Chemistry

Эффективное просеивание фрагментов на предприятии XChem в Diamond Light Source

Published: May 29, 2021 doi: 10.3791/62414

Alice Douangamath*^1,2, Ailsa Powell*^1,2, Daren Fearon*^1,2, Patrick M. Collins^1,2, Romain Talon^1,2,3, Tobias Krojer^3,4, Rachael Skyner^1,2, Jose Brandao-Neto^1,2, Louise Dunnett^1,2, Alexandre Dias^1,2, Anthony Aimon^1,2,3, Nicholas M. Pearce^1,3, Conor Wild^3,5, Tyler Gorrie-Stone¹, Frank von Delft^1,2,3,4,6

¹Diamond Light Source Ltd, Harwell Science and Innovation Campus, ²Research Complex at Harwell, Harwell Science and Innovation Campus, ³Structural Genomics Consortium, University of Oxford, ⁴Centre for Medicines Discovery, University of Oxford, ⁵Oxford Protein Informatics Group, Department of Statistics, Oxford University, ⁶Department of Biochemistry, University of Johannesburg

* These authors contributed equally

Summary

В этом документе описывается полный процесс XChem для скрининга фрагментов на основе кристаллов, начиная с подачи заявки на доступ и заканчивая всеми последующими шагами до распространения данных.

Abstract

При обнаружении лекарств на основе фрагментов сотни, а часто и тысячи соединений с молекулярной массой менее ~300 Да тестируются на интересующем белке, чтобы идентифицировать химические соединения, которые могут быть превращены в мощные кандидаты в лекарственные препараты. Поскольку соединения малы, взаимодействия слабы, поэтому метод скрининга должен быть высокочувствительным; Более того, структурная информация, как правило, имеет решающее значение для превращения этих попаданий в свинецоподобные соединения. Таким образом, кристаллография белков всегда была золотым стандартом, но исторически слишком сложной, чтобы найти широкое применение в качестве первичного скрининга.

Первые эксперименты XChem были продемонстрированы в 2014 году, а затем опробованы с академическими и промышленными сотрудниками для проверки процесса. С тех пор большие исследовательские усилия и значительное время пучка оптимизировали подготовку образцов, разработали библиотеку фрагментов с возможностью быстрого последующего наблюдения, автоматизировали и улучшили возможности пучка I04-1 для автоматического сбора данных, а также внедрили новые инструменты для управления данными, анализа и идентификации попаданий.

В настоящее время XChem является установкой для крупномасштабного кристаллографического скрининга фрагментов, поддерживающей весь процесс осаждения кристаллов и доступной для академических и промышленных пользователей по всему миру. С 2016 года активно развивается рецензируемая академическая пользовательская программа, направленная на то, чтобы охватить проекты как можно более широкого научного охвата, включая хорошо проверенные, а также исследовательские проекты. Академический доступ распределяется через двухгодичные конкурсы для рецензируемых предложений, а собственные работы организуются группой Diamond's Industrial Liaison. Этот рабочий процесс уже был регулярно применен к более чем сотне мишеней из различных терапевтических областей и эффективно выявляет слабые связующие вещества (1%-30% попаданий), которые служат высококачественными отправными точками для разработки соединений и предоставляют обширную структурную информацию о сайтах связывания. Устойчивость этого процесса была продемонстрирована непрерывным скринингом мишеней SARS-CoV-2 во время пандемии COVID-19, включая 3-недельный цикл обработки основной протеазы.

Introduction

Fragment-Based Drug Discovery (FBDD) является широко используемой стратегией для поиска свинца, и с момента своего появления 25 лет назад она поставила четыре препарата для клинического использования, и более 40 молекул были доведены до клинических испытаний ^1,2,3. Фрагменты представляют собой небольшие химические образования, обычно с молекулярной массой 300 Да или меньше. Они были выбраны из-за их низкой химической сложности, которая является хорошей отправной точкой для разработки высокоэффективных ингибиторов с высокими лигандами и превосходными физико-химическими свойствами. Их размер означает, что они отбирают образцы связывания белков более тщательно, чем библиотеки более крупных лекарственных или свинцовых соединений, и, таким образом, также выявляют горячие точки и предполагаемые аллостерические сайты. В сочетании со структурной информацией фрагменты обеспечивают подробную карту потенциальных молекулярных взаимодействий между белком и лигандом. Тем не менее, для надежного обнаружения и валидации тех образований, которые имеют тенденцию слабо связываться с белком-мишенью, требуется целый ряд надежных и чувствительных биофизических методов скрининга, таких как поверхностный плазмонный резонанс (SPR), ядерный магнитный резонанс (ЯМР) или изотермическая титрующая калориметрия (ITC)^4,5.

Рентгеновская кристаллография является неотъемлемой частью инструментария FBDD: она достаточно чувствительна для идентификации слабых связующих веществ и непосредственно дает структурную информацию о взаимодействиях на молекулярном уровне. Он дополняет другие биофизические экраны и, как правило, необходим для прогрессирования попаданий осколков в соединения свинца; Для этого требуются высококачественные кристаллические системы, что означает, что кристаллизация обладает высокой воспроизводимостью, а кристаллы идеально дифрагируют с разрешением более 2,8 Å.

Исторически сложилось так, что было очень трудно использовать кристаллографию в качестве первичного фрагментного экрана 6,7,8, как в академических кругах^, так и в промышленности. В отличие от них, синхротроны достигли порядка улучшений в робототехнике, автоматизации 9,10,11 и детекторной технологии 12,13, а в сочетании со столь же ускоренными вычислительными мощностями и алгоритмами обработки данных^14,15,16 полные наборы дифракционных данных могут быть измерены за секунды^, а большое их количество полностью автоматически, как это было впервые сделано в LillyCAT 7 и более поздний МАССИВ^17,18 (Европейский центр синхротронного излучения (ESRF)). Это привело к тому, что синхротроны разработали оптимизированные платформы, чтобы сделать скрининг фрагментов на основе кристаллов в качестве основного экрана доступным для широкого сообщества пользователей (XChem в Diamond; CrystalDirect на EMBL/ESRF¹⁹; BESSY в Центре им. Гельмгольца в Берлине²⁰; FragMax на MaxIV²¹).

В данной работе описаны протоколы, составляющие платформу XChem для скрининга фрагментов методом рентгеновской кристаллографии, от пробоподготовки до конечных структурных результатов 3D-моделирования. Конвейер (рис. 1) потребовал разработки новых подходов к идентификации кристаллов²², замачиванию 23 и сбору²⁴, а также программного обеспечения для управления данными²⁵ и алгоритмического подхода к идентификации фрагментов²⁶, который в настоящее время широко используется в сообществе. Технология сбора кристаллов в настоящее время продается поставщиком (см. таблицу материалов), а открытая доступность инструментов позволила другим синхротронам адаптировать их для создания эквивалентных платформ²¹. Текущие проекты направлены на анализ данных, завершение моделирования и распространение данных с помощью платформы Fragalysis²⁷. Лаборатория пробоподготовки примыкает к линии пучка I04-1, что упрощает логистику передачи сотен замороженных образцов на линию пучка, а выделенное время излучения на линии I04-1 позволяет быстро получать обратную связь по рентгеновскому излучению для управления кампанией.

