Summary
我々は、ニワトリ胚への人工マイクロRNA配列の導入とゲノム組み込みを、 in ovo エレクトロポレーションとTol2トランスポゾンシステムを用いて行う新しい機能喪失アプローチを開発しました。この技術は、発生中の遺伝子機能の研究のための堅牢で安定した遺伝子ノックダウン方法論を提供します。
Abstract
ニワトリ網膜は、その大きなサイズ、迅速な発達、視覚化や実験操作のためのアクセシビリティなどの利点を備えた、発生神経生物学における重要なモデルシステムです。しかし、その主な技術的限界は、遺伝子機能解析のための堅牢な機能喪失アプローチの欠如でした。このプロトコルは、Tol2トランスポゾンシステムを使用した人工マイクロRNA(miRNA)のトランスジェニック発現を含む、発生中のニワトリ網膜における遺伝子サイレンシングの方法論を説明しています。このアプローチでは、EmGFP(エメラルドグリーン蛍光タンパク質)マーカーの発現カセットと標的遺伝子に対する人工pre-miRNA配列を含むTol2トランスポゾンプラスミドを、 in ovo エレクトロポレーションによってTol2トランスポザーゼ発現コンストラクトとともに胚性ニワトリ網膜に導入します。トランスフェクトされた網膜細胞において、トランスポザーゼはトランスポゾンベクターからの発現カセットの切除および宿主染色体への組み込みを触媒し、miRNAおよびEmGFPタンパク質の安定した発現をもたらす。これまでの研究では、この手法を用いることで、神経発生において複数の機能を発揮する糖タンパク質であるNelの発現を、発生中のニワトリ網膜において有意に抑制できることを実証しました。我々の結果は、この方法論が遺伝子発現の安定的かつ堅牢な抑制を誘導し、したがって網膜発生の研究のための効率的な機能喪失アプローチを提供することを示しています。
Introduction
脊椎動物の網膜は、神経発生を研究するための重要なモデルシステムです。その末梢位置にもかかわらず、網膜は解剖学的および発達的に中枢神経系の延長であり、網膜神経節細胞の軸索からなる視神経は中枢神経系内の管を表す。ひよこ網膜は、神経発達の分子メカニズムを研究するためのモデルシステムとして重要な利点があります:それは大きく、急速に発達します。それは人間の網膜と構造的および機能的類似性を持っています。視覚化や実験的な操作に非常にアクセスしやすいです。神経発生中の細胞増殖・分化、形態形成、軸索誘導の分子機構は、ニワトリ網膜を用いて広く研究されている。
卵子では、エレクトロポレーションは、発生中のニワトリ胚の細胞に異所性遺伝子を導入するために過去20年間にわたって首尾よく使用されてきました。この技術により、発生中の細胞の標識、細胞運命の追跡、細胞移動および軸索路のトレース、および遺伝子機能のin vivo分析のための異所性遺伝子発現が可能になります。ニワトリ胚における効率的な異所性遺伝子発現のためのin ovoエレクトロポレーションの条件は十分に確立されている1,2,3。
これらの利点にもかかわらず、遺伝子機能の研究のための安定した機能喪失技術の欠如は、ニワトリ胚の主要な技術的限界であった。低分子干渉RNA(siRNA)4やショートヘアピンRNA(shRNA)5の発現ベクターでエレクトロポレーションしたニワトリ胚は標的遺伝子のノックダウンを示しますが、これらのアプローチでは、導入されたRNAまたはDNAを失うと細胞が効果が消失するため、遺伝子抑制は一過性です。より安定した遺伝子抑制は、RCAS(RエプリケーションCompetent Avian slicoma-leukosisウイルス(ASLV)ロングターミナルリピート(LTR)とSプライスアクセプター)レトロウイルスシステム6によってニワトリ胚にsiRNAを送達することによって達成され得る。ウイルスベクターは宿主ゲノムに組み込まれ、異所性遺伝子が安定に発現します。ただし、レトロウイルスは、細胞周期の有糸分裂(M)期にのみ分裂細胞のゲノムに組み込まれるため、この機能喪失アプローチを適用できる発生段階および/または細胞型に制限が課される可能性があります。さらに、RCASによる導入遺伝子の発現は、in ovoエレクトロポレーションによって誘導されるものよりも遅く、頑健ではないようです7。
トランスポゾンは、ゲノム上のある場所から別の場所に移動する遺伝的要素です。Tol2エレメントは、hAT転移エレメントファミリーのメンバーであり、Tol2エレメント8のトランスポゾン反応を触媒するトランスポザーゼをコードする内部遺伝子を含む。Tol2エレメントの左端と右端の配列(それぞれ200 bpと150 bp)に挟まれた遺伝子発現カセットを担持したプラスミドベクターをTol2トランスポザーゼ発現コンストラクトで脊椎動物細胞に導入すると、プラスミドから発現カセットが切り出され、宿主ゲノムに組み込まれ、異所性遺伝子の安定発現をサポートします(図1).Tol2転移因子は、ゼブラフィッシュ9,10、カエル11、ヒナ12、マウス13を含む異なる脊椎動物種において非常に効率的に遺伝子転位を誘導できることが示されており、したがって、遺伝子導入および挿入突然変異誘発の有用な方法である。Tol2トランスポゾン系は、長鎖二本鎖RNAからプロセシングされたsiRNAのゲノム組み込みによる標的遺伝子の条件付きノックダウンに使用されています14。
