Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

השגת סינון מקטעים יעיל במתקן XChem ב-Diamond Light Source

Published: May 29, 2021 doi: 10.3791/62414
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1,2, 1,2, 1,2,3, 3,4, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3, 1,3, 3,5, 1, 1,2,3,4,6
1Diamond Light Source Ltd, Harwell Science and Innovation Campus, 2Research Complex at Harwell, Harwell Science and Innovation Campus, 3Structural Genomics Consortium, University of Oxford, 4Centre for Medicines Discovery, University of Oxford, 5Oxford Protein Informatics Group, Department of Statistics, Oxford University, 6Department of Biochemistry, University of Johannesburg
* These authors contributed equally

Summary

מאמר זה מתאר את תהליך XChem המלא לסינון מקטעים מבוסס גביש, החל מהגשת בקשה לגישה וכל השלבים הבאים להפצת נתונים.

Abstract

בגילוי תרופות מבוססות פרגמנטים, מאות או לעתים קרובות אלפי תרכובות קטנות מ~300 Da נבדקות מול החלבון המעניין כדי לזהות ישויות כימיות שניתן לפתח לתרופות מועמדות חזקות. מכיוון שהתרכובות קטנות, האינטראקציות חלשות, ולכן שיטת הסינון חייבת להיות רגישה מאוד; יתר על כן, מידע מבני נוטה להיות חיוני לפירוט פגיעות אלה לתרכובות דמויות עופרת. לכן, קריסטלוגרפיה של חלבונים תמיד הייתה טכניקה סטנדרטית זהב, אך היסטורית מאתגרת מכדי למצוא שימוש נרחב כמסך ראשי.

ניסויים ראשוניים של XChem הודגמו בשנת 2014 ולאחר מכן נוסו עם משתפי פעולה אקדמיים ותעשייתיים כדי לאמת את התהליך. מאז, מאמץ מחקרי גדול וזמן אלומה משמעותי ייעלו את הכנת הדגימות, פיתחו ספריית מקטעים עם אפשרויות מעקב מהירות, הפכו את היכולת של I04-1 beamline לאיסוף נתונים ללא השגחה ושיפרו אותה, ויישמו כלים חדשים לניהול נתונים, ניתוח וזיהוי פגיעות.

XChem הוא כעת מתקן לסינון מקטעים קריסטלוגרפיים בקנה מידה גדול, התומך בכל תהליך הגבישים עד לשיקוע, ונגיש למשתמשים אקדמיים ותעשייתיים ברחבי העולם. תוכנית המשתמשים האקדמיים שעברו ביקורת עמיתים פותחה באופן פעיל מאז 2016, כדי להתאים לפרויקטים בהיקף מדעי רחב ככל האפשר, כולל פרויקטים מתוקפים היטב, כמו גם גישוש. הגישה האקדמית מוקצית באמצעות קולות קוראים דו-שנתיים להצעות שעברו ביקורת עמיתים, ועבודה קניינית מסודרת על ידי קבוצת הקישור התעשייתי של דיאמונד. תהליך עבודה זה כבר מיושם באופן שגרתי על למעלה ממאה מטרות מתחומים טיפוליים מגוונים, ומזהה ביעילות קלסרים חלשים (שיעור פגיעה של 1%-30%), המשמשים הן כנקודות מוצא איכותיות לתכנון תרכובת והן מספקים מידע מבני נרחב על אתרי קשירה. עמידות התהליך הודגמה על ידי המשך סינון מטרות SARS-CoV-2 במהלך מגיפת COVID-19, כולל סיבוב של 3 שבועות עבור הפרוטאז הראשי.

Introduction

גילוי תרופות מבוסס פרגמנטים (FBDD) היא אסטרטגיה נפוצה לגילוי עופרת, ומאז הופעתה לפני 25 שנה, היא סיפקה ארבע תרופות לשימוש קליני ויותר מ -40 מולקולות קודמו לניסויים קליניים 1,2,3. פרגמנטים הם ישויות כימיות קטנות בדרך כלל עם משקל מולקולרי של 300 Da או פחות. הם נבחרים בשל המורכבות הכימית הנמוכה שלהם, המספקים נקודות התחלה טובות לפיתוח מעכבי ליגנד יעילים מאוד עם תכונות פיסיקוכימיות מצוינות. גודלם אומר שהם דוגמים את נוף הקישור של חלבונים בצורה יסודית יותר מאשר ספריות של תרכובות גדולות יותר דמויי תרופות או עופרת, וכך גם חושפים נקודות חמות ואתרים אלוסטריים משוערים. בשילוב עם מידע מבני, המקטעים מספקים מפה מפורטת של האינטראקציות המולקולריות האפשריות בין חלבון לליגנד. עם זאת, זיהוי ואימות אמינים של ישויות אלה, הנוטות להיקשר חלש לחלבון המטרה, דורש מערך של שיטות סינון ביופיזיות חזקות ורגישות כגון תהודה פלסמונית פני השטח (SPR), תהודה מגנטית גרעינית (NMR), או קלורימטריה טיטרציה איזותרמית (ITC)4,5.

קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן היא חלק חיוני מארגז הכלים של FBDD: היא רגישה מספיק כדי לזהות קלסרים חלשים ומניבה ישירות מידע מבני על האינטראקציות ברמה המולקולרית. הוא משלים מסכים ביופיזיקליים אחרים ובדרך כלל חיוני לקידום פגיעות פרגמנטים לתרכובות עופרת; זה דורש מערכות גבישים באיכות גבוהה, כלומר התגבשות היא מאוד לשחזור, גבישים אידיאלי diffract כדי טוב יותר מ 2.8 Å רזולוציה.

מבחינה היסטורית, היה קשה מאוד להשתמש בקריסטלוגרפיה כמסך פרגמנט ראשוני 6,7,8, בין אם באקדמיה ובין אם בתעשייה. לעומת זאת, סינכרוטרונים השיגו שיפורים בסדר גודל ברובוטיקה, אוטומציה 9,10,11 וטכנולוגיית גלאים 12,13, ובשילוב עם כוח מחשוב מואץ באותה מידה ואלגוריתמים של עיבוד נתונים14,15,16, ניתן למדוד מערכי נתונים שלמים של עקיפה בשניות ומספרים גדולים מהם ללא השגחה, כפי שחלוץ ב- LillyCAT7 ומאוחר יותר MASSIF17,18 (מתקן קרינת סינכרוטרון אירופי (ESRF)). זה הוביל את הסינכרונים לפתח פלטפורמות יעילות ביותר כדי להפוך את סינון המקטעים מבוסס הגביש כמסך ראשי לנגיש לקהילת משתמשים רחבה (XChem at Diamond; CrystalDirect ב-EMBL/ESRF19; BESSY בהלמהולץ-צנטרום ברלין20; FragMax ב- MaxIV21).

מאמר זה מתעד את הפרוטוקולים המרכיבים את פלטפורמת XChem להקרנת מקטעים על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, החל מהכנת הדגימה ועד לתוצאות המבניות הסופיות של פגיעות במודל תלת-ממדי. הצינור (איור 1) דרש פיתוח גישות חדשות לזיהוי גבישים 22, השריה 23 וקצירת24, כמו גם תוכנת ניהול נתונים 25 וגישה אלגוריתמית לזיהוי מקטעים 26 שנמצאת כיום בשימוש נרחב בקהילה. טכנולוגיית קצירת הגבישים נמכרת כעת על ידי ספק (ראה טבלת חומרים), והזמינות הפתוחה של הכלים אפשרה לסינכרונים אחרים להתאים אותם להקמת פלטפורמות מקבילות21. פרויקטים מתמשכים עוסקים בניתוח נתונים, השלמת מודלים והפצת נתונים באמצעות פלטפורמת Fragalysis27. מעבדת הכנת הדגימות צמודה לקו האלומה I04-1, מה שמפשט את הלוגיסטיקה של העברת מאות דגימות קפואות לקו האלומה וזמן אלומה ייעודי על I04-1 מאפשר משוב רנטגן מהיר שינחה את הקמפיין.

XChem היא חלק בלתי נפרד מתוכנית המשתמשים של דיאמונד, עם שתי שיחות בשנה (תחילת אפריל ואוקטובר). תהליך ביקורת העמיתים שוכלל תוך התייעצות עם מומחים לגילוי תרופות מהאקדמיה והתעשייה. יחד עם טיעון מדעי חזק, תהליךההצעה 28 דורש מהמועמדים להעריך בעצמם לא רק את נכונותה של מערכת הגבישים, אלא גם את מומחיותם בשיטות ביוכימיות ואורתוגונליות ביופיזיקליות ויכולתם להתקדם בבדיקות סקר באמצעות כימיה עוקבת. דרכי הגישה התפתחו גם כדי להתאים לקהילת המשתמשים הרב-תחומית:

רמה 1 (פרויקט יחיד ) מיועדת לפרויקטים בשלב הגישוש וכלי אימות פגיעות (ביופיזיקה או כלים ביוכימיים) ואסטרטגיות מעקב לא צריכות להיות במקום. אם יתקבל, הפרויקט יקבל מספר מופחת של משמרות זמן אלומה, מספיק להוכחת היתכנות.

