Chemistry

Oppnå effektiv fragmentscreening på XChem-anlegget ved Diamond Light Source

Published: May 29, 2021 doi: 10.3791/62414

Alice Douangamath*^1,2, Ailsa Powell*^1,2, Daren Fearon*^1,2, Patrick M. Collins^1,2, Romain Talon^1,2,3, Tobias Krojer^3,4, Rachael Skyner^1,2, Jose Brandao-Neto^1,2, Louise Dunnett^1,2, Alexandre Dias^1,2, Anthony Aimon^1,2,3, Nicholas M. Pearce^1,3, Conor Wild^3,5, Tyler Gorrie-Stone¹, Frank von Delft^1,2,3,4,6

¹Diamond Light Source Ltd, Harwell Science and Innovation Campus, ²Research Complex at Harwell, Harwell Science and Innovation Campus, ³Structural Genomics Consortium, University of Oxford, ⁴Centre for Medicines Discovery, University of Oxford, ⁵Oxford Protein Informatics Group, Department of Statistics, Oxford University, ⁶Department of Biochemistry, University of Johannesburg

* These authors contributed equally

Summary

Denne artikkelen beskriver hele XChem-prosessen for krystallbasert fragmentscreening, fra søknad om tilgang og alle påfølgende trinn til dataformidling.

Abstract

I fragmentbasert legemiddeloppdagelse testes hundrevis eller ofte tusenvis av forbindelser mindre enn ~ 300 Da mot proteinet av interesse for å identifisere kjemiske enheter som kan utvikles til potente legemiddelkandidater. Siden forbindelsene er små, er interaksjonene svake, og screeningmetoden må derfor være svært følsom; Videre har strukturell informasjon en tendens til å være avgjørende for å utarbeide disse treffene i blylignende forbindelser. Derfor har proteinkrystallografi alltid vært en gullstandardteknikk, men historisk for utfordrende til å finne utbredt bruk som en primærskjerm.

Innledende XChem-eksperimenter ble demonstrert i 2014 og deretter testet med akademiske og industrielle samarbeidspartnere for å validere prosessen. Siden da har en stor forskningsinnsats og betydelig stråletid strømlinjeformet prøvepreparering, utviklet et fragmentbibliotek med raske oppfølgingsmuligheter, automatisert og forbedret evnen til I04-1 strålelinje for uovervåket datainnsamling, og implementert nye verktøy for datahåndtering, analyse og treffidentifikasjon.

XChem er nå et anlegg for storskala krystallografisk fragmentscreening, som støtter hele krystall-til-deponeringsprosessen, og tilgjengelig for akademiske og industrielle brukere over hele verden. Det fagfellevurderte akademiske brukerprogrammet har blitt aktivt utviklet siden 2016, for å imøtekomme prosjekter fra så bredt vitenskapelig omfang som mulig, inkludert godt validerte så vel som utforskende prosjekter. Akademisk tilgang tildeles gjennom halvårlige samtaler for fagfellevurderte forslag, og proprietært arbeid arrangeres av Diamonds industrielle forbindelsesgruppe. Denne arbeidsflyten har allerede blitt rutinemessig brukt på over hundre mål fra ulike terapeutiske områder, og identifiserer effektivt svake bindemidler (1% -30% treffrate), som både tjener som høykvalitets utgangspunkt for sammensatt design og gir omfattende strukturell informasjon om bindingssteder. Prosessens motstandskraft ble demonstrert ved fortsatt screening av SARS-CoV-2-mål under COVID-19-pandemien, inkludert en 3-ukers snuoperasjon for hovedproteasen.

Introduction

Fragment-Based Drug Discovery (FBDD) er en mye brukt strategi for blyoppdagelse, og siden fremveksten for 25 år siden har den levert fire medisiner til klinisk bruk og mer enn 40 molekyler har blitt avansert til kliniske studier ^1,2,3. Fragmenter er små kjemiske enheter, vanligvis med en molekylvekt på 300 Da eller mindre. De er valgt for sin lave kjemiske kompleksitet, som gir gode utgangspunkt for utvikling av høyligandeffektive hemmere med gode fysisk-kjemiske egenskaper. Størrelsen betyr at de tar prøver av bindingslandskapet til proteiner grundigere enn biblioteker av større medikament- eller blylignende forbindelser, og dermed også avdekker hot spots og antatte allosteriske steder. Kombinert med strukturell informasjon gir fragmenter et detaljert kart over potensielle molekylære interaksjoner mellom protein og ligand. Likevel krever pålitelig påvisning og validering av de enhetene som har en tendens til å binde seg svakt til målproteinet, en rekke robuste og sensitive biofysiske screeningsmetoder som overflateplasmonresonans (SPR), kjernemagnetisk resonans (NMR) eller isotermisk titreringskalorimetri (ITC) ^4,5.

Røntgenkrystallografi er en viktig del av FBDD-verktøykassen: den er følsom nok til å identifisere svake bindemidler og gir direkte strukturell informasjon om interaksjonene på molekylært nivå. Det er komplementært til andre biofysikkskjermer og vanligvis viktig for å utvikle fragmenttreff til blyforbindelser; det krever krystallsystemer av høy kvalitet, noe som betyr at krystallisering er svært reproduserbar, og krystaller ideelt diffrakterer til bedre enn 2, 8 Å oppløsning.

Historisk har det vært svært vanskelig å bruke krystallografi som primær fragmentskjerm ^6,7,8^, verken i akademia eller i industrien. I motsetning til dette oppnådde synkrotroner størrelsesordensforbedringer i robotikk, automatisering 9,10,11 og detektorteknologi 12,13, og kombinert med like akselerert datakraft og algoritmer for databehandling^14,15,16^, kan komplette diffraksjonsdatasett måles i sekunder og et stort antall av dem helt uten tilsyn, som banebrytende på LillyCAT⁷ og senere MASSIF^17,18 (European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)). Dette førte til at synkrotroner utviklet svært strømlinjeformede plattformer for å gjøre krystallbasert fragmentscreening som primærskjerm tilgjengelig for et bredt brukerfellesskap (XChem at Diamond; CrystalDirect ved EMBL/ESRF¹⁹; BESSY på Helmholtz-Zentrum Berlin²⁰; FragMax ved MaxIV²¹).

Denne artikkelen dokumenterer protokollene som utgjør XChem-plattformen for fragmentscreening ved røntgenkrystallografi, fra prøvepreparering til de endelige strukturelle resultatene av 3D-modellerte treff. Rørledningen (figur 1) krevde utvikling av nye tilnærminger til krystallidentifikasjon 22, bløtlegging 23 og høsting 24, samt datahåndteringsprogramvare²⁵ og en algoritmisk tilnærming til å identifisere fragmenter ²⁶ som nå er mye brukt i samfunnet. Krystallhøstingsteknologien selges nå av en leverandør (se materialfortegnelse), og den åpne tilgjengeligheten av verktøyene har gjort det mulig for andre synkrotroner å tilpasse dem til å sette opp tilsvarende plattformer²¹. Pågående prosjekter omhandler dataanalyse, modellferdigstillelse og dataformidling gjennom Fragalyse-plattformen²⁷. Prøveprepareringslaboratoriet ligger ved siden av strålelinje I04-1, noe som forenkler logistikken med å overføre hundrevis av frosne prøver til strålelinjen og dedikert stråletid på I04-1 tillater rask røntgentilbakemelding for å veilede kampanjen.