XChem является неотъемлемой частью пользовательской программы Diamond, с двумя звонками в год (в начале апреля и в октябре). Процесс рецензирования был усовершенствован после консультаций с экспертами в области разработки лекарств из академических кругов и промышленности. Наряду с сильным научным обоснованием, процесс подачи заявок²⁸ требует от кандидатов самостоятельной оценки не только готовности кристаллической системы, но и их опыта в биохимических и ортогональных биофизических методах, а также способности продвигать скрининговые хиты с помощью последующей химии. Способы доступа также эволюционировали, чтобы приспособиться к многопрофильному сообществу пользователей:

Уровень 1 (один проект ) предназначен для проектов, находящихся на исследовательской стадии, и инструменты проверки попаданий (биофизические или биохимические инструменты) и последующие стратегии не требуются. В случае одобрения проекту предоставляется уменьшенное количество сдвигов времени луча, достаточное для проверки концепции.

Уровень 2 (один проект) предназначен для хорошо проверенных проектов и требует наличия последующих инструментов и стратегий последующих действий. В случае одобрения проекту выделяется достаточное время для полноценного скрининга фрагментов. Отдельные проекты (Tier 1 или Tier 2) должны быть завершены в течение 6 месяцев периода распределения (с апреля по сентябрь или с октября по март).

Группа распределения блоков (BAG) предназначена для консорциумов групп и проектов, в которых в рамках BAG существует надежный процесс выбора целей и приоритизации, а также четкий конвейер последующих действий. BAG должны иметь по крайней мере одного эксперта, полностью прошедшего обучение по XChem (суперпользователя), который координирует их деятельность с персоналом Diamond и обучает членов BAG. Выделенное количество сдвигов времени луча определяется числом научно обоснованных проектов в BAG и переоценивается за период распределения на основе отчета BAG. Доступ предоставляется в течение 2 лет.

Эксперимент XChem разделен на три этапа, для каждого из которых определена точка принятия решения: тест на устойчивость к растворителю, предварительный скрининг и основной экран (рис. 2). Тест на устойчивость к растворителям помогает определить параметры замачивания, количество растворителя (ДМСО, этиленгликоля или других криопротекторов, если это необходимо), которое кристаллическая система может выдержать и как долго. Концентрация растворителя обычно колеблется от 5% до 30% в течение, по крайней мере, двух временных точек. Дифракционные данные собираются и сравниваются с базовой дифракцией кристаллической системы; Это определит параметры замачивания для следующего этапа. Для предварительного скрининга 100-150 соединений вымачиваются в условиях, определенных в тесте на растворитель, и его цель - подтвердить, что кристаллы могут переносить соединения в этих условиях. При необходимости криопротектор впоследствии добавляется к каплям, уже содержащим фрагменты. Критерии успеха заключаются в том, что 80% или более кристаллов выживают достаточно хорошо, чтобы дать дифракционные данные хорошего и стабильного качества; Если это не удается, условия замачивания обычно пересматриваются путем изменения времени замачивания или концентрации растворителя. После успешного предварительного скрининга остальные соединения, выбранные для эксперимента, могут быть настроены с использованием окончательных параметров.

Библиотека DSI (см. Таблицу материалов) была специально разработана для обеспечения быстрого последующего прогрессирования с использованием уравновешенной химии²⁹ и была рабочей лошадкой учреждения. Он доступен пользователям в концентрации 500 мМ в ДМСО. Академические пользователи также могут получить доступ к другим библиотекам, предоставленным сотрудниками (в общей сложности более 2000 соединений) в концентрациях 100-500 мМ в ДМСО (полный список можно найти на веб-сайте²⁸). Большая часть общего сбора также доступна в этиленгликоле для кристаллических систем, которые не переносят ДМСО. Пользователи также могут принести свои собственные библиотеки, при условии, что они находятся в пластинах, совместимых с акустической системой обработки жидкостей (см. Таблицу материалов).

Для всех трех этапов эксперимента (определение характеристик растворителя, предварительный скрининг или полноэкранный анализ) следующие процедуры пробоподготовки идентичны (рис. 3): выбор места дозирования соединения с помощью визуализации и нацеливания кристаллизационных капель с помощью TeXRank²²; дозирование в капли с использованием акустической системы дозирования жидкостей как для растворителя, так и для соединений²³; эффективная уборка кристаллов с помощью Crystal shifter²⁴; и загрузка информации об образце в базу данных линии пучка (ISPyB). В настоящее время интерфейсом для планирования и проведения экспериментов является приложение на основе Excel (SoakDB), которое генерирует необходимые входные файлы для различного оборудования платформы, а также отслеживает и записывает все результаты в базу данных SQLite. Сканеры штрих-кодов используются на различных этапах процесса для отслеживания образцов, и эти данные добавляются в базу данных.

Дифракционные данные собираются в автоматическом режиме с использованием выделенного времени луча на линии пучка I04-1. Доступны два режима центрирования, а именно: оптический и рентгеновский на основе¹⁷. Для игольчатых и стержневидных кристаллов рекомендуется рентгеновское центрирование, в то время как более крупные кристаллы, как правило, поддерживают оптический режим, который является более быстрым и, следовательно, позволяет собрать больше образцов за отведенное время пучка. В зависимости от разрешения кристаллов (установленного до входа на платформу) сбор данных может составлять как 60 с, так и 15 с. Сбор данных на этапе испытания растворителя обычно позволяет определить, какая комбинация будет лучше всего работать с производительностью пучка I04-1.

Управление большим объемом данных осуществляется с помощью XChemExplorer (XCE)²⁵, который также может быть использован для запуска этапа идентификации хитов с помощью PanDDA²⁶. XCE — это инструмент управления данными и рабочим процессом, который поддерживает крупномасштабный анализ белково-лигандных структур (рис. 4); он считывает любые результаты автоматической обработки данных, собранных в Diamond Light Source (DIALS¹⁶, Xia2¹⁴, AutoPROC³⁰ и STARANISO³¹), и автоматически выбирает один из результатов на основе качества данных и сходства с эталонной моделью. Важно, чтобы модель была репрезентативной для кристаллической системы, используемой для просеивания XChem, и должна включать все воды или другие молекулы растворителей, а также все кофакторы, лиганды и альтернативные конформации, видимые в кристаллах, пропитанных только растворителем. Качество этой эталонной модели напрямую влияет на объем работы, необходимой на этапе построения и уточнения модели. PanDDA используется для анализа всех данных и выявления сайтов связывания. Он выравнивает структуры по эталонной структуре, вычисляет статистические карты, идентифицирует события и вычисляет карты событий^26,32. В парадигме PanDDA нет ни необходимости, ни желания строить полную кристаллографическую модель; То, что должно быть смоделировано, - это только вид белка, в котором связан фрагмент (модель связанного состояния), поэтому основное внимание должно быть сосредоточено только на построении лиганда и окружающих его остатков/молекул растворителя в соответствии с картой событий³².

Protocol

1. Подача проектного предложения

Содержание предложения: поскольку программа XChem переполнена, тщательная и полная информация в заявке имеет решающее значение для прохождения экспертной оценки.
1. Докажите! Представьте важность цели и поместите ее в более широкий контекст.
  1. Сформулируйте стратегию после кампании по скринингу фрагментов: ортогональные методы проверки попаданий и способы их достижения. При необходимости организуйте сотрудничество.
  2. Из-за интенсивной лабораторной работы и анализа данных настоятельно рекомендуется заранее назначить опытного кристаллографа.
  3. Надежная кристаллическая система является ключом к устранению технических отклонений, и пользователи должны учитывать эти важные моменты.
    1. Убедитесь, что условия кристаллизации дают воспроизводимые капли с кристаллами аналогичного дифракционного качества в планшетах, пригодных для использования на платформе, с объемом резервуара 30 мкл (или меньше) и размером капель от 200 до 500 нл. В идеале более 50% капель в пластине должны содержать кристаллы размером не менее 35 мкм³³.
    2. Обеспечьте стабильное дифракционное качество кристаллов (2,6 Å или выше).
    3. Проверьте пригодность кристаллической системы для скрининга фрагментов, включая упаковку кристаллов и доступность известных участков. Предыдущие свидетельства о том, что молекула связана в этих местах, часто обнадеживают.

