Summary
Desenvolvemos uma nova abordagem de perda de função que envolve a introdução e integração genômica de sequências artificiais de micro-RNA em embriões de pintinhos usando eletroporação em ovo e o sistema transposon Tol2. Esta técnica fornece uma metodologia robusta e estável de knockdown gênico para estudos da função gênica durante o desenvolvimento.
Abstract
A retina de pintinhos tem sido um importante sistema modelo em neurobiologia do desenvolvimento, com vantagens que incluem seu grande tamanho, rápido desenvolvimento e acessibilidade para visualização e manipulações experimentais. No entanto, sua principal limitação técnica tem sido a falta de abordagens robustas de perda de função para análises de função gênica. Este protocolo descreve uma metodologia de silenciamento gênico na retina de pintinhos em desenvolvimento que envolve a expressão transgênica de microRNAs artificiais (miRNAs) usando o sistema transposon Tol2. Nesta abordagem, um plasmídeo transposon Tol2 que contém um de expressão para o marcador EmGFP (proteína fluorescente verde esmeralda) e sequências artificiais de pré-miRNA contra um gene alvo é introduzido na retina embrionária de pintinhos com uma construção de expressão de transposase de Tol2 por eletroporação in ovo . Nas células retinianas transfectadas, a transposase catalisa a excisão do de expressão do vetor transposon e sua integração nos cromossomos do hospedeiro, levando à expressão estável de miRNAs e da proteína EmGFP. Em nosso estudo anterior, demonstramos que a expressão de Nel, uma glicoproteína que exerce múltiplas funções no desenvolvimento neural, pode ser significativamente suprimida na retina de pintinhos em desenvolvimento usando esta técnica. Nossos resultados indicam que esta metodologia induz uma supressão estável e robusta da expressão gênica e, portanto, fornece uma abordagem eficiente de perda de função para estudos do desenvolvimento da retina.
Introduction
A retina de vertebrados é um importante sistema modelo para o estudo do desenvolvimento neural. Apesar de sua localização periférica, a retina é anatômica e em desenvolvimento uma extensão do sistema nervoso central, e o nervo óptico, que consiste em axônios de células ganglionares da retina, representa um trato dentro do sistema nervoso central. A retina de pintinhos tem vantagens significativas como um sistema modelo para estudar o mecanismo molecular do desenvolvimento neural: é grande e se desenvolve rapidamente; tem semelhanças estruturais e funcionais com a retina humana; É altamente acessível para visualização e manipulações experimentais. Mecanismos moleculares de proliferação e diferenciação celular, morfogênese e orientação axonal durante o desenvolvimento neural têm sido extensivamente estudados usando a retina de galinha.
A eletroporação in ovo tem sido utilizada com sucesso nas últimas duas décadas para introduzir genes ectópicos em células do embrião de pintinhos em desenvolvimento. Esta técnica permite a marcação de células em desenvolvimento, o rastreamento do destino celular e o rastreamento da migração celular e dos tratos axonais, bem como a expressão gênica ectópica para análise in vivo da função gênica. As condições de eletroporação in ovo para a expressão gênica ectópica eficiente em embriões de pintinhos estão bem estabelecidas 1,2,3.
Apesar dessas vantagens, a falta de uma técnica estável de perda de função para estudos da função gênica tem sido uma grande limitação técnica do embrião de pintinho. Enquanto embriões de pintinhos eletroporados com pequenos RNAs interferentes (siRNAs)4 ou vetores de expressão para RNAs curtos (shRNAs)5 apresentam knockdown do gene alvo, a supressão gênica nessas abordagens é transitória porque os efeitos desaparecem quando as células perdem os RNAs ou DNAs introduzidos. Uma supressão gênica mais estável pode ser obtida pela entrega de siRNAs em embriões de pintos por um sistema de retrovírus RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) with a Splice acceptor)6. O vetor viral integra-se ao genoma do hospedeiro, e os genes ectópicos são expressos de forma estável. No entanto, o retrovírus só pode se integrar ao genoma de células em divisão durante a fase mitótica (M) do ciclo celular, o que pode impor uma limitação nos estágios de desenvolvimento e/ou tipos celulares para os quais essa abordagem de perda de função pode ser aplicada. Além disso, a expressão de transgenes por RCAS parece mais lenta e menos robusta do que a induzida pela eletroporação in ovo 7.
Transposons são elementos genéticos que se movem de um local no genoma para outro. O elemento Tol2 é um membro da família de elementos transponíveis hAT e contém um gene interno que codifica uma transposase que catalisa a reação de transposon do elemento Tol28. Quando um vetor plasmidial que carrega um de expressão gênica flanqueado pelas sequências das extremidades esquerda e direita dos elementos Tol2 (200 pb e 150 pb, respectivamente) é introduzido em células vertebradas com uma construção de expressão de transposase de Tol2, o de expressão é extirpado do plasmídeo e integrado ao genoma do hospedeiro, o que suporta uma expressão estável do gene ectópico (Figura 1). Tem sido demonstrado que o elemento transponível Tol2 pode induzir a transposição gênica de forma muito eficiente em diferentes espécies de vertebrados, incluindo zebrafish9,10, rãs 11, pintos 12 e camundongos 13, sendo, portanto, um método útil de transgênese e mutagênese insercional. O sistema transposon Tol2 tem sido usado com sucesso para knockdown condicional de um gene alvo por integração genômica de siRNA que é processado a partir de RNA de fita dupla longa14.