このプロトコルは、Tol2トランスポゾンシステムによる人工マイクロRNA(miRNA)の導入を含むニワトリ胚における機能喪失アプローチを説明しています15,16。このアプローチでは、EmGFP(エメラルドグリーン蛍光タンパク質)マーカーと標的遺伝子に対する人工miRNAの発現カセットをTol2トランスポゾンベクターにクローニングします。次いで、Tol2トランスポゾン構築物を、in ovoエレクトロポレーションによってTol2トランスポザーゼ発現構築物と共に胚性ニワトリ網膜に導入する。トランスフェクトされた網膜細胞において、トランスポザーゼはトランスポゾンベクターからの発現カセットの切除および宿主染色体への組み込みを触媒し、miRNAおよびEmGFPタンパク質の安定した発現をもたらす。これまでの研究では、主に神経系に発現する細胞外糖タンパク質であるNelの発現を、発生中のニワトリ網膜でノックダウンすることに成功しました(代表的な結果を参照)。我々の結果は、この手法により、ovoにおいて安定的かつ効率的な遺伝子抑制を達成できることを示しています。
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Protocol
1. miRNA発現ベクターの構築
注:miRNA発現ベクターを構築するための手順(ステップ1.1-1.3、1.5-1.6)は、前述のように、miRNA発現キットであるEmGFPを用いたBlock-iT Pol II miR RNA発現キット用に最適化されています15,16。このキットには、miRNA発現を可能にするように設計された発現ベクター(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA)、コントロールベクター(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA陰性コントロールプラスミド)、アクセサリー試薬、およびmiRNA発現ベクターを作製するための説明書(材料表参照)が含まれています17。
- 標的遺伝子に対するpre-miRNAをコードする一本鎖DNAオリゴの設計:オンラインツールRNAi Designer(材料表参照)を使用して、一本鎖DNAオリゴ(「トップストランド」オリゴ(ターゲットプレmiRNA)および「ボトムストランド」オリゴ(トップストランドオリゴの相補体))を設計します。一本鎖オリゴの必要な特徴(図2A)とターゲット配列の例(図2B)については、図2を参照してください。
注:特定の標的遺伝子に対して5〜10個のpre-miRNA配列を生成し、 in vitro でノックダウン活性をスクリーニングすることをお勧めします(ステップ1.4)。 - トップストランドとボトムストランドのオリゴをアニーリングして二本鎖オリゴを生成する
- 以下のアニーリング反応(表1)を滅菌0.5 mLマイクロ遠心チューブにセットします。
- 反応混合物を95°Cで4分間インキュベートします。トップストランドとボトムストランドのオリゴをアニールし、反応混合物を室温(RT)に5〜10分間冷却することにより、二本鎖オリゴを生成します。サンプルを短時間(~5秒)遠心分離します。
注:アニールされたオリゴは、-20°Cで少なくとも1年間は分解することなく保存できます。
- 二本鎖オリゴをmiRNA発現ベクター(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA(miRNA発現キットに付属))にクローニングする:メーカーのマニュアル17に従って、個々の二本鎖オリゴを直鎖化miRNA発現ベクターにクローニングします。
- ノックダウン効果の評価
注:個々のmiRNA配列は、ovoに適用する前に、in vitroで遺伝子抑制効率をテストすることをお勧めします。ノックダウン効率は、miRNA発現プラスミドを標的遺伝子を発現する細胞株にトランスフェクトすることによって試験することができる。あるいは、個々のmiRNA発現プラスミドを、標的遺伝子の発現コンストラクトを有する細胞株に同時トランスフェクトすることができる。天然状態で膜固定されていないタンパク質をコードする標的遺伝子(例えば、可溶性タンパク質)については、アルカリホスファターゼ(AP)融合タンパク質を使用して、標的タンパク質の発現をモニタリングすることができる。標的タンパク質をコードするcDNA配列を、APタグベクター(APtag-1-APtag-5;材料表参照)中のヒト胎盤アルカリホスファターゼにインフレームで融合させ、細胞18に導入することができる。培養細胞(HEK293T細胞など)で発現させると、APタグ付き標的タンパク質が培養培地中に高レベルで分泌されるため、miRNA導入細胞の培地中のAP活性の低下を測定することでmiRNA配列のノックダウン効果を評価できます(サブステップ1.4.1-1.4.4)。- 細胞HEK293T 24ウェルプレート(8 x 104 細胞/ウェル)で一晩培養します。個々のmiRNA発現コンストラクトで細胞をAPタグ付き標的タンパク質の発現プラスミドで一過性にトランスフェクトします。pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA陰性コントロールプラスミド(miRNA発現キットに付属)をコントロールとして使用します。(APタグ付き標的タンパク質を安定に発現する細胞株を使用する場合は、個々のmiRNA発現コンストラクトのみで細胞をトランスフェクトします。
注:トランスフェクションには、従来のリポフェクション試薬( 材料表を参照)が使用されます。 - トランスフェクションの48〜72時間後に馴化培地を回収し、65°Cの水浴中で5分間、内因性AP活性を熱不活性化します。デスクトップマイクロ遠心分離機で破片を最高速度で5分間スピンアウトします。
- 上清を10 mM HEPES、pH 7.0で緩衝し、0.45 μmフィルターに通します。
- 100 μL(プレートリーダーでの測定用)または500 μL(分光光度計用)の上清を取り、等量の2x AP基質バッファーを追加します(表2)。プレートリーダーまたは分光光度計でOD405 を測定して、AP活性を確認します。
注:馴化培地のAP活性が高すぎて正確な測定ができない場合は、HBAHバッファー(ハンクス平衡塩溶液(HBSS)、0.5 mg / mLウシ血清アルブミン、20 mM HEPES(pH 7.0))またはキャリアタンパク質を含む別のバッファーで希釈してください。リン酸含有バッファー(PBSなど)は、無機リン酸がAPの競合阻害剤として作用するため、使用しないでください。
- 細胞HEK293T 24ウェルプレート(8 x 104 細胞/ウェル)で一晩培養します。個々のmiRNA発現コンストラクトで細胞をAPタグ付き標的タンパク質の発現プラスミドで一過性にトランスフェクトします。pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA陰性コントロールプラスミド(miRNA発現キットに付属)をコントロールとして使用します。(APタグ付き標的タンパク質を安定に発現する細胞株を使用する場合は、個々のmiRNA発現コンストラクトのみで細胞をトランスフェクトします。
- miRNA配列の連鎖
注:ノックダウン効果は、同じ標的遺伝子に対して異なるmiRNAを連鎖させるか、同じmiRNAを繰り返すことによって増強することができる。miRNA発現ベクターは、複数のpre-miRNA配列の連鎖およびそれらのコシストロン発現を支持する17。- 製造業者の説明書17に従って、in vitroアッセイ(ステップ1.4)において最も高いノックダウン活性を示す2つの異なるpre-miRNA配列を(同じ標的遺伝子に対して)鎖状にする。
- ステップ1.4に記載される インビトロ アッセイを用いて鎖状構築物の遺伝子抑制効率を評価する。3つ以上のpre-miRNA配列が同様に高いノックダウン活性を示す場合は、2つの配列の異なる組み合わせをテストし、最も高いノックダウン活性を示す組み合わせを使用します( 代表的な結果を参照)。
- EmGFP-pre-miRNA発現カセットのTol2トランスポゾンベクターへの転写
注:EmGFP cDNAおよび2つのpre-miRNA配列を含む発現カセットは、Tol2トランスポゾンベクター(pT2K-CAGGSベクター、 材料表を参照)に転写されます。この目的のために、発現カセット(CMVプロモーターの3'末端からmiRNA発現ベクターのmiRNAリバースシーケンシングプライマー部位までを包含する)を人工制限酵素部位を有するプライマーを用いてPCR増幅し、PCR産物をTol2トランスポゾンベクターにクローニングする。Tol2トランスポゾンベクターには、挿入された発現カセットの発現を駆動するユビキタスCAGGSプロモーターが含まれています。CAGGSプロモーターと発現カセットは、Tol2配列によって隣接しています(図1)。- EmGFP-pre-miRNA発現カセットのPCR増幅: 表3に記載の反応セットアップおよび熱サイクリング条件に従う。
- ゲル精製PCR産物(約1.3 kb)を制限酵素消化Tol2トランスポゾンベクターにリゲートします。プラスミドをコンピテント大腸菌細胞にエレクトロポレートし( 材料表を参照)、組換え体(pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNAコンストラクト)を選択します。
- 従来のmaxiprepキットを用いてプラスミドを調製します( 材料表参照)。プラスミドの構造と配列は、それぞれ制限マッピングとPCRに使用したプライマーを使用して確認します。
2.卵の貯蔵と孵化
- 地元の農場や商業業者から受精したホワイトレグホン(Gallus gallus)の卵を購入します。
注:卵は、孵卵中の生存率の大幅な損失や発育の遅延なしに、孵卵前に最大1週間、12〜16°Cまたは4°Cで保持できます。 - 卵に孵卵の開始日をラベル付けし、卵の上側(胚が配置される場所)に印を付けます。受精卵を38°Cで水平位置でインキュベートし、胚がハンバーガーおよびハミルトン(HH)ステージ10(33-38時間)-11(40-45時間)19に達するまでインキュベートします。
3. インオボ エレクトロポレーション
- in ovo エレクトロポレーションの調製
- 0.25%ファストグリーン溶液の調製:25 mgのファストグリーンFCFを10 mLのPBSに溶解します。0.2 μmシリンジフィルターを使用して溶液をろ過します。溶液はRTに保存できます。
- DNAカクテル:個々のpT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNAプラスミド(サブステップ1.6.3)とTol2トランスポザーゼ発現プラスミド(pCAGGS-T2TPベクター; 材料表参照)(各5 μg/μL)を2:1の比率で混合して注射液を調製します。注入された領域を視覚化するために、0.25%高速グリーン溶液の1/10ボリュームを追加します。
注:最適なDNA濃度は、コンストラクトによって異なる場合があります。 - マイクロインジェクション装置のセットアップ(図3A、B):マイクロインジェクション装置は、ハミルトンシリンジ、18 Gニードル(針の長さ= 2インチ)、PVC(ポリ塩化ビニル)チューブ(長さ2 cm)、マイクロピペットニードル(マイクロピペットプラーでオメガドットファイバー(外径1 mm X 内径0.75 mm)のキャピラリーチューブを引っ張ることによって作成できます)。