רמה 2 (פרויקט יחיד) מיועדת לפרויקטים מאומתים היטב ודורשת כלים במורד הזרם ואסטרטגיות מעקב כדי להיות במקום. אם יתקבל, יוקצה לפרויקט מספיק זמן קרן לקמפיין סינון מלא של פרגמנטים. פרויקטים בודדים (רמה 1 או רמה 2) יושלמו במהלך 6 החודשים של תקופת ההקצאה (אפריל עד ספטמבר או אוקטובר עד מרץ).

Block Allocation Group (BAG) מיועד לקונסורציום של קבוצות ופרויקטים, שבו מתקיים תהליך חזק של בחירת יעדים ותעדוף בתוך ה-BAG, יחד עם צינור מעקב ברור. ל-BAGs חייב להיות לפחות מומחה אחד שעבר הכשרה מלאה של XChem (משתמש-על), אשר מתאם את פעילותם עם צוות Diamond ומכשיר את חברי BAG. מספר משמרות זמן הקרן המוקצה מוגדר על ידי מספר הפרויקטים החזקים מבחינה מדעית ב- BAG ומוערך מחדש לכל תקופת הקצאה בהתבסס על דוח ה- BAG. הגישה זמינה למשך שנתיים.

ניסוי XChem מחולק לשלושה שלבים, עם נקודת החלטה עבור כל אחד מהם: מבחן סבילות לממס, טרום מסך ומסך ראשי (איור 2). בדיקת סבילות הממס מסייעת להגדיר את פרמטרי ההשריה, את כמות הממס (DMSO, אתילן גליקול או חומרי הקפאה אחרים במידת הצורך) שהמערכת הגבישית יכולה לסבול ולכמה זמן. ריכוזי הממסים נעים בדרך כלל בין 5%-30% על פני שתי נקודות זמן לפחות. נתוני עקיפה נאספים ומושווים לעקיפה הבסיסית של מערכת הגביש; פעולה זו תקבע את פרמטרי ההשריה לשלב הבא. עבור המסך המקדים, 100-150 תרכובות מושרות בתנאים שנקבעו במבחן הממס, ומטרתו לאשר כי הגבישים יכולים לסבול את התרכובות בתנאים אלה. במידת הצורך, ההקפאה מתווספת לאחר מכן לטיפות שכבר מכילות את השברים. קריטריוני ההצלחה הם ש-80% או יותר מהגבישים שורדים מספיק טוב כדי להניב נתוני עקיפה באיכות טובה ועקבית; אם פעולה זו נכשלת, תנאי ההשריה משתנים בדרך כלל על ידי שינוי זמן ההשריה או ריכוז הממס. לאחר סינון מקדים מוצלח, ניתן להגדיר את שאר התרכובות שנבחרו לניסוי באמצעות הפרמטרים הסופיים.

ספריית DSI (ראו טבלת חומרים) תוכננה בכוונה לאפשר התקדמות מעקב מהירה באמצעות כימיה יציבה29 והייתה ספריית סוס העבודה של המתקן. הוא זמין למשתמשים בריכוז של 500 mM ב- DMSO. משתמשים אקדמיים יכולים גם לגשת לספריות אחרות המסופקות על ידי משתפי פעולה (מעל 2,000 תרכובות בסך הכל) בריכוזים של 100-500 מילימטר ב- DMSO (רשימה מלאה ניתן למצוא באתר28). חלק גדול מהאוסף הכולל זמין גם באתילן גליקול, עבור מערכות גבישיות שאינן סובלות DMSO. משתמשים יכולים גם להביא ספריות משלהם, בתנאי שהן נמצאות בצלחות התואמות למערכת הטיפול בנוזלים אקוסטיים (ראה טבלת חומרים).

עבור כל שלושת שלבי הניסוי (אפיון ממס, טרום מסך או מסך מלא), הליכי הכנת הדגימה הבאים זהים (איור 3): בחירת מיקום ניפוק התרכובת באמצעות הדמיה ומיקוד של טיפות התגבשות עם TeXRank22; ניפוק לטיפות באמצעות מערכת ניפוק נוזלים אקוסטית הן לממס והן לתרכובות23; קציר יעיל של הגבישים באמצעות מעביר קריסטל24; והעלאת מידע לדוגמה למסד הנתונים של Beamline (ISPyB). הממשק הנוכחי לתכנון וביצוע ניסויים הוא יישום מבוסס אקסל (SoakDB), אשר מייצר את קבצי הקלט הדרושים עבור הציוד השונים של הפלטפורמה, ועוקב ומתעד את כל התוצאות במסד נתונים SQLite. סורקי ברקוד משמשים בשלבים שונים לאורך התהליך כדי לסייע במעקב אחר דוגמאות ונתונים אלה מתווספים למסד הנתונים.

נתוני עקיפה נאספים במצב ללא השגחה באמצעות זמן אלומה ייעודי על קו האלומה I04-1. שני מצבי מרכוז זמינים, כלומר, אופטי ורנטגן מבוסס17. עבור גבישים בצורת מחט ומוט, מומלץ לבצע מרכוז קרני רנטגן, בעוד שגבישים גושים יותר תומכים בדרך כלל במצב אופטי, שהוא מהיר יותר ולכן מאפשר לאסוף יותר דגימות בזמן הקרן המוקצב. בהתאם לרזולוציה של הגבישים (שנקבעו לפני הכניסה לפלטפורמה), איסוף הנתונים יכול להיות חשיפה כוללת של 60 שניות או 15 שניות. איסוף נתונים בשלב בדיקת הממס בדרך כלל מודיע איזה שילוב יעבוד הכי טוב עם הביצועים של beamline I04-1.

הנפח הגדול של ניתוח הנתונים מנוהל באמצעות XChemExplorer (XCE)25, אשר יכול לשמש גם כדי להפעיל את שלב זיהוי הלהיטים באמצעות PanDDA26. XCE הוא כלי לניהול נתונים וזרימת עבודה שתומך בניתוח בקנה מידה גדול של מבני ליגנד חלבונים (איור 4); הוא קורא כל אחת מתוצאות העיבוד האוטומטי מנתונים שנאספו ב- Diamond Light Source (DIALS16, Xia214, AutoPROC30 ו- STARANISO31) ובוחר אוטומטית אחת מהתוצאות בהתבסס על איכות הנתונים ודמיון למודל ייחוס. חשוב שהמודל ייצג את המערכת הגבישית המשמשת לבדיקת XChem, ועליו לכלול את כל המים או מולקולות ממס אחרות, כמו גם את כל הקו-פקטורים, הליגנדות והקונפורמציות החלופיות הנראות בגבישים ספוגים בממס בלבד. איכותו של מודל ייחוס זה תשפיע ישירות על כמות העבודה הנדרשת בשלב בניית המודל ושכלולו. PanDDA משמש לניתוח כל הנתונים ולזיהוי אתרים מחייבים. הוא מיישר מבנים למבנה ייחוס, מחשב את המפות הסטטיסטיות, מזהה אירועים ומחשב מפות אירועים26,32. בפרדיגמת PanDDA, אין צורך או רצוי לבנות את המודל הקריסטלוגרפי המלא; מה שיש למדל הוא רק את נקודת המבט של החלבון שבו מקטע קשור (מודל מצב הכבול), ולכן ההתמקדות צריכה להיות רק בבניית הליגנד ומולקולות השאריות/ממס שמסביב על פי מפת האירועים32.

Protocol

1. הגשת הצעה לפרויקט

  1. תוכן ההצעה: מכיוון שתוכנית XChem מנויה יתר על המידה, מידע יסודי ומלא בהצעה הוא קריטי למעבר ביקורת עמיתים.
    1. הפוך את הטיעון! להציג את חשיבות היעד ולשים אותו בהקשר הרחב יותר.
      1. נסחו את האסטרטגיה לאחר קמפיין סינון הפרגמנטים: השיטות האורתוגונליות הקיימות כדי לאמת את הפגיעות וכיצד לקדם אותן. יישרו קו בין שיתופי הפעולה, במידת הצורך.
      2. בשל החלק האינטנסיבי של ניתוח המעבדה והנתונים, מומלץ מאוד להקצות קריסטלוגרף מנוסה מראש.
      3. מערכת גבישים חזקה היא המפתח למניעת שונות טכנית ועל המשתמשים להתייחס לנקודות חיוניות אלה.
        1. ודא שתנאי ההתגבשות מניבים טיפות ניתנות לשחזור עם גבישים באיכות עקיפה דומה בלוחות המתאימים לשימוש על האסדה עם נפח מאגר של 30 μL (או פחות) וגודל טיפה בין 200-500 nL. באופן אידיאלי, יותר מ -50% מהטיפות בצלחת יהיו גבישים בגודל 35 מיקרומטר לפחות33.
        2. להבטיח איכות עקיפה עקבית של גבישים (2.6 Å או יותר).
        3. בדקו את התאמת מערכת הגביש לסינון שברים, כולל אריזת גבישים ונגישות אתרים מוכרים. עדויות קודמות למולקולה הקשורה באתרים אלה מרגיעות לעתים קרובות.