Este protocolo descreve uma abordagem de perda de função no embrião de pintinho que envolve a introdução de microRNAs artificiais (miRNAs) pelo sistema transposon Tol215,16. Nesta abordagem, um de expressão para o marcador EmGFP (proteína fluorescente verde esmeralda) e miRNAs artificiais contra um gene alvo é clonado em um vetor transposon Tol2. A construção transposon Tol2 é então introduzida na retina embrionária de pintos com uma construção de expressão transposase Tol2 por eletroporação in ovo. Nas células retinianas transfectadas, a transposase catalisa a excisão do de expressão do vetor transposon e sua integração nos cromossomos do hospedeiro, levando à expressão estável de miRNAs e da proteína EmGFP. Em nossos estudos anteriores, derrubamos com sucesso a expressão de Nel, uma glicoproteína extracelular predominantemente expressa no sistema nervoso, na retina de pintinhos em desenvolvimento (ver Resultados Representativos). Nossos resultados indicam que a supressão gênica estável e eficiente pode ser alcançada em ovo por esta técnica.
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Protocol
1. Construção de vetores de expressão de miRNA
NOTA: Os procedimentos para a construção de vetores de expressão de miRNA (etapas 1.1-1.3, 1.5-1.6.) são otimizados para o kit de expressão de miRNA, Block-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP, conforme descrito anteriormente15,16. O kit fornece o vetor de expressão projetado para permitir a expressão de miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), um vetor de controle (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-plasmídeo de controle negativo), reagentes acessórios e instruções para produzir vetores de expressão de miRNA (ver Tabela de Materiais)17.
- Projetando oligos de DNA de fita simples codificando pré-miRNAs contra o gene alvo: Projetar oligos de DNA de fita simples ("top strand" oligos (target pre-miRNAs) e "bottom fit" oligos (complementos de top strand oligos)) usando a ferramenta on-line, RNAi Designer (veja Tabela de Materiais). Veja a Figura 2 para as características requeridas dos oligos de fita simples (Figura 2A) e exemplos de sequências alvo (Figura 2B).
NOTA: Recomenda-se que 5-10 sequências de pré-miRNA sejam geradas para um determinado gene alvo e rastreadas para atividades knockdown in vitro (etapa 1.4). - Recozimento dos oligos de fita superior e inferior para gerar um oligo de fita dupla
- Estabelecer a seguinte reação de anelamento (Tabela 1) em um tubo de microcentrífuga estéril de 0,5 mL.
- Incubar a mistura de reacção a 95 °C durante 4 min. Recozer os oligos de fita superior e inferior para gerar um oligo de fita dupla, permitindo que a mistura de reação resfrie à temperatura ambiente (RT) por 5-10 min. Centrifugar a amostra brevemente (~5 s).
NOTA: Os oligos recozidos podem ser armazenados a -20 °C sem degradação durante, pelo menos, um ano.
- Clonagem dos oligos de fita dupla no vetor de expressão de miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA (Provided in the miRNA expression kit)): Clone oligos individuais de fita dupla no vetor de expressão de miRNA linearizado, de acordo com o manual do fabricante17.
- Avaliação dos efeitos knockdown
NOTA: Recomenda-se que sequências individuais de miRNA sejam testadas quanto à eficiência de supressão gênica in vitro antes de serem aplicadas em ovo. A eficiência do knockdown pode ser testada transfectando plasmídeos de expressão de miRNA em uma linhagem celular que expressa o gene alvo. Alternativamente, plasmídeos individuais de expressão de miRNA podem ser co-transfectados em linhagens celulares com uma construção de expressão para o gene alvo. Para genes alvo que codificam proteínas que não estão ancoradas na membrana em seu estado nativo (por exemplo, proteínas solúveis), uma proteína de fusão de fosfatase alcalina (AP) pode ser usada para monitorar a expressão da proteína-alvo. Uma sequência de cDNA que codifica a proteína-alvo pode ser fundida em frame à fosfatase alcalina placentária humana em vetores AP-tag (APtag-1- APtag-5; ver Tabela de Materiais) e introduzida nas células18. Quando expressa em células de cultura (por exemplo, células HEK293T), a proteína-alvo marcada com AP é secretada em altos níveis em meios de cultura e, portanto, os efeitos knockdown das sequências de miRNA podem ser avaliados medindo a diminuição da atividade de AP nos meios de cultura de células transfectadas com miRNA (subetapas 1.4.1-1.4.4).- A cultura HEK293T células em uma placa de 24 poços (8 x 104 células/poço) durante a noite. Transfect transitoriamente as células com expressão individual de miRNA constrói com um plasmídeo de expressão de uma proteína-alvo marcada com AP. Use o plasmídeo de controle negativo pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA (fornecido no kit de expressão de miRNA) como controle. (Se forem usadas linhagens celulares que expressam de forma estável uma proteína-alvo marcada com AP, transfecte as células apenas com construções individuais de expressão de miRNA.)