2. Подготовка к визиту

Передача протоколов кристаллизации для кристаллизации на месте.
1. Обеспечьте 2 x 50 мл раствора резервуара, готового к использованию.
2. Предоставить белковый раствор в необходимой концентрации для кристаллизации, готовый к использованию в аликвотах 30-50 мкл.
3. Обеспечьте 10 мл белкового буферного раствора.
4. Обеспечьте семенной материал (даже если он не нужен в протоколе кристаллизации).
  ПРИМЕЧАНИЕ: Затравка способствует воспроизводимости кристаллизации и ускоряет время зарождения³³.
5. Заполните информационную форму о кристаллизации, доступную на веб-сайте XChem²⁸.
6. Предоставьте информацию о хранении в форме доставки, доступной на веб-сайте XChem²⁸.
Установите NoMachine и настройте удаленный рабочий стол для Diamond (https://www.diamond.ac.uk/Users/Experiment-at-Diamond/IT-User-Guide/Not-at-DLS/Nomachine.html).
Создайте и передайте хорошую эталонную модель, проконсультировавшись с опытным кристаллографом или сотрудниками службы поддержки XChem.

3. Эксперимент по скринингу фрагментов

Определение места дозирования компаунда.
1. Визуализация кристаллизационных пластин.
  1. Изобразите все кристаллические пластины (см. Таблицу материалов), необходимые для эксперимента, в тепловизорах с кристаллическими пластинами (см. Таблицу материалов). С помощью программного обеспечения имидж-сканера сгенерируйте имена номерных знаков в каталоге, соответствующем типу пластины, в следующем формате : Предложение Number_Plate Номер.
  2. Распечатайте штрих-коды (щелкните правой кнопкой мыши по названию пластины и выберите ее в меню), поместите их на противоположную сторону таблички от букв ряда, поместите пластину (пластины) в порт загрузки штрих-кодом в сторону от пользователя.
  3. Используйте программное обеспечение для управления тепловизором, просканируйте порт загрузки, щелкните правой кнопкой мыши на пластинах и выберите Image Plates.
  4. После завершения визуализации извлеките пластины из тепловизоратора.
2. Выбор кристаллов и расположение соединений
  ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения кристаллизационных капель обрабатываются в конвейере Luigi с использованием алгоритма Ranker компании TexRank, основанного на текстонах, для ранжирования капель по вероятному присутствию кристаллов²². Это займет около 10 минут, после чего изображения будут доступны в TexRank.
  1. Откройте TeXRank с ПК и выберите лоток для кристаллов либо из списка в правом нижнем углу, либо введя штрих-код в поле в левом верхнем углу.
  2. Выберите правильный формат тепловизора и вид одной скважины. Перемещайтесь по изображениям капель и когда есть кристалл, который подходит для использования в эксперименте, щелкните правой кнопкой мыши в сторону от кристалла, но внутри капли - цель состоит в том, чтобы нацелиться, где в капле добавить растворитель/соединения, поэтому не хотите напрямую попадать в кристалл²³.
  3. Пройдите через всю пластину и после завершения нажмите кнопку Echo 1 Target ; Сохраните в каталоге Crystal Targets под соответствующим посещением. Не изменяйте имя файла.
  4. Повторите то же самое для любых дополнительных пластин.
Дозирование компаунда
1. Генерация файлов для дозирования компаунда
  1. В SoakDB введите информацию о выборе библиотеки или растворителе в таблицу библиотеки/растворителя.
  2. Введите объем капли и загрузку в списке целевых кристаллов.
  3. Сгенерируйте необходимые пакеты.
  4. Введите параметры замачивания. Нажмите « Рассчитать », а затем кнопку «Экспорт в ожидание ». Для растворителя добавьте различные концентрации в таблицу. При этом генерируются файлы для использования в акустическом диспенсере.
  5. Если вы используете криопротектор, введите концентрацию и создайте файлы таким же образом.
2. Дозирование растворов с помощью акустического дозатора (см. Таблицу материалов)
  1. Возьмите исходную пластину (компаунды или растворитель/криопротектор) и вращайте планшет в центрифуге в течение 2 минут при 1 000 x g.
  2. При дозировании растворителя или криопротектора пипетку 30 мкл в соответствующую лунку на пластине из 384 полипропилена; Накройте пленкой microseal, затем центрифугите, как указано выше.
  3. Откройте программное обеспечение; выберите New (Создать ) и выберите правильную скважинную пластину (384PP, 384LDV или 1536LDV) и класс жидкости (DMSO, CP, BP или GP). Убедитесь, что в качестве целевой пластины выбран правильный тип пластины. Затем установите флажок «Пользовательский » и продолжите.
  4. Нажмите кнопку Импорт и выберите соответствующий пакетный файл. Выполните действия по импорту в соответствии с запросом программного обеспечения.
  5. Используйте карты пластин, чтобы проверить раствор для дозирования и места назначения.
  6. Запустите протокол, следуя подсказкам по мере их появления. Раствор(ы) из исходной пластины будет распыляться на выбранные кристаллические капли.
  7. Храните пластину в инкубаторе необходимое время.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры определяются на этапе определения характеристик растворителя, температура будет составлять либо 4 °C, либо 20 °C в зависимости от температуры роста кристаллов, и время обычно составляет от 1 ч до 3 ч.
Сбор кристаллов с помощью полуавтоматического устройства для сбора кристаллов (см. Содержание материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется криозащита, повторите шаг 3.2.2 для добавления растворов криопротектора к кристаллическим каплям перед сбором образцов.
1. Подготовка к сбору урожая
  1. Подготовьте файлы, необходимые для сбора урожая в SoakDB. При появлении запроса подтвердите, что замачивание завершено, а партии завершены.
  2. Отсканируйте количество шайб, необходимое для эксперимента, под правильным номером предложения.
  3. Выберите лоток с петлями подходящего размера для кристаллов (35 мкм, 75 мкм или 150 мкм). Важно выбрать размер петли, который максимально точно соответствует размеру кристалла, чтобы обеспечить более точное автоматическое центрирование на линии пучка, улучшить качество данных за счет уменьшения фона и устранить необходимость в криопротекторе.
  4. Откройте соответствующее программное обеспечение и откройте вкладку рабочего процесса.
  5. Отсканируйте шайбы в программном обеспечении и прокрутите вверх списка, выделив первую шайбу.
  6. Поместите шайбы в пенопластовую дьюар и охладите их жидким азотом.
  7. Выберите Import File From SoakDB и выберите пакет для сбора; Проверьте, назначен ли пакет левому держателю. Появится рабочий список.
  8. Возьмите хрустальную пластину, снимите печать и вставьте левый держатель; Переместите пластину в парковочное положение.
2. Сбор кристаллов
  1. Устройтесь поудобнее и нажмите кнопку Start Workflow (экран сенсорный), чтобы перейти к первому выбранному положению скважины.
  2. Если кристалл уцелел, установите кристалл в петлю и погрузите в жидкий азот, поставив его на позицию 1 в первой шайбе в списке.
  3. Выберите подходящее описание кристалла в интерфейсе (нормальный, расплавленный, треснувший, желе или цветной).
  4. Если капля является компаундной жидкостью, запишите описание состояния соединения (прозрачное, кристаллическое, выпавшее в осадок, плохое дозирование или разделение фаз).
  5. Если кристалл был успешно смонтирован, выберите Смонтировано , в противном случае выберите Сбой.
  6. Пластина переместится в следующую выбранную скважину. Заполните все позиции шайбы последовательно (не оставляйте зазора, если кристалл не удался). Продолжайте до конца рабочего процесса.
  7. В конце рабочего процесса загрузите все дополнительные партии и продолжайте заполнять шайбы по порядку. Нет необходимости заводить новую шайбу для новой партии.
3. Штрих-кодирование результатов уборки урожая
  1. После того, как все кристаллы будут собраны, отнесите шайбы к сканеру штрих-кодов, поместите по одной в держатель, чтобы отсканировать шайбу и закрепить штрих-коды.
  2. Когда это будет сделано, наденьте крышки на шайбы и храните в хранилище жидкого азота дьюара.
  3. Загрузите выходной файл в интерфейс SoakDB.
4. Запись образца информации в ISPyB^34,35,36
  1. Загрузка образцов данных в ISPyB
    1. В SoakDB обновите линию пучка, перейдите в раздел «Обновление для ISPyB» и нажмите «Экспорт», чтобы создать файл для загрузки в ISPyB.
    2. Открытая шпаклевка. Войдите в систему и перейдите в следующий каталог: dls/labxchem/data/year/lbXXXX-1/processing/lab36/ispyb.
    3. Запустите скрипт csv2ispyb (csv2ispyb lbXXXX-1-date.csv)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь сэмплы загружены в ISPyB.
  2. Записывайте местоположение шайбы и стратегию сбора данных.
    1. Записывайте детали и расположение шайб
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно записывать детали и расположение шайб, чтобы их можно было найти и загрузить на лучевую линию.
      1. В SoakDB откройте вторую вкладку с надписью Pucks.
      2. Заполните данные в полях вверху. В частности, расположение шайб (складские дьюары и трости), параметры сбора данных, включая ожидаемое разрешение и номер предложения.
      3. Нажмите на кнопку «Сохранить » и в таблице появится список всех шайб. Скопируйте недавно забитые шайбы.
      4. Откройте электронную таблицу очереди XChem (ярлык на рабочем столе) и вставьте информацию. Заполните любую дополнительную актуальную информацию.