2. הכנה לביקור

  1. העברת פרוטוקולי התגבשות להתגבשות באתר.
    1. ספק 2 x 50 מ"ל של פתרון מאגר, מוכן לשימוש.
    2. לספק את הפתרון חלבון בריכוז הדרוש להתגבשות, מוכן לשימוש aliquots של 30-50 μL.
    3. לספק 10 מ"ל של תמיסת חיץ החלבון.
    4. לספק מלאי זרעים (גם אם אין צורך בפרוטוקול התגבשות).
      הערה: הזריעה מעדיפה את יכולת ההתגבשות ומזרזת את זמן הגרעין33.
    5. מלא את טופס מידע ההתגבשות הזמין באתר XChem28.
    6. ספק את פרטי האחסון בטופס המשלוח הזמין באתר XChem28.
  2. התקן את NoMachine והגדר שולחן עבודה מרוחק ל- Diamond (https://www.diamond.ac.uk/Users/Experiment-at-Diamond/IT-User-Guide/Not-at-DLS/Nomachine.html).
  3. צור והעבר מודל ייחוס טוב, בהתייעצות עם קריסטלוגרף מומחה או צוות תמיכה של XChem.

3. ניסוי סינון פרגמנטים

  1. הגדרת מיקום חלוקת המתחם.
    1. הדמיה של לוחות התגבשות.
      1. דמיינו את כל לוחות הגביש (ראו טבלת חומרים) הדרושים לניסוי במדמייני לוחות הקריסטל (ראו טבלת חומרים). באמצעות תוכנת ההדמיה, צור שמות לוחית בספרייה הנכונה עבור סוג הלוחית בפורמט הבא הצעה Number_Plate מספר.
      2. הדפס את הברקודים (לחץ לחיצה ימנית על שם הצלחת ובחר מהתפריט), מקם אותם בצד הנגדי של הצלחת מאותיות השורה, הכנס את הלוחות ליציאת הטעינה כשהברקוד פונה הרחק מהמשתמש.
      3. השתמש בתוכנת בקרת התמונה, סרוק את יציאת העומס, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על לוחות ולאחר מכן בחר לוחות תמונה.
      4. לאחר השלמת ההדמיה, הסר לוחות ממכונת הצילום.
    2. בחירת גבישים ומיקום המתחם
      הערה: התמונות של טיפות ההתגבשות מעובדות בתוך צינור לואיג'י באמצעות האלגוריתם מבוסס הטקסטונים של TexRank Ranker כדי לדרג את הטיפות לפי נוכחות סבירה של גבישים22. פעולה זו אורכת כ-10 דקות והתמונות יהיו זמינות ב-TexRank.
      1. פתח את TeXRank ממחשב ובחר את מגש הקריסטל מהרשימה בפינה השמאלית התחתונה או על ידי הקלדת הברקוד בתיבה בפינה השמאלית העליונה.
      2. בחר את תבנית התמונה הנכונה ואת תצוגת הבאר היחידה. עברו בין תמונות הטיפה וכשיש גביש שמתאים לשימוש בניסוי, לחצו לחיצה ימנית הרחק מהגביש אבל בתוך הטיפה – המטרה היא לכוון לאן בטיפה להוסיף ממס/תרכובות, אז לא רוצים לפגוע ישירות בגביש23.
      3. המשך דרך הצלחת כולה ולאחר שתסיים בחר את הד 1 יעד לחצן; שמור בספריית יעדי קריסטל תחת הביקור הרלוונטי. אל תשנה את שם הקובץ.
      4. חזור על הפעולה עבור כל צלחת נוספת.
  2. ניפוק תרכובת
    1. יצירת קבצים לחלוקה מורכבת
      1. ב- SoakDB, הזן בחירת ספרייה או מידע ממס בטבלת הספרייה/הממס.
      2. הזן את נפח הטיפה והעומס ברשימת גבישי היעד.
      3. צור את האצוות הנדרשות.
      4. הזן את פרמטרי ההשרייה. לחץ על חישוב ולאחר מכן על יצוא ממתין לחצן. עבור ממס, להוסיף את הריכוזים השונים לשולחן. פעולה זו יוצרת את הקבצים לשימוש במתקן האקוסטי.
      5. אם אתה משתמש cryoprotectant, הזן את הריכוז וליצור את הקבצים באותו אופן.
    2. ניפוק פתרונות באמצעות המתקן האקוסטי (ראה טבלת חומרים)
      1. קח את צלחת המקור (תרכובות או ממס / cryoprotectant) וסובב את הצלחת בצנטריפוגה במשך 2 דקות ב 1,000 x גרם.
      2. אם מחלק ממס או cryoprotectant, פיפטה 30 μL לתוך הבאר הרלוונטית על צלחת 384PP; מכסים בסרט מיקרו-אטם ואז בצנטריפוגה כנ"ל.
      3. פתח את התוכנה; בחר חדש ובחר את צלחת באר המקור הנכונה (384PP, 384LDV או 1536LDV) ואת מחלקת הנוזל (DMSO, CP, BP או GP). ודא שסוג הלוח הנכון נבחר כלוחית היעד. לאחר מכן סמן את התיבה מותאם אישית והמשך.
      4. בחר ייבוא ובחר את קובץ האצווה הרלוונטי. השלם את שלבי הייבוא כפי שתתבקש על-ידי התוכנה.
      5. השתמש במפות הלוחות כדי לבדוק את הפתרון לחלוקה ואת מיקומי היעד.
      6. הפעל את הפרוטוקול, בהתאם להנחיות כפי שהן עולות. התמיסות מלוח המקור יוותרו לטיפות הקריסטל שנבחרו.
      7. אחסנו את הצלחת באינקובטור למשך הזמן הנדרש.
        הערה: פרמטרים אלה נקבעים בשלב אפיון הממס, הטמפרטורה תהיה 4 ° C או 20 ° C בהתאם לטמפרטורת צמיחת הגביש והזמנים הם בדרך כלל בין 1 שעות ל 3 שעות.
  3. קצירת גבישים באמצעות מכשיר קצירת גבישים חצי אוטומטי (ראה טבלת חומרים).
    הערה: אם נדרשת הגנה קריו-פרוטקטיבית, חזור על שלב 3.2.2 להוספת תמיסות הגנה קריו-פרוטקטיבית על טיפות הקריסטל לפני קצירת הדגימות.
    1. הכנה לקטיף
      1. הכינו את הקבצים הדרושים לקציר ב-SoakDB. כאשר נשאל, ודא כי השריה נעשתה, ואת האצוות הושלמו.
      2. סרוק את מספר הדסקיות הדרוש לניסוי תחת מספר ההצעה הנכון.
      3. בחר מגש של לולאות בגודל המתאים עבור הגבישים (35 מיקרומטר, 75 מיקרומטר או 150 מיקרומטר). חשוב לציין, בחר גודל לולאה התואם את גודל הגביש ככל האפשר כדי לאפשר את המרכוז האוטומטי על קו הקרן להיות מדויק יותר, לשפר את איכות הנתונים על ידי הפחתת הרקע ולבטל את הצורך cryoprotectant.
      4. פתח את התוכנה הרלוונטית ופתח את כרטיסיית זרימת העבודה.
      5. סרוק את הזין לתוך התוכנה וגלול חזרה לראש הרשימה, תוך הדגשת הזין הראשון.
      6. מניחים את הדסקיות בקצף ומקררים אותן בחנקן נוזלי.
      7. בחרו 'ייבוא קובץ מ-SoakDB ' ובחרו את האצווה לקציר; בדוק אם האצווה מוקצית למחזיק השמאלי. מופיעה רשימת עבודה.
      8. קח את צלחת הקריסטל, להסיר את החותם, ולשים את מחזיק שמאל; הזיזו את הצלחת למצב החניה.
    2. קצירת גבישים
      1. תרגיש בנוח ולחץ על לחצן התחל זרימת עבודה (המסך הוא מסך מגע) כדי לעבור למיקום הבאר הראשון שנבחר.
      2. אם הגביש שרד, הרכיבו את הגביש בלולאה וצללו לתוך החנקן הנוזלי והציבו אותו במקום 1 בזין הראשון ברשימה.
      3. בחר את התיאור המתאים לגביש מהממשק (רגיל, מותך, סדוק, ג'לי או צבעוני).
      4. אם הטיפה היא ספוג מורכב, רשום את תיאור המצב המורכב (שקוף, גבישי, מואץ, ניפוק גרוע או הפרדת פאזה).
      5. אם הגביש הותקן בהצלחה, בחר Mounted אחרת בחר Fail.
      6. הצלחת תעבור לבאר הבאה שנבחרה. מלא את כל מיקומי הדסקית ברציפות (אל תשאיר רווח אם הגביש נכשל). המשך עד לסוף זרימת העבודה.
      7. בסוף זרימת העבודה, טען את כל האצוות הנוספות והמשך למלא את הדסקיות לפי הסדר. אין צורך להתחיל פאק חדש עבור אצווה חדשה.
    3. מעקב ברקוד אחר תוצאות הקציר
      1. לאחר שכל הגבישים נקצרו, קחו את הגבישים לסורק הברקוד, הניחו אחד בכל פעם במחזיק כדי לסרוק את הזין ולהצמיד ברקודים.
      2. כאשר זה הושלם, לשים את המכסים על pucks ולאחסן באחסון חנקן נוזלי dewar.
      3. טען את קובץ הפלט לממשק SoakDB.
    4. רישום מידע לדוגמה לתוך ISPyB34,35,36
      1. העלאת נתונים לדוגמה ל- ISPyB
        1. ב- SoakDB, עדכן את קו האלומה, בקר בעדכון עבור ISPyB ולחץ על ייצוא כדי ליצור את הקובץ להעלאה ל- ISPyB.
        2. מרק פתוח. התחבר ודפדף לספרייה הבאה dls/labxchem/data/year/lbXXXX-1/processing/lab36/ispyb.
        3. הפעל את קובץ ה-script csv2ispyb (csv2ispyb lbXXXX-1-date.csv)
          הערה: הדגימות נטענות כעת לתוך ISPyB.
      2. תעד את מיקום הזין ואת אסטרטגיית איסוף הנתונים.
        1. רשום את הפרטים ואת המיקום של הגוזלים
          הערה: חשוב לתעד את הפרטים והמיקום של הדסקיות כדי שניתן יהיה לאתר אותן ולהעמיס אותן על קו הקורה.
          1. ב- SoakDB, פתח את הכרטיסייה השנייה שכותרתה Pucks.
          2. מלא את הפרטים בתיבות לאורך החלק העליון. באופן ספציפי, מיקום של pucks (דיואר אחסון וקנים), פרמטרים איסוף נתונים, כולל רזולוציה צפויה ומספר הצעה.
          3. לחץ על כפתור שמור ורשימה של כל הפאקים תופיע בטבלה. העתק את הפאקים שמולאו לאחרונה.
          4. פתח את הגיליון האלקטרוני של תור XChem (קיצור דרך בשולחן העבודה) והדבק את המידע. מלא כל מידע רלוונטי נוסף.