NOTA: Um reagente de lipofecção convencional (ver Tabela de Materiais) é usado para transfecção. - Coletar o meio condicionado 48-72 h após a transfecção e inativar a atividade AP endógena em banho-maria a 65 °C por 5 min. Detritos spinout em uma microcentrífuga de mesa na velocidade máxima por 5 min.
- Tamponar o sobrenadante com HEPES 10 mM, pH 7,0 e passar por um filtro de 0,45 μm.
- Tomar 100 μL (para medição em um leitor de placas) ou 500 μL (para um espectrofotômetro) do sobrenadante e adicionar uma quantidade igual de tampão de substrato 2x AP (Tabela 2). Verifique a atividade AP medindo OD405 em um leitor de placas ou em um espectrofotômetro.
NOTA: Se a atividade AP do meio condicionado for muito alta para medição precisa, dilua-o com tampão HBAH (solução salina balanceada de Hanks (HBSS), albumina de soro bovino 0,5 mg/mL, HEPES 20 mM (pH 7,0)) ou outro tampão que contenha uma proteína transportadora. Não use tampões contendo fosfato (por exemplo, PBS) porque o fosfato inorgânico atua como um inibidor competitivo da PA.
- A cultura HEK293T células em uma placa de 24 poços (8 x 104 células/poço) durante a noite. Transfect transitoriamente as células com expressão individual de miRNA constrói com um plasmídeo de expressão de uma proteína-alvo marcada com AP. Use o plasmídeo de controle negativo pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA (fornecido no kit de expressão de miRNA) como controle. (Se forem usadas linhagens celulares que expressam de forma estável uma proteína-alvo marcada com AP, transfecte as células apenas com construções individuais de expressão de miRNA.)
- Encadeamento da sequência de miRNA
NOTA: Os efeitos knockdown podem ser aumentados encadeando diferentes miRNAs contra o mesmo gene alvo ou repetindo o mesmo miRNA. O vetor de expressão de miRNA suporta o encadeamento de múltiplas sequências de pré-miRNA e sua expressão co-cistrônica17.- Encadear duas sequências diferentes de pré-miRNA (contra o mesmo gene alvo) que apresentam maior atividade knockdown em ensaios in vitro (passo 1.4), de acordo com as instruções do fabricante17.
- Avaliar a eficiência de supressão gênica das construções encadeadas usando ensaios in vitro conforme descrito na etapa 1.4. Se três ou mais sequências de pré-miRNA mostrarem atividades de knockdown igualmente altas, teste diferentes combinações de duas sequências e use as combinações que mostram a maior atividade de knockdown (veja Resultados Representativos).
- Transferindo o de expressão EmGFP-pre-miRNA para o vetor transposon Tol2
NOTA: O de expressão contendo cDNA EmGFP e duas sequências de pré-miRNA é transferido para o vetor transposon Tol2 (vetor pT2K-CAGGS, ver Tabela de Materiais). Para este fim, o de expressão (abrangendo desde a extremidade 3' do promotor do CMV até o sítio do primer de sequenciamento reverso de miRNA do vetor de expressão de miRNA) é amplificado por PCR usando primers com um sítio enzimático de restrição artificial, e o produto da PCR é clonado no vetor transposon Tol2. O vetor transposon Tol2 contém o promotor CAGGS onipresente, que impulsiona a expressão do de expressão inserido. O promotor CAGGS e o de expressão são ladeados pelas sequências de Tol2 (Figura 1).- Amplificação por PCR do de expressão EmGFP-pre-miRNA: Siga a configuração da reação e as condições de termociclagem descritas na Tabela 3.
- Ligate o produto da PCR purificado em gel (c. 1,3 kb) no vetor de transposon Tol2 digerido pela enzima de restrição. Eletroporar o plasmídeo em células competentes de E. coli (ver Tabela de Materiais) e selecionar os recombinantes (construções de miRNA pT2K-CAGGS-EmGFP-2x).
- Prepare o plasmídeo usando um kit maxiprep convencional (ver Tabela de Materiais). Verificar a estrutura e a sequência do plasmídeo por meio do mapeamento de restrição e do uso dos primers utilizados para a PCR, respectivamente.
2. Armazenamento e incubação dos ovos
- Compre ovos fertilizados de leghorn branco (Gallus gallus) de fazendas locais ou vendedores comerciais.
NOTA: Os ovos podem ser mantidos a 12-16 °C ou a 4 °C até 1 semana antes da incubação, sem perda significativa de viabilidade ou atraso no desenvolvimento durante a incubação. - Rotule os ovos com a data de início de incubação e marque o lado superior do ovo (onde o embrião será posicionado). Incubar os ovos fertilizados em posição horizontal a 38 °C até que os embriões atinjam os estágios 10 (33-38 h) -11 (40-45 h) de Hamburger e Hamilton (H)19.
3. Em ovo eletroporação
- Preparação para eletroporação in ovo
- Preparação de solução verde rápida a 0,25%: Dissolver 25 mg de Fast Green FCF em 10 mL de PBS. Filtrar a solução utilizando um filtro de seringa de 0,2 μm. A solução pode ser armazenada em RT.
- Coquetel de DNA: Preparar a solução de injeção misturando os plasmídeos individuais de miRNA pT2K-CAGGS-EmGFP-2x (subetapa 1.6.3) com o plasmídeo de expressão da transposase Tol2 (vetor pCAGGS-T2TP; ver Tabela de Materiais) (5 μg/μL cada) na proporção de 2:1. Adicionar 1/10 volume de solução verde rápida a 0,25% para visualizar a área injetada.
NOTA: A concentração ótima de DNA pode variar dependendo das construções. - Montagem do aparelho de microinjeção (Figura 3A,B): O aparelho de microinjeção consiste nos seguintes itens (ver Tabela de Materiais): seringa de Hamilton, agulha de 18 G (comprimento da agulha = 2"), tubulação de PVC (cloreto de polivinila) (2 cm de comprimento), agulha de micropipeta (pode ser feita puxando tubos capilares com fibra de ponto ômega (1 mm D.O. X 0,75 mm I.D.) com um puxador de micropipeta).
- Encha uma seringa Hamilton com óleo mineral pesado. Ligue uma agulha de 18 G à seringa e preencha o espaço interior da agulha com óleo, deprimindo o êmbolo da seringa.
- Coloque um pedaço de tubo de PVC de 2 cm de comprimento na extremidade da agulha e encha o tubo com o óleo.
- Conecte uma agulha de micropipeta puxada à tubulação. Quebre a ponta da agulha da micropipeta para um diâmetro de 10-20 μm por pinças finas para fazer uma pequena abertura. Encha toda a agulha com óleo.
NOTA: Deve-se tomar cuidado para não reter bolhas de ar no sistema, pois elas inibiriam o fluxo da solução de DNA.
- Colocar 5 μL do cocktail de ADN colorido (subpasso 3.1.2) numa placa de Petri estéril. Sob o microscópio dissecante, coloque a ponta da agulha de micropipeta na solução de DNA na placa de Petri estéril e retire lentamente a solução para dentro da agulha.
- Aguarde até que a pressão se equilibre dentro e fora da agulha (para evitar que o ar entre na agulha) e retire a ponta da agulha da solução de DNA. Mantenha a ponta da agulha submersa em PBS estéril em um copo pequeno até a injeção.
- Montagem do aparelho de eletroporação (Figura 3A,C):
- Coloque um par de eletrodos de platina com um suporte de eletrodos em um micromanipulador. Ajustar o espaçamento entre a ponta dos eletrodos para 2 mm (Figura 3C,E).
- Conecte os eletrodos a um gerador de pulso de onda quadrada com cabos (consulte Tabela de Materiais).
- Microinjeção de solução de DNA (Figura 3D)
- Retire um ovo de galinha da incubadora e limpe a superfície do ovo com um papel de seda embebido em etanol 70%.
- Anexe uma agulha de 18 G a uma seringa de 10 ml. Introduza a agulha através da extremidade romba do ovo, inclinada para baixo (45°) para evitar danificar a gema.
- Retire 2-3 mL de albumina do ovo. Feche o orifício com um pedaço de fita adesiva. Confirme se o embrião e a membrana vitelínica estão desprendidos da casca "candling" o ovo com luz.
- Retire um pedaço de casca de ovo (círculo de 2-3 cm de diâmetro) da parte superior do ovo usando tesoura e pinça para expor o embrião. Não retire mais de cinco ovos ao mesmo tempo para evitar a secagem dos embriões durante a eletroporação.
NOTA: Se for difícil abrir uma janela sem quebrar o ovo, toda a parte superior do ovo pode ser coberta com fita adesiva ou fita adesiva antes de remover um pedaço de casca de ovo. - Insira a ponta da agulha na vesícula óptica a partir de seu lado proximal em um ângulo de 45° e injete o coquetel de DNA pressionando lentamente (ou tocando) o êmbolo até que a solução de cor azul preencha o lúmen (Figura 3D).
NOTA: Alternativamente, um sistema de microinjeção sob pressão (ver Tabela de Materiais) pode ser usado para a injeção de soluções de DNA. - Retire a agulha e coloque sua ponta de volta no PBS.
- Eletroporação (Figura 3E)
- Defina os parâmetros de pulso do eletroporator da seguinte forma: Tensão: 15 V, Comprimento de pulso: 50 ms, Intervalo de pulso: 950 ms, Número de pulso: 5
- Adicione algumas gotas de HBSS na membrana vitelínica sobre o embrião. Abaixe os eletrodos para dentro da HBSS usando o micromanipulador, perpendicularmente ao eixo anteroposterior do embrião.
NOTA: Alternativamente, este procedimento pode ser feito sem adição de HBSS, pois a albumina é um bom condutor elétrico que permite uma eletroporação eficiente. - Posicionar os eletrodos em ambos os lados (anterior (nasal) e posterior (temporal) da vesícula óptica (Figura 3E). Certifique-se de que os eléctrodos não tocam o embrião ou os vasos sanguíneos. Aplicar campos elétricos pulsados.
- Retire os eletrodos e limpe suavemente os eletrodos com um cotonete estéril embebido em água para evitar o acúmulo de albumina.
- Sele a janela com fita Scotch e incube novamente o embrião até o estágio de desenvolvimento desejado.