4. Сбор данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Данные собираются в автоматическом режиме и управляются командой XChem/beamline.

Запоминание неправильно центрированных образцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Они необходимы, когда возникли проблемы со сбором данных для определенных образцов, скорее всего, вызванные неправильным центрированием выводов.
1. Посмотрите на представление устройства смены выборок в ISPyB, выберите Ранжировать по точке доступа , чтобы оценить образцы по автоматически обработанному разрешению в цветовой градации от зеленого до красного.
2. Нажмите на образцы, чтобы проверить наличие красных или желтых образцов.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Это вызовет сбор данных.
3. Проверьте снимки кристалла, чтобы убедиться, что кристалл центрирован.
4. Запишите все те, которые не были отцентрированы, и отправьте местному контактному лицу, которое соберет недостающие образцы.

5. Анализ данных

Получение и анализ результатов автоматической обработки Diamond с помощью XChemExplorer (XCE)²⁵.
1. В терминале перейдите в подпапку Processing: cd /dls/labxchem/data/year/visit/processing или для XChem BAGs: cd /dls/labxchem/data/year/visit/processing/project/processing/.
2. Используйте псевдоним xce, чтобы открыть XChemExplorer.
3. Нажмите кнопку Обновить таблицы из источника данных .
4. На вкладке «Обзор » находится сводка экспериментальных данных. Добавьте дополнительные категории с помощью параметра « Выбрать столбцы для отображения » в меню «Источник данных ».
5. На вкладке «Настройки » выберите каталог сбора данных (/dls/i04-1/data/year/visit/).
6. Откройте вкладку Наборы данных, выберите цель в ниспадающем меню Выбрать целевой объект, выберите Get New Results from Auto processing из ниспадающего меню Наборы данных и нажмите Run.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь XCE будет анализировать визит сбора данных для результатов автоматической обработки. Это может занять некоторое время при первом запуске, в зависимости от количества наборов данных или каталогов, которые анализируются.
7. Проверьте согласованность и качество данных, проверив разрешение, группу пробелов и Rmerge. Исключаются данные с разрешением ниже 2,8 Å.
  ПРИМЕЧАНИЕ: По умолчанию выбор набора данных основан на оценке, рассчитанной на основе I/sigI, полноты и количества уникальных отражений, но для использования^можно выбрать и другие результаты обработки.
8. Чтобы выбрать другой результат обработки для отдельных наборов данных, щелкните Sample ID и выберите нужную программу/запуск. Чтобы изменить конвейер обработки для всех наборов данных, выберите Изменить настройки в меню Установки и измените Механизм выбора набора данных.
9. При необходимости повторно обработайте данные через ISPyB³⁷.
10. Если обработанные данные для образца неприемлемы, пометьте их как Не удалось исключить из дальнейшего анализа.
11. Когда закончите, нажмите Обновить таблицы из источника данных , чтобы добавить данные в последующие таблицы.
Вычисление начальных карт с помощью DIMPLE³⁸.
1. Откройте вкладку « Карты », выберите опорную модель из выпадающего меню и выберите нужные наборы данных, а затем нажмите «Запустить DIMPLE для выбранных файлов MTZ».
2. XCE одновременно выполняет несколько заданий DIMPLE в кластере в Diamond. Найдите состояние этих заданий в столбце Dimple Status и обновите их с помощью кнопки Update Tables from Datasource или с помощью команды qstat в Linux.
3. После завершения проверьте, приемлемы ли значения Dimple Rcryst, Dimple Rfree и Space Group. При необходимости (высокое Rfree/неправильная группа пробелов/большая разница в объеме элементарной ячейки) измените результаты автообработки, как описано выше, и повторите генерацию карты для этих наборов данных.
Генерация лигандных ограничителей с использованием Grade³⁹, AceDRG⁴⁰ или phenix.eLBOW⁴¹.
1. Выберите нужную программу (Настройки, Настройки редактирования, Программа генерации ограничений), а затем выберите наборы данных на вкладке Карты, после чего запустите Создать файл CIF/PDB/PNG для ВЫБРАННЫХ соединений из выпадающего списка Карты и ограничения.
2. Обновите состояние этих заданий в столбце « Составное состояние » с помощью кнопки «Обновить таблицы из источника данных ».
Построение модели наземного состояния (Pre-run)
ПРИМЕЧАНИЕ: Термин «модель основного состояния» представляет собой структуру белка в его безлигандной форме, наблюдаемую в 100 наборах данных (это число выбирается произвольно). Поскольку модель основного состояния используется в качестве эталона для построения лиганд-связанного состояния, крайне важно построить точную модель основного состояния, включая все молекулы растворителя и воды, до анализа всей кампании скрининга фрагментов. На этом шаге сотня первых наборов данных с самым высоким разрешением, помеченных PanDDA как не содержащие интересных событий (и, следовательно, вероятно, не содержащие лигандов), используются для создания карты среднего состояния земли, в то время как набор данных с наименьшим_{свободным} R выбирается для уточнения. Карта среднего состояния земли не является кристаллографической картой, однако важно использовать ее только для построения модели основного состояния.
1. Откройте вкладку PanDDAs и при необходимости обновите таблицы из datasource.
2. Определите выходной каталог (/dls/labxchem/data/year/visit/processing/analysis/panddas).
3. Выберите Pre-run для Ground State Model и нажмите Run.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Наборы данных с высоким Rfree и непредвиденными группами пробелов должны быть автоматически исключены из анализа.
4. Чтобы вручную исключить наборы данных с большим количеством Rfree и непредвиденные группы пробелов, выберите Игнорировать полностью.
5. Проверьте состояние предварительного задания с помощью qstat в окне терминала.
6. После завершения выберите « Построить модель наземного состояния » и нажмите « Выполнить».