XChem er en integrert del av Diamonds brukerprogram, med to samtaler per år (begynnelsen av april og oktober). Fagfellevurderingsprosessen har blitt raffinert i samråd med eksperter på narkotikaforskning fra akademia og industri. Sammen med en sterk vitenskapelig sak krever forslagsprosessen²⁸ at søkere selv vurderer ikke bare krystallsystemets beredskap, men også deres kompetanse innen biokjemiske og ortogonale biofysiske metoder og kapasitet til å utvikle screeningtreff gjennom oppfølgingskjemi. Tilgangsmodusene har også utviklet seg for å imøtekomme det tverrfaglige brukerfellesskapet:

Tier 1 (single project ) er for prosjekter på utforskende stadium og treffer valideringsverktøy (biofysikk eller biokjemiske verktøy) og oppfølgingsstrategier trenger ikke være på plass. Hvis det blir akseptert, får prosjektet redusert antall stråleskift, nok til konseptutprøving.

Nivå 2 (enkeltprosjekt) er for godt validerte prosjekter og krever at nedstrømsverktøy og oppfølgingsstrategier er på plass. Hvis det aksepteres, tildeles prosjektet nok stråletid til en full fragmentscreeningkampanje. Enkeltprosjekter (Tier 1 eller Tier 2) skal fullføres innen 6 måneder av tildelingsperioden (enten april til september eller oktober til mars).

Block Allocation Group (BAG) er for et konsortium av grupper og prosjekter, der en robust målutvelgelses- og prioriteringsprosess er på plass i BAG, sammen med en tydelig oppfølgingspipeline. BAGs må ha minst en fullt XChem utdannet ekspert (superbruker), som koordinerer sine aktiviteter med Diamond ansatte og trener BAG medlemmer. Tildelt antall stråletidsforskyvninger er definert av antall vitenskapelig sterke prosjekter i BAG og revurderes per tildelingsperiode basert på BAGs rapport. Tilgangen er tilgjengelig i 2 år.

XChem-eksperimentet er delt inn i tre faser, med et beslutningspunkt for hvert av dem: løsemiddeltoleransetest, pre-screen og hovedskjerm (figur 2). Løsningsmiddeltoleransetesten bidrar til å definere bløtleggingsparametrene, mengden løsningsmiddel (DMSO, etylenglykol eller andre kryobeskyttelsesmidler om nødvendig) krystallsystemet kan tolerere og hvor lenge. Løsningsmiddelkonsentrasjoner varierer vanligvis fra 5% -30% over minst to tidspunkter. Diffraksjonsdata samles inn og sammenlignes med krystallsystemets basediffraksjon; Dette vil bestemme soaking parametere for neste trinn. For pre-screen blir 100-150 forbindelser gjennomvåt ved hjelp av betingelsene bestemt i løsningsmiddeltesten, og dens formål er å bekrefte at krystallene kan tolerere forbindelsene under disse forholdene. Om nødvendig blir kryobeskyttelsesmidlet deretter tilsatt til dråpene som allerede inneholder fragmentene. Suksesskriteriene er at 80% eller mer av krystallene overlever godt nok til å gi diffraksjonsdata av god og konsistent kvalitet; Hvis dette mislykkes, blir bløtleggingsforholdene vanligvis revidert ved å endre bløtleggingstiden eller løsningsmiddelkonsentrasjonen. Etter en vellykket pre-screen, kan resten av forbindelsene valgt for eksperimentet settes opp ved hjelp av de endelige parametrene.

Det DSI-klare biblioteket (se materialfortegnelse) ble med hensikt designet for å muliggjøre rask oppfølgingsprogresjon ved hjelp av klar kjemi²⁹ og har vært anleggets arbeidshestbibliotek. Den er tilgjengelig for brukere i en konsentrasjon på 500 mM i DMSO. Akademiske brukere kan også få tilgang til andre biblioteker levert av samarbeidspartnere (over 2000 forbindelser totalt) i konsentrasjoner på 100-500 mM i DMSO (en fullstendig liste finner du på nettstedet²⁸). Mye av den samlede samlingen er også tilgjengelig i etylenglykol, for krystallsystemer som ikke tåler DMSO. Brukere kan også ta med sine egne biblioteker, forutsatt at de er i plater som er kompatible med det akustiske væskehåndteringssystemet (se materialfortegnelse).

For alle tre trinnene i eksperimentet (løsningsmiddelkarakterisering, forhåndsskjerm eller fullskjerm) er følgende prøveprepareringsprosedyrer identiske (figur 3): valg av forbindelsesdispenseringssted gjennom avbildning og målretting av krystallisasjonsdråper med TeXRank²²; dispensering i dråper ved bruk av det akustiske væskedispenseringssystemet for både løsningsmiddel og forbindelser²³; effektiv høsting av krystallene ved hjelp av Crystal shifter²⁴; og opplasting av eksempelinformasjon til strålelinjedatabasen (ISPyB). Det nåværende grensesnittet for eksperimentdesign og utførelse er et Excel-basert program (SoakDB), som genererer de nødvendige inngangsfilene for plattformens forskjellige utstyr, og sporer og registrerer alle resultater i en SQLite-database. Strekkodeskannere brukes på ulike stadier gjennom hele prosessen for å spore eksempler, og disse dataene legges til i databasen.

Diffraksjonsdata samles inn i uovervåket modus ved bruk av dedikert stråletid på strålelinje I04-1. To sentreringsmoduser er tilgjengelige, nemlig optisk og røntgenbasert¹⁷. For nål- og stavformede krystaller anbefales røntgensentrering, mens chunkierkrystaller generelt støtter optisk modus, noe som er raskere og derfor gjør det mulig å samle inn flere prøver i den tildelte stråletiden. Avhengig av oppløsningen til krystallene (etablert før du går inn i plattformen) kan datainnsamlingen enten være 60 s eller 15 s total eksponering. Datainnsamling under løsemiddeltestfasen informerer vanligvis hvilken kombinasjon som vil fungere best med ytelsen til strålelinje I04-1.

Det store volumet av dataanalyse styres gjennom XChemExplorer (XCE) ²⁵, som også kan brukes til å starte treffidentifikasjonstrinnet ved hjelp av PanDDA²⁶. XCE er et datahåndterings- og arbeidsflytverktøy som støtter storskala analyse av proteinligandstrukturer (figur 4); den leser noen av de automatiske behandlingsresultatene fra data samlet inn ved Diamond Light Source (DIALS¹⁶, Xia2¹⁴, AutoPROC³⁰ og STARANISO³¹) og velger automatisk ett av resultatene basert på datakvalitet og likhet med en referansemodell. Det er viktig at modellen er representativ for krystallsystemet som brukes til XChem-screening, og må inkludere alt vann eller andre løsningsmiddelmolekyler, samt alle kofaktorer, ligander og alternative konformasjoner som bare er synlige i krystaller dynket med løsningsmiddel. Kvaliteten på denne referansemodellen vil direkte påvirke mengden arbeid som kreves under modellbyggings- og foredlingsfasen. PanDDA brukes til å analysere alle dataene og identifisere bindingssteder. Den justerer strukturer til en referansestruktur, beregner de statistiske kartene, identifiserer hendelser og beregner hendelseskart^26,32. I PanDDA-paradigmet er det verken nødvendig eller ønskelig å bygge den fulle krystallografiske modellen; Det som må modelleres er bare synet av proteinet der et fragment er bundet (bound-state-modellen), så fokuset trenger bare være på å bygge liganden og omkringliggende rester/løsningsmiddelmolekyler i henhold til hendelseskartet³².

Protocol

1. Innlevering av prosjektforslag

Forslag innhold: siden XChem programmet er overtegnet, grundig og fullstendig informasjon i forslaget er avgjørende for bestått peer-review.
1. Gjør saken! Presenter viktigheten av målet og sett det inn i en større sammenheng.
  1. Formuler strategien etter fragmentscreeningkampanjen: de ortogonale metodene som er på plass for å validere treffene og hvordan de skal utvikles. Still inn samarbeidene om nødvendig.
  2. På grunn av den intense laboratorie- og dataanalysedelen, anbefales det sterkt å tildele en erfaren krystallograf på forhånd.
  3. Et robust krystallsystem er nøkkelen til å eliminere teknisk variasjon, og brukere bør ta opp disse viktige punktene.
    1. Sørg for at krystallisasjonsbetingelsene gir reproduserbare dråper med tilsvarende krystaller av diffraksjonskvalitet i plater egnet for bruk på plattformen med et reservoarvolum på 30 μL (eller mindre) og en dråpestørrelse mellom 200-500 nL. Ideelt sett vil mer enn 50% av dråpene i en plate ha krystaller på minst 35 μm størrelse³³.
    2. Sikre konsistent diffraksjonskvalitet av krystaller (2,6 Å eller bedre).
    3. Kontroller krystallsystemets egnethet for fragmentscreening, inkludert krystallpakking og tilgjengelighet på kjente steder. Tidligere bevis på et molekyl bundet i disse områdene er ofte beroligende.

2. Forberedelse til besøket

Overføring av krystallisasjonsprotokoller for krystallisering på stedet.
1. Sørg for 2 x 50 ml reservoarløsning som er klar til bruk.
2. Tilfør proteinoppløsningen ved den nødvendige konsentrasjonen for krystallisering, klar til bruk i alikoter på 30-50 μL.
3. Gi 10 ml av proteinbufferløsningen.
4. Gi frølager (selv om det ikke er nødvendig i krystallisasjonsprotokollen).
  MERK: Såing favoriserer reproduserbarhet av krystallisering og fremskynder nukleasjonstiden³³.
5. Fyll ut krystallisasjonsinformasjonsskjemaet som er tilgjengelig på XChem-nettstedet²⁸.
6. Oppgi lagringsinformasjonen i forsendelsesskjemaet som er tilgjengelig på XChem-nettstedet²⁸.
Installer NoMachine og sett opp et eksternt skrivebord til Diamond (https://www.diamond.ac.uk/Users/Experiment-at-Diamond/IT-User-Guide/Not-at-DLS/Nomachine.html).
Generere og overføre en god referansemodell, i samråd med en ekspert krystallograf eller XChem støttepersonell.

3. Fragment screening eksperiment

Definere plasseringen av den sammensatte dispenseren.
1. Avbildning av krystallisasjonsplater.
  1. Avbilde alle krystallplatene (se Materialfortegnelse) som kreves for eksperimentet i krystallplateavbildningene (se Materialfortegnelse). Bruk bildeprogramvaren til å generere platenavn i riktig katalog for platetypen i følgende format: Forslag Number_Plate nummer.
  2. Skriv ut strekkodene (høyreklikk på platenavnet og velg fra menyen), plasser dem på motsatt side av platen fra radbokstavene, sett platen (e) i lastporten med strekkoden vendt bort fra brukeren.
  3. Bruk programvaren for bildekontroll, skann lastporten, høyreklikk på plater, og velg deretter Bildeplater.
  4. Når avbildningen er fullført, fjern platene fra bildeapparatet.
2. Velge krystaller og sammensatt plassering
  MERK: Bildene av krystallisasjonsdråpene behandles i Luigi-rørledningen ved hjelp av TexRanks tekstbaserte algoritme Ranker for å rangere dråpene etter den sannsynlige tilstedeværelsen av krystaller²². Dette tar ca 10 min og bildene vil da være tilgjengelig i TexRank.
  1. Åpne TeXRank fra en PC og velg krystallbrettet enten fra listen nederst til høyre eller ved å skrive strekkoden i boksen øverst til venstre.
  2. Velg riktig bildeformat og enkel brønnvisning. Flytt gjennom dråpen bilder og når det er en krystall som er egnet til bruk i et eksperiment, høyreklikk vekk fra krystallen, men inne i dråpen-målet er å målrette hvor i dråpen for å legge løsemiddel / forbindelser, så ønsker ikke å direkte treffe krystall²³.
  3. Fortsett gjennom hele platen og når du er ferdig, velg Echo 1 Target knapp; Lagre i Crystal Targets-katalogen under det aktuelle besøket. Ikke endre filnavnet.
  4. Gjenta for eventuelle ekstra plater.
Sammensatt dispensering
1. Generere filer for sammensatt dispensering
  1. I SoakDB skriver du inn bibliotekvalg eller løsningsmiddelinformasjon i biblioteket / løsningsmiddeltabellen.
  2. Skriv inn slippvolumet og last inn i listen over målrettede krystaller.
  3. Generer de nødvendige partiene.
  4. Angi sugeparametrene. Klikk på Beregn og deretter på Eksporter venter-knappen . For løsemiddel, tilsett de forskjellige konsentrasjonene i tabellen. Dette genererer filene for bruk i den akustiske dispenseren.
  5. Hvis du bruker kryobeskyttelsesmiddel, skriv inn konsentrasjonen og opprett filene på samme måte.
2. Påføringsløsninger ved bruk av den akustiske dispenseren (se materialfortegnelse)
  1. Ta kildeplaten (forbindelser eller løsemiddel / cryoprotectant) og spinn platen i sentrifugen i 2 minutter ved 1000 x g.
  2. Ved dispensering av løsemiddel eller kryobeskyttelsesmiddel, pipett 30 μL inn i den relevante brønnen på en 384PP-plate; Dekk til med en mikroseal film og sentrifuge som ovenfor.
  3. Åpne programvaren; velg Ny og velg riktig kildebrønnplate (384PP, 384LDV eller 1536LDV) og væskeklasse (DMSO, CP, BP eller GP). Forsikre deg om at riktig platetype er valgt som destinasjonsplate. Merk deretter av for Egendefinert boksen og fortsett.
  4. Velg Importer og velg den aktuelle batchfilen. Fullfør importtrinnene slik programvaren ber deg om det.
  5. Bruk platekartene til å kontrollere løsningen som skal dispenseres og destinasjonsstedene.
  6. Kjør protokollen, følg instruksjonene når de kommer opp. Løsningen(e) fra kildeplaten vil dispensere i de valgte krystalldråpene.
  7. Oppbevar platen i inkubatoren i ønsket tid.
    MERK: Disse parametrene bestemmes i løsningsmiddelkarakteriseringstrinnet, temperaturen vil være enten 4 ° C eller 20 ° C, avhengig av krystallveksttemperaturen, og tidene er vanligvis mellom 1 time og 3 timer.
Høsting av krystaller ved bruk av halvautomatisk krystallhøstingsanordning (se Tabell over materialer).
MERK: Hvis kryobeskyttelse er nødvendig, gjenta trinn 3.2.2 for tilsetning av kryobeskyttelsesmiddelløsninger på krystalldråpene før høsting av prøvene.
1. Forberedelse for høsting
  1. Forbered filene som kreves for høsting i SoakDB. Når du blir spurt, bekreft at soaks er ferdig, og batchene fullført.
  2. Skann ut antall pucker som kreves for eksperimentet under riktig forslagsnummer.
  3. Velg et brett med løkker av passende størrelse for krystallene (35 μm, 75 μm eller 150 μm). Det er viktig å velge en sløyfestørrelse som samsvarer med krystallens størrelse så nært som mulig for å gjøre det mulig for automatisk sentrering på strålelinjen å være mer nøyaktig, forbedre datakvaliteten ved å redusere bakgrunnen og eliminere behovet for kryobeskyttelsesmiddel.
  4. Åpne den aktuelle programvaren og åpne arbeidsflytfanen.
  5. Skann puckene inn i programvaren og bla tilbake til toppen av listen, og den første pucken.
  6. Legg puckene i en skumdewar og kjøl dem ned med flytende nitrogen.
  7. Velg Importer fil fra SoakDB og velg batchen du vil høste; Kontroller om partiet er tilordnet til venstre holder. En arbeidsliste vises.
  8. Ta krystallplaten, fjern forseglingen og sett i venstre holder; Flytt platen til parkeringsposisjonen.
2. Høsting av krystaller
  1. Bli komfortabel og trykk på Start arbeidsflyt-knappen (skjermen er en berøringsskjerm) for å gå til den første valgte brønnposisjonen.
  2. Hvis krystallen har overlevd, monter krystallen i løkken og stup inn i flytende nitrogen og plasser den i posisjon 1 i den første pucken i listen.
  3. Velg riktig beskrivelse for krystallen fra grensesnittet (normal, smeltet, sprukket, gelé eller farget).
  4. Hvis dråpen er en sammensatt suge, registrer beskrivelsen av forbindelsestilstanden (klar, krystallinsk, utfelt, dårlig dispensering eller faseseparasjon).
  5. Hvis krystallen er montert, velger du Montert ellers velger du Mislykkes.
  6. Platen vil flytte til neste valgte brønn. Fyll alle puckposisjonene fortløpende (ikke etterlat et gap hvis en krystall har mislyktes). Fortsett til slutten av arbeidsflyten.
  7. På slutten av arbeidsflyten, last inn eventuelle ekstra partier og fortsett å fylle puckene i rekkefølge. Det er ikke nødvendig å starte en ny puck for en ny batch.
3. Strekkodesporing av slakteresultatene
  1. Når alle krystallene er høstet, tar du puckene til strekkodeskanneren, plasserer en om gangen i holderen for å skanne pucken og feste strekkoder.
  2. Når dette er fullført, legg lokkene på puckene og lagre i en flytende nitrogenlagringsdewar.
  3. Last utdatafilen inn i SoakDB-grensesnittet.
4. Registrere eksempelinformasjon på ISPyB^34,35,36
  1. Laste opp eksempeldata til ISPyB
    1. I SoakDB, oppdater strålelinjen besøk Oppdater for ISPyB og klikk på Eksporter for å opprette filen som skal lastes opp til ISPyB.
    2. Åpen kitt. Logg inn og bla til følgende katalog dls / labxchem / data / year / lbXXXX-1 / processing / lab36 / ispyb.
    3. Kjør skriptet csv2ispyb (csv2ispyb lbXXXX-1-date.csv)
      MERK: Prøvene er nå lastet inn i ISPyB.
  2. Registrer puckplasseringen og datainnsamlingsstrategien.
    1. Registrer detaljene og plasseringen av puckene
      MERK: Det er viktig å registrere detaljene og plasseringen av puckene slik at de kan lokaliseres og lastes på strålelinjen.
      1. I SoakDB åpner du den andre fanen merket Pucks.
      2. Fyll ut detaljene i boksene øverst. Spesifikt plassering av pucker (lagring dewar og stokker), datainnsamlingsparametere, inkludert forventet oppløsning og forslagsnummer.
      3. Klikk på Lagre-knappen og en liste over alle puckene vil vises i tabellen. Kopier de nylig fylte puckene.
      4. Åpne XChem-køregnearket (snarvei på skrivebordet) og lim inn informasjonen. Fyll ut eventuell relevant tilleggsinformasjon.

4. Innsamling av opplysninger

MERK: Data samles inn i en uovervåket modus og administreres av XChem/beamline-teamet.

Gjenerindring av feilsentrerte prøver.
MERK: Disse kreves når det har vært problemer med datainnsamlingen for visse prøver, mest sannsynlig forårsaket når pinnene ikke har sentrert riktig.
1. Se på eksempelvekslervisningen i ISPyB, velg Rangering etter tilgangspunkt for å gradere eksemplene etter automatisk behandlet oppløsning i en fargegradering fra grønn til rød.
2. Klikk på prøvene for å se etter eventuelle røde eller gule prøver.
  MERK: Dette vil få opp datainnsamlingen.
3. Sjekk krystallbildene for å se om krystallen har sentrert.
4. Noter alle de som ikke har sentrert og send til den lokale kontakten som vil huske de manglende prøvene.

5. Dataanalyse

Henting og analyse av Diamonds autobehandlingsresultater gjennom XChemExplorer (XCE)²⁵.
1. I en terminal, gå til undermappen Behandling: cd / dls / labxchem / data / år / besøk / behandling eller for XChem BAGs: cd / dls / labxchem / data / år / besøk / behandling / prosjekt / behandling /.
2. Bruk aliaset xce for å åpne XChemExplorer.
3. Velg knappen Oppdater tabeller fra datakilde .
4. Under fanen Oversikt er det et sammendrag av eksperimentelle data. Legg til flere kategorier med alternativet Velg kolonner som skal vises på Datakilde-menyen .
5. Under Innstillinger-fanen velger du datainnsamlingskatalogen (/dls/i04-1/data/year/visit/).
6. Åpne Datasett-fanen, velg målet fra rullegardinmenyen Velg mål, velg Get Nye resultater fra automatisk behandling fra rullegardinmenyen Datasett, og klikk på Kjør.
  MERK: XCE vil nå analysere datainnsamlingsbesøket for automatisk behandling av resultater. Dette kan ta litt tid første gang det kjøres, avhengig av antall datasett/kataloger som analyseres.
7. Kontroller konsekvens og kvalitet på data ved å sjekke oppløsning, mellomromsgruppe og Rmerge. Ekskluder data lavere enn 2,8 Å oppløsning.
  MERK: Som standard er valg av datasett basert på en poengsum beregnet fra I / sigI, fullstendighet og antall unike refleksjoner, men andre behandlingsresultater kan velges for bruk²⁵.
8. For å velge et annet behandlingsresultat for individuelle datasett, hvis foretrukket, klikk på Prøve-ID og velg ønsket program / kjøre. Hvis du vil endre behandlingspipelinen for alle datasett, velger du Rediger innstillinger på Innstillinger-menyen og endrer mekanismen for valg av datasett.
9. Hvis det er nødvendig, behandler du dataene på nytt via ISPyB³⁷.
10. Hvis ingen behandlede data for et utvalg godtas, merker du som Kunne ikke utelates fra videre analyse.
11. Når du er ferdig, klikker du på Oppdater tabeller fra datakilde for å legge til data i påfølgende tabeller.
Beregning av innledende kart ved hjelp av DIMPLE³⁸.
1. Åpne kategorien Kart , velg referansemodellen fra rullegardinmenyen og velg de ønskede datasettene etterfulgt av Kjør DIMPLE på utvalgte MTZ-filer.
2. XCE kjører mange SMILEHULL-jobber samtidig på klyngen på Diamond. Finn statusen for disse jobbene under Dimple Status-kolonnen og oppdater ved hjelp av Oppdater tabeller fra Datasource-knappen eller ved hjelp av qstat-kommandoen i Linux.
3. Når du er ferdig, sjekk om verdiene Dimple Rcryst, Dimple Rfree og Space Group er akseptable. Om nødvendig (høy Rfree/feil mellomromsgruppe/stor forskjell i enhetscellevolum), endre resultatene for automatisk behandling som beskrevet tidligere og gjenta kartgenerering for disse datasettene.
Generering av ligandbegrensninger ved bruk av grad³⁹, AceDRG⁴⁰ eller fenix.eLBOW⁴¹.
1. Velg ønsket program (Innstillinger, Rediger innstillinger, Begrensningsgenereringsprogram) og velg deretter datasett under Kart-fanen etterfulgt av å kjøre Opprett CIF/PDB/PNG-fil med SELECTED forbindelser fra rullegardinmenyen Maps & Restraints .
2. Oppdater statusen for disse jobbene som du finner under kolonnen Sammensatt status , ved hjelp av knappen Oppdater tabeller fra datakilde .
Bygging av grunntilstandsmodellen (Pre-run)
MERK: Begrepet grunntilstandsmodell representerer strukturen av proteinet i sin ligandfrie form, som observert i 100 datasett (dette tallet er valgt vilkårlig). Siden grunntilstandsmodellen brukes som referanse for å bygge ligandbundet tilstand, er det avgjørende å bygge en nøyaktig grunntilstandsmodell, inkludert alle løsningsmiddel- og vannmolekyler, før analysen av hele fragmentscreeningskampanjen. I dette trinnet brukes de hundre første datasettene med høyest oppløsning som er merket av PanDDA som mangler interessante hendelser (og dermed sannsynligvis ligandfrie) til å generere gjennomsnittskartet for grunntilstand, mens datasettet med lavest_R-fri velges for avgrensningen. Grunntilstandsmiddelkartet er ikke et krystallografisk kart, men det er viktig å bare bruke dette kartet til bygging av grunntilstandsmodellen.
1. Åpne PanDDA-fanen og oppdater tabeller fra datasource om nødvendig.
2. Definer utdatakatalogen (/dls/labxchem/data/year/visit/processing/analysis/panddas).
3. Velg Pre-run for Ground State Model og klikk på Kjør.
  MERK: Datasett med høye ledige og uventede plassgrupper bør automatisk utelates fra analysen.
4. Hvis du vil utelate datasett med høye ledige og uventede mellomromsgrupper manuelt, velger du Ignorer fullstendig.
5. Kontroller statusen for jobben før kjøring ved hjelp av qstat i et terminalvindu.
6. Når du er ferdig, velger du Bygg grunntilstandsmodell og klikker på Kjør.
  MERK: Dette vil åpne Coot med PanDDA-gjennomsnittskartet og en referansemodell / 2Fo-FC / Fo-Fc-kart fra datasettet av beste kvalitet for remodellering og forbedring ved hjelp av Coot. Det er av største betydning at bare PanDDA-middelkartet brukes til modellering.
Identifisere treff ved hjelp av PanDDA²⁶
1. PanDDA-analyse
  MERK: Det kan ta litt tid å kjøre på klyngen hvis det er mange datasett, enhetscellen er stor, og det er flere kopier av proteinet i den asymmetriske enheten.
  1. Gjenta de tidligere beskrevne trinnene for Analyser DLS-automatisk behandling av resultater og Innledende kartberegning. For kartberegningen bruker du grunntilstandsmodellen som referanse: Oppdater referansefilliste > Angi ny referanse og generer ligandbegrensninger etter behov for de nye dataene (trinn 6.1-6.3).
  2. Under PanDDAs-fanen sørger du for at utdatakatalogen er satt som før, og kjør pandda.analyse fra rullegardinmenyen Hit Identification .
  3. Sjekk statusen til jobben i Linux-terminalen ved hjelp av qstat-kommandoen.
2. PanDDA inspiserer - sjekking/ byggebindingshendelser
  1. Under PanDDAs-fanen i XCE, kjør pandda.inspect fra rullegardinmenyen Hit Identification for å åpne Coot⁴² med PanDDA-kontrollpanelet.
    MERK: Pandda.inspect-kontrollpanelet gir et sammendrag av PanDDA-statistikk og lar brukerne navigere gjennom bindingshendelser / nettsteder. En sammendrags-HTML-fil av resultatene genereres også og kan oppdateres under inspeksjon ved å velge Oppdater HTML.
  2. For å modellere en ligand, klikk på Slå sammen ligand med modell og lagre modell før du navigerer til en annen hendelse for å unngå å miste endringer i bundet tilstandsmodellen.
    MERK: Bare modeller som er oppdatert og lagret, vil bli eksportert for forbedring på et senere tidspunkt.
  3. Bruk feltet Hendelseskommentar til å legge til merknader i bindingshendelsen og Registrer områdeinformasjon til å legge til merknader på bindingsområder.
  4. Last inn gjennomsnitt og 2mFo-DFc-kart (fra DIMPLE) for sammenligning med hendelseskartet og modellen.
    1. Når alle levedyktige ligander er modellert, slått sammen og lagret basert på hendelseskartet, lukker du pandda.inspect.
3. PanDDA-eksport og -forbedring
  MERK: Etter PanDDA-inspeksjonsmodeller eksporteres tilbake til prosjektkatalogen, og en innledende runde med forbedring lanseres. Det er for øyeblikket to tilgjengelige rørledninger for å gjøre dette under fanen PANDDAer i XCE.
  1. Export NEW/ALL/SELECTED PANDDA-modellene genererer et ensemble av bundne og ubundne modeller for raffinement og genererer parametere for beleggsikring for Refmac⁴³.
    MERK: Ensemblemodellen vil bli brukt til forbedring, men bare bound-state-modellen vil bli oppdatert i Coot og deponert i PDB. Denne rørledningen brukes best for datasett med fragmenter med lavt belegg og betydelige endringer i proteinmodellen.
  2. Finjuster NEW/ALL bound-state-modeller med BUSTER forbedrer bound-state bare med Buster⁴⁴.
    MERK: Dette brukes best med ligander/datasett med høyt belegg med minimale endringer i proteinmodellen.
Finjustering av treffene (alle datasett som er valgt for finjustering, vises nå i kategorien Finjustering). Velg Open COOT - BUSTER Refinement eller Open COOT - REFMAC Refinement fra rullegardinmenyen Refinement for å åpne Coot med XCE Refinement-kontrollpanelet.
1. Velg statusen til prøvene som skal finjusteres fra rullegardinmenyen Velg prøver (vanligvis 3 - i raffinement) og klikk på GO.
  MERK: XCE-kontrollpanelet gir et sammendrag av antall datasett for den kategorien og tillater navigering mellom datasett samtidig som det gir et sammendrag av forbedringsstatistikk.
2. Kommenter ligandtilliten i XCE-kontrollpanelet: 0 - ingen ligand til stede- Fragment har ikke bundet; 1 - Lav tillit- Fragment har muligens bundet, men er ikke spesielt overbevisende; 2 - Riktig ligand, svak tetthet- Brukeren er sikker på at fragmentet har bundet, men det er lavt belegg / det er noen problemer med kartene; 3 - Klar tetthet, uventet ligand- Kart indikerer tydelig ligandbinding som ikke korrelerer med gitt kjemisk struktur; 4 - Høy tillit- Ligand er entydig bundet.
3. Gjør eventuelle nødvendige endringer i modellen på dette stadiet, og start ytterligere forbedring ved hjelp av Begrens-knappen .
4. Bruk knappen Vis gjøremålsliste for MolProbity for å få tilgang til MolProbity^45-analysen som kjøres på alle finjusteringssykluser.
5. Hvis det er nødvendig, kan du legge til forbedringsparametere, for eksempel for anisotrope temperaturfaktorer, tvillingdata eller beleggsforbedring ved å velge Refinement Parameters-knappen .
  MERK: Databehandlingsstatistikk er også gitt i XCE under fanen Forbedring , og hvis forbedring utføres med Buster-rørledningen, leveres Buster-rapporter, inkludert MOGUL-analyse⁴⁶.
6. Endre statusen for et datasett etter hvert som det går gjennom finjustering både i hovedvinduet for XCE under kategorien Finjustering eller i Coot XCE-kontrollpanelet . Når du er fornøyd med at modellen er nøyaktig rundt liganden og egnet til å deles for videre analyse, endrer du statusen til CompChem Ready. Når finjusteringen er fullført og modellen klar for opplasting til PDB, endrer du statusen til Deponeringsklar.

6. Innskudd av dataene

MERK: Alle datasett fra et fragmentskjermbilde og bakketilstandsmodellen som brukes til å generere PanDDA-hendelseskartene, kan deponeres i PDB ved hjelp av gruppeavsetninger.

Konverter alle PanDDA-hendelseskart til MTZ-format ved å kjøre hendelseskart ->SF fra Hit Identification menyen.
Angi ytterligere metadata, for eksempel forfattere og metoder, ved å velge Deponering > Rediger informasjon. Fyll ut alle nødvendige elementer og klikk på Lagre i database, og lagre deretter denne informasjonen for deponering av grunntilstandsmodellen. Gjør dette etter at modellstatusen er endret til Deponeringsklar.
I kategorien Deponering velger du knappen Forbered mmcif for å generere mmcif-filer med strukturfaktor for alle deponeringsklare datasett. Følgende melding vises i terminalvinduet når dette er fullført: Ferdig med å forberede mmcif-filer for wwPDB-deponering.
Velg Kopier mmcif-knappen for å kopiere alle disse filene til et enkelt bzipped tar-arkiv i gruppeavsetningskatalogen for besøket.
Gå til https://deposit-group-1.rcsb.rutgers.edu/groupdeposit; Logg inn med brukernavn: GroupTester og passord: !2016rcsbpdb. Opprett en økt, og last opp filen ligand-bound.tar.bz2 fra gruppens avsetningsmappe.
Etter vellykket innsending av de ligandbundne strukturene, sendes en e-post med PDB-kodene. Velg Oppdater DB med PDB-koder fra Deponering-menyen ; kopier og lim inn informasjonen fra denne e-posten i popup-vinduet og klikk på Oppdater database for å legge til PDB-IDer.
For å deponere grunntilstandsmodellen som brukes av PanDDA, velg den aktuelle PanDDA-katalogen i XCE og kjør apo->mmcif fra Hit Identification menyen.
MERK: XCE vil vilkårlig velge en høyoppløselig struktur med lav Rfree som modell for deponeringsbunten og deretter kompilere alle strukturfaktor mmcif-filer til en enkelt fil.
I kategorien Deponering velger du knappen Legg til i database under delen Gruppeavsetning av grunntilstandsmodell .
Skriv inn metadataene for bakketilstandsmodellen (igjen ved å velge Deponering > Rediger informasjon), last inn forrige fil og Lagre i database.
Forbered mmcif-filen med grunntilstand ved å kjøre Forbered mmcif fra delen Gruppeavsetning av grunntilstandsmodell , og når du er ferdig, kopierer du mmcifen til mappen Gruppeavsetning ved å velge Kopier mmcif-knappen fra samme inndeling.
Som før, gå til https://deposit-group-1.rcsb.rutgers.edu/groupdeposit; Logg inn med brukernavn: GroupTester og passord: !2016rcsbpdb. Opprett en økt, og last opp ground_state_structures.tar.bz2-filen fra deponeringsmappen for gruppen.

Representative Results

XChem-rørledningen for fragmentscreening ved røntgenkrystallografi har blitt omfattende strømlinjeformet, noe som gjør det mulig å ta det opp av det vitenskapelige samfunnet (figur 5). Denne prosessen har blitt validert på over 150 screeningkampanjer med en trefffrekvens som varierer mellom 1% og 30%47,48,49,50,51,52 og av mange gjentatte brukere. Krystallsystemer som ikke er egnet (lav oppløsning, inkonsekvent i krystallisering eller i diffraksjonskvalitet) eller ikke kan tolerere enten DMSO eller etylenglykol, elimineres tidlig i prosessen, noe som sparer tid, krefter og ressurser. Vellykkede kampanjer gir et tredimensjonalt kart over potensielle interaksjonssteder på målproteinet; et typisk utfall er XChem-skjermen av hovedproteasen til SARS-CoV-2 (figur 6). Vanligvis finnes fragmenttreff i: (a) kjente steder av interesse, for eksempel enzymaktive steder og underlommer⁴⁸; (b) antatte allosteriske steder, for eksempel i protein-protein-interaksjoner⁵³; c) grensesnitt for krystallpakking, generelt betraktet som falske positiver (figur 6). Disse strukturelle dataene gir generelt grunnlag for sammenslåing, kobling eller voksende fragmenttreff til blylignende små molekyler ^1,3.

Figur 1: XChem-rørledningen. Plattformen er representert skjematisk fra prosjektforslag gjennom prøvepreparering, datainnsamling og hitidentifikasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Screeningstrategi. Arbeidsflyten angir formålet med hver milepæl, eksperimentets krav og beslutningspunktene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Arbeidsflyt for prøveforberedelse. Kritiske trinn for prøveprepareringen er representert med informasjon fra hvert trinn som registreres i en SQLite-database. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Dataanalyse ved hjelp av XCE. Kritiske trinn i dataanalysen er representert av et arbeidsflytdiagram med de relevante programvarepakkene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Utviklingen av XChem-brukerprogrammet: Diagrammet viser opptak og konsolidering av brukerprogrammet fra 2015 til 2019 med opprettelsen av BAG-er i 2019 og plattformens motstandskraft gjennom COVID-19-pandemien i 2020. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Representative resultater av XChem fragmentskjerm. SARS-CoV2 hovedprotease (M^pro) dimer er representert i overflaten med aktive treff vist i gule, antatte allosteriske treff vist i magenta, og overflate-/krystallpakkeartefakter vist i grønt. Figuren ble laget ved hjelp av Chimera og M^pro PDB-oppføringer fra gruppeavsetning G_1002156. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Prosessen som er skissert i denne artikkelen, har blitt grundig testet av brukerfellesskapet, og tilpasningsevnen til protokollene beskrevet her er nøkkelen til å håndtere det brede utvalget av prosjekter som vanligvis oppstår på plattformen. Imidlertid er noen forutsetninger for krystallsystemet nødvendige.

For enhver fragmentscreeningskampanje utført ved hjelp av røntgenkrystallografi, er et reproduserbart og robust krystallsystem kritisk. Siden standard XChem-protokoll innebærer tilsetning av fragmentet direkte til krystalldråpen, bør optimalisering fokusere på antall dråper som inneholder krystaller av høy kvalitet i stedet for det totale antall krystaller. Hvis dråper inneholder flere krystaller, er de effektivt overflødige, selv om de kan lindre høstingsprosessen. Videre kan det være utfordrende å overføre krystallisasjonsprotokollen fra hjemmeinstituttet til fasiliteter på stedet. Dette oppnås generelt best ved bruk av krystallsåing for å fremme reproduserbar nukleering⁵⁴, og derfor er en god praksis for brukere å gi frølagre sammen med deres protein- og krystalliseringsløsninger.

For å sikre god oppløselighet og støtte for forbindelser, er de høye bløtleggingskonsentrasjonene som er ment å drive binding av svake fragmenter, fragmentbiblioteker gitt i organiske løsningsmidler, spesielt DMSO og etylenglykol. Tilveiebringelse av to forskjellige løsningsmidler gir brukerne et alternativ for krystaller som ikke tolererer DMSO i det hele tatt, eller hvor det okkluderer bindingen av fragmenter på et sted av interesse. Brukere kan levere alternative biblioteker i vandig buffer: forbindelser vil dispensere godt forutsatt at de er fullstendig oppløst og formatert i plater som er kompatible med væskedispenseringsroboten.

For prosjekter der det ikke er mulig å finne et passende organisk løsningsmiddel som både vil solubilisere biblioteket og tolereres av krystallsystemet, er en alternativ prosedyre å bruke tørkede forbindelser som etablert ved BESSY⁵⁵.

I samfunnet er det et langvarig spørsmål om å kunne suge forbindelser til krystaller dyrket i krystallisasjonsbetingelser som inneholder høye saltkonsentrasjoner. Praktisk talt observeres mer utfelling av forbindelsene og rask dannelse av saltkrystaller på høstingstrinnet, noe som reduseres ved å påføre et fuktig miljø rundt høstingsområdet. Generelt gir screeningkampanjer i krystallsystemer fra høye saltkrystallisasjonsforhold en sammenlignbar trefffrekvens til lave saltforhold.

De innledende stadiene av XChem-prosessen (løsemiddeltoleransetesting og pre-screen) er relativt små og raske eksperimenter, men tillater klar go / no go-beslutning for prosjektet. Mest smertefullt vil alternative krystallsystemer måtte bli funnet hvis ingen av løsemidlene tolereres, eller forhåndsskjermen resulterer i en svært lav treffrate. I kontrast, hvis de lykkes, informerer resultatene direkte bløtleggingstilstanden som skal brukes til screeningeksperimentet, og den beste strategien for datainnsamling. Siden kvaliteten på dataene, spesielt oppløsningen, vil påvirke kvaliteten på elektrondensiteten for treffidentifikasjon og analyse, er målet å suge ved høyest mulig sammensatt konsentrasjon som ikke har en skadelig effekt på diffraksjonskvaliteten (med flertallet av datasettene (~ 80%) diffraksjon til en oppløsning på 2,8 Å eller bedre).

Dataanalyseprosessen er strømlinjeformet i XChemExplorer, som er avhengig av PanDDA-programvaren for påvisning av svake bindemidler og lar brukerne raskt visualisere og gjennomgå resultatene av screeningkampanjen. XChemExplorer importerer databehandlingsresultater fra pakkene som er tilgjengelige på Diamond (DIALS 16, autoPROC 30, STARANISO³¹ og Xia2¹⁴) med oppløsningsgrenser bestemt av standardmetoden for hver pakke (dvs. ^CC1/2 = 0,3). Som standard er valg av datasett basert på en poengsum beregnet fra I/sigI, fullstendighet og en rekke unike refleksjoner, men spesifikke behandlingsresultater kan velges for bruk både globalt eller for individuelle prøver²⁵. Data er også ekskludert fra analyse av PanDDA basert på kriterier inkludert oppløsning,_R-fri og forskjell i enhetscellevolum mellom referanse- og måldata (standardverdier er henholdsvis 3,5 Å, 0,4 og 12 %), slik at dårlig diffracting, feilsentrerte eller feilindekserte krystaller ikke påvirker analysen.

PanDDA-algoritmen utnytter det betydelige antallet datasett samlet inn under en fragmentkampanje for å oppdage partielle beleggligander som ikke er synlige i standard krystallografiske kart. Innledningsvis bruker PanDDA data samlet inn under testing av løsemiddeltoleranse og forhåndsskjermtrinn for å forberede et gjennomsnittlig tetthetskart som deretter brukes til å lage en grunntilstandsmodell. Siden denne modellen vil bli brukt til alle påfølgende analysetrinn, er det viktig at den nøyaktig representerer det ikke-liganderte proteinet under betingelsene som brukes til fragmentskjermen. PanDDA bruker deretter en statistisk analyse for å identifisere bundne ligander, og genererer et hendelseskart for krystallens bundne tilstand. Et hendelseskart genereres ved å trekke den ubundne brøkdelen av krystallet fra datasettet for delvis belegg og presenterer hva som ville bli observert hvis liganden var bundet ved fullt belegg. Selv fragmenter som vises tydelig i konvensjonelle 2mF_o-DF _c-kart , kan bli feilmodellert hvis hendelseskartene ikke konsulteres³². Mens PanDDA er en kraftig metode for å identifisere datasett som avviker fra gjennomsnittskartene (som vanligvis indikerer fragmentbinding) og beregninger som RSCC, RSZD, B-faktorforhold og RMSD under avgrensning er gitt til brukerens fordel, er brukeren i siste instans ansvarlig for å avgjøre om den observerte tettheten nøyaktig viser den forventede liganden og den mest passende konformasjonen.

Etter dataanalyse og forbedring er det mulig for alle brukere å sette inn flere strukturer samtidig i Protein Data Bank (PDB) ved hjelp av XChemExplorer. For hvert fragment-skjermbilde er det laget to gruppeavsetninger. Den første avsetningen inneholder alle fragmentbundne modeller, med koeffisienter for beregning av PanDDA-hendelseskart inkludert i MMCIF-filer. Den andre avsetningen gir den medfølgende grunntilstandsmodellen, langs de målte strukturfaktorene til alle datasettene i eksperimentet: disse dataene kan brukes til å reprodusere PanDDA-analysen, og for å utvikle fremtidige algoritmer. Når det gjelder strukturene til treffene, når fragmentbelegget er lavt, oppfører raffinementet seg bedre hvis modellene er sammensatt av de ligandbundne og forvirrende grunntilstandsstrukturene³²; Praksisen er likevel å deponere bare bunde-stat-fraksjonene, siden de sammensatte modellene generelt er komplekse og vanskelige å tolke. Som et resultat er noen kvalitetsindikatorer omregnet av PDB (spesielt R / Rfree) noen ganger litt forhøyet. Det er også mulig å levere alle rådata ved hjelp av plattformer som Zenodo⁵⁶, selv om dette for øyeblikket ikke støttes av XChem-rørledningen.

Totalt sett, siden operasjonen i 2016, kunne fragmentligander identifiseres i over 95% av målene ved hjelp av denne prosedyren. Erfaringer fra de mange prosjektene som XChem har støttet ble destillert til beste praksis for krystallforberedelse³³, mens et fragmentbibliotek ble utviklet som implementerte det klare konseptet for å hjelpe fragmentprogresjon²⁹, og bidro også til å etablere praksisen med å gjøre bibliotekets sammensetning offentlig. Plattformen har demonstrert viktigheten av godt vedlikeholdt infrastruktur og dokumenterte prosesser, beskrevet her, og gjort det mulig å evaluere andre fragmentbiblioteker^57,58, for å sammenligne biblioteker⁴⁸, og for å informere utformingen av det samarbeidende EUOpenscreen-DRIVE-biblioteket ^59,60.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.

Acknowledgments

Dette arbeidet representerer en stor felles innsats mellom Diamond Light Source og Structure Genomic Consortium. Forfatterne ønsker å anerkjenne Diamonds ulike støttegrupper og MX-gruppe for deres bidrag til automatisering av i04-1 beamline og for å gi strømlinjeformet datainnsamling og automatisk behandling av rørledninger, som vanligvis kjøres på tvers av alle MX-strålelinjer. De vil også takke SGC PX-gruppen for deres motstandskraft som de første brukerne som testet oppsettet og Evotec for å være den første seriøse industrielle brukeren. Dette arbeidet ble støttet av iNEXT-Discovery (Grant 871037) finansiert av Horizon 2020-programmet til EU-kommisjonen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DSI-poised library	Enamine	DSI-896	fragment library
Echo 550 and 650 series	Beckman-Coulter		acoustic dispensing system
Echo microplates	Beckman-Coulter	001-12380; 001-8768; 001-6025	1536-well and 384-well microplates
Shifter	Oxford Lab Technology		harvesting device
Microplate centrifuge with a swing-out rotor	Sigma	model 11121	microplate centrifuge
3-drops crystallisation plates	Swissci	3W96T-UVP	Crystallisation plates
Formulatrix plate imager and Rockmaker software	Formulatrix		Crystallisation plates imaging device

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Erlanson, D. A., Fesik, S. W., Hubbard, R. E., Jahnke, W., Jhoti, H. Twenty years on: The impact of fragments on drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 605-619 (2016).
Jacquemard, C., Kellenberger, E. A bright future for fragment-based drug discovery: what does it hold. Expert Opinion on Drug Discovery. 14 (5), 413-416 (2019).
Jahnke, W., et al. Fragment-to-lead medicinal chemistry publications in 2019. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (24), 15494-15507 (2019).
Li, Q. Application of fragment-based drug discovery to versatile targets. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 180 (2020).
Kirsch, P., Hartman, A. M., Hirsch, A. K. H., Empting, M. Concepts and core principles of fragment-based drug design. Molecules. 24 (23), Basel, Switzerland. 4309 (2019).
Patel, D., Bauman, J. D., Arnold, E. Advantages of crystallographic fragment screening: functional and mechanistic insights from a powerful platform for efficient drug discovery. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 116 (2-3), 92-100 (2014).
Wasserman, S., et al. Automated synchrotron crystallography for drug discovery: the LRL-CAT beamline at the APS. Acta Crystallographica Section A Foundations of Crystallography. 67 (1), 46-47 (2011).
Hartshorn, M. J. Fragment-based lead discovery using X-ray crystallography. Journal of Medicinal Chemistry. 48 (2), 403-413 (2005).
Arzt, S., et al. Automation of macromolecular crystallography beamlines. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 89 (2), 124-152 (2005).
Beteva, A. High-throughput sample handling and data collection at synchrotrons: Embedding the ESRF into the high-throughput gene-to-structure pipeline. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 62, Pt 10 1162-1169 (2006).
Papp, G., et al. FlexED8: The first member of a fast and flexible sample-changer family for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 10 841-851 (2017).
Casanas, A., et al. EIGER detector: Application in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D, Structural Biology. 72, Pt 9 1036-1048 (2016).
Henrich, B., et al. PILATUS: A single photon counting pixel detector for X-ray applications. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 607 (1), 247-249 (2009).
Winter, G., Lobley, C. M. C., Prince, S. M. Decision making in xia2. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 69, Pt 7 1260-1273 (2013).
Winter, G., McAuley, K. E. Automated data collection for macromolecular crystallography. Methods. 55 (1), 81-93 (2011).
Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D, Structural Biology. 74, Pt 2 85-97 (2018).
Bowler, M. W. MASSIF-1: A beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
Von Stetten, D., et al. ID30A-3 (MASSIF-3) - A beamline for macromolecular crystallography at the ESRF with a small intense beam. Journal of Synchrotron Radiation. 27, Pt 3 844-851 (2020).
Cipriani, F., et al. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 68, Pt 10 1393-1399 (2012).
Helmholtz Zentrum Berlin. , Available from: https://www.helmholtzberlin.de/forschung/oe/np/gmx/fragment-screening/index_en.html (2021).
Lima, G. M. A., et al. FragMAX: the fragment-screening platform at the MAX IV Laboratory. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 76 (8), 771-777 (2020).
Ng, J. T., Dekker, C., Kroemer, M., Osborne, M., Von Delft, F. Using textons to rank crystallization droplets by the likely presence of crystals. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 70, Pt 10 2702-2718 (2014).
Collins, P. M., et al. Gentle, fast and effective crystal soaking by acoustic dispensing. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 3 246-255 (2017).
Wright, N. D., et al. The low-cost Shifter microscope stage transforms the speed and robustness of protein crystal harvesting. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 77, Pt 1 62-74 (2021).
Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein-ligand structure determination. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 3 267-278 (2017).
Pearce, N. M., et al. A multi-crystal method for extracting obscured crystallographic states from conventionally uninterpretable electron density. Nature Communications. 8, 15123 (2017).
Fragalysis. , Available from: https://fragalysis.diamond.ac.uk (2021).
Diamond Light Source Ltd. , Available from: https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Fragment-Screening.html (2021).
Cox, O. B., et al. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7 (3), 2322-2330 (2016).
Vonrhein, C., et al. Data processing and analysis with the autoPROC toolbox. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 67, Pt 4 293-302 (2011).
Vonrhein, C., et al. Advances in automated data analysis and processing within autoPROC , combined with improved characterisation, mitigation and visualisation of the anisotropy of diffraction limits using STARANISO. Acta Crystallographica Section A: Foundations and Advances. 74 (1), 360 (2018).
Pearce, N. M., Krojer, T., Von Delft, F. Proper modelling of ligand binding requires an ensemble of bound and unbound states. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 3 265-266 (2017).
Collins, P. M., et al. Achieving a good crystal system for crystallographic x-ray fragment screening. Methods in Enzymology. 610, 251-264 (2018).
Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
Fisher, S. J., Levik, K. E., Williams, M. A., Ashton, A. W., McAuley, K. E. SynchWeb: a modern interface for ISPyB. Journal of Applied Crystallography. 48, Pt 3 927-932 (2015).
Ginn, H. M., et al. SynchLink: an iOS app for ISPyB. Journal of Applied Crystallography. 47, Pt 5 1781-1783 (2014).
Diamond Light Source Ltd. , Available from: https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Common/Common-Manual/Data-Analysis/Reprocessing-in-ISPyB.html (2021).
Wojdyr, M., Keegan, R., Winter, G., Ashton, A. DIMPLE - a pipeline for the rapid generation of difference maps from protein crystals with putatively bound ligands. Acta Crystallographica. Section A, Foundations of Crystallography. 69, 299 (2013).
Global Phasing Limited. , Available from: http://www.globalphasing.com (2021).
Long, F., et al. AceDRG: A stereochemical description generator for ligands. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 3 112-122 (2017).
Moriarty, N. W., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Electronic ligand builder and optimization workbench (eLBOW): A tool for ligand coordinate and restraint generation. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 65, Pt 10 1074-1080 (2009).
Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).
Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 53, Pt 3 240-255 (1997).
Bricogne, G., et al. Buster version 2.10.3. Global Phasing Ltd. , Cambridge, United Kingdom. (2017).
Chen, V. B., et al. MolProbity: All-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66, Pt 1 12-21 (2010).
Bruno, I. J., et al. Retrieval of crystallographically-derived molecular geometry information. Journal of Chemical Information and Computer Sciences. 44 (6), 2133-2144 (2004).
Delbart, F., et al. An allosteric binding site of the α7 nicotinic acetylcholine receptor revealed in a humanized acetylcholine-binding protein. TheJournal of Biological Chemistry. 293, 2534-2545 (2018).
Douangamath, A., et al. Crystallographic and electrophilic fragment screening of the SARS-CoV-2 main protease. Nature Communications. 11 (1), 5047 (2020).
Guo, J., et al. In crystallo-screening for discovery of human norovirus 3C-like protease inhibitors. Journal of Structural Biology: X. 4, 100031 (2020).
Keedy, D. A., et al. An expanded allosteric network in PTP1B by multitemperature crystallography, fragment screening, and covalent tethering. eLife. 7, 36307 (2018).
McIntyre, P. J., et al. Characterization of three druggable hot-spots in the aurora-a/tpx2 interaction using biochemical, biophysical, and fragment-based approaches. ACS Chemical Biology. 12 (11), 2906-2914 (2017).
Thomas, S. E., et al. Structure-guided fragmentbased drug discovery at the synchrotron: Screening binding sites and correlations with hotspot mapping. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 377 (2147), 20180422 (2019).
Nichols, C., et al. Mining the PDB for tractable cases where x-ray crystallography combined with fragment screens can be used to systematically design protein-protein inhibitors: Two test cases illustrated by IL1β-IL1R and p38α-TAB1 complexes. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (14), 7559-7568 (2020).
D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned. Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, Pt 9 1117-1126 (2014).
Wollenhaupt, J., et al. F2X-Universal and F2X-Entry: Structurally diverse compound libraries for crystallographic fragment screening. Structure. 28 (6), 694-706 (2020).
Zenodo. , Available from: https://zenodo.org (2021).
Foley, D. J., et al. Synthesis and demonstration of the biological relevance of sp(3) -rich scaffolds distantly related to natural product frameworks. Chemistry. 23 (60), Weinheim an der Bergstrasse. Germany. 15227-15232 (2017).
Kidd, S. L., et al. Demonstration of the utility of DOS-derived fragment libraries for rapid hit derivatisation in a multidirectional fashion. Chemical Science. 11 (39), 10792-10801 (2020).
EU-openscreen ERIC. , Available from: https://www.eu-openscreen.eu/ (2021).
Schuller, M., et al. Fragment binding to the Nsp3 macrodomain of SARS-CoV-2 identified through crystallographic screening and computational docking. bioRxiv. 393405, (2020).

Chemistry

Oppnå effektiv fragmentscreening på XChem-anlegget ved Diamond Light Source

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.