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Representative Results
Construção de construtos de transposon Tol2 para expressão de miRNAs artificiais contra Nel
Nel (Neural Epidermal growth factor (EGF)-Like; também conhecido como Nell2) é uma glicoproteína extracelular. Apresenta semelhanças estruturais com a trombospondina-1 e é predominantemente expressa no sistema nervoso20,21. Demonstramos anteriormente que o Nel regula a diferenciação e a sobrevivência das células ganglionares da retina15 e atua como uma pista de orientação inibitória para os axônios da retina22,23,24. Na retina de pintinhos em desenvolvimento, a expressão de Nel é detectada no epitélio pigmentar presuntivo em HH15 (dia embrionário (E) 2,5). Na HH20 (E3.5), a expressão de Nel também é observada em células ganglionares retinianas recém-diferenciadas. A forte expressão de Nel no epitélio pigmentar e nas células ganglionares da retina continua pelo menos até E1815.
Para examinar a função de Nel no desenvolvimento das células ganglionares da retina, a expressão do gene Nel foi derrubada pela introdução de miRNAs artificiais na retina em desenvolvimento usando eletroporação em ovo e o sistema transposon Tol215,16. Primeiro, pares de oligonucleotídeos de DNA de fita simples foram projetados para 10 sequências-alvo potenciais na região codificadora de proteínas do cDNA Nel de galinha (número de acesso GenBank: NM_001030740.1) usando a ferramenta de projeto de RNAi on-line (ver Tabela de Materiais). Os pares de oligonucleotídeos foram recozidos e clonados individualmente no vetor de expressão de miRNA. Em seguida, construtos individuais foram transfectados em células HEK293T que expressam Nel-AP de forma estável, e suas eficiências de knockdown foram avaliadas medindo-se a atividade de AP nos meios de cultura. O plasmídeo controle pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativo foi utilizado como controle (Figura 4A).
Três sequências de pré-miRNA de Nel que apresentaram maiores efeitos knock down foram selecionadas (contra os nucleotídeos 482-502, 910-930 e 2461-2481 de cDNA de Nel de galinha, respectivamente), e duas sequências de pré-miRNA foram clonadas no vetor de expressão de miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-2x Nel pre-miRNA), de acordo com as instruções do fabricante17. As de expressão que codificam os dois pré-miRNA e EmGFP foram amplificadas por PCR com um sítio EcoRI artificial em ambas as extremidades (5′-GGGAATTCTCTGGCTAACTAGAGAAC-3′ e 5′-CCGAATTCCCTCTAGATCAACCACT-3′) e clonadas no vetor pT2K-CAGGS (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA). A sequência do de expressão foi confirmada utilizando-se os primers utilizados para a PCR. As construções de pré-miRNA pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel foram individualmente co-transfectadas com o vetor de expressão da transposase Tol2 (pCAGGS-T2TP) em células HEK293T que expressam Nel-AP de forma estável, e os efeitos inibitórios sobre a expressão de Nel-AP foram avaliados medindo as atividades de AP nos meios de cultura. Como mostrado na Figura 4B, a eficiência do knockdown foi significativamente aumentada pelo encadeamento de duas sequências de miRNA. Supressão robusta da expressão de Nel-AP (mais de 90%) foi observada pelo menos até 13 dias após a transfecção (Figura 4B).
Supressão estável da expressão de Nel na retina de pintinhos em desenvolvimento
Uma construção pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pré-miRNA (contendo sequências alvo para os nucleotídeos 482-502 e 2461-2481 do cDNA de Nel de galinha) foi co-transfectada com o vetor de expressão de transposase (pCAGGS-T2TP) para o lado temporal ou nasal da retina de pintinhos por eletroporação in ovo em HH9-11 (Figura 3, Figura 5A). Os cortes foram preparados a partir das retinas E4.5 ou E8, e os efeitos sobre a expressão de Nel foram avaliados por imunohistoquímica usando o anticorpo anti-Nel22. Em E4.5, a expressão de Nel no epitélio pigmentar da retina foi significativamente reduzida nas células que expressam EmGFP (Figura 5B-D). Em E8, reduções na expressão de Nel também foram claramente observadas nas células ganglionares da retina (Figura 5E-I). A supressão significativa da expressão de Nel continuou pelo menos até E18 (dados não mostrados). A introdução de miRNA controle não afetou a expressão de Nel na retina (Figura 5J-O).