- ハミルトンシリンジに重質鉱油を入れます。18 Gの針をシリンジに取り付け、シリンジプランジャーを押し下げて針の内部空間をオイルで満たします。
- 長さ2cmのPVCチューブを針の端に取り付け、チューブにオイルを充填します。
- 引っ張ったマイクロピペット針をチューブに取り付けます。マイクロピペット針の先端を細い鉗子で直径10〜20μmに折って小さな開口部を作ります。針全体をオイルで満たします。
注意: 気泡はDNA溶液の流れを阻害するため、システム内に気泡を閉じ込めないように注意する必要があります。
- 5 μLの着色DNAカクテル(サブステップ3.1.2)を滅菌ペトリ皿に入れます。解剖顕微鏡下で、マイクロピペット針の先端を滅菌ペトリ皿上のDNA溶液に入れ、溶液をゆっくりと針に引き込みます。
- 針の内側と外側の圧力が平衡するまで待ち(空気が針に入るのを防ぐため)、針の先端をDNA溶液から取り出します。注射まで、針の先端を小さなビーカー内の滅菌PBSに沈めたままにします。
- エレクトロポレーション装置のセットアップ(図3A、C):
- マイクロマニピュレーターに電極ホルダー付きの一対の白金電極をセットします。電極の先端間の間隔を2 mmに調整します(図3C、E)。
- 電極をケーブルで方形波パルス発生器に接続します( 材料表を参照)。
- DNA溶液のマイクロインジェクション(図3D)
- インキュベーターから鶏の卵を取り出し、70%エタノールに浸したティッシュペーパーで卵の表面を拭きます。
- 18 Gの針を10 mLのシリンジに取り付けます。卵黄を傷つけないように、下向き(45°)の角度で卵の鈍い端に針を挿入します。
- 卵から2〜3 mLのアルブミンを引き出します。スコッチテープで穴を塞ぎます。卵子を光で「キャンドリング」することによって、胚と硝子膜が殻から剥がれていることを確認します。
- はさみと鉗子を使用して卵の上から卵殻(直径2〜3 cmの円)を取り除き、胚を露出させます。エレクトロポレーション中の胚の乾燥を防ぐために、一度に5個を超える卵を窓に入れないでください。
注意: 卵を割らずに窓を開けるのが難しい場合は、卵殻を取り除く前に、卵の上部全体をセロテープまたはスコッチテープで覆うことができます。 - 針の先端を近位側から視小胞に45°の角度で挿入し、青色の溶液が内腔を満たすまでプランジャーをゆっくりと押し下げる(または軽くたたく)ことによってDNAカクテルを注入します(図3D)。
注:あるいは、圧力マイクロインジェクションシステム( 材料表を参照)を使用してDNA溶液を注入することもできます。 - 針を引き出し、その先端をPBSに戻します。
- エレクトロポレーション(図3E)
- エレクトロポレーターのパルスパラメータを次のように設定します:電圧:15 V、パルス長:50 ms、パルス間隔:950 ms、パルス数:5
- 胚の上の硝子膜に数滴のHBSSを加えます。マイクロマニピュレーターを使用して、胚の前後軸に垂直に電極をHBSSに下げます。
注:あるいは、アルブミンは効率的なエレクトロポレーションを可能にする優れた導電体であるため、この手順はHBSSを追加せずに行うことができます。 - 視小胞の両側(前(鼻)側と後側(側頭))に電極を配置します(図3E)。電極が胚や血管に触れないようにしてください。パルス電界を適用します。
- 電極を取り外し、アルブミンの蓄積を避けるために、水に浸した滅菌綿棒で電極をそっと洗浄します。
- スコッチテープで窓を密封し、目的の発達段階まで胚を再インキュベートします。
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Representative Results
Nelに対する人工miRNA発現のためのTol2トランスポゾンコンストラクトの構築
ネル(N耳Eピダーマル成長因子(EGF)-Like;Nell2としても知られています)は、細胞外糖タンパク質です。トロンボスポンジン-1と構造的に類似しており、主に神経系で発現しています20,21。我々は以前に、Nelが網膜神経節細胞15の分化および生存を調節し、網膜軸索22、23、24に対する抑制誘導手がかりとして作用することを実証した。発生中のニワトリ網膜では、HH15の推定色素上皮でNel発現が検出されます(胚日(E)2.5)。HH20(E3.5)では、新たに分化した網膜神経節細胞でもNel発現が観察されます。色素上皮および網膜神経節細胞におけるNelの強い発現は、少なくともE1815まで続く。
網膜神経節細胞の発生におけるNelの機能を調べるために、in ovoエレクトロポレーションとTol2トランスポゾンシステムを用いて、発生中の網膜に人工miRNAを導入することにより、Nel遺伝子の発現をノックダウンしました15,16。まず、オンラインRNAi設計ツール(材料表参照)を用いて、ニワトリNel cDNA(GenBankアクセッション番号:NM_001030740.1)のタンパク質コード領域における10個の潜在的な標的配列に対して、一本鎖DNAオリゴヌクレオチドのペアを設計した。オリゴヌクレオチド対をアニーリングし、miRNA発現ベクターに個別にクローニングした。次に、個々のコンストラクトをNel-APを安定に発現するHEK293T細胞にトランスフェクトし、培養培地中のAP活性を測定することにより、それらのノックダウン効率を評価しました。pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA陰性対照プラスミドを対照として用いた(図4A)。
最も高いノックダウン効果を示した3つのNel pre-miRNA配列を選択し(ニワトリNel cDNAのヌクレオチド482-502、910-930、および2461-2481に対してそれぞれ)、2つのpre-miRNA配列をmiRNA発現ベクター(pcDNA6.2-GW/EmGFP-2x Nel pre-miRNA)にタンデムクローニングしました。2つのプレmiRNAおよびEmGFPをコードする発現カセットを、両端に人工EcoRI部位を有するPCRによって増幅し(5'-GGGAATTCTCTGGCTAACTAGAGAAC-3'および5'-CCGAATTCCCTCTAGATCAACCACT-3')、pT2K-CAGGSベクター(pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA)にクローニングした。発現カセットの配列は、PCRに用いたプライマーを用いて確認した。pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNAコンストラクトを、Nel-APを安定に発現するHEK293T細胞にTol2トランスポザーゼ発現ベクター(pCAGGS-T2TP)と個別に同時トランスフェクトし、培養液中のAP活性を測定することにより、Nel-AP発現に対する抑制効果を評価しました。 図4Bに示すように、ノックダウン効率は、2つのmiRNA配列の連鎖によって有意に増強された。Nel-AP発現の強力な抑制(90%以上)は、トランスフェクション後少なくとも13日まで観察された(図4B)。
発達中のニワトリ網膜におけるNel発現の安定抑制
pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNAコンストラクト(ニワトリネルcDNAのヌクレオチド482-502および2461-2481の標的配列を含む)をトランスポザーゼ発現ベクター(pCAGGS-T2TP)と同時トランスフェクトし、HH9-11でのインオボエレクトロポレーションにより、ニワトリ網膜の側頭側または鼻側にトランスフェクトしました(図3、図5A)。E4.5またはE8網膜から切片を調製し、Nel発現に及ぼす影響を抗Nel抗体22を用いた免疫組織化学により評価した。E4.5では、網膜色素上皮におけるNelの発現がEmGFP発現細胞において有意に減少した(図5B-D)。E8では、網膜神経節細胞においてもNel発現の低下が明瞭に観察された(図5E-I)。Nel発現の有意な抑制は、少なくともE18まで続いた(データ示さず)。コントロールmiRNAの導入は、網膜におけるNel発現に影響を及ぼさなかった(図5J-O)。
図1:トランスポザーゼによるTol2隣接cDNAの転位。 トランスポゼーゼによるEmGFPおよび鎖状2つのpre-miRNA配列(2x pre-miRNA)に対するTol2隣接発現カセットの転位を示す模式図である。発現カセットを含むTol2トランスポゾンベクター(pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNAコンストラクト)をTol2トランスポザーゼ発現コンストラクト(pCAGGS-T2TP)を有する細胞に導入すると、Tol2隣接発現カセットがベクターから切り出され、トランスポザーゼ活性によって宿主ゲノムに組み込まれる。EmGFPおよびmiRNAの発現は、ユビキタスプロモーターCAGGSによって駆動されます。この図は、Nakamotoらから修正されています15。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:改変されたプレmiRNAの構造 。 (A)設計されたプレmiRNA配列は、マウスmiR-155配列17に基づいている。トップストランドオリゴは、(5'末端から3'末端まで)4ヌクレオチドオーバーハング(TGCT(青))、アンチセンス標的配列(21ヌクレオチド)、末端ループ配列(赤)、およびセンス標的配列(19ヌクレオチド)を含む。アンチセンス標的配列は、成熟miRNA配列を表す。ボトムストランドオリゴは、4ヌクレオチドの5'オーバーハング(CCTG(青))とトップストランドオリゴの逆相補配列を含むが、3'末端に4ヌクレオチドオーバーハングを欠く(AGCA-3':トップストランドオリゴの5'-TGCTの逆相補)。センス標的配列は、標的配列のヌクレオチド9および10を欠いている。アンチセンス標的配列中の「余分な」2つのヌクレオチドは、成熟miRNA分子のステムループ構造において内部ループを形成し、より高いノックダウン率をもたらす17。(b)ニワトリネルに対する標的配列の一例。ニワトリネル遺伝子の標的配列に対する上鎖および下鎖におけるセンスおよびアンチセンス配列(GenBankアクセッション番号NM_001030740.1、ヌクレオチド482-502)が示されている。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3: インオボ マイクロインジェクションとエレクトロポレーション 。 (A) インオボ マイクロインジェクションとエレクトロポレーション用のワークステーション。(1)解剖顕微鏡。(2)注入装置。(3)エレクトロポレーション装置。(4)デュアルグースネック顕微鏡照明器。(5)エレクトロポレーター。(b)注入装置。18Gの針(7)を備えたハミルトンシリンジ(6)をPVCチューブ(8)と引っ張られたマイクロピペット針(9)に接続し、マイクロマニピュレーター(10)にセットします。装置の内部空間は重鉱物油で満たされている。(c)エレクトロポレーション装置。電極ホルダ(12)を備えた白金電極(11)の組は、マイクロマニピュレータ(13)上にセットされる。電極はケーブル(14)でエレクトロポレーターに接続されています。(D)HH 10-11での視神経小胞へのDNAカクテル溶液のマイクロインジェクション。引っ張られたマイクロピペット針は、その近位側から視小胞に挿入される。ファストグリーン(青)のDNAカクテル溶液を、染料が内腔全体を満たすまで視静脈胞に注入します。(E)視小胞へのエレクトロポレーション。電極は平行に配置され(電極間の距離は2mmである)、注入された視小胞が電極間に位置するように:一方の電極は視神経小胞の前面(鼻)表面近くに位置し、他方は後脳のレベルで胚の後部に位置する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:Nel遺伝子抑制効率に関する個別または鎖プレmiRNA配列の インビトロ 評価。 (A)個々のプレmiRNA配列のノックダウン効果。ニワトリネルcDNA(GenBankアクセッション番号:NM_001030740 1)の5つの代表的な構築物(塩基番号482-502、910-930、1106-1126、1663-1683、および2461-2481に対応するアンチセンス標的配列)の結果を示す。個々のmiRNA発現コンストラクト(pcDNA6.2-GW/EmGFP-Nel pre-miRNA)を、Nel-APを安定に発現するHEK293T細胞にトランスフェクトした。pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA陰性対照プラスミドを対照として用いた。Nel−APの発現は、トランスフェクション後48〜96時間の培養培地中のAP活性を測定することによって評価した。3つのNel pre-miRNA発現コンストラクト(それぞれヌクレオチド482-502、910-930、および2461-2481に対して)は、Nel発現の有意な抑制を示した。(B)鎖状プレmiRNA配列のノックダウン効果。3つの最も強力なpre-miRNA配列(ヌクレオチド482-502、910-930、および2461-2481に対して)のうち2つをpcDNA6.2-GW/EmGFP-miRベクターにタンデムクローニングし、発現カセット(2つのpre-miRNA配列およびEmGFP cDNAを含む)をpT2K-CAGGSベクター(pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA)に転写した。pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNAコンストラクトを、Nel-APを安定に発現するHEK293T細胞にTol2トランスポザーゼ発現ベクター(pCAGGS-T2TP)と個別に同時トランスフェクトし、トランスフェクション後2日から13日までの培地中のAP活性を測定することでNel-APの発現を評価しました。3つの組み合わせ(482-502/910-930、482-502/2461-2481、910-930/2461-2481)はすべて、非鎖の個々のpre-miRNA配列と比較して増強された抑制活性を示した。Nel−AP発現の有意な抑制は、2日目から少なくとも13日目まで観察された。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:Tol2トランスポゾンを介したmiRNA導入遺伝子の組み込みによる、発生中のニワトリ網膜におけるNel発現の安定したノックダウン。2つのネルプレmiRNA配列とEmGFP(pT2K-CAGGS-EmGFP-ネルプレmiRNA(482-502)-ネルプレmiRNA(2461-2481))の発現カセットを含むTol2トランスポゾンコンストラクト(A-I)または無関係なmiRNAとEmGFP(J-O)を発現するコントロールコンストラクトを、トランスポザーゼ発現ベクター(pCAGGS-T2TP)でインオボにより視小胞の側頭または鼻の半分に同時トランスフェクトしたHH9-HH11(E1.5)でのエレクトロポレーション。網膜切片をE4.5(B-D, J-L)またはE8(E-I, M-O)で作製し,抗ネル抗体(赤)を用いた免疫組織化学によりNel遺伝子抑制の効率を検討した。DNAは負に帯電しているため、導入遺伝子はアノード側の組織にエレクトロポレーションされます。したがって、網膜の半分のみがEmGFPで標識された(トランスフェクション(TF)側、緑色)。(A)E4.5における網膜の側頭半分におけるEmGFPマーカー遺伝子の発現。視裂(白い矢印)は、トランスフェクションされた側とトランスフェクションされていない(対照)側の境界を表します。(B-I)発生中のニワトリ網膜におけるネル発現のRNAiノックダウン。(B-D)E4.5では、EmGFP(C,D)を発現する網膜色素上皮(PE)細胞において、Nel発現が有意に低下する(B,D)。DにおけるNel免疫染色およびEmGFP発現の相補パターンに注目してください。NR、神経網膜。(E-I)E8では、網膜色素上皮および神経節細胞層(GCL)におけるNel発現(E,G)はトランスフェクション側(F,G)で減少する。(H, I)トランスフェクション領域と対応するコントロール領域をそれぞれE(小さな長方形で示す)の高倍率ビュー。(D,G)左の2つの画像のマージされた画像。(J-O)コントロールマイクロRNAの発現。陰性対照コンストラクトの導入は、E4.5(J-L)またはE8(M-O)網膜におけるネルの発現に影響しない。(L,O)左の2つの画像のマージされた画像。トランスフェクション側と対照側の境界は、C、F、K、およびNの点線で示されています。 スケールバー、50μm(A)および(B-I)は、それぞれNakamoto, M. & Nakamoto, C 16およびNakamoto et al.15から改変されている。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| アニーリング反応のセットアップ | |