4. איסוף נתונים

הערה: הנתונים נאספים במצב ללא השגחה ומנוהלים על-ידי צוות XChem/beamline.

  1. איסוף דגימות שאינן ממורכזות כהלכה.
    הערה: אלה נדרשים כאשר אירעו בעיות באיסוף הנתונים עבור דגימות מסוימות, שנגרמו ככל הנראה כאשר הסיכות לא ממורכזות כראוי.
    1. התבונן בתצוגת מחליף הדגימות ב- ISPyB, בחר דרג לפי AP כדי לדרג את הדגימות לפי רזולוציה מעובדת אוטומטית בהדרגתיות צבע מירוק לאדום.
    2. לחץ על הדגימות כדי לבדוק אם יש דגימות אדומות או צהובות.
      הערה: פעולה זו תעלה את איסוף הנתונים.
    3. בדוק את תצלומי הגביש כדי לראות אם הגביש התרכז.
    4. רשום את כל אלה שלא התרכזו ושלח לאיש הקשר המקומי שיאסוף את הדגימות החסרות.

5. ניתוח נתונים

  1. אחזור וניתוח תוצאות העיבוד האוטומטי של Diamond באמצעות XChemExplorer (XCE)25.
    1. במסוף, עבור אל תיקיית המשנה עיבוד: cd /dls/labxchem/data/year/visit/processing או עבור XChem BAGs: cd /dls/labxchem/data/year/visit/processing/project/processing/.
    2. השתמש בכינוי xce כדי לפתוח את XChemExplorer.
    3. בחר בלחצן עדכן טבלאות ממקור נתונים .
    4. תחת הכרטיסייה סקירה כללית , יש סיכום של נתוני הניסוי. הוסף קטגוריות נוספות בעזרת האפשרות Select Columns to Show בתפריט Datasource .
    5. תחת הכרטיסיה הגדרות , בחר את ספריית איסוף הנתונים (/dls/i04-1/data/year/visit/).
    6. פתח את הכרטיסיה ערכות נתונים, בחר את היעד מהתפריט הנפתח בחר יעד, בחר Get תוצאות חדשות מעיבוד אוטומטי מהתפריט הנפתח ערכות נתונים ולחץ על הפעל.
      הערה: XCE ינתח כעת את ביקור איסוף הנתונים לקבלת תוצאות עיבוד אוטומטי. פעולה זו עשויה להימשך זמן מה בפעם הראשונה שהיא מופעלת, בהתאם למספר ערכות הנתונים/ספריות המנותחות.
    7. בדוק עקביות ואיכות נתונים על-ידי בדיקת רזולוציה, קבוצת רווחים ומיזוג Rmerge. אל תכלול נתונים ברזולוציה נמוכה מ- 2.8 Å.
      הערה: כברירת מחדל, בחירת ערכת הנתונים מבוססת על ציון המחושב מתוך I/sigI, שלמות ומספר השתקפויות ייחודיות, אך ניתן לבחור תוצאות עיבוד אחרות לשימוש25.
    8. כדי לבחור תוצאת עיבוד שונה עבור ערכות נתונים בודדות, אם אתה מעדיף, לחץ על מזהה לדוגמה ובחר את התוכנית/הפעלה הרצויה. לשינוי צינור העיבוד של כל ערכות הנתונים, בחר Edit preferences מתפריט Preferences ושנה את Dataset Selection Mechanism.
    9. במידת הצורך, עבד מחדש את הנתונים באמצעות ISPyB37.
    10. אם לא קביל נתונים מעובדים עבור מדגם, יש לתייג כנכשל כדי לא לכלול בניתוח נוסף.
    11. לאחר שתסיים, לחץ על עדכן טבלאות ממקור נתונים כדי להוסיף נתונים לטבלאות הבאות.
  2. חישוב מפות ראשוניות באמצעות DIMPLE38.
    1. פתח את מפות הכרטיסייה, בחר את מודל ההפניה מהתפריט הנפתח ובחר את ערכות הנתונים הרצויות ואחריו הפעל DIMPLE על קבצי MTZ נבחרים.
    2. XCE מפעילה מספר עבודות DIMPLE בו זמנית על האשכול ב-Diamond. מצא את המצב של משימות אלה תחת העמודה מצב גומה ורענן באמצעות הלחצן עדכן טבלאות ממקור נתונים או באמצעות הפקודה qstat ב- Linux.
    3. לאחר שתסיים, בדוק אם הערכים Dimple Rcryst, Dimple Rfree ו- Space Group קבילים. במידת הצורך (Rfree גבוה/קבוצת רווח שגויה/הבדל גדול בנפח תא יחידה), שנה את תוצאות העיבוד האוטומטי כפי שתואר קודם לכן וחזור על יצירת מפות עבור ערכות נתונים אלה.
  3. יצירת ריסוני ליגנד באמצעות Grade39, AceDRG40 או phenix.eLBOW41.
    1. בחר את התוכנית הרצויה (העדפות, העדפות עריכה, תוכנית ליצירת ריסונים) ולאחר מכן בחר ערכות נתונים תחת הכרטיסיה מפות ולאחר מכן הפעל את הקובץ Create CIF/PDB/PNG של תרכובות נבחרות מהתפריט הנפתח מפות וריסון.
    2. רענן את המצב של משימות אלה שנמצאות תחת העמודה מצב מורכב באמצעות הלחצן עדכן טבלאות ממקור נתונים .
  4. בניית מודל מצב הקרקע (Pre-run)
    הערה: המונח מודל מצב קרקע מייצג את מבנה החלבון בצורתו נטולת הליגנד, כפי שנצפה ב-100 מערכי נתונים (מספר זה נבחר באופן שרירותי). מכיוון שמודל מצב הקרקע משמש כנקודת ייחוס לבניית מצב קשור ליגנד, קריטי לבנות מודל מצב קרקע מדויק, הכולל את כל מולקולות הממס והמים, לפני ניתוח כל מסע סינון המקטעים. בשלב זה, מאה מערכי הנתונים הראשונים ברזולוציה הגבוהה ביותר המסומנים על ידי PanDDA כחסרי אירועים מעניינים (ולכן ככל הנראה נטולי ליגנדים) משמשים ליצירת מפת ממוצע מצב הקרקע, בעוד מערך הנתונים עם Rחופשי הנמוך ביותר נבחר לעידון. מפת מצב הקרקע אינה מפה קריסטלוגרפית, אולם חשוב להשתמש במפה זו רק לבניית מודל מצב הקרקע.
    1. פתח את הכרטיסייה PanDDAs ועדכן טבלאות ממקור נתונים במידת הצורך.
    2. הגדר את ספריית הפלט (/dls/labxchem/data/year/visit/processing/analysis/panddas).
    3. בחר Pre-run עבור Ground State Model ולחץ על Run.
      הערה: ערכות נתונים עם Rfree גבוה וקבוצות רווח בלתי צפויות צריכות להיכלל באופן אוטומטי בניתוח.
    4. כדי לא לכלול ידנית ערכות נתונים עם Rfree גבוה וקבוצות רווח בלתי צפויות, בחר התעלם לחלוטין.