Figura 1: Transposição de cDNAs flanqueados por Tol2 por transposase. Um esquema mostrando a transposição de um de expressão flanqueado por Tol2 para EmGFP e encadeado duas sequências de pré-miRNA (2x pré-miRNA) por transposase. Quando um vetor transposon Tol2 contendo o de expressão (construção miRNA pT2K-CAGGS-EmGFP-2x) é introduzido em células com uma construção de expressão transposase Tol2 (pCAGGS-T2TP), o de expressão flanqueado por Tol2 é extirpado do vetor e integrado ao genoma do hospedeiro pela atividade da transposase. A expressão de EmGFP e miRNAs é impulsionada pelo promotor ubíquo CAGGS. Esse valor foi modificado a partir de Nakamoto et al.15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Estrutura do pré-miRNA projetado. (A) A sequência de pré-miRNA projetada é baseada na sequência murina miR-15517. A cadeia superior oligo contém (da extremidade 5' à extremidade 3') uma saliência de quatro nucleotídeos (TGCT (azul)), sequência alvo antisense (21 nucleotídeos), sequência de loop terminal (vermelho) e sequência alvo sense (19 nucleotídeos). A sequência alvo antisense representa a sequência de miRNA madura. O oligo da fita inferior contém uma saliência de quatro nucleotídeos 5' (CCTG (azul)) e a sequência de complemento reverso do oligo da fita superior, mas não possui a saliência de quatro nucleotídeos na extremidade 3' (AGCA-3': complemento reverso de 5'-TGCT do oligo da fita superior). A sequência alvo sense não possui os nucleotídeos 9 e 10 da sequência alvo. Os dois nucleotídeos "extras" na sequência alvo antisense formam um laço interno na estrutura stem-loop da molécula madura de miRNA, o que resulta em uma maior taxa de knockdown17. (B) Um exemplo de sequência alvo contra frango Nel. Sequências sense e antisense nas fitas superior e inferior para uma sequência alvo do gene Nel da galinha (número de acesso GenBank NM_001030740.1, nucleotídeos 482-502) são mostradas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Microinjeção in ovo e eletroporação. (A) Estação de trabalho para microinjeção in ovo e eletroporação. (1) Microscópio dissecante. (2) Aparelho de injeção. (3) Aparelho de eletroporação. (4) Iluminador duplo do microscópio de pescoço de ganso. (5) Eletroporator. (B) Aparelhos de injeção. Uma seringa de Hamilton (6) com uma agulha 18 G (7) é conectada a tubos de PVC (8) e a uma agulha de micropipeta puxada (9) e fixada em um micromanipulador (10). O espaço interno do aparelho é preenchido com óleo mineral pesado. (C) Aparelho de eletroporação. Um conjunto de eletrodos de platina (11) com um suporte de eletrodos (12) é fixado em um micromanipulador (13). Os eletrodos são conectados ao eletroporador com cabos (14). (D) Microinjeção de solução de coquetel de DNA na vesícula óptica em HH 10-11. A agulha de micropipeta puxada é inserida na vesícula óptica a partir de seu lado proximal. Solução de coquetel de DNA com verde rápido (azul) é injetada na vesícula óptica até que o corante preencha todo o lúmen. (E) Eletroporação na vesícula óptica. Os eletrodos são colocados em paralelo (A distância entre os eletrodos é de 2 mm) e de forma que a vesícula óptica injetada esteja localizada entre os eletrodos: Um eletrodo está localizado perto da superfície anterior (nasal) da vesícula óptica, e o outro está na parte posterior do embrião, no nível do rombencéfalo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Avaliação in vitro de sequências individuais ou encadeadas de pré-miRNA para eficiência de supressão do gene Nel. (A) Efeitos knockdown de sequências individuais de pré-miRNA. Resultados de cinco construtos representativos (sequências alvo Antisense correspondentes números de nucleotídeos 482-502, 910-930, 1106-1126, 1663-1683 e 2461-2481 de cDNA de frango Nel (número de acesso GenBank: NM_001030740.1)) são mostrados. Construções individuais de expressão de miRNA (pré-miRNA pcDNA6.2-GW/EmGFP-Nel) foram transfectadas em células HEK293T que expressam Nel-AP de forma estável. O plasmídeo de controle negativo pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-foi utilizado como controle. A expressão de Nel-AP foi avaliada medindo-se as atividades de PA nos meios de cultura 48-96 h após a transfecção. Três construções de expressão de pré-miRNA de Nel (contra os nucleotídeos 482-502, 910-930 e 2461-2481, respectivamente) mostraram supressão significativa da expressão de Nel. (B) Efeitos knockdown de sequências encadeadas de pré-miRNA. Duas das três sequências de pré-miRNA mais potentes (contra os nucleotídeos 482-502, 910-930 e 2461-2481) foram clonadas tandemicamente no vetor pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR, e o de expressão (contendo as duas sequências de pré-miRNA e emGFP cDNA) foi transferido para o vetor pT2K-CAGGS (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA). As construções de pré-miRNA pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel foram