  ПРИМЕЧАНИЕ: Это откроет Coot с картой среднего PanDDA и эталонной моделью/картами 2Fo-Fc/Fo-Fc из набора данных наилучшего качества для повторного моделирования и уточнения с помощью Coot. Крайне важно, чтобы для моделирования использовалась только средняя карта PanDDA.
Идентификация хитов с помощью PanDDA²⁶
1. Анализ PanDDA
  ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнение в кластере может занять некоторое время, если имеется много наборов данных, элементарная ячейка большая, а в асимметричной ячейке имеется несколько копий белка.
  1. Повторите описанные выше шаги для анализа результатов автоматической обработки DLS и начального вычисления карты. Для расчета карты используйте модель наземного состояния в качестве эталона: Refresh Reference File List > Set New Reference и generate Ligand Restraints по мере необходимости для новых данных (шаги 6.1-6.3).
  2. На вкладке PanDDAs убедитесь, что выходной каталог установлен, как и раньше, и запустите pandda.analyse из выпадающего меню Hit Identification .
  3. Проверьте статус задания в терминале Linux с помощью команды qstat.
2. PanDDA inspect - проверка/сборка событий привязки
  1. На вкладке PanDDAs в XCE запустите pandda.inspect из выпадающего меню Hit Identification , чтобы открыть Coot⁴² с помощью панели управления PanDDA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Панель управления pandda.inspect предоставляет сводку статистики PanDDA и позволяет пользователям перемещаться по событиям/сайтам привязки. Также создается сводный HTML-файл результатов, который можно обновить во время проверки, выбрав Обновить HTML.
  2. Чтобы смоделировать лиганд, нажмите на Merge Ligand With Model и Save Model перед переходом к другому событию, чтобы избежать потери изменений в модели связанного состояния.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Только те модели, которые были обновлены и сохранены, будут экспортированы для доработки на более позднем этапе.
  3. Используйте поле « Комментарий к событию » для аннотирования события привязки и поле «Сведения о сайте записи » для аннотирования сайтов привязки.
  4. Нагружаем карты усреднения и 2mFo-DFc (из DIMPLE) для сравнения с картой событий и моделью.
    1. После того, как все жизнеспособные лиганды будут смоделированы, объединены и сохранены на основе карты событий, закройте pandda.inspect.
3. Экспорт и доработка PanDDA
  ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие модели проверки PanDDA экспортируются обратно в каталог проекта и запускается начальный раунд доработки. В настоящее время для этого доступны два конвейера на вкладке PANDDA в XCE.
  1. При экспорте моделей NEW/ALL/SELECTED PANDDA создается ансамбль связанных и несвязанных моделей для уточнения, а также генерируются параметры ограничения занятости для Refmac⁴³.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ансамблевая модель будет использоваться для уточнения, но только связанная модель будет обновлена в Coot и депонирована в PDB. Этот конвейер лучше всего использовать для наборов данных с фрагментами с низкой заполняемостью и значительными изменениями в белковой модели.
  2. Уточнение моделей с привязкой NEW/ALL с помощью BUSTER уточняет связанное состояние только с помощью Buster⁴⁴.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это лучше всего использовать с лигандами/наборами данных с высокой заполняемостью с минимальными изменениями в белковой модели.
Уточнение хитов (все датасеты, выбранные для уточнения, теперь будут видны на вкладке Уточнение). Выберите Open COOT - BUSTER Refinement или Open COOT - REFMAC Refinement в раскрывающемся меню Refinement, чтобы открыть Coot с помощью панели управления XCE Refinement.
1. Выберите статус образцов для уточнения из выпадающего списка Select Samples (обычно 3 - в уточнении) и нажмите GO.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Панель управления XCE предоставляет сводку по количеству наборов данных для этой категории и позволяет перемещаться между наборами данных, предоставляя сводку статистики уточнения.
2. Аннотируйте достоверность лиганда в панели управления XCE: 0 - лиганд отсутствует - фрагмент не привязан; 1 - Низкая достоверность - Фрагмент, возможно, связан, но не особенно убедителен; 2 - Правильный лиганд, слабая плотность - Пользователь уверен, что фрагмент связан, но он мало занят/есть некоторые проблемы с картами; 3 - Четкая плотность, неожиданный лиганд- Карты четко указывают на связывание лиганда, которое не коррелирует с заданной химической структурой; 4 - Высокая достоверность - Лиганд однозначно связан.
3. Внесите необходимые изменения в модель на этом этапе и начните дальнейшую доработку с помощью кнопки Уточнить .
4. Используйте кнопку Show MolProbity To-Do List , чтобы получить доступ к анализу MolProbity⁴⁵ , выполняемому во всех циклах уточнения.
5. При необходимости добавьте параметры уточнения, например, для анизотропных температурных коэффициентов, сдвоенных данных или уточнения занятости, нажав кнопку Параметры уточнения .
  ПРИМЕЧАНИЕ: Статистика обработки данных также предоставляется в XCE на вкладке Refinement , и если уточнение выполняется с помощью конвейера Buster, предоставляются Buster-отчеты, включая анализ MOGUL⁴⁶.
6. Изменяйте состояние набора данных по мере его уточнения как в главном окне XCE на вкладке Уточнение , так и на панели управления Coot XCE . Убедившись, что модель точна вокруг лиганда и пригодна для совместного использования для дальнейшего анализа, измените статус на CompChem Ready. Когда уточнение будет завершено и модель будет готова к загрузке в PDB, измените статус на Готовность к осаждению.

6. Депонирование данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Все наборы данных из фрагментного экрана и модель наземного состояния, используемая для создания карт событий PanDDA, могут быть депонированы в PDB с помощью групповых отложений.