| トップストランドオリゴ (200 μM TE バッファー中) | 5 μL (終濃度 50 μM) |
| ボトムストランドオリゴ (200 μM TE バッファー中) | 5 μL (終濃度 50 μM) |
| 10x オリゴアニーリングバッファー* | 2 μL |
| DNase/RNaseフリーの水* | 8 μL |
| トータル | 20 μL |
| * miRNA発現キットに付属( 材料表参照) | |
表1:アニーリング反応のセットアップ
| 2x AP 基板バッファ | |
| 10 M ジエタノールアミン (pH 9.8) | 4ミリリットル |
| 1 M MgCl2 | 10 μL |
| L-ホモアルギニン | 45ミリグラム |
| ウシ血清アルブミン(BSA) | 10ミリグラム |
| p-ニトロフェニルホスファート | 63ミリグラム |
| H2O | 追加して総容量20 mLにします |
表2:2x AP基板バッファ。溶液は-20°Cでアリコートで保存し、p-ニトロフェニルホスフェートは光に敏感であるため、光から保護する必要があります。
| 反応のセットアップ | |||
| pcDNA6.2-GW/EmGFP-2xプレmiRNAプラスミド (セクション1.5より) またはpcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA陰性コントロールプラスミド* (0.1 μg/μL) |
1 μL | ||
| 10x Pfu バッファ | 5 μL | ||
| dNTPミックス(dATP、dCTP、dGTP、およびdTTPの各10 mM) | 1 μL | ||
| EmGFP フォワードプライマー* (5'-GGCATGGAGGAGCTTACAA-3'; 10 μM) | 1 μL | ||
| miRNA リバースプライマー* (5'- CTCTAGATCAACCACTTTGT-3'; 10 μM) | 1 μL | ||
| PFU DNA ポリメラーゼ (5 単位/μL) | 0.5 μL | ||
| H2O | 40.5 μL | ||
| 総量 | 50 μL | ||
| * miRNA発現キットで提供されます。 | |||
| 熱サイクル条件 | |||
| 94 °C | 5 ミン | ||
| 次の30サイクル: | |||
| 94 °C | 45秒 | ||
| 58 °C | 1 ミン | ||
| 72 °C | 2 ミン | ||
| 72 °C | 10 ミン | ||
表3:反応セットアップおよび熱サイクル条件。
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Discussion
このプロトコルは、 in ovo エレクトロポレーションと Tol2 トランスポゾンシステムを用いた人工 miRNA のトランスジェニック発現による、発生中のニワトリ網膜における遺伝子サイレンシングの詳細なガイドを提供します。
この手法を正常に実行するには、次の要素が非常に重要です。まず、堅牢なノックダウン効果を発揮することが確認されているmiRNA配列を使用することが重要です。 それらをin ovo エレクトロポレーションに適用する前に、 in vitro アッセイで個々のpre-miRNA配列の遺伝子抑制効率をテストし(ステップ1.4)、最も高いノックダウン活性を示す2つのpre-miRNA配列を鎖鎖します(ステップ1.5)。第二に、DNA溶液を注入するためのマイクロピペット針を挿入するときに、視神経小胞および周囲の神経組織を損傷しないことが重要です。胚への過度の損傷は、胚の奇形や死につながる可能性があります。組織の損傷を避けるために、マイクロピペットを正しい向きで視神経小胞に導入します。マイクロピペット針の先端が小さく鋭利になると、視神経小胞の貫通がスムーズになり、組織の損傷が少なくなります。しかしながら、非常に小さな先端を有する針は、DNA溶液を装填および放出するのが困難である。ここで説明する研究では、直径10〜20μmの先端開口部を有する針を使用した。第三に、視神経小胞全体をDNA溶液で満たすようにしてください(高速グリーンの広がりによって視覚化されるように)。第四に、視小胞の所望の領域(例えば、側頭側、鼻側)にDNAを標的化するための最適な位置に電極を配置する。負に帯電したDNA分子はアノード側に移動します。したがって、電極の正確な配置と向きは、最終結果に大きく影響します。最後に、最適なDNA濃度とエレクトロポレーションパラメータを使用します。
エレクトロポレーションの24時間後に蛍光シグナルが観察されない場合は、次の点を考慮する必要があります:(1)エレクトロポレーションされたプラスミドが正しい配列を持っていることを確認します。(2)個々のプラスミドの濃度と純度を再確認します。(3)DNA溶液が視神経小胞の内腔を満たし、神経管に拡散しないことを確認します。(4)使用したエレクトロポレーションパラメータが正しいことを確認します。(5)電気パルスを印加している間、電極が卵子膜に接触していることを確認してください。
