, figur 5A). Sektioner blev fremstillet ud fra E4.5 eller E8 retina, og effekter på Nel-ekspression blev evalueret ved immunhistokemi ved anvendelse af anti-Nel-antistof22. Ved E4.5 blev ekspressionen af Nel i retinale pigmentepitel signifikant reduceret i EmGFP-ekspressive celler (figur 5B-D). Ved E8 blev fald i Nel-ekspression også tydeligt observeret i retinale ganglionceller (figur 5E-I). Signifikant undertrykkelse af Nel-ekspression fortsatte i hvert fald indtil E18 (data ikke vist). Indførelsen af kontrol-miRNA påvirkede ikke Nel-ekspression i nethinden (figur 5J-O).
Figur 1: Transponering af Tol2-flankeret cDNA ved transposase. Et skema, der viser transponering af en Tol2-flankeret ekspressionskassette til EmGFP og sammenkædede to pre-miRNA-sekvenser (2x pre-miRNA) ved transposase. Når en Tol2-transposonvektor indeholdende ekspressionskassetten (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA-konstruktion) indføres i celler med en Tol2-transposaseekspressionskonstruktion (pCAGGS-T2TP), udskæres Tol2-flankeret ekspressionskassette fra vektoren og integreres i værtsgenomet ved transposaseaktiviteten. Ekspression af EmGFP og miRNA'er drives af den allestedsnærværende promotor CAGGS. Dette tal er blevet ændret fra Nakamoto et al.15. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Struktur af det konstruerede pre-miRNA. (A) Den designede pre-miRNA-sekvens er baseret på murine miR-155 sekvens17. Den øverste streng oligo indeholder (fra 5'-enden til 3'-enden) et fire-nukleotidoverhæng (TGCT (blå)), antisensemålsekvens (21 nukleotider), terminal loopsekvens (rød) og sansmålsekvens (19 nukleotider). Antisense-målsekvensen repræsenterer den modne miRNA-sekvens. Den nederste streng oligo indeholder et fire-nukleotid 5' overhæng (CCTG (blå)) og den omvendte komplementsekvens af topstrengen oligo, men mangler fire-nukleotidudhænget i 3'-enden (AGCA-3': omvendt komplement af 5'-TGCT af topstrengoligoen). Sense-målsekvensen mangler nukleotider 9 og 10 i målsekvensen. De "ekstra" to nukleotider i antisensemålsekvensen danner en intern sløjfe i stam-loop-strukturen af det modne miRNA-molekyle, hvilket resulterer i en højere knockdown-hastighed17. (B) Et eksempel på målsekvens mod kylling Nel. Sanse- og antisensesekvenser i de øverste og nederste tråde for en målsekvens af kyllingens Nel-gen (GenBank-tiltrædelsesnummer NM_001030740.1, nukleotider 482-502) vises. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: I ovo-mikroinjektion og elektroporation. (A) Arbejdsstation til in ovo mikroinjektion og elektroporation. (1) Dissekering af mikroskop. (2) Injektionsapparatur. (3) Elektroporationsapparater. (4) Dobbelt svanehalsmikroskopbelysning. (5) Elektroporator. (B) Injektionsapparatur. En Hamilton-sprøjte (6) med en 18 G kanyle (7) er forbundet til PVC-slanger (8) og til en trukket mikropipettekanyle (9) og sat på en mikromanipulator (10). Apparatets indre rum er fyldt med tung mineralolie. C) Elektroporationsapparater. Et sæt platinelektroder (11) med en elektrodeholder (12) er indstillet på en mikromanipulator (13). Elektroderne er forbundet til elektroporatoren med kabler (14). D) Mikroinjektion af DNA-cocktailopløsning i den optiske vesikel ved HH 10-11. Den trukne mikropipettenål indsættes i den optiske vesikel fra dens proksimale side. DNA-cocktailopløsning med hurtig grøn (blå) injiceres i den optiske vesikel, indtil farvestoffet fylder hele lumen. E) Elektroporation i den optiske vesikel. Elektroder placeres parallelt (afstanden mellem elektroderne er 2 mm) og på en sådan måde, at den injicerede optiske vesikel er placeret mellem elektroderne: Den ene elektrode er placeret nær den forreste (nasal) overflade af den optiske vesikel, og den anden er i den bageste del af embryoet på baghjernens niveau. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: In vitro evaluering af individuelle eller kædede pre-miRNA sekvenser for Nel genundertrykkelse effektivitet. (A) Knockdown-effekter af individuelle pre-miRNA-sekvenser. Resultaterne af fem repræsentative konstruktioner (Antisense-målsekvenser svarende til nukleotidnumrene 482-502, 910-930, 1106-1126, 1663-1683 og 2461-2481 af kylling Nel cDNA (GenBank-tiltrædelsesnummer: NM_001030740.1)) vises. Individuelle miRNA-ekspressionskonstruktioner (pcDNA6.2-GW / EmGFP-Nel pre-miRNA) blev transfekteret til HEK293T celler, der stabilt udtrykker Nel-AP. PCDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativt kontrolplasmid blev anvendt som kontrol. Ekspression af Nel-AP blev evalueret ved at måle AP-aktiviteterne i kulturmedierne 48-96 timer efter transfektion. Tre Nel pre-miRNA-ekspressionskonstruktioner (mod henholdsvis nukleotider 482-502, 910-930 og 2461-2481) viste signifikant undertrykkelse af Nel-ekspression. (B) Knockdown-effekter af kædede pre-miRNA-sekvenser. To af de tre mest potente pre-miRNA-sekvenser (mod nukleotider 482-502, 910-930 og 2461-2481) blev tandemly klonet ind i pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-vektoren, og ekspressseksitetten (indeholdende de to pre-miRNA-sekvenser og EmGFP cDNA) blev overført til pT2K-CAGGS-vektoren (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA). pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA-konstruktionerne blev individuelt co-transfekteret med ekspressionsvektorer for Tol2-transposase (pCAGGS-T2TP) til HEK293T celler, der stabilt udtrykker Nel-AP, og ekspression af Nel-AP blev evalueret ved at måle AP-aktiviteterne i kulturmedierne fra 2 til 13 dage efter transfektion. Alle tre kombinationer (482-502/910-930, 482-502/2461-2481, 910-930/2461-2481) viste forbedrede undertrykkelsesaktiviteter sammenlignet med ukædede individuelle pre-miRNA-sekvenser. Signifikant undertrykkelse af Nel-AP-ekspression blev observeret fra dag 2 til mindst dag 13. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Stabil knockdown af Nel-ekspression i den udviklende chick retina ved Tol2 transposon-medieret integration af miRNA-transgen. En Tol2-transposonkonstruktion indeholdende en ekspressionskassette af to Nel pre-miRNA-sekvenser og EmGFP (pT2K-CAGGS-EmGFP-Nel pre-miRNA (482-502)-Nel pre-miRNA (2461-2481)) (A-I) eller en kontrolkonstruktion, der udtrykker et ikke-relateret miRNA og EmGFP (J-O), blev co-transfekteret med en transposaseekspressionsvektor (pCAGGS-T2TP) ind i den tidsmæssige eller nasale halvdel af den optiske vesikel ved in ovo elektroporation ved HH9-HH11 (E1.5). Retinale sektioner blev fremstillet ved E4.5 (B-D, J-L) eller E8 (E-I, M-O), og effektiviteten af Nel-genundertrykkelse blev undersøgt ved immunhistokemi ved anvendelse af anti-Nel-antistof (rød). Da DNA er negativt ladet, elektroporeres transgenerne ind i vævet på anodesiden; således blev kun halvdelen af nethinden mærket med EmGFP (transfektion (TF) side, grøn). (A) Ekspression af EmGFP-markørgenet i den temporale halvdel af nethinden ved E4.5. Den optiske sprække (hvid pil) repræsenterer grænsen mellem transfekterede og ikke-transfekterede (kontrol) sider. (B-I) RNAi knockdown af Nel ekspression i den udviklende chick nethinden. (B-D) Ved E4.5 reduceres Nel-ekspression signifikant (B, D) i retinale pigmentepitel (PE) celler, der udtrykker EmGFP (C, D). Bemærk det komplementære mønster af Nel-immunfarvning og EmGFP-ekspression i D. NR, neurale nethinden. (E-I) Ved E8 reduceres Nel-ekspression (E, G) i retinale pigmentepitel og ganglioncellelaget (GCL) på transfektionssiden (F, G). (H, I) Højere forstørrelsesvisninger af henholdsvis et transfektionsområde og et tilsvarende kontrolområde i E (angivet med små rektangler). (D,G) Flettede billeder af de to venstre billeder. (J-O) Ekspression af kontrol miRNA. Introduktion af den negative kontrolkonstruktion påvirker ikke ekspressionen af Nel i E4.5 (J-L) eller E8 (M-O) nethinden. (L,O) Flettede billeder af de to venstre billeder. Grænsen mellem transfektions- og kontrolsider er angivet med en stiplet linje i C, F, K og N. Skalastænger, 50 μm. (A) og (B-I) er blevet modificeret fra henholdsvis Nakamoto, M. & Nakamoto, C 16 og Nakamoto etal.15. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Opsætning af udglødningsreaktion | |
| Topstreng oligo (200 μM i TE-buffer) | 5 μL (slutkoncentration 50 μM) |
| Bundstreng oligo (200 μM i TE-buffer) | 5 μL (slutkoncentration 50 μM) |
| 10x Oligo udglødningsbuffer* | 2 μL |
| DNase/RNasefrit vand* | 8 μL |
| Total | 20 μL |
| * Leveres i miRNA-ekspressionssættet (se materialetabel) | |
Tabel 1: Opsætning af udglødningsreaktion
| 2x AP substrat buffer | |
| 10 m diethanolamin (pH 9,8) | 4 ml |
| 1 M MgCl2 | 10 μL |
| L-homoarginin | 45 mg |
| Bovin serumalbumin (BSA) | 10 mg |
| p-nitrophenylphosphat | 63 mg |
| H2O | Tilføj for at udgøre et samlet volumen på 20 ml |
Tabel 2: 2x AP-substratbuffer. Opløsningen skal opbevares i delprøver ved -20 °C og beskyttes mod lys, da p-nitrophenylphosphat er lysfølsomt.
| Opsætning af reaktion | |||
| pcDNA6.2-GW/EmGFP-2x pre-miRNA-plasmid (fra afsnit 1.5) eller pcDNA6,2-GW/EmGFP-miRNA-negativt kontrolplasmid* (0,1 μg/μL) |
1 μL | ||
| 10x Pfu-buffer | 5 μL | ||
| dNTP-blanding (10 mM hver af dATP, dCTP, dGTP og dTTP) | 1 μL | ||
| EmGFP fremadgående primer* (5'-GGCATGGACGAGCTGTACAA-3'; 10 μM) | 1 μL | ||
| miRNA omvendt primer* (5'- CTCTAGATCAACCACTTTGT-3'; 10 μM) | 1 μL | ||
| Pfu DNA-polymerase (5 enheder/μL) | 0,5 μL | ||
| H2O | 40,5 μL | ||
| Samlet volumen | 50 μL | ||
| * Leveres i miRNA-ekspressionssættet. | |||
| Termocykliske forhold | |||
| 94 °C | 5 minutter | ||
| 30 cyklusser af følgende: | |||
| 94 °C | 45 s | ||
| 58 °C | 1 min | ||
| 72 °C | 2 minutter | ||
| 72 °C | 10 minutter | ||
Tabel 3: Reaktionsopsætning og termocykelforholdene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol giver en detaljeret vejledning til genhæmning i den udviklende chick retina ved transgen ekspression af kunstige miRNA'er ved anvendelse af i ovo elektroporation og Tol2 transposon systemet.