Преобразуйте все карты событий PanDDA в формат MTZ, выполнив команду Event Map ->SF из меню Hit Identification .
Укажите дополнительные метаданные, такие как авторы и методы, выбрав Депонирование > Редактировать информацию. Заполните все необходимые поля и нажмите кнопку Сохранить в базе данных , а затем сохраните эту информацию для отображения модели наземного состояния. Сделайте это после того, как состояние модели изменится на Готовность к осаждению.
На вкладке Deposition ( Осаждение ) нажмите кнопку Prepare mmcif ( Подготовить mmcif ), чтобы создать файлы mmcif структурного фактора для всех наборов данных Deposition Ready . Когда это будет завершено, в окне терминала появится следующее сообщение: Finished Preparation mmcif Files for wwPDB Deposition.
Нажмите кнопку Копировать mmcif , чтобы скопировать все эти файлы в один bzip-архив tar в каталоге группового осаждения визита.
Перейдите в https://deposit-group-1.rcsb.rutgers.edu/groupdeposit; Логин с именем пользователя: grouptester и паролем: !2016rcsbpdb. Создайте сессию и загрузите файл ligand-bound.tar.bz2 из каталога группового осаждения.
После успешной отправки структур, связанных с лигандами, отправляется электронное письмо с PDB-кодами. Выберите Update DB with PDB Codes (Обновить БД с помощью PDB-кодов) в меню Deposition (Осаждение ); скопируйте и вставьте информацию из этого электронного письма во всплывающее окно и нажмите « Обновить базу данных », чтобы добавить PDB-идентификаторы.
Для того, чтобы депонировать модель основного состояния, используемую PanDDA, выберите соответствующий каталог PanDDA в XCE и запустите apo->mmcif из меню Hit Identification (Идентификация попаданий ).
ПРИМЕЧАНИЕ: XCE произвольно выберет структуру с высоким разрешением и низким Rfree в качестве модели для пакета осаждения, а затем скомпилирует все файлы mmcif структурных факторов в один файл.
На вкладке Deposition (Осаждение) нажмите кнопку Add to Database (Добавить в базу данных) под разделом Group Deposition of Ground-State Model (Групповое осаждение модели наземного состояния).
Введите метаданные для модели наземного состояния (опять же, выбрав Осаждение > Редактировать информацию), загрузите предыдущий файл и Сохранить в базу данных.
Подготовьте файл mmcif основного состояния, выполнив команду Prepare mmcif из раздела Group Deposition of Ground-State Model, а по завершении скопируйте файл mmcif в каталог Group Deposition, нажав кнопку Copy mmcif в том же разделе.
Как и раньше, перейдите в https://deposit-group-1.rcsb.rutgers.edu/groupdeposit; Логин с именем пользователя: grouptester и паролем: !2016rcsbpdb. Создайте сессию и загрузите файл ground_state_structures.tar.bz2 из каталога группового депонирования.

Representative Results

Конвейер XChem для скрининга фрагментов методом рентгеновской кристаллографии был значительно оптимизирован, что позволило научному сообществу принять его (рис. 5). Этот процесс был проверен на более чем 150 скрининговых кампаниях с коэффициентом попадания от 1% до 30%47,48,49,50,51,52 и многими повторными пользователями. Кристаллические системы, которые не подходят (низкое разрешение, нестабильные по кристаллизации или дифракционному качеству) или не переносят ни ДМСО, ни этиленгликоль, исключаются на ранних этапах процесса, что экономит время, усилия и ресурсы. Успешные кампании предоставляют трехмерную карту потенциальных сайтов взаимодействия с целевым белком; типичным результатом является XChem-скрининг основной протеазы SARS-CoV-2 (рис. 6). Как правило, фрагментные попадания обнаруживаются в: (а) известных участках, представляющих интерес, таких как активные центры ферментов и подкарманы⁴⁸; (b) предполагаемые аллостерические сайты, например, в белок-белковых взаимодействиях⁵³; (c) интерфейсы кристаллической упаковки, обычно рассматриваемые как ложные срабатывания (рис. 6). Эти структурные данные, как правило, служат основой для слияния, связывания или наращивания фрагментов в свинцеподобные малые молекулы ^1,3.

Рисунок 1: Конвейер XChem. Платформа представлена схематически, начиная с проектного предложения и заканчивая подготовкой образцов, сбором данных и идентификацией попаданий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Стратегия скрининга. Рабочий процесс указывает цель каждой вехи, требования эксперимента и точки принятия решений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Рабочий процесс пробоподготовки. Критические этапы подготовки образцов представлены с информацией о каждом этапе, записанной в базе данных SQLite. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Анализ данных с помощью XCE. Критические этапы анализа данных представлены в виде диаграммы рабочего процесса с соответствующими программными пакетами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Эволюция пользовательской программы XChem: Диаграмма демонстрирует распространение и консолидацию пользовательской программы с 2015 по 2019 год с созданием BAG в 2019 году и устойчивостью платформы во время пандемии COVID-19 в 2020 году. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Репрезентативные результаты экрана фрагмента XChem. Димер основной протеазы SARS-CoV2 (M^pro) представлен на поверхности с попаданиями в активные центры показаны желтым цветом, предполагаемые аллостерические попадания показаны пурпурным цветом, а артефакты поверхности/упаковки кристаллов показаны зеленым цветом. Рисунок был сделан с использованием записей Chimera и M^pro PDB из G_1002156 группового осаждения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Процесс, описанный в этом документе, был тщательно протестирован сообществом пользователей, а адаптивность протоколов, описанных здесь, является ключом к решению широкого спектра проектов, обычно встречающихся на платформе. Тем не менее, для кристаллической системы необходимо выполнить несколько предварительных условий.

Для любой кампании по скринингу фрагментов, проводимой с помощью рентгеновской кристаллографии, решающее значение имеет воспроизводимая и прочная кристаллическая система. Поскольку стандартный протокол XChem предполагает добавление фрагмента непосредственно в кристаллическую каплю, оптимизация должна быть сосредоточена на количестве дропов, содержащих высококачественные кристаллы, а не на общем количестве кристаллов. Если капли содержат несколько кристаллов, то они фактически избыточны, хотя могут облегчить процесс сбора. Кроме того, перенос протокола кристаллизации из домашнего института в локальное оборудование может быть сложной задачей. Как правило, это лучше всего достигается с помощью затравки кристаллов для содействия воспроизводимому зародышеобразованию⁵⁴, и, следовательно, хорошей практикой для пользователей является предоставление исходных материалов вместе с их растворами для белков и кристаллизации.

Для обеспечения хорошей растворимости и поддержки соединений в органических растворителях, в частности в ДМСО и этиленгликоле, предусмотрены высокие концентрации замачивания, предназначенные для связывания слабых фрагментов. Использование двух различных растворителей дает пользователям альтернативу для кристаллов, которые вообще не переносят ДМСО или где он блокирует связывание фрагментов в интересующем участке. Пользователи могут поставлять альтернативные библиотеки в водном буфере: соединения будут хорошо дозироваться при условии, что они полностью растворены и отформатированы в пластинах, совместимых с роботом-дозатором жидкости.

Для проектов, где невозможно найти подходящий органический растворитель, который бы одновременно растворял библиотеку и переносился кристаллической системой, альтернативной процедурой является использование высушенных соединений, как установлено в BESSY⁵⁵.

В сообществе существует давний вопрос о возможности впитывания соединений в кристаллы, выращенные в условиях кристаллизации, содержащих высокую концентрацию солей. Практически наблюдается большее осаждение соединений и быстрое образование кристаллов соли на этапе уборки, которое уменьшается за счет применения влажной среды вокруг зоны сбора урожая. Как правило, скрининговые кампании в кристаллических системах в условиях кристаллизации с высоким содержанием соли дают сопоставимую частоту попаданий в условиях с низким содержанием соли.

Начальные этапы процесса XChem (тестирование на устойчивость к растворителям и предварительный скрининг) являются относительно небольшими и быстрыми экспериментами, но позволяют принять четкое решение о том, что можно или нет для проекта. Наиболее болезненно то, что альтернативные кристаллические системы должны быть найдены, если ни один из растворителей не переносится, или предварительный скрининг приводит к очень низкому проценту попаданий. Напротив, если они успешны, результаты напрямую информируют об условиях замачивания, которые будут использоваться для скринингового эксперимента, и о наилучшей стратегии сбора данных. Поскольку качество данных, особенно разрешение, будет влиять на качество электронной плотности для идентификации и анализа попаданий, цель состоит в том, чтобы замочить соединение в максимально возможной концентрации, которое не оказывает вредного влияния на качество дифракции (при этом большинство наборов данных (~80%) дифрагируют до разрешения 2,8 Å или выше).

Процесс анализа данных оптимизирован в XChemExplorer, который использует программное обеспечение PanDDA для обнаружения слабых связующих веществ и позволяет пользователям быстро визуализировать и просматривать результаты кампании скрининга. XChemExplorer импортирует результаты обработки данных из пакетов, доступных в Diamond (DIALS¹⁶, autoPROC 30, STARANISO³¹ и Xia2¹⁴) с ограничениями разрешения, определяемыми стандартным методом для каждого пакета (т.е.^CC1/2 = 0.3). По умолчанию выбор набора данных основан на оценке, вычисленной на основе I/sigI, полноты и ряда уникальных отражений, но конкретные результаты обработки могут быть выбраны для использования как глобально, так и для отдельных выборок²⁵. Данные также исключаются из анализа PanDDA на основе таких критериев, как разрешение,_{R free} и разница в объеме элементарной ячейки между эталонными и целевыми данными (по умолчанию 3,5 Å, 0,4 и 12% соответственно), чтобы плохо дифрагированные, неправильно центрированные или неправильно индексированные кристаллы не влияли на анализ.

Алгоритм PanDDA использует значительное количество наборов данных, собранных во время кампании фрагментов, для обнаружения лигандов частичной занятости, которые не видны на стандартных кристаллографических картах. Первоначально PanDDA использует данные, собранные во время испытаний на устойчивость к растворителям и этапов предварительного скрининга, для подготовки карты средней плотности, которая затем используется для создания модели наземного состояния. Поскольку эта модель будет использоваться на всех последующих этапах анализа, жизненно важно, чтобы она точно представляла нелигандированный белок в условиях, используемых для скрининга фрагментов. Затем PanDDA использует статистический анализ для идентификации связанных лигандов, генерируя карту событий для связанного состояния кристалла. Карта событий генерируется путем вычитания несвязанной доли кристалла из набора данных частичной занятости и представляет то, что наблюдалось бы, если бы лиганд был связан при полной занятости. Даже те фрагменты, которые кажутся четкими в обычных картах_{2mF o-DF} _c , могут быть неправильно смоделированы, если не обращаться к картам событий³². Несмотря на то, что PanDDA является мощным методом идентификации наборов данных, отличающихся от средних карт (что обычно указывает на привязку фрагментов), а такие метрики, как ГП КС, РСЗД, отношение B-фактора и RMSD во время уточнения, предоставляются в интересах пользователей, пользователь в конечном итоге несет ответственность за принятие решения о том, точно ли наблюдаемая плотность отображает ожидаемый лиганд и наиболее подходящую конформацию.

После анализа и уточнения данных все пользователи могут одновременно депонировать несколько структур в Protein Data Bank (PDB) с помощью XChemExplorer. Для каждого фрагмента-экрана делаются два групповых осаждения. Первое осаждение содержит все модели, связанные с фрагментами, с коэффициентами для вычисления карт событий PanDDA, включенными в файлы MMCIF. Второе осаждение обеспечивает сопутствующую модель наземного состояния, наряду с измеренными структурными факторами всех наборов данных эксперимента: эти данные могут быть использованы для воспроизведения анализа PanDDA и для разработки будущих алгоритмов. Что касается структур попаданий, то при низкой занятости фрагментов уточнение ведет себя лучше, если модели представляют собой композицию связанных с лигандами и искажающих структур основного состояния³²; Тем не менее, практика заключается в том, чтобы депонировать только связанные дроби, поскольку полные составные модели в целом сложны и трудны для интерпретации. В результате некоторые показатели качества, пересчитанные PDB (в частности, R/Rfree), иногда немного завышены. Также можно предоставлять все необработанные данные с помощью таких платформ, как Zenodo⁵⁶, хотя в настоящее время это не поддерживается конвейером XChem.

В целом, с момента его введения в эксплуатацию в 2016 году фрагментные лиганды могут быть идентифицированы более чем в 95% мишеней с помощью этой процедуры. Опыт, накопленный во многих проектах, поддержанных XChem, был использован в передовой практике подготовки кристаллов³³, в то время как была разработана библиотека фрагментов, которая реализовала уравновешенную концепцию для помощи в продвижении фрагментов²⁹, а также помогла установить практику обнародования библиотечной композиции. Платформа продемонстрировала важность хорошо поддерживаемой инфраструктуры и документированных процессов, подробно описанных здесь, и позволила оценить другие библиотеки фрагментов^57,58, сравнить библиотеки⁴⁸ и проинформировать о разработке совместной библиотеки EUOpenscreen-DRIVE ^59,60.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Acknowledgments

Эта работа представляет собой большую совместную работу Diamond Light Source и Структурно-геномного консорциума. Авторы хотели бы выразить признательность различным группам поддержки Diamond и MX group за их вклад в автоматизацию пучковой линии i04-1 и за обеспечение оптимизированных конвейеров сбора и автоматической обработки данных, которые обычно работают на всех пучковых линиях MX. Они также хотели бы поблагодарить группу SGC PX за их устойчивость, став первыми пользователями, которые протестировали установку, и Evotec за то, что она стала первым серьезным промышленным пользователем. Работа выполнена при поддержке iNEXT-Discovery (грант 871037), финансируемого программой Европейской комиссии Horizon 2020.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DSI-poised library	Enamine	DSI-896	fragment library
Echo 550 and 650 series	Beckman-Coulter		acoustic dispensing system
Echo microplates	Beckman-Coulter	001-12380; 001-8768; 001-6025	1536-well and 384-well microplates
Shifter	Oxford Lab Technology		harvesting device
Microplate centrifuge with a swing-out rotor	Sigma	model 11121	microplate centrifuge
3-drops crystallisation plates	Swissci	3W96T-UVP	Crystallisation plates
Formulatrix plate imager and Rockmaker software	Formulatrix		Crystallisation plates imaging device