    5. בדוק את המצב של משימת ההפעלה מראש באמצעות qstat בחלון מסוף.
    6. לאחר שתסיים, בחר בנה מודל מצב קרקע ולחץ על הפעל.
      הערה: פעולה זו תפתח את Coot עם מפת הממוצע PanDDA ומודל ייחוס/מפות 2Fo-Fc/Fo-Fc מתוך מערך הנתונים האיכותי ביותר למידול מחדש ועידון באמצעות Coot. יש חשיבות עליונה לכך שרק מפת המשמעות של PanDDA תשמש למידול.
  5. זיהוי פגיעות באמצעות PanDDA26
    1. ניתוח PanDDA
      הערה: זה יכול לקחת קצת זמן לרוץ על הצביר אם יש הרבה מערכי נתונים, תא היחידה גדול, ויש עותקים מרובים של החלבון ביחידה אסימטרית.
      1. חזור על השלבים המתוארים לעיל עבור ניתוח DLS, עיבוד אוטומטי, תוצאות וחישוב מפה ראשוני. לחישוב המפה, השתמש במודל מצב הקרקע כהפניה: רענן רשימת קבצי הפניות > הגדר הפניה חדשה וצור מגבלות ליגנד לפי הצורך עבור הנתונים החדשים (שלבים 6.1-6.3).
      2. תחת הכרטיסייה PanDDAs ודא שספריית הפלט מוגדרת כמו קודם והפעל את pandda.analyse מהתפריט הנפתח Hit Identification .
      3. בדוק את מצב המשימה במסוף Linux באמצעות הפקודה qstat.
    2. PanDDA inspect - בדיקה/בנייה של אירועים מחייבים
      1. תחת הכרטיסייה PanDDAs ב- XCE, הפעל את pandda.inspect מהתפריט הנפתח Hit Identification כדי לפתוח את Coot42 עם לוח הבקרה של PanDDA.
        הערה: לוח הבקרה pandda.inspect מספק סיכום של נתונים סטטיסטיים של PanDDA ומאפשר למשתמשים לנווט בין אירועים/אתרים מחייבים. קובץ HTML מסכם של התוצאות נוצר גם הוא וניתן לעדכן אותו במהלך הבדיקה על-ידי בחירה באפשרות עדכן HTML.
      2. כדי למדל ליגנד, לחץ על מזג ליגנד עם מודל ושמור מודל לפני ניווט לאירוע אחר כדי להימנע מאובדן שינויים במודל המצב המאוגד.
        הערה: רק דגמים שעודכנו ונשמרו ייוצאו לצורך מיקוד בשלב מאוחר יותר.
      3. השתמש בשדה ' הערת אירוע ' כדי להוסיף ביאורים לאירוע האיגוד וב'מידע על אתר רשומות ' כדי להוסיף ביאורים לאתרי איגוד.
      4. טען ממוצע ומפות 2mFo-DFc (מ- DIMPLE) להשוואה עם מפת האירועים והדגם.
        1. לאחר שכל הליגנדות בנות קיימא מודלו, מוזגו ונשמרו בהתבסס על מפת האירועים, סגור את pandda.inspect.
    3. ייצוא ועידון PanDDA
      הערה: לאחר PanDDA לבדוק מודלים מיוצאים בחזרה לספריית הפרויקט וסבב ראשוני של ליטוש מושק. כרגע יש שני צינורות זמינים לעשות זאת תחת הכרטיסיה PANDDAs ב- XCE.
      1. ייצוא דגמי PANDDA חדשים/כולם/נבחרים יוצר אנסמבל של דגמים מאוגדים ולא מאוגדים לצורך עידון ומייצר פרמטרים של ריסון תפוסה עבור Refmac43.
        הערה: מודל האנסמבל ישמש לעידון, אך רק מודל המצב הכבול יעודכן ב-Coot ויופקד ב-PDB. צינור זה משמש בצורה הטובה ביותר עבור מערכי נתונים עם מקטעי תפוסה נמוכה ושינויים משמעותיים במודל החלבון.
      2. חידוד מודלים חדשים/כל של מצבים קשורים עם Buster מזקק את המצב הכבול רק עם Buster44.
        הערה: מומלץ להשתמש בשיטה זו עם ליגנדות/מערכי נתונים בתפוסה גבוהה עם שינויים מינימליים במודל החלבון.
  6. ליטוש הלהיטים (כל ערכות הנתונים שנבחרו למיקוד יוצגו כעת בכרטיסיה מיקוד). בחר Open COOT - BUSTER Refinement או Open COOT - REFMAC Refinement מהתפריט הנפתח Refinement כדי לפתוח את Coot באמצעות לוח הבקרה XCE Refinement.
    1. בחר את מצב הדגימות שיש למקד מהתפריט הנפתח בחר דוגמאות (בדרך כלל 3 - בחידוד) ולחץ על GO.
      הערה: לוח הבקרה של XCE מספק סיכום של מספר ערכות הנתונים עבור קטגוריה זו ומאפשר ניווט בין ערכות נתונים תוך מתן סיכום של סטטיסטיקת חידוד.
    2. הוסף הערות לביטחון הליגנד בלוח הבקרה של XCE: 0 - אין נוכחות ליגנד - הקטע אינו קשור; 1 - ביטחון עצמי נמוך - פרגמנט אולי קשור אך אינו משכנע במיוחד; 2 - ליגנד נכון, צפיפות חלשה - המשתמש בטוח שקטע יש כרוך אבל זה תפוסה נמוכה / יש כמה בעיות עם המפות; 3 - צפיפות ברורה, ליגנד בלתי צפוי - מפות מציינות בבירור קשירת ליגנד שאינה תואמת את המבנה הכימי שסופק; 4 - ביטחון עצמי גבוה - ליגנד קשור באופן חד משמעי.
    3. בצע את השינויים הדרושים בדגם בשלב זה והתחל בליטוש נוסף באמצעות לחצן מקד .
    4. השתמש בלחצן הצג רשימת משימות לביצוע של MolProbity כדי לגשת לניתוח MolProbity45 הפועל בכל מחזורי הליטוש.
    5. במידת הצורך, הוסף פרמטרים של עידון, לדוגמה, עבור גורמי טמפרטורה אנאיזוטרופיים, נתונים תאומים או מיקוד תפוסה על-ידי בחירה בלחצן פרמטרי עידוד .
      הערה: סטטיסטיקות עיבוד נתונים מסופקות גם ב- XCE תחת הכרטיסיה מיקוד ואם המיקוד מתבצע עם צינור Buster, דוחות Buster, כולל ניתוח MOGUL46, מסופקים.
    6. שנה את המצב של ערכת נתונים במהלך הליטוש בחלון XCE הראשי תחת הכרטיסיה Refinement או בלוח הבקרה Coot XCE . כאשר אתה משוכנע שהמודל מדויק סביב הליגנד ומתאים לשיתוף לניתוח נוסף, שנה את הסטטוס ל- CompChem Ready. כאשר המיקוד הושלם והדגם מוכן להעלאה ל- PDB, שנה את המצב לתצהיר מוכן.

6. הפקדת הנתונים

הערה: ניתן להפקיד את כל ערכות הנתונים ממסך פרגמנט ואת מודל מצב הקרקע המשמש ליצירת מפות האירועים של PanDDA ב- PDB באמצעות הפקדות קבוצתיות.