このプロトコルにおける in ovo エレクトロポレーションとトランスポゾン媒介遺伝子組み込み法の組み合わせには、いくつかの明確な利点があります。第一に、miRNAの安定した産生をサポートし、標的遺伝子の持続的な抑制をサポートします。ニワトリ網膜の発達はE1.5から始まり、孵化まで続きます(網膜神経節細胞はE2からE9の期間にわたって産生されます)。遺伝子機能喪失解析のためには、この間、人工miRNAの発現を安定的に維持する必要があります。従来の発現ベクターを用いたRNAi配列の発現は、発現構築物が染色体に効率的に組み込まれないため、一般に一過性である。しかしながら、ここに記載の方法では、発現カセットの染色体組込みは、共エレクトロポレーショントランスポザーゼの活性によって媒介され、導入遺伝子の安定な発現をもたらす。
第二に、この方法では、同じCAGGSプロモーターがトランスフェクトされた細胞において複数のmiRNA配列とEmGFPマーカーの共シストロン発現を誘導し、二重遺伝子発現を達成するための2つのプロモーターを含むレトロウイルスベクターの一般的な合併症の1つであるプロモーター干渉のリスクを回避します25。
最後に、複製能力のあるレトロウイルスベクターとは異なり、この方法によってエレクトロポレーションされた導入遺伝子は、隣接する細胞に移されない。したがって、適切な種類の電極を使用し、それらを正しい位置に配置することにより、トランスフェクションの領域をより正確に制御できます。
上述の利点にもかかわらず、現在の方法はまた、 ovo エレクトロポレーションに内在する制限を有する。例えば、トランスフェクションおよび遺伝子抑制の速度は胚間で異なり得、比較的多数の胚を解析のためにトランスフェクトする必要があるかもしれない。さらに、後の発達段階(E4-E5など)の 卵子 の胚性網膜へのエレクトロポレーションは、眼が心臓のすぐ近くに位置しているため、実験的に困難であり、エレクトロポレーション後の心停止のリスクを高めます。
ここで説明するシステムは、発達中のひよこ網膜における迅速かつ堅牢な遺伝子抑制を可能にする。このアプローチは、神経組織および非神経組織を含むニワトリ胚の他の部分にも適用することができる。したがって、本システムはヒナ発育の分子機構の解明に貢献することが期待されます。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
pT2K-CAGGSおよびpCAGGS-T2TPベクターは、それぞれ高橋佳子(京都大学、京都)および川上浩一(国立遺伝学研究所、三島)から提供された。原稿を批判的に読んでくれたマイケル・ベルベログルに感謝します。この研究は、王立協会およびバイオテクノロジーおよび生物科学研究評議会(BBSRC)(英国)からM.N.への助成金によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G needle, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A and AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 and Q202 | Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB cables | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 cables | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 square wave electroporator | Nepa Gene | CUY21 | |
| Diethanolamine (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Dissecting microscope | |||
| Egg incubator | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| Electrode holder | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli cells |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers | ||
| Gooseneck fiber light source | |||
| FuGene 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Hamilton syringe (50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Hanks' balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-Homoarginine | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulator | Narishige (Japan) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Micropipette puller | Shutter Instrument | P97 | |
| p-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Optional) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Thermal cycler |
References
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