Følgende faktorer er af afgørende betydning for at udføre denne teknik med succes. For det første er det afgørende at bruge miRNA-sekvenser, der er bekræftet for at udøve robuste knockdown-effekter. Før du anvender dem til in ovo-elektroporation , skal du teste individuelle pre-miRNA-sekvenser for genundertrykkelseseffektivitet i in vitro-assays (trin 1.4) og kæde to pre-miRNA-sekvenser, der viser de højeste knockdown-aktiviteter (trin 1.5). For det andet er det vigtigt ikke at beskadige den optiske vesikel og det omgivende nervevæv, når mikropipettenålen indsættes til injektion af DNA-opløsningen. Overdreven skade på embryoner kan føre til embryonale misdannelser og død. For at undgå vævsskader skal du indføre mikropipetten i den optiske vesikel i den rigtige retning. Mindre og skarpere spidser af mikropipettenålen ville gøre penetration af synsvesiklen glattere og resultere i mindre vævsskade. Imidlertid har nåle med meget små spidser svært ved at indlæse og frigive DNA-opløsningen. I den her beskrevne undersøgelse blev nåle med en spidsåbning på 10-20 μm i diameter anvendt. For det tredje skal du sørge for at fylde hele den optiske vesikel med DNA-opløsningen (som visualiseret ved spredning af hurtig grøn). For det fjerde skal du placere elektroderne i de optimale positioner for at målrette DNA'er ind i det ønskede område af den optiske vesikel (f.eks. Tidsmæssig side, næseside). Negativt ladede DNA-molekyler vil bevæge sig mod anodesiden; Derfor påvirker den præcise placering og orientering af elektroderne kritisk de endelige resultater. Endelig skal du bruge de optimale DNA-koncentrationer og elektroporationsparametre.
Hvis der ikke observeres noget fluorescerende signal efter 24 timers elektroporation, skal følgende overvejes: (1) Bekræft, at de elektroporerede plasmider har korrekte sekvenser. (2) Kontroller koncentrationen og renheden af individuelle plasmider igen. (3) Sørg for, at DNA-opløsningen fylder lumen i den optiske vesikel, og at den ikke diffunderer væk i neuralrøret. (4) Kontroller, at de anvendte elektroporationsparametre er korrekte. (5) Kontroller, at elektroderne er i kontakt med vitellinmembranen, mens de elektriske impulser påføres.
Kombinationen af in ovo-elektroporation og en transposonmedieret genintegrationsmetode i denne protokol giver flere forskellige fordele. For det første understøtter det den stabile produktion af miRNA'er og dermed vedvarende undertrykkelse af målgener. Udviklingen af kyllingens nethinde starter ved E1.5 og fortsætter indtil udklækning (retinale ganglionceller produceres i perioden fra E2 til E9). Til tab-af-funktion analyse af genfunktion bør ekspression af kunstige miRNA'er opretholdes stabilt i denne periode. Ekspression af RNAi-sekvenser ved hjælp af konventionelle ekspressionsvektorer er generelt forbigående, fordi ekspressionskonstruktionen ikke integreres effektivt i kromosomer. I den her beskrevne metode medieres kromosomintegration af ekspresssektoren imidlertid af aktiviteten af co-elektroporeret transposase, hvilket resulterer i stabil ekspression af transgenerne.
For det andet inducerer den samme CAGGS-promotor i denne metode co-cistronisk ekspression af flere miRNA-sekvenser og EmGFP-markøren i transfekterede celler, hvorved risikoen for promotorinterferens omgås, hvilket er en af de almindelige komplikationer med retrovirale vektorer, der indeholder to promotorer, for at opnå dobbelt genekspression25.
Endelig overføres transgenet, der elektroporeres ved denne metode, i modsætning til replikationskompetente retrovirale vektorer ikke til naboceller. Derfor kan transfektionsområdet styres mere præcist ved at anvende de relevante typer elektroder og ved at placere dem i de korrekte positioner.