  1. המר את כל מפות האירועים של PanDDA לפורמט MTZ על ידי הפעלת מפת אירועים ->SF מתפריט זיהוי פגיעה .
  2. ספק מטה-נתונים נוספים, כגון מחברים ופעולות שירות, על-ידי בחירה באפשרות Deposition > Edit information. מלא את כל הפריטים הדרושים ולחץ על שמור במסד נתונים ולאחר מכן שמור מידע זה לתצהיר של מודל מצב הקרקע. בצע פעולה זו לאחר שמצב הדגם השתנה לתצהיר מוכן.
  3. בכרטיסייה Deposition, בחר בלחצן Prepare mmcif ליצירת קובצי mmcif של גורם מבנה לכל ערכות הנתונים Deposition Ready. ההודעה הבאה תופיע בחלון המסוף כאשר פעולה זו תושלם: סיים להכין קבצי mmcif עבור תצהיר wwPDB.
  4. בחר בלחצן העתק mmcif כדי להעתיק את כל הקבצים הללו לארכיון זפת bzipped יחיד בספריית התצהיר הקבוצתי של הביקור.
  5. עבור אל https://deposit-group-1.rcsb.rutgers.edu/groupdeposit; התחבר עם שם משתמש: GroupTester וסיסמה: !2016RCSBPDB. צור הפעלה והעלה את הקובץ ligand-bound.tar.bz2 מספריית התצהיר של הקבוצה.
  6. לאחר הגשה מוצלחת של המבנים הקשורים לליגנד, נשלח דואר אלקטרוני עם קודי PDB. בחר Update DB with PDB Codes מתפריט Deposition ; העתק והדבק את המידע מהודעת דוא"ל זו בחלון המוקפץ ולחץ על עדכן מסד נתונים כדי להוסיף מזהי PDB.
  7. על מנת להפקיד את מודל מצב הקרקע המשמש את PanDDA, בחר את ספריית PanDDA הרלוונטית ב- XCE והפעל apo->mmcif מתפריט זיהוי פגיעה .
    הערה: XCE יבחר באופן שרירותי מבנה ברזולוציה גבוהה עם Rfree נמוך כמודל לחבילת התצהיר ולאחר מכן יקמפל את כל קובצי mmcif של גורם המבנה לקובץ יחיד.
  8. בכרטיסיה תצהיר (Deposition), בחר בלחצן הוסף למסד נתונים מתחת למקטע Group Deposition of Ground-State Model (מיקום קבוצה של מודל מצב קרקע ).
  9. הזינו מטא-נתונים למודל מצב הקרקע (שוב באמצעות בחירה באפשרות ' תצהיר > עריכת מידע'), טענו את הקובץ הקודם ושמרו במסד הנתונים.
  10. הכן את קובץ mmcif של מצב קרקע על-ידי הפעלת Prepare mmcif מהמקטע Group Deposition of Ground-State Model ולאחר השלמתו, העתק את mmcif לספריה Group Deposition על-ידי בחירה בלחצן העתק mmcif מאותו מקטע.
  11. כמו קודם, עבור אל https://deposit-group-1.rcsb.rutgers.edu/groupdeposit; התחבר עם שם משתמש: GroupTester וסיסמה: !2016RCSBPDB. צור הפעלה והעלה את הקובץ ground_state_structures.tar.bz2 מספריית תצהיר הקבוצה.

Representative Results

צינור XChem להקרנת מקטעים באמצעות קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן עבר ייעול נרחב, מה שאפשר את קליטתו על ידי הקהילה המדעית (איור 5). תהליך זה אומת ביותר מ-150 קמפיינים לסינון עם שיעור כניסות הנע בין 1% ל-30% 47,48,49,50,51,52 ועל ידי משתמשים חוזרים רבים. מערכות גבישיות שאינן מתאימות (רזולוציה נמוכה, לא עקביות בהתגבשות או באיכות עקיפה) או שאינן יכולות לסבול DMSO או אתילן גליקול מסולקות בשלב מוקדם של התהליך וחוסכות זמן, מאמץ ומשאבים. קמפיינים מוצלחים מספקים מפה תלת ממדית של אתרי אינטראקציה פוטנציאליים על חלבון היעד; תוצאה טיפוסית היא מסך XChem של הפרוטאז הראשי של SARS-CoV-2 (איור 6). בדרך כלל, פגיעות פרגמנט נמצאות ב: (א) אתרים ידועים בעלי עניין, כגון אתרים פעילים באנזימים ותת-כיסים48; (ב) אתרים אלוסטריים משוערים, למשל, באינטראקציות חלבון-חלבון53; (c) ממשקי אריזה גבישיים, הנחשבים בדרך כלל כתוצאות חיוביות שגויות (איור 6). נתונים מבניים אלה מספקים בדרך כלל בסיס למיזוג, קישור או גידול של פגיעות מקטעים למולקולות קטנות דמויות עופרת 1,3.

Figure 1
איור 1: צינור XChem. הפלטפורמה מיוצגת באופן סכמטי החל מהצעת הפרויקט דרך הכנת המדגם, איסוף הנתונים וזיהוי להיטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אסטרטגיית סינון. זרימת העבודה מציינת את המטרה של כל אבן דרך, את דרישות הניסוי ואת נקודות ההחלטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תהליך עבודה של הכנת מדגם. שלבים קריטיים להכנת המדגם מיוצגים עם מידע מכל שלב המתועד במסד נתונים SQLite. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ניתוח נתונים באמצעות XCE. שלבים קריטיים בניתוח הנתונים מיוצגים על-ידי דיאגרמת זרימת עבודה עם חבילות התוכנה הרלוונטיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: התפתחות תוכנית המשתמשים של XChem: התרשים מדגים את הקליטה והקונסולידציה של תוכנית המשתמשים משנת 2015 עד 2019 עם יצירת BAGs בשנת 2019 ועמידות הפלטפורמה במהלך מגפת COVID-19 בשנת 2020. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: תוצאות מייצגות של מסך מקטע XChem. דימר פרוטאז ראשי של SARS-CoV2 (Mpro) מיוצג בפני השטח עם פגיעות אתר פעילות המוצגות בצהוב, פגיעות אלוסטריות משוערות המוצגות במגנטה, וחפצי אריזת משטח/גבישים מוצגים בירוק. האיור נעשה באמצעות ערכי כימרה ו-Mpro PDB מתצהיר קבוצתי G_1002156. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

התהליך המתואר במאמר זה נבדק בהרחבה על ידי קהילת המשתמשים ויכולת ההסתגלות של הפרוטוקולים המתוארים כאן היא המפתח לטיפול במגוון הרחב של פרויקטים שבדרך כלל נתקלים בהם בפלטפורמה. עם זאת, יש צורך בכמה תנאים מוקדמים של מערכת הגביש.

עבור כל מסע סינון פרגמנטים המתבצע באמצעות קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, מערכת גבישים ניתנת לשחזור וחזקה היא קריטית. מכיוון שפרוטוקול XChem הסטנדרטי כולל הוספה של המקטע ישירות לטיפת הגביש, המיטוב צריך להתמקד במספר הטיפות המכילות גבישים באיכות גבוהה ולא במספר הכולל של הגבישים. אם טיפות מכילות גבישים מרובים, אז הם למעשה מיותרים אם כי עשויים להקל על תהליך הקציר. יתר על כן, העברת פרוטוקול ההתגבשות מהמכון הביתי למתקנים באתר יכולה להיות מאתגרת. בדרך כלל הדרך הטובה ביותר להשיג זאת היא באמצעות זריעת גבישים כדי לקדם גרעין54 הניתן לשחזור, ולכן, נוהג טוב הוא שמשתמשים יספקו מלאי זרעים יחד עם פתרונות החלבונים וההתגבשות שלהם.

כדי להבטיח מסיסות ותמיכה טובה בתרכובת, ריכוזי ההשריה הגבוהים שנועדו להניע קשירה של מקטעים חלשים, ספריות המקטעים מסופקות בממסים אורגניים, במיוחד DMSO ואתילן גליקול. אספקה של שני ממסים שונים נותנת למשתמשים חלופה לגבישים שאינם סובלים DMSO כלל, או כאשר הוא מונע את קשירת השברים באתר מעניין. משתמשים יכולים לספק ספריות חלופיות בחיץ מימי: תרכובות יוותרו היטב בתנאי שהן מומסות לחלוטין ומעוצבות בלוחות התואמים לרובוט חלוקת הנוזלים.

בפרויקטים בהם לא ניתן למצוא ממס אורגני מתאים שגם יסיס את הספרייה וגם יהיה נסבל על ידי המערכת הגבישית, הליך חלופי הוא שימוש בתרכובות מיובשות כפי שנקבע ב- BESSY55.

בקהילה קיימת שאלה ארוכת שנים לגבי היכולת לספוג תרכובות לגבישים הגדלים בתנאי התגבשות המכילים ריכוזי מלח גבוהים. מעשית, יותר משקעים של תרכובות היווצרות מהירה של גבישי מלח בשלב הקציר הוא ציין, אשר מופחת על ידי החלת סביבה לחה סביב אזור הקציר. באופן כללי, מסעות סינון במערכות גבישיות מתנאי התגבשות מלח גבוהים נותנים שיעור פגיעה דומה לתנאי מלח נמוכים.