individualmente co-transfectadas com vetores de expressão da transposase de Tol2 (pCAGGS-T2TP) em células HEK293T que expressam Nel-AP de forma estável, e a expressão de Nel-AP foi avaliada medindo-se as atividades de AP nos meios de cultura de 2 a 13 dias após a transfecção. Todas as três combinações (482-502/910-930, 482-502/2461-2481, 910-930/2461-2481) mostraram atividades de supressão aumentadas em comparação com sequências individuais de pré-miRNA desencadeadas. Supressão significativa da expressão de Nel-AP foi observada do dia 2 até, pelo menos, o dia 13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Knockdown estável da expressão de Nel na retina de pintinhos em desenvolvimento pela integração do transgene de miRNA mediada por transposon Tol2. Uma construção de transposon de Tol2 contendo um de expressão de duas sequências de pré-miRNA de Nel e EmGFP (pT2K-CAGGS-EmGFP-Nel pre-miRNA (482-502)-Nel pre-miRNA (2461-2481)) (A-I) ou uma construção de controle que expressa um miRNA não relacionado e EmGFP (J-O) foi co-transfectada com um vetor de expressão de transposase (pCAGGS-T2TP) na metade temporal ou nasal da vesícula óptica por in ovo eletroporação em HH9-HH11 (E1.5). Cortes de retina foram preparados em E4.5 (B-D, J-L) ou E8 (E-I, M-O), e a eficiência da supressão do gene Nel foi examinada por imunohistoquímica usando anticorpo anti-Nel (vermelho). Como o DNA é carregado negativamente, os transgenes são eletroporados no tecido do lado do ânodo; assim, apenas metade da retina foi marcada com EMGFP (transfecção (TF) lado, verde). (A) Expressão do gene marcador EmGFP na metade temporal da retina em E4.5. A fissura óptica (seta branca) representa o limite entre os lados transfectado e não transfectado (controle). (B-I) Knockdown de RNAi da expressão de Nel na retina de pintinhos em desenvolvimento. (B-D) Em E4.5, a expressão de Nel é significativamente reduzida (B,D) em células do epitélio pigmentado da retina (EP) que expressam EmGFP (C,D). Observar o padrão complementar de imunomarcação de Nel e expressão de EmGFP em D. NR, retina neural. (E-I) Em E8, a expressão de Nel (E,G) no epitélio pigmentado da retina e na camada de células ganglionares (GCL) está diminuída no lado da transfecção (F,G). (H, I) Vistas de maior ampliação de uma área de transfecção e uma área de controle correspondente em E (indicada por pequenos retângulos), respectivamente. (D,G) Imagens mescladas das duas imagens esquerdas. (J-O) Expressão de miRNA de controle. A introdução do construto controle negativo não afeta a expressão de Nel na retina E4.5 (J-L) ou E8 (M-O). (L,O) Imagens mescladas das duas imagens esquerdas. O limite entre os lados de transfecção e controle é indicado por uma linha pontilhada em C, F, K e N. Barras de escala, 50 μm. (A) e (B-I) foram modificadas de Nakamoto, M. & Nakamoto, C 16 e Nakamoto et al.15, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Configuração da reação de recozimento | |
| Oligo de fita superior (200 μM em tampão TE) | 5 μL (Concentração final 50 μM) |
| Oligofilamento de fundo (200 μM em tampão TE) | 5 μL (Concentração final 50 μM) |
| 10x Oligo tampão de recozimento* | 2 μL |
| Água livre de DNase/RNase* | 8 μL |
| Total | 20 μL |
| * Fornecido no kit de expressão de miRNA (ver Tabela de Materiais) | |
Tabela 1: Configuração da reação de recozimento
| 2x tampão de substrato AP | |
| Dietanolamina 10 M (pH 9,8) | 4 mL |
| 1 M MgCl2 | 10 μL |
| L-Homoarginina | magnésio 45 |
| Albumina de Soro Bovino (BSA) | magnésio 10 |
| p-Nitrofenilfosfato | magnésio 63 |
| H2O | Adicionar para perfazer um volume total de 20 mL |
Tabela 2: Tampão de substrato AP 2x. A solução deve ser armazenada em alíquotas a -20 °C e ser protegida da luz, uma vez que o p-nitrofenilfosfato é sensível à luz.
| Configuração de reação | |||
| pcDNA6.2-GW/EmGFP-2x plasmídeo pré-miRNA (Da Seção 1.5) ou plasmídeo de controle negativo para pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA* (0,1 μg/μL) |
1 μL | ||
| 10x buffer de Pfu | 5 μL | ||
| Mistura de dNTP (10 mM cada de dATP, dCTP, dGTP e dTTP) | 1 μL | ||
| Primer EmGFP forward* (5'-GGCATGGACGAGCTGTACAA-3'; 10 μM) | 1 μL | ||
| Primer reverso de miRNA* (5'- CTCTAGATCAACCACTTTGT-3'; 10 μM) | 1 μL | ||
| Pfu DNA polimerase (5 unidades/μL) | 0,5 μL | ||
| H2O | 40,5 μL | ||
| Volume total | 50 μL | ||
| * Fornecido no kit de expressão de miRNA. | |||
| Condições de termociclagem | |||
| 94 °C | 5 minutos | ||
| 30 ciclos dos seguintes: | |||
| 94 °C | 45 s | ||
| 58 °C | 1 min | ||
| 72 °C | 2 minutos | ||
| 72 °C | 10 minutos | ||
Tabela 3: Configuração da reação e condições de ciclagem térmica.
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Discussion
Este protocolo fornece um guia detalhado para o silenciamento gênico na retina de pintinhos em desenvolvimento pela expressão transgênica de miRNAs artificiais usando eletroporação em ovo e o sistema transposon Tol2.
Os seguintes fatores são de fundamental importância para a realização bem-sucedida desta técnica. Primeiro, é fundamental usar sequências de miRNA que são confirmadas para exercer efeitos knockdown robustos. Antes de aplicá-los para eletroporação in ovo , teste sequências individuais de pré-miRNA para eficiência de supressão gênica em ensaios in vitro (etapa 1.4) e sequência de duas sequências de pré-miRNA em cadeia que mostram as maiores atividades knockdown (etapa 1.5). Em segundo lugar, é importante não danificar a vesícula óptica e os tecidos nervosos circundantes ao inserir a agulha de micropipeta para injeção da solução de DNA. Danos excessivos em embriões podem levar à malformação embrionária e à morte. Para evitar danos teciduais, introduza a micropipeta na vesícula óptica na orientação correta. Pontas menores e mais afiadas da agulha da micropipeta tornariam a penetração da vesícula óptica mais suave e resultariam em menos danos aos tecidos. No entanto, agulhas com pontas muito pequenas têm dificuldade em carregar e liberar a solução de DNA. No estudo aqui descrito, foram utilizadas agulhas com abertura da ponta de 10-20 μm de diâmetro. Em terceiro lugar, certifique-se de preencher toda a vesícula óptica com a solução de DNA (como visualizado pela propagação do verde rápido). Quarto, coloque os eletrodos nas posições ideais para atingir os DNAs na área desejada da vesícula óptica (por exemplo, lado temporal, lado nasal). Moléculas de DNA carregadas negativamente se moverão para o lado do ânodo; portanto, a colocação e orientação precisas dos eletrodos afetam criticamente os resultados finais. Finalmente, use as concentrações ideais de DNA e parâmetros de eletroporação.
Se nenhum sinal fluorescente for observado após 24 h de eletroporação, deve-se considerar: (1) Confirmar se os plasmídeos eletroporados têm sequências corretas. (2) Verificar novamente a concentração e a pureza de plasmídeos individuais. (3) Certifique-se de que a solução de DNA preencha o lúmen da vesícula óptica e não se difunda para o tubo neural. (4) Verifique se os parâmetros de eletroporação utilizados estão corretos. (5) Verifique se os eletrodos estão em contato com a membrana vitelínica enquanto os pulsos elétricos são aplicados.
A combinação de eletroporação in ovo e um método de integração gênica mediado por transposons neste protocolo oferece várias vantagens distintas. Primeiro, suporta a produção estável de miRNAs e, portanto, a supressão persistente de genes-alvo. O desenvolvimento da retina dos pintinhos inicia-se em E1.5 e continua até a eclosão (as células ganglionares da retina são produzidas no período de E2 a E9). Para a análise da perda de função do gene, a expressão de miRNAs artificiais deve ser mantida de forma estável durante esse período. A expressão de sequências de RNAi usando vetores de expressão convencionais é geralmente transitória porque a construção da expressão não consegue ser eficientemente integrada aos cromossomos. No método aqui descrito, entretanto, a integração cromossômica do de expressão é mediada pela atividade da transposase co-eletroporada, o que resulta em expressão estável dos transgenes.
Em segundo lugar, nesse método, o mesmo promotor CAGGS induz a expressão co-cistrônica de múltiplas sequências de miRNA e do marcador EmGFP em células transfectadas, contornando assim o risco de interferência do promotor, que é uma das complicações comuns com vetores retrovirais contendo dois promotores para atingir dupla expressãogênica25.
Finalmente, ao contrário dos vetores retrovirais competentes em replicação, o transgene que é eletroporado por esse método não é transferido para as células vizinhas. Portanto, a área de transfecção pode ser controlada com mais precisão usando os tipos apropriados de eletrodos e colocando-os nas posições corretas.
Apesar das vantagens descritas acima, o método atual também apresenta limitações inerentes à eletroporação em ovo . Por exemplo, as taxas de transfecção e supressão gênica podem variar entre embriões, e um número relativamente grande de embriões pode precisar ser transfectado para análise. Além disso, a eletroporação na retina embrionária em estágios posteriores de desenvolvimento (por exemplo, E4-E5) tem dificuldades experimentais porque os olhos estão localizados próximos ao coração nesses estágios, o que aumenta o risco de parada cardíaca após a eletroporação.
O sistema aqui descrito permite a supressão gênica rápida e robusta na retina de pintinhos em desenvolvimento. Essa abordagem também pode ser aplicada a outras partes do embrião de pintinhos, incluindo os tecidos neurais e não neurais. Espera-se, portanto, que este sistema possa contribuir para a elucidação dos mecanismos moleculares de desenvolvimento de pintinhos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os vetores pT2K-CAGGS e pCAGGS-T2TP foram gentilmente cedidos por Yoshiko Takahashi (Universidade de Kyoto, Kyoto, Japão) e Koichi Kawakami (Instituto Nacional de Genética, Mishima, Japão), respectivamente. Agradecemos a Michael Berberoglu por sua leitura crucial do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por bolsas da Royal Society and Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (Reino Unido) para M.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G needle, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A and AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 and Q202 | Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB cables | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 cables | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 square wave electroporator | Nepa Gene | CUY21 | |
| Diethanolamine (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Dissecting microscope | |||
| Egg incubator | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| Electrode holder | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli cells |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers | ||
| Gooseneck fiber light source | |||
| FuGene 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Hamilton syringe (50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Hanks' balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-Homoarginine | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulator | Narishige (Japan) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Micropipette puller | Shutter Instrument | P97 | |
| p-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Optional) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Thermal cycler |
References
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