På trods af fordelene beskrevet ovenfor har den nuværende metode også begrænsninger, der er forbundet med ovo-elektroporation . For eksempel kan transfektions- og gensuppressionshastigheden variere mellem embryoner, og det kan være nødvendigt at transfektere et relativt stort antal embryoner til analyse. Derudover har elektroporation i fosternethinden i ovo på senere udviklingsstadier (f.eks. E4-E5) eksperimentelle vanskeligheder, fordi øjnene er placeret tæt på hjertet på disse stadier, hvilket øger risikoen for hjertestop efter elektroporation.
Det her beskrevne system tillader hurtig og robust genundertrykkelse i den udviklende chick nethinden. Denne tilgang kan også anvendes på andre dele af kyllingembryoet, herunder neurale og ikke-neurale væv. Vi forventer derfor, at dette system kan bidrage til belysning af molekylære mekanismer for kyllingudvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
pT2K-CAGGS- og pCAGGS-T2TP-vektorerne blev venligst leveret af henholdsvis Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Kyoto, Japan) og Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Mishima, Japan). Vi takker Michael Berberoglu for hans afgørende læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Royal Society and Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (UK) til M.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G needle, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A and AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 and Q202 | Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB cables | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 cables | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 square wave electroporator | Nepa Gene | CUY21 | |
| Diethanolamine (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Dissecting microscope | |||
| Egg incubator | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| Electrode holder | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli cells |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers | ||
| Gooseneck fiber light source | |||
| FuGene 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Hamilton syringe (50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Hanks' balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-Homoarginine | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulator | Narishige (Japan) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Micropipette puller | Shutter Instrument | P97 | |
| p-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Optional) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Thermal cycler |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).
- Funahashi, J., et al. Role of Pax-5 in the regulation of a mid-hindbrain organizer's activity. Development, Growth & Differentiation. 41 (1), 59-72 (1999).
- Harada, H., Omi, M., Nakamura, H. In ovo electroporation methods in chick embryos. Methods in Molecular Biology. 1650, 167-176 (2017).
- Hu, W. Y., Myers, C. P., Kilzer, J. M., Pfaff, S. L., Bushman, F. D. Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference. Current Biology. 12 (15), 1301-1311 (2002).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Development, Growth & Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Koga, A., Iida, A., Hori, H., Shimada, A., Shima, A. Vertebrate DNA transposon as a natural mutator: the medaka fish Tol2 element contributes to genetic variation without recognizable traces. Molecular Biology and Evolution. 23 (7), 1414-1419 (2006).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kawakami, K., Imanaka, K., Itoh, M., Taira, M. Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Gene. 338 (1), 93-98 (2004).
- Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 2 (2), 616-624 (2007).
- Kawakami, K., Noda, T. Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells. Genetics. 166 (2), 895-899 (2004).
- Hou, X., et al. Conditional knockdown of target gene expression by tetracycline regulated transcription of double strand RNA. Development, Growth & Differentiation. 53, 69-75 (2011).
- Nakamoto, C., et al. Nel positively regulates the genesis of retinal ganglion cells by promoting their differentiation and survival during development. Molecular Biology of the Cell. 25 (2), 234-244 (2014).
- Nakamoto, M., Nakamoto, C. iRetinal Development: Methods and Protocols. Vol. 2092 Methods in Molecular Biology. Mao, C. -A. 8, Springer. 91-108 (2020).
- BLOCK-iT PolII miR RNAi Expression Vector Kits, User Manual Pol II miR RNAi Expression Vector Kits. Invitrogen. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&title=BLOCK-iT&trade (2021).
- Flanagan, J. G., et al. Alkaline phosphatase fusions of ligands or receptors as in situ probes for staining of cells, tissues, and embryos. Methods in Enzymology. 327, 19-35 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. I. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a M(r) 93 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 203 (2), 212-222 (1995).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a Mr 91 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 207 (2), 233-234 (1996).
- Jiang, Y., et al. In vitro guidance of retinal axons by a tectal lamina-specific glycoprotein Nel. Molecular and Cellular Neuroscience. 41 (2), 113-119 (2009).
- Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions. Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).
- Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue. Development. 146 (4), (2019).
- Yee, J. K., et al. Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).