השלבים הראשונים של תהליך XChem (בדיקת סבילות לממס וטרום מסך) הם ניסויים בקנה מידה קטן יחסית ומהיר, אך מאפשרים החלטה ברורה של go/no go עבור הפרויקט. למרבה הכאב, יהיה צורך למצוא מערכות גבישים חלופיות אם אף אחד מהממסים אינו נסבל, או אם המסך המקדים גורם לשיעור פגיעות נמוך מאוד. לעומת זאת, אם הם מצליחים, התוצאות מודיעות ישירות על תנאי ההשריה לשימוש בניסוי הסינון, ועל האסטרטגיה הטובה ביותר לאיסוף נתונים. מכיוון שאיכות הנתונים, ובמיוחד הרזולוציה, ישפיעו על איכות צפיפות האלקטרונים לצורך זיהוי וניתוח פגיעות, המטרה היא להשרות בריכוז המורכב הגבוה ביותר האפשרי שאין לו השפעה מזיקה על איכות העקיפה (כאשר רוב מערכי הנתונים (~80%) עקיפה לרזולוציה של 2.8 Å ומעלה).

תהליך ניתוח הנתונים יעיל בתוך XChemExplorer, המסתמך על תוכנת PanDDA לזיהוי קלסרים חלשים ומאפשר למשתמשים לדמיין ולסקור במהירות את תוצאות קמפיין הסינון. XChemExplorer מייבאת תוצאות עיבוד נתונים מהחבילות הזמינות ב- Diamond (DIALS16, autoPROC 30, STARANISO31 ו- Xia214) עם מגבלות רזולוציה שנקבעו על ידי השיטה הסטנדרטית עבור כל חבילה (כלומר,CC1/2 = 0.3). כברירת מחדל, בחירת ערכת הנתונים מבוססת על ציון המחושב מ- I/sigI, שלמות ומספר השתקפויות ייחודיות, אך ניתן לבחור תוצאות עיבוד ספציפיות לשימוש הן באופן גלובלי והן עבור דגימות בודדות25. נתונים אינם נכללים גם בניתוח על ידי PanDDA בהתבסס על קריטריונים הכוללים רזולוציה,R free, והבדל בנפח תא היחידה בין נתוני ייחוס ויעד (ברירות המחדל הן 3.5 Å, 0.4 ו- 12% בהתאמה), כך שגבישים בעלי פיזור גרוע, מיקוד שגוי או אינדקס שגוי אינם משפיעים על הניתוח.

אלגוריתם PanDDA מנצל את המספר המשמעותי של מערכי נתונים שנאספו במהלך קמפיין פרגמנטים כדי לזהות ליגנדות תפוסה חלקיות שאינן נראות במפות קריסטלוגרפיות סטנדרטיות. בתחילה, PanDDA משתמשת בנתונים שנאספו במהלך בדיקת סבילות הממס ושלבי טרום המסך כדי להכין מפת צפיפות ממוצעת המשמשת לאחר מכן ליצירת מודל מצב קרקע. מכיוון שמודל זה ישמש לכל שלבי הניתוח הבאים, חיוני שהוא ייצג במדויק את החלבון הבלתי קשור בתנאים המשמשים למסך הפרגמנט. PanDDA משתמש בניתוח סטטיסטי כדי לזהות ליגנדות קשורות, ויוצר מפת אירועים עבור המצב הכבול של הגביש. מפת אירועים נוצרת על ידי חיסור החלק הלא מאוגד של הגביש ממערך הנתונים של התפוסה החלקית ומציגה מה היה נצפה אם הליגנד היה קשור בתפוסה מלאה. אפילו קטעים שנראים ברורים במפות 2mFo-DF c רגילות עלולים להיות במודל שגוי אם לא מתייעצים במפות האירועים32. בעוד PanDDA היא שיטה רבת עוצמה לזיהוי מערכי נתונים השונים מהמפות הממוצעות (המעידות בדרך כלל על קשירת מקטעים) ומדדים כגון RSCC, RSZD, יחס גורם B ו- RMSD במהלך העידון מסופקים לטובת המשתמשים, המשתמש אחראי בסופו של דבר להחליט אם הצפיפות הנצפית מתארת במדויק את הליגנד הצפוי ואת הקונפורמציה המתאימה ביותר.

לאחר ניתוח נתונים ושכלולם, כל המשתמשים יכולים להפקיד בו זמנית מבנים מרובים בבנק נתוני החלבונים (PDB) באמצעות XChemExplorer. עבור כל מסך פרגמנט, שני תצהירים קבוצתיים נעשים. התצהיר הראשון מכיל את כל המודלים הקשורים למקטעים, עם מקדמים לחישוב מפות אירועים של PanDDA הכלולים בקבצי MMCIF. התצהיר השני מספק את מודל מצב הקרקע הנלווה, לאורך גורמי המבנה הנמדדים של כל מערכי הנתונים של הניסוי: נתונים אלה יכולים לשמש לשחזור ניתוח PanDDA, ולפיתוח אלגוריתמים עתידיים. באשר למבנים של הלהיטים, כאשר תפוסת הפרגמנטים נמוכה, העידון מתנהג טוב יותר אם המודלים מורכבים ממבני הקרקע הקשורים לליגנד ומבלבלים32; עם זאת, הנוהג הוא להפקיד רק את שברי המצב הכבול, שכן המודלים המרוכבים המלאים הם בדרך כלל מורכבים וקשים לפרשנות. כתוצאה מכך, כמה מחווני איכות המחושבים מחדש על ידי PDB (בפרט, R/Rfree) הם לפעמים מעט מוגבהים. ניתן גם לספק את כל הנתונים הגולמיים באמצעות פלטפורמות כגון Zenodo56, אם כי זה לא נתמך כרגע על ידי צינור XChem.

בסך הכל, מאז הפעלתו בשנת 2016, ניתן היה לזהות ליגנדות מקטעים ביותר מ-95% מהמטרות באמצעות הליך זה. הניסיון מהפרויקטים הרבים ש-XChem תמכה בהם זוקק לשיטות עבודה מומלצות להכנת קריסטלים33, בעוד שפותחה ספריית פרגמנטים שיישמה את הרעיון המוכן לסיוע בהתקדמות פרגמנט29, וגם עזרה לבסס את הפרקטיקה של הפיכת קומפוזיציית הספרייה לציבורית. הפלטפורמה הדגימה את החשיבות של תשתית מתוחזקת היטב ותהליכים מתועדים, המפורטים כאן, ואפשרה להעריך ספריות פרגמנטים אחרות 57,58, להשוות ספריות48, וליידע את העיצוב של ספריית EUOpenscreen-DRIVEהשיתופית 59,60.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו מייצגת מאמץ משותף גדול בין מקור אור היהלום לבין קונסורציום גנומי המבנה. המחברים רוצים להודות לקבוצות התמיכה השונות של Diamond ולקבוצת MX על תרומתן לאוטומציה של i04-1 beamline ועל אספקת צינורות יעילים לאיסוף נתונים ועיבוד אוטומטי, אשר בדרך כלל רצים על פני כל אלומות MX. הם גם רוצים להודות לקבוצת SGC PX על עמידותם כמשתמשים הראשונים שבדקו את ההתקנה ול- Evotec על היותם המשתמשים התעשייתיים הרציניים הראשונים. עבודה זו נתמכה על ידי iNEXT-Discovery (מענק 871037) שמומן על ידי תוכנית Horizon 2020 של הנציבות האירופית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DSI-poised library Enamine DSI-896 fragment library
Echo 550 and 650 series Beckman-Coulter acoustic dispensing system
Echo microplates Beckman-Coulter 001-12380; 001-8768; 001-6025 1536-well and 384-well microplates
Shifter Oxford Lab Technology harvesting device
Microplate centrifuge with a swing-out rotor Sigma model 11121 microplate centrifuge
3-drops crystallisation plates Swissci 3W96T-UVP Crystallisation plates
Formulatrix plate imager and Rockmaker software Formulatrix Crystallisation plates imaging device