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Erlanson, D. A., Fesik, S. W., Hubbard, R. E., Jahnke, W., Jhoti, H. Twenty years on: The impact of fragments on drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 605-619 (2016).
Jacquemard, C., Kellenberger, E. A bright future for fragment-based drug discovery: what does it hold. Expert Opinion on Drug Discovery. 14 (5), 413-416 (2019).
Jahnke, W., et al. Fragment-to-lead medicinal chemistry publications in 2019. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (24), 15494-15507 (2019).
Li, Q. Application of fragment-based drug discovery to versatile targets. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 180 (2020).
Kirsch, P., Hartman, A. M., Hirsch, A. K. H., Empting, M. Concepts and core principles of fragment-based drug design. Molecules. 24 (23), Basel, Switzerland. 4309 (2019).
Patel, D., Bauman, J. D., Arnold, E. Advantages of crystallographic fragment screening: functional and mechanistic insights from a powerful platform for efficient drug discovery. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 116 (2-3), 92-100 (2014).
Wasserman, S., et al. Automated synchrotron crystallography for drug discovery: the LRL-CAT beamline at the APS. Acta Crystallographica Section A Foundations of Crystallography. 67 (1), 46-47 (2011).
Hartshorn, M. J. Fragment-based lead discovery using X-ray crystallography. Journal of Medicinal Chemistry. 48 (2), 403-413 (2005).
Arzt, S., et al. Automation of macromolecular crystallography beamlines. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 89 (2), 124-152 (2005).
Beteva, A. High-throughput sample handling and data collection at synchrotrons: Embedding the ESRF into the high-throughput gene-to-structure pipeline. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 62, Pt 10 1162-1169 (2006).
Papp, G., et al. FlexED8: The first member of a fast and flexible sample-changer family for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 10 841-851 (2017).
Casanas, A., et al. EIGER detector: Application in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D, Structural Biology. 72, Pt 9 1036-1048 (2016).
Henrich, B., et al. PILATUS: A single photon counting pixel detector for X-ray applications. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 607 (1), 247-249 (2009).
Winter, G., Lobley, C. M. C., Prince, S. M. Decision making in xia2. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 69, Pt 7 1260-1273 (2013).
Winter, G., McAuley, K. E. Automated data collection for macromolecular crystallography. Methods. 55 (1), 81-93 (2011).
Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D, Structural Biology. 74, Pt 2 85-97 (2018).
Bowler, M. W. MASSIF-1: A beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
Von Stetten, D., et al. ID30A-3 (MASSIF-3) - A beamline for macromolecular crystallography at the ESRF with a small intense beam. Journal of Synchrotron Radiation. 27, Pt 3 844-851 (2020).
Cipriani, F., et al. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 68, Pt 10 1393-1399 (2012).
Helmholtz Zentrum Berlin. , Available from: https://www.helmholtzberlin.de/forschung/oe/np/gmx/fragment-screening/index_en.html (2021).
Lima, G. M. A., et al. FragMAX: the fragment-screening platform at the MAX IV Laboratory. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 76 (8), 771-777 (2020).
Ng, J. T., Dekker, C., Kroemer, M., Osborne, M., Von Delft, F. Using textons to rank crystallization droplets by the likely presence of crystals. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 70, Pt 10 2702-2718 (2014).
Collins, P. M., et al. Gentle, fast and effective crystal soaking by acoustic dispensing. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 3 246-255 (2017).
Wright, N. D., et al. The low-cost Shifter microscope stage transforms the speed and robustness of protein crystal harvesting. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 77, Pt 1 62-74 (2021).
Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein-ligand structure determination. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 3 267-278 (2017).
Pearce, N. M., et al. A multi-crystal method for extracting obscured crystallographic states from conventionally uninterpretable electron density. Nature Communications. 8, 15123 (2017).
Fragalysis. , Available from: https://fragalysis.diamond.ac.uk (2021).
Diamond Light Source Ltd. , Available from: https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Fragment-Screening.html (2021).
Cox, O. B., et al. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7 (3), 2322-2330 (2016).
Vonrhein, C., et al. Data processing and analysis with the autoPROC toolbox. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 67, Pt 4 293-302 (2011).
Vonrhein, C., et al. Advances in automated data analysis and processing within autoPROC , combined with improved characterisation, mitigation and visualisation of the anisotropy of diffraction limits using STARANISO. Acta Crystallographica Section A: Foundations and Advances. 74 (1), 360 (2018).
Pearce, N. M., Krojer, T., Von Delft, F. Proper modelling of ligand binding requires an ensemble of bound and unbound states. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 3 265-266 (2017).
Collins, P. M., et al. Achieving a good crystal system for crystallographic x-ray fragment screening. Methods in Enzymology. 610, 251-264 (2018).
Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
Fisher, S. J., Levik, K. E., Williams, M. A., Ashton, A. W., McAuley, K. E. SynchWeb: a modern interface for ISPyB. Journal of Applied Crystallography. 48, Pt 3 927-932 (2015).
Ginn, H. M., et al. SynchLink: an iOS app for ISPyB. Journal of Applied Crystallography. 47, Pt 5 1781-1783 (2014).
Diamond Light Source Ltd. , Available from: https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Common/Common-Manual/Data-Analysis/Reprocessing-in-ISPyB.html (2021).
Wojdyr, M., Keegan, R., Winter, G., Ashton, A. DIMPLE - a pipeline for the rapid generation of difference maps from protein crystals with putatively bound ligands. Acta Crystallographica. Section A, Foundations of Crystallography. 69, 299 (2013).
Global Phasing Limited. , Available from: http://www.globalphasing.com (2021).
Long, F., et al. AceDRG: A stereochemical description generator for ligands. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 3 112-122 (2017).
Moriarty, N. W., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Electronic ligand builder and optimization workbench (eLBOW): A tool for ligand coordinate and restraint generation. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 65, Pt 10 1074-1080 (2009).
Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).
Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 53, Pt 3 240-255 (1997).
Bricogne, G., et al. Buster version 2.10.3. Global Phasing Ltd. , Cambridge, United Kingdom. (2017).
Chen, V. B., et al. MolProbity: All-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66, Pt 1 12-21 (2010).
Bruno, I. J., et al. Retrieval of crystallographically-derived molecular geometry information. Journal of Chemical Information and Computer Sciences. 44 (6), 2133-2144 (2004).
Delbart, F., et al. An allosteric binding site of the α7 nicotinic acetylcholine receptor revealed in a humanized acetylcholine-binding protein. TheJournal of Biological Chemistry. 293, 2534-2545 (2018).
Douangamath, A., et al. Crystallographic and electrophilic fragment screening of the SARS-CoV-2 main protease. Nature Communications. 11 (1), 5047 (2020).
Guo, J., et al. In crystallo-screening for discovery of human norovirus 3C-like protease inhibitors. Journal of Structural Biology: X. 4, 100031 (2020).
Keedy, D. A., et al. An expanded allosteric network in PTP1B by multitemperature crystallography, fragment screening, and covalent tethering. eLife. 7, 36307 (2018).
McIntyre, P. J., et al. Characterization of three druggable hot-spots in the aurora-a/tpx2 interaction using biochemical, biophysical, and fragment-based approaches. ACS Chemical Biology. 12 (11), 2906-2914 (2017).
Thomas, S. E., et al. Structure-guided fragmentbased drug discovery at the synchrotron: Screening binding sites and correlations with hotspot mapping. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 377 (2147), 20180422 (2019).
Nichols, C., et al. Mining the PDB for tractable cases where x-ray crystallography combined with fragment screens can be used to systematically design protein-protein inhibitors: Two test cases illustrated by IL1β-IL1R and p38α-TAB1 complexes. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (14), 7559-7568 (2020).
D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned. Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, Pt 9 1117-1126 (2014).
Wollenhaupt, J., et al. F2X-Universal and F2X-Entry: Structurally diverse compound libraries for crystallographic fragment screening. Structure. 28 (6), 694-706 (2020).
Zenodo. , Available from: https://zenodo.org (2021).
Foley, D. J., et al. Synthesis and demonstration of the biological relevance of sp(3) -rich scaffolds distantly related to natural product frameworks. Chemistry. 23 (60), Weinheim an der Bergstrasse. Germany. 15227-15232 (2017).
Kidd, S. L., et al. Demonstration of the utility of DOS-derived fragment libraries for rapid hit derivatisation in a multidirectional fashion. Chemical Science. 11 (39), 10792-10801 (2020).
EU-openscreen ERIC. , Available from: https://www.eu-openscreen.eu/ (2021).
Schuller, M., et al. Fragment binding to the Nsp3 macrodomain of SARS-CoV-2 identified through crystallographic screening and computational docking. bioRxiv. 393405, (2020).

Chemistry

Эффективное просеивание фрагментов на предприятии XChem в Diamond Light Source

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.