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erlanson, D. A., Fesik, S. W., Hubbard, R. E., Jahnke, W., Jhoti, H. Twenty years on: The impact of fragments on drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 605-619 (2016).
  2. Jacquemard, C., Kellenberger, E. A bright future for fragment-based drug discovery: what does it hold. Expert Opinion on Drug Discovery. 14 (5), 413-416 (2019).
  3. Jahnke, W., et al. Fragment-to-lead medicinal chemistry publications in 2019. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (24), 15494-15507 (2019).
  4. Li, Q. Application of fragment-based drug discovery to versatile targets. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 180 (2020).
  5. Kirsch, P., Hartman, A. M., Hirsch, A. K. H., Empting, M. Concepts and core principles of fragment-based drug design. Molecules. 24 (23), Basel, Switzerland. 4309 (2019).
  6. Patel, D., Bauman, J. D., Arnold, E. Advantages of crystallographic fragment screening: functional and mechanistic insights from a powerful platform for efficient drug discovery. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 116 (2-3), 92-100 (2014).
  7. Wasserman, S., et al. Automated synchrotron crystallography for drug discovery: the LRL-CAT beamline at the APS. Acta Crystallographica Section A Foundations of Crystallography. 67 (1), 46-47 (2011).
  8. Hartshorn, M. J. Fragment-based lead discovery using X-ray crystallography. Journal of Medicinal Chemistry. 48 (2), 403-413 (2005).
  9. Arzt, S., et al. Automation of macromolecular crystallography beamlines. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 89 (2), 124-152 (2005).
  10. Beteva, A. High-throughput sample handling and data collection at synchrotrons: Embedding the ESRF into the high-throughput gene-to-structure pipeline. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 62, Pt 10 1162-1169 (2006).
  11. Papp, G., et al. FlexED8: The first member of a fast and flexible sample-changer family for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 10 841-851 (2017).
  12. Casanas, A., et al. EIGER detector: Application in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D, Structural Biology. 72, Pt 9 1036-1048 (2016).
  13. Henrich, B., et al. PILATUS: A single photon counting pixel detector for X-ray applications. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 607 (1), 247-249 (2009).
  14. Winter, G., Lobley, C. M. C., Prince, S. M. Decision making in xia2. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 69, Pt 7 1260-1273 (2013).
  15. Winter, G., McAuley, K. E. Automated data collection for macromolecular crystallography. Methods. 55 (1), 81-93 (2011).
  16. Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D, Structural Biology. 74, Pt 2 85-97 (2018).
  17. Bowler, M. W. MASSIF-1: A beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
  18. Von Stetten, D., et al. ID30A-3 (MASSIF-3) - A beamline for macromolecular crystallography at the ESRF with a small intense beam. Journal of Synchrotron Radiation. 27, Pt 3 844-851 (2020).
  19. Cipriani, F., et al. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 68, Pt 10 1393-1399 (2012).
  20. Helmholtz Zentrum Berlin. , Available from: https://www.helmholtzberlin.de/forschung/oe/np/gmx/fragment-screening/index_en.html (2021).
  21. Lima, G. M. A., et al. FragMAX: the fragment-screening platform at the MAX IV Laboratory. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 76 (8), 771-777 (2020).
  22. Ng, J. T., Dekker, C., Kroemer, M., Osborne, M., Von Delft, F. Using textons to rank crystallization droplets by the likely presence of crystals. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 70, Pt 10 2702-2718 (2014).
  23. Collins, P. M., et al. Gentle, fast and effective crystal soaking by acoustic dispensing. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 3 246-255 (2017).
  24. Wright, N. D., et al. The low-cost Shifter microscope stage transforms the speed and robustness of protein crystal harvesting. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 77, Pt 1 62-74 (2021).
  25. Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein-ligand structure determination. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 3 267-278 (2017).
  26. Pearce, N. M., et al. A multi-crystal method for extracting obscured crystallographic states from conventionally uninterpretable electron density. Nature Communications. 8, 15123 (2017).
  27. Fragalysis. , Available from: https://fragalysis.diamond.ac.uk (2021).
  28. Diamond Light Source Ltd. , Available from: https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Fragment-Screening.html (2021).
  29. Cox, O. B., et al. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7 (3), 2322-2330 (2016).
  30. Vonrhein, C., et al. Data processing and analysis with the autoPROC toolbox. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 67, Pt 4 293-302 (2011).
  31. Vonrhein, C., et al. Advances in automated data analysis and processing within autoPROC , combined with improved characterisation, mitigation and visualisation of the anisotropy of diffraction limits using STARANISO. Acta Crystallographica Section A: Foundations and Advances. 74 (1), 360 (2018).
  32. Pearce, N. M., Krojer, T., Von Delft, F. Proper modelling of ligand binding requires an ensemble of bound and unbound states. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 3 265-266 (2017).
  33. Collins, P. M., et al. Achieving a good crystal system for crystallographic x-ray fragment screening. Methods in Enzymology. 610, 251-264 (2018).
  34. Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
  35. Fisher, S. J., Levik, K. E., Williams, M. A., Ashton, A. W., McAuley, K. E. SynchWeb: a modern interface for ISPyB. Journal of Applied Crystallography. 48, Pt 3 927-932 (2015).
  36. Ginn, H. M., et al. SynchLink: an iOS app for ISPyB. Journal of Applied Crystallography. 47, Pt 5 1781-1783 (2014).
  37. Diamond Light Source Ltd. , Available from: https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Common/Common-Manual/Data-Analysis/Reprocessing-in-ISPyB.html (2021).
  38. Wojdyr, M., Keegan, R., Winter, G., Ashton, A. DIMPLE - a pipeline for the rapid generation of difference maps from protein crystals with putatively bound ligands. Acta Crystallographica. Section A, Foundations of Crystallography. 69, 299 (2013).
  39. Global Phasing Limited. , Available from: http://www.globalphasing.com (2021).
  40. Long, F., et al. AceDRG: A stereochemical description generator for ligands. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 3 112-122 (2017).
  41. Moriarty, N. W., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Electronic ligand builder and optimization workbench (eLBOW): A tool for ligand coordinate and restraint generation. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 65, Pt 10 1074-1080 (2009).
  42. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).
  43. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 53, Pt 3 240-255 (1997).
  44. Bricogne, G., et al. Buster version 2.10.3. Global Phasing Ltd. , Cambridge, United Kingdom. (2017).
  45. Chen, V. B., et al. MolProbity: All-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66, Pt 1 12-21 (2010).
  46. Bruno, I. J., et al. Retrieval of crystallographically-derived molecular geometry information. Journal of Chemical Information and Computer Sciences. 44 (6), 2133-2144 (2004).
  47. Delbart, F., et al. An allosteric binding site of the α7 nicotinic acetylcholine receptor revealed in a humanized acetylcholine-binding protein. TheJournal of Biological Chemistry. 293, 2534-2545 (2018).
  48. Douangamath, A., et al. Crystallographic and electrophilic fragment screening of the SARS-CoV-2 main protease. Nature Communications. 11 (1), 5047 (2020).
  49. Guo, J., et al. In crystallo-screening for discovery of human norovirus 3C-like protease inhibitors. Journal of Structural Biology: X. 4, 100031 (2020).
  50. Keedy, D. A., et al. An expanded allosteric network in PTP1B by multitemperature crystallography, fragment screening, and covalent tethering. eLife. 7, 36307 (2018).
  51. McIntyre, P. J., et al. Characterization of three druggable hot-spots in the aurora-a/tpx2 interaction using biochemical, biophysical, and fragment-based approaches. ACS Chemical Biology. 12 (11), 2906-2914 (2017).
  52. Thomas, S. E., et al. Structure-guided fragmentbased drug discovery at the synchrotron: Screening binding sites and correlations with hotspot mapping. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 377 (2147), 20180422 (2019).
  53. Nichols, C., et al. Mining the PDB for tractable cases where x-ray crystallography combined with fragment screens can be used to systematically design protein-protein inhibitors: Two test cases illustrated by IL1β-IL1R and p38α-TAB1 complexes. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (14), 7559-7568 (2020).
  54. D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned. Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, Pt 9 1117-1126 (2014).
  55. Wollenhaupt, J., et al. F2X-Universal and F2X-Entry: Structurally diverse compound libraries for crystallographic fragment screening. Structure. 28 (6), 694-706 (2020).
  56. Zenodo. , Available from: https://zenodo.org (2021).
  57. Foley, D. J., et al. Synthesis and demonstration of the biological relevance of sp(3) -rich scaffolds distantly related to natural product frameworks. Chemistry. 23 (60), Weinheim an der Bergstrasse. Germany. 15227-15232 (2017).
  58. Kidd, S. L., et al. Demonstration of the utility of DOS-derived fragment libraries for rapid hit derivatisation in a multidirectional fashion. Chemical Science. 11 (39), 10792-10801 (2020).
  59. EU-openscreen ERIC. , Available from: https://www.eu-openscreen.eu/ (2021).
  60. Schuller, M., et al. Fragment binding to the Nsp3 macrodomain of SARS-CoV-2 identified through crystallographic screening and computational docking. bioRxiv. 393405, (2020).

Tags

סינון מקטעים יעיל מתקן XChem מקור אור יהלום גילוי תרופות מבוססות פרגמנטים קריסטלוגרפיה של חלבונים מסך ראשי ניסויים ראשוניים של XChem הכנת דגימות ספריית מקטעים קרן I04-1 איסוף נתונים ניהול נתונים זיהוי פגיעות סינון שברים קריסטלוגרפיים בקנה מידה גדול משתמשים אקדמיים ותעשייתיים תוכנית משתמשים אקדמיים שעברו ביקורת עמיתים
השגת סינון מקטעים יעיל במתקן XChem ב-Diamond Light Source
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Douangamath, A., Powell, A., Fearon, … More

Douangamath, A., Powell, A., Fearon, D., Collins, P. M., Talon, R., Krojer, T., Skyner, R., Brandao-Neto, J., Dunnett, L., Dias, A., Aimon, A., Pearce, N. M., Wild, C., Gorrie-Stone, T., von Delft, F. Achieving Efficient Fragment Screening at XChem Facility at Diamond Light Source. J. Vis. Exp. (171), e62414, doi:10.3791/62414 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter