Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Opnåelse af effektiv fragmentscreening på XChem-facilitet ved Diamond Light Source

Published: May 29, 2021 doi: 10.3791/62414
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1,2, 1,2, 1,2,3, 3,4, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3, 1,3, 3,5, 1, 1,2,3,4,6
1Diamond Light Source Ltd, Harwell Science and Innovation Campus, 2Research Complex at Harwell, Harwell Science and Innovation Campus, 3Structural Genomics Consortium, University of Oxford, 4Centre for Medicines Discovery, University of Oxford, 5Oxford Protein Informatics Group, Department of Statistics, Oxford University, 6Department of Biochemistry, University of Johannesburg
* These authors contributed equally

Summary

Dette papir beskriver den komplette XChem-proces til krystalbaseret fragmentscreening, startende fra ansøgning om adgang og alle efterfølgende trin til dataformidling.

Abstract

I fragmentbaseret lægemiddelopdagelse testes hundreder eller ofte tusinder af forbindelser mindre end ~ 300 Da mod proteinet af interesse for at identificere kemiske enheder, der kan udvikles til potente lægemiddelkandidater. Da forbindelserne er små, er interaktionerne svage, og screeningsmetoden skal derfor være meget følsom; Desuden har strukturelle oplysninger tendens til at være afgørende for at uddybe disse hits til blylignende forbindelser. Derfor har proteinkrystallografi altid været en guldstandardteknik, men historisk set for udfordrende til at finde udbredt anvendelse som en primær skærm.

Indledende XChem-eksperimenter blev demonstreret i 2014 og derefter afprøvet med akademiske og industrielle samarbejdspartnere for at validere processen. Siden da har en stor forskningsindsats og betydelig stråletid strømlinet prøveforberedelsen, udviklet et fragmentbibliotek med hurtige opfølgningsmuligheder, automatiseret og forbedret I04-1 beamlines kapacitet til ubemandet dataindsamling og implementeret nye værktøjer til datastyring, analyse og hitidentifikation.

XChem er nu en facilitet til storskala krystallografisk fragmentscreening, der understøtter hele krystaller-til-aflejring-processen og tilgængelig for akademiske og industrielle brugere over hele verden. Det peer-reviewed akademiske brugerprogram er blevet aktivt udviklet siden 2016 for at imødekomme projekter fra så bredt et videnskabeligt omfang som muligt, herunder velvaliderede såvel som sonderende projekter. Akademisk adgang tildeles gennem halvårlige indkaldelser af peer-reviewed forslag, og proprietært arbejde arrangeres af Diamonds Industrial Liaison Group. Denne arbejdsgang er allerede rutinemæssigt blevet anvendt på over hundrede mål fra forskellige terapeutiske områder og identificerer effektivt svage bindemidler (1% -30% hitrate), som både tjener som udgangspunkt af høj kvalitet til sammensat design og giver omfattende strukturel information om bindingssteder. Processens modstandsdygtighed blev demonstreret ved fortsat screening af sars-CoV-2-mål under covid-19-pandemien, herunder en 3-ugers turn-around for hovedproteasen.

Introduction

Fragment-Based Drug Discovery (FBDD) er en udbredt strategi for blyopdagelse, og siden dens fremkomst for 25 år siden har den leveret fire lægemidler til klinisk brug, og mere end 40 molekyler er blevet avanceret til kliniske forsøg 1,2,3. Fragmenter er små kemiske enheder, normalt med en molekylvægt på 300 Da eller mindre. De er udvalgt på grund af deres lave kemiske kompleksitet, som giver gode udgangspunkter for udvikling af stærkt ligandeffektive hæmmere med fremragende fysisk-kemiske egenskaber. Deres størrelse betyder, at de sampler proteinernes bindingslandskab mere grundigt end biblioteker af større lægemiddel- eller blylignende forbindelser og dermed også afslører hot spots og formodede allosteriske steder. Kombineret med strukturel information giver fragmenter et detaljeret kort over de potentielle molekylære interaktioner mellem protein og ligand. Pålidelig påvisning og validering af disse enheder, som har tendens til at binde svagt til målproteinet, kræver ikke desto mindre en række robuste og følsomme biofysiske screeningsmetoder såsom overfladeplasmonresonans (SPR), kernemagnetisk resonans (NMR) eller isotermisk titreringskalorimetri (ITC)4,5.

Røntgenkrystallografi er en væsentlig del af FBDD-værktøjssættet: det er følsomt nok til at identificere svage bindemidler og giver direkte strukturel information om interaktionerne på molekylært niveau. Det er komplementært til andre biofysiske skærme og normalt afgørende for at udvikle fragmenthits til blyforbindelser; det kræver krystalsystemer af høj kvalitet, hvilket betyder, at krystallisering er meget reproducerbar, og krystaller ideelt diffrakterer til bedre end 2,8 Å opløsning.

Historisk set har det været meget vanskeligt at bruge krystallografi som primær fragmentskærm 6,7,8, hvad enten det er i den akademiske verden eller i industrien. I modsætning hertil opnåede synkrotroner størrelsesordensforbedringer inden for robotteknologi, automatisering 9,10,11 og detektorteknologi 12,13, og kombineret med lige accelereret computerkraft og algoritmer til databehandling14,15,16 kan komplette diffraktionsdatasæt måles i sekunder og et stort antal af dem helt uden opsyn, som banebrydende på LillyCAT7 og senere MASSIF17,18 (European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)). Dette førte synkrotroner til at udvikle meget strømlinede platforme for at gøre krystalbaseret fragmentscreening som primær skærm tilgængelig for et bredt brugerfællesskab (XChem at Diamond; CrystalDirect på EMBL/ESRF19; BESSY på Helmholtz-Zentrum Berlin20; FragMax på MaxIV21).

Dette papir dokumenterer de protokoller, der udgør XChem-platformen til fragmentscreening ved røntgenkrystallografi, fra prøveforberedelse til de endelige strukturelle resultater af 3D-modellerede hits. Rørledningen (figur 1) krævede udvikling af nye tilgange til krystalidentifikation22, blødgøring 23 og høstning24 samt datastyringssoftware 25 og en algoritmisk tilgang til identifikation af fragmenter 26, der nu er meget udbredt i samfundet. Krystalhøstningsteknologien sælges nu af en leverandør (se materialetabellen), og den åbne tilgængelighed af værktøjerne har gjort det muligt for andre synkrotroner at tilpasse dem til at oprette tilsvarende platforme21. Igangværende projekter omhandler dataanalyse, modelfærdiggørelse og dataformidling gennem Fragalyse-platformen27. Prøveforberedelseslaboratoriet støder op til beamline I04-1, hvilket forenkler logistikken med at overføre hundredvis af frosne prøver til strålelinjen, og dedikeret stråletid på I04-1 muliggør hurtig røntgenfeedback til at guide kampagnen.

XChem er en integreret del af Diamonds brugerprogram med to opkald om året (begyndelsen af april og oktober). Peer review-processen er blevet raffineret i samråd med eksperter i lægemiddelopdagelse fra den akademiske verden og industrien. Sammen med en stærk videnskabelig sag kræver forslagsprocessen28 , at ansøgere selv vurderer ikke kun krystalsystemets parathed, men også deres ekspertise inden for biokemiske og ortogonale biofysiske metoder og kapacitet til at udvikle screeningshits gennem opfølgende kemi. Adgangsformerne har også udviklet sig for at imødekomme det tværfaglige brugersamfund:

Niveau 1 (enkeltprojekt ) er for projekter i undersøgelsesfasen, og det er ikke nødvendigt at anvende valideringsværktøjer (biofysik eller biokemiske værktøjer) og opfølgningsstrategier. Hvis projektet accepteres, tildeles projektet et reduceret antal stråletidsskift, nok til bevis for konceptet.

Niveau 2 (enkeltprojekt) er til velvaliderede projekter og kræver, at downstream-værktøjer og opfølgningsstrategier er på plads. Hvis det accepteres, tildeles projektet tilstrækkelig stråletid til en fuld fragmentscreeningskampagne. Enkeltprojekter (tier 1 eller tier 2) skal afsluttes inden for de 6 måneder af tildelingsperioden (enten april til september eller oktober til marts).

Block Allocation Group (BAG) er for et konsortium af grupper og projekter, hvor en robust måludvælgelses- og prioriteringsproces er på plads inden for BAG sammen med en klar opfølgningspipeline. BAG'er skal have mindst én fuldt XChem-uddannet ekspert (superbruger), som koordinerer deres aktiviteter med Diamond-personale og træner BAG-medlemmerne. Det tildelte antal beamtimeskift defineres af antallet af videnskabeligt stærke projekter i BAG og revurderes pr. tildelingsperiode baseret på BAG's rapport. Adgangen er tilgængelig i 2 år.

XChem-eksperimentet er opdelt i tre faser med et beslutningspunkt for hver af dem: opløsningsmiddeltolerancetest, præ-skærm og hovedskærm (figur 2). Opløsningsmiddeltolerancetesten hjælper med at definere blødgøringsparametrene, mængden af opløsningsmiddel (DMSO, ethylenglycol eller andre kryoprotektorer, hvis det er nødvendigt), krystalsystemet kan tåle, og hvor længe. Opløsningsmiddelkoncentrationer varierer typisk fra 5% -30% over mindst to tidspunkter. Diffraktionsdata indsamles og sammenlignes med krystalsystemets basediffraktion; Dette bestemmer blødgøringsparametrene for det følgende trin. Til forskærmen gennemblødes 100-150 forbindelser under anvendelse af de betingelser, der er bestemt i opløsningsmiddeltesten, og dens formål er at bekræfte, at krystallerne kan tolerere forbindelserne under disse forhold. Om nødvendigt tilsættes kryoprotektanten efterfølgende til de dråber, der allerede indeholder fragmenterne. Succeskriterierne er, at 80% eller mere af krystallerne overlever godt nok til at give diffraktionsdata af god og ensartet kvalitet; Hvis dette mislykkes, revideres blødgøringsbetingelserne normalt ved at ændre blødgøringstiden eller opløsningsmiddelkoncentrationen. Efter en vellykket forundersøgelse kan resten af de forbindelser, der er valgt til eksperimentet, indstilles ved hjælp af de endelige parametre.

Det DSI-pariserede bibliotek (se materialetabel) blev bevidst designet til at muliggøre hurtig opfølgningsprogression ved hjælp af klar kemi29 og har været facilitetens arbejdshestebibliotek. Den er tilgængelig for brugere i en koncentration på 500 mM i DMSO. Akademiske brugere kan også få adgang til andre biblioteker, der leveres af samarbejdspartnere (over 2.000 forbindelser i alt) i koncentrationer på 100-500 mM i DMSO (en komplet liste findes på webstedet28). Meget af den samlede samling er også tilgængelig i ethylenglycol til krystalsystemer, der ikke tåler DMSO. Brugere kan også medbringe deres egne biblioteker, forudsat at de er i plader, der er kompatible med det akustiske væskehåndteringssystem (se materialetabel).

For alle tre trin i eksperimentet (opløsningsmiddelkarakterisering, præ-skærm eller fuld skærm) er følgende prøveforberedelsesprocedurer identiske (figur 3): valg af forbindelsesdispenseringssted gennem billeddannelse og målretning af krystalliseringsdråber med TeXRank22; dispensering i dråber ved hjælp af det akustiske væskedispenseringssystem for både opløsningsmiddel og forbindelser23; effektiv høst af krystallerne ved hjælp af krystalskifteren24; og upload af eksempeloplysninger til beamline-databasen (ISPyB). Den nuværende grænseflade til eksperimentdesign og udførelse er en Excel-baseret applikation (SoakDB), der genererer de nødvendige inputfiler til platformens forskellige udstyr og sporer og registrerer alle resultater i en SQLite-database. Stregkodescannere bruges på forskellige stadier i hele processen til at hjælpe med at spore prøver, og disse data føjes til databasen.

Diffraktionsdata indsamles i uovervåget tilstand ved hjælp af dedikeret beamtime på beamline I04-1. To centreringstilstande er tilgængelige, nemlig optisk og røntgenbaseret17. For nåle- og stavformede krystaller anbefales røntgencentrering, mens klumpede krystaller generelt understøtter optisk tilstand, hvilket er hurtigere og derfor gør det muligt at indsamle flere prøver i den tildelte stråletid. Afhængigt af opløsningen af krystallerne (etableret før de kommer ind på platformen) kan dataindsamling enten være 60 s eller 15 s total eksponering. Dataindsamling under opløsningsmiddeltestfasen informerer normalt om, hvilken kombination der fungerer bedst med ydeevnen af strålelinje I04-1.

Den store mængde dataanalyse styres via XChemExplorer (XCE)25, som også kan bruges til at starte hitidentifikationstrinnet ved hjælp af PanDDA26. XCE er et datastyrings- og workflowværktøj, der understøtter storskala analyse af protein-ligandstrukturer (figur 4); den læser ethvert af de automatiske behandlingsresultater fra data indsamlet på Diamond Light Source (DIALS16, Xia214, AutoPROC30 og STARANISO31) og vælger automatisk et af resultaterne baseret på datakvalitet og lighed med en referencemodel. Det er vigtigt, at modellen er repræsentativ for det krystalsystem, der anvendes til XChem-screening, og skal omfatte alt vand eller andre opløsningsmiddelmolekyler samt alle cofaktorer, ligander og alternative konformationer, der er synlige i krystaller, der kun er gennemblødt med opløsningsmiddel. Kvaliteten af denne referencemodel vil direkte påvirke mængden af arbejde, der kræves i modelbygnings- og forbedringsfasen. PanDDA bruges til at analysere alle data og identificere bindingssteder. Det justerer strukturer til en referencestruktur, beregner de statistiske kort, identificerer begivenheder og beregner begivenhedskort26,32. I PanDDA-paradigmet er det hverken nødvendigt eller ønskeligt at opbygge den fulde krystallografiske model; Det, der skal modelleres, er kun synet af proteinet, hvor et fragment er bundet (bound-state-modellen), så fokus behøver kun at være på at opbygge liganden og omgivende rester/opløsningsmiddelmolekyler i henhold til begivenhedskortet32.

Protocol

1. Indsendelse af projektforslag

  1. Forslagets indhold: Da XChem-programmet er overtegnet, er grundig og fuldstændig information i forslaget afgørende for at bestå peer-review.
    1. Gør sagen! Præsenter vigtigheden af målet og sæt det i en bredere sammenhæng.
      1. Formuler strategien efter fragmentscreeningskampagnen: de ortogonale metoder, der er på plads til at validere hits, og hvordan man udvikler dem. Arranger samarbejderne, hvis det er nødvendigt.
      2. På grund af den intense laboratorie- og dataanalysedel anbefales det stærkt at tildele en erfaren krystallograf på forhånd.
      3. Et robust krystalsystem er nøglen til at eliminere teknisk variation, og brugerne bør tage fat på disse væsentlige punkter.
        1. Sørg for, at krystalliseringsbetingelserne giver reproducerbare dråber med krystaller af lignende diffrakterende kvalitet i plader, der er egnede til brug på platformen med et reservoirvolumen på 30 μL (eller mindre) og en dråbestørrelse mellem 200-500 nL. Ideelt set vil mere end 50% af dråberne i en plade have krystaller på mindst 35 μm størrelse33.
        2. Sørg for ensartet diffraktionskvalitet af krystaller (2,6 Å eller bedre).
        3. Kontroller krystalsystemets egnethed til fragmentscreening, herunder krystalpakning og tilgængelighed af kendte steder. Tidligere beviser for et molekyle bundet på disse steder er ofte betryggende.

2. Forberedelse af besøget

  1. Overførsel af krystalliseringsprotokoller til krystallisation på stedet.
    1. Giv 2 x 50 ml reservoiropløsning, klar til brug.
    2. Der tilvejebringes proteinopløsningen i den nødvendige koncentration til krystallisation, klar til brug i alikvoter på 30-50 μL.
    3. Der tilvejebringes 10 ml proteinbufferopløsning.
    4. Giv frøbestand (selvom det ikke er nødvendigt i krystallisationsprotokollen).
      BEMÆRK: Såning favoriserer krystallisationsreproducerbarhed og fremskynder kimdannelsestiden33.
    5. Udfyld krystalliseringsinformationsformularen, der er tilgængelig på XChem-webstedet28.
    6. Angiv lagringsoplysningerne i forsendelsesformularen, der er tilgængelig på XChem-webstedet28.
  2. Installer NoMachine, og konfigurer et fjernskrivebord til Diamond (https://www.diamond.ac.uk/Users/Experiment-at-Diamond/IT-User-Guide/Not-at-DLS/Nomachine.html).
  3. Generer og overfør en god referencemodel i samråd med en ekspertkrystallograf eller XChem-supportpersonale.

3. Eksperiment med screening af fragmenter

  1. Definition af forbindelsens dispenseringsplacering.
    1. Billeddannelse krystalliseringsplader.
      1. Tag billeder af alle de krystalplader (se Materialetabel), der kræves til eksperimentet i krystalpladebilleddannerne (se Materialetabel). Brug billedsoftwaren til at generere pladenavn(e) i den korrekte mappe for pladetypen i følgende format Forslag Number_Plate nummer.
      2. Udskriv stregkoderne (højreklik på pladenavnet og vælg i menuen), placer dem på den modsatte side af pladen fra rækkebogstaverne, sæt pladen (e) i lastporten med stregkoden vendt væk fra brugeren.
      3. Brug imager-styringssoftwaren, scan lastporten, højreklik på plader, og vælg derefter Image Plates.
      4. Når billeddannelsen er færdig, skal du fjerne pladerne fra billedapparatet.
    2. Valg af krystaller og sammensat placering
      BEMÆRK: Billederne af krystalliseringsdråberne behandles inden for Luigi-rørledningen ved hjælp af TexRanks tekstonbaserede algoritme Ranker til at rangere dråberne efter den sandsynlige tilstedeværelse af krystaller22. Dette tager cirka 10 minutter, og billederne vil derefter være tilgængelige i TexRank.
      1. Åbn TeXRank fra en pc, og vælg krystalbakken enten fra listen nederst til højre eller ved at skrive stregkoden i feltet øverst til venstre.
      2. Vælg det korrekte billedformat og visningen af et enkelt felt. Flyt gennem dråbebillederne, og når der er en krystal, der er egnet til brug i et eksperiment, skal du højreklikke væk fra krystallen, men inde i dråben - målet er at målrette hvor i dråben for at tilføje opløsningsmiddel / forbindelser, så ønsker ikke at ramme krystallendirekte 23.
      3. Fortsæt gennem hele pladen, og når du er færdig, skal du vælge Echo 1 Target-knappen ; Gem i mappen Crystal Targets under det relevante besøg. Du må ikke ændre filnavnet.
      4. Gentag for eventuelle ekstra plader.
  2. Dispensering af forbindelser
    1. Generering af filer til sammensat dispensering
      1. I SoakDB skal du indtaste oplysninger om biblioteksvalg eller opløsningsmiddel i tabellen bibliotek/opløsningsmiddel.
      2. Indtast dråbevolumen og belastning på listen over målrettede krystaller.
      3. Generer de nødvendige batches.
      4. Indtast blødgøringsparametrene. Klik på Beregn og derefter på knappen Eksporter. For opløsningsmiddel tilsættes de forskellige koncentrationer til tabellen. Dette genererer filerne til brug i den akustiske dispenser.
      5. Hvis du bruger kryoprotektant, skal du indtaste koncentrationen og oprette filerne på samme måde.
    2. Dispenseringsløsninger ved hjælp af akustikdispenseren (se materialetabel)
      1. Tag kildepladen (forbindelser eller opløsningsmiddel/kryoprotektiv) og drej pladen i centrifugen i 2 minutter ved 1.000 x g.
      2. Hvis der dispenseres solvens eller kryoprotektiv, pipetteres 30 μL i det relevante hul på en 384PP-plade; Dæk med en mikroforseglingsfilm, og centrifuger derefter som ovenfor.
      3. Åbn softwaren; vælg Ny , og vælg den korrekte kildebrøndplade (384PP, 384LDV eller 1536LDV) og væskeklassen (DMSO, CP, BP eller GP). Sørg for, at den korrekte pladetype er valgt som destinationsplade. Marker derefter Tilpasset og fortsæt.
      4. Vælg Importér , og vælg den relevante batchfil. Udfør importtrinnene, som softwaren beder dig om.
      5. Brug pladekortene til at kontrollere dispenseringsopløsningen og destinationsstederne.
      6. Kør protokollen, følg vejledningen, når de kommer op. Opløsningen/opløsningerne fra kildepladen vil dispensere i de valgte krystaldråber.
      7. Opbevar pladen i inkubatoren i den krævede tid.
        BEMÆRK: Disse parametre bestemmes i opløsningsmiddelkarakteriseringstrinnet, temperaturen vil være enten 4 °C eller 20 °C afhængigt af krystalvæksttemperaturen, og tiderne er typisk mellem 1 time og 3 timer.
  3. Høstning af krystaller ved hjælp af den halvautomatiske krystalhøstningsanordning (se Tabel over materialer).
    BEMÆRK: Hvis kryobeskyttelse er påkrævet, gentages trin 3.2.2 for tilsætning af kryoprotektive opløsninger på krystaldråberne, inden prøverne høstes.
    1. Forberedelse til høst
      1. Forbered de filer, der kræves til høst i SoakDB. Når du bliver spurgt, skal du bekræfte, at blødgørne er færdige, og batcherne afsluttet.
      2. Scan antallet af pucke, der kræves til eksperimentet under det korrekte forslagsnummer.
      3. Vælg en bakke med løkker i passende størrelse til krystallerne (35 μm, 75 μm eller 150 μm). Det er vigtigt at vælge en sløjfestørrelse, der matcher krystalstørrelsen så tæt som muligt for at gøre det muligt for den automatiske centrering på strålelinjen at være mere nøjagtig, forbedre datakvaliteten ved at reducere baggrunden og eliminere behovet for kryoprotektant.
      4. Åbn den relevante software, og åbn fanen workflow.
      5. Scan puckene ind i softwaren, og rul tilbage til toppen af listen, og fremhæv den første puck.
      6. Placer puckene i en skumdewar og afkøl dem med flydende nitrogen.
      7. Vælg Importer fil fra SoakDB , og vælg den batch, der skal høstes; Kontroller, om batchen er tildelt den venstre holder. Der vises en arbejdsliste.
      8. Tag krystalpladen, fjern forseglingen, og sæt den venstre holder i; Flyt pladen til parkeringspositionen.
    2. Høstning af krystaller
      1. Sæt dig godt til rette, og tryk på knappen Start arbejdsforløb (skærmen er en berøringsskærm) for at flytte til den først valgte brøndposition.
      2. Hvis krystallen har overlevet, skal du montere krystallen i løkken og springe ned i det flydende nitrogen og placere den i position 1 i den første puck på listen.
      3. Vælg den passende beskrivelse for krystallen fra grænsefladen (normal, smeltet, revnet, gelé eller farvet).
      4. Hvis dråben er en sammensat blødgøring, skal du registrere beskrivelsen af den sammensatte tilstand (klar, krystallinsk, udfældet, dårlig dispensering eller faseseparation).
      5. Hvis krystallen er monteret korrekt, skal du vælge Monteret , ellers skal du vælge Mislykket.
      6. Pladen flyttes til den næste valgte brønd. Udfyld alle puckpositionerne fortløbende (efterlad ikke et hul, hvis en krystal har svigtet). Fortsæt indtil slutningen af arbejdsgangen.
      7. Ved afslutningen af arbejdsgangen skal du indlæse yderligere batches og fortsætte med at fylde puckene i rækkefølge. Der er ingen grund til at starte en ny puck til en ny batch.
    3. Stregkodesporing af høstresultaterne
      1. Når alle krystallerne er høstet, skal du tage puckene til stregkodescanneren, placere en ad gangen i holderen for at scanne pucken og pin stregkoder.
      2. Når dette er afsluttet, skal du sætte lågene på puckene og opbevare i en flydende nitrogenopbevaringsdewar.
      3. Indlæs outputfilen i SoakDB-grænsefladen.
    4. Registrering af eksempeloplysninger i ISPyB34,35,36
      1. Upload eksempeldata til ISPyB
        1. I SoakDB skal du opdatere beamline-besøget Opdatering til ISPyB og klikke på Eksporter for at oprette filen, der skal uploades til ISPyB.
        2. Åben kitt. Log ind og gennemse følgende mappe dls / labxchem / data / år / lbXXXX-1 / behandling / lab36 / ispyb.
        3. Kør scriptet csv2ispyb (csv2ispyb lbXXXX-1-date.csv)
          BEMÆRK: Eksemplerne indlæses nu i ISPyB.
      2. Registrer puckens placering og dataindsamlingsstrategi.
        1. Optag detaljerne og placeringen af puckene
          BEMÆRK: Det er vigtigt at registrere detaljerne og placeringen af puckene, så de kan lokaliseres og læsses på strålelinjen.
          1. I SoakDB skal du åbne den anden fane mærket Pucks.
          2. Udfyld detaljerne i felterne øverst. Specifikt placering af pucke (opbevaring dewar og stokke), dataindsamlingsparametre, herunder forventet opløsning og forslagsnummer.
          3. Klik på knappen Gem , og en liste over alle pucke vises i tabellen. Kopier de nyligt fyldte pucke.
          4. Åbn XChem-køregnearket (genvej på skrivebordet), og indsæt oplysningerne. Udfyld eventuelle yderligere relevante oplysninger.

4. Dataindsamling

BEMÆRK: Data indsamles i en ubemandet tilstand og administreres af XChem/beamline-teamet.

  1. Erindring af forkert centrerede prøver.
    BEMÆRK: Disse er nødvendige, når der har været problemer med dataindsamlingen for visse prøver, sandsynligvis forårsaget, når stifterne ikke er centreret korrekt.
    1. Se på eksempelskiftervisningen i ISPyB, vælg Ranger efter AP for at klassificere prøverne efter automatisk behandlet opløsning i en farvegraduering fra grøn til rød.
    2. Klik på prøverne for at kontrollere, om der er røde eller gule prøver.
      BEMÆRK: Dette åbner dataindsamlingen.
    3. Kontroller krystalsnapshots for at se, om krystallen er centreret.
    4. Noter alle dem, der ikke har centreret, og send til den lokale kontakt, der vil huske de manglende prøver.

5. Analyse af data

  1. Hentning og analyse af Diamonds resultater af automatisk behandling via XChemExplorer (XCE)25.
    1. I en terminal skal du gå til undermappen Processing: cd /dls/labxchem/data/year/visit/processing eller for XChem BAGs: cd /dls/labxchem/data/year/visit/processing/project/processing/.
    2. Brug aliaset xce til at åbne XChemExplorer.
    3. Vælg knappen Opdater tabeller fra datakilde .
    4. Under fanen Oversigt er der en oversigt over eksperimentelle data. Tilføj flere kategorier med indstillingen Vælg kolonner, der skal vises i menuen Datakilde .
    5. Under fanen Indstillinger skal du vælge dataindsamlingsmappen (/dls/i04-1/data/år/besøg/).
    6. Åbn fanen Datasæt, vælg målet i rullemenuen Vælg mål, vælg Get Nye resultater fra Automatisk behandling fra rullemenuen Datasæt, og klik på Kør.
      BEMÆRK: XCE analyserer nu dataindsamlingsbesøget for automatisk behandling af resultater. Dette kan tage noget tid, første gang det køres, afhængigt af antallet af datasæt/mapper, der analyseres.
    7. Kontroller konsistens og kvalitet af data ved at kontrollere opløsning, mellemrumsgruppe og Rmerge. Udelad data, der er lavere end en opløsning på 2,8 Å.
      BEMÆRK: Som standard er valg af datasæt baseret på en score beregnet ud fra I/sigI, fuldstændighed og antal unikke refleksioner, men andre behandlingsresultater kan vælges til brug25.
    8. Hvis du vil vælge et andet behandlingsresultat for individuelle datasæt, skal du klikke på Eksempel-id og vælge det ønskede program/den ønskede kørsel, hvis du foretrækker det. Hvis du vil ændre behandlingspipelinen for alle datasæt, skal du vælge Rediger præferencer i menuen Indstillinger og ændre mekanismen til valg af datasæt.
    9. Hvis det er nødvendigt, skal du behandle dataene igen via ISPyB37.
    10. Hvis ingen behandlede data for en prøve er acceptable, skal du markere som Mislykkedes for at udelukke fra yderligere analyse.
    11. Når du er færdig, skal du klikke på Opdater tabeller fra datakilde for at tilføje data til efterfølgende tabeller.
  2. Beregning af indledende kort ved hjælp af DIMPLE38.
    1. Åbn fanen Maps , vælg referencemodellen i rullemenuen, og vælg de ønskede datasæt efterfulgt af Kør DIMPLE på udvalgte MTZ-filer.
    2. XCE kører adskillige DIMPLE-job samtidigt på klyngen hos Diamond. Find status for disse job under kolonnen Dimple Status , og opdater ved hjælp af knappen Opdater tabeller fra Datasource eller ved hjælp af qstat-kommandoen i Linux.
    3. Når du er færdig, skal du kontrollere, om værdierne Dimple Rcryst, Dimple Rfree og Space Group er acceptable. Hvis det er nødvendigt (høj Rfree/forkert mellemrumsgruppe/stor forskel i enhedscellevolumen), skal du ændre resultaterne af automatisk behandling som beskrevet tidligere og gentage kortgenereringen for disse datasæt.
  3. Generering af ligandbegrænsninger ved hjælp af grad39, AceDRG40 eller phenix.eLBOW41.
    1. Vælg det ønskede program (Indstillinger, Rediger præferencer, Program til generering af begrænsninger), og vælg derefter datasæt under fanen Kort efterfulgt af at køre Opret CIF/PDB/PNG-fil med VALGTE forbindelser fra rullemenuen Kort og begrænsninger.
    2. Opdater status for disse job, der findes under kolonnen Sammensat status , ved hjælp af knappen Opdater tabeller fra datakilde .
  4. Opbygning af jordtilstandsmodellen (Pre-run)
    BEMÆRK: Udtrykket jordtilstandsmodel repræsenterer strukturen af proteinet i dets ligandfrie form, som observeret i 100 datasæt (dette tal vælges vilkårligt). Da jordtilstandsmodellen bruges som reference for opbygning af ligandbundet tilstand, er det afgørende at opbygge en nøjagtig jordtilstandsmodel, herunder alle opløsningsmiddel- og vandmolekyler, inden analysen af hele fragmentscreeningskampagnen. I dette trin bruges de hundrede datasæt med den højeste opløsning, der er markeret af PanDDA som manglende interessante begivenheder (og dermed sandsynligvis ligandfri), til at generere middelkortet for jordtilstanden, mens datasættet med lavesteR-fri vælges til forbedringen. Jordtilstandsmiddelkortet er ikke et krystallografisk kort, men det er vigtigt kun at bruge dette kort til opbygning af jordtilstandsmodellen.
    1. Åbn fanen PanDDA'er, og opdater tabeller fra datakilden, hvis det er nødvendigt.
    2. Definer outputmappen (/dls/labxchem/data/year/visit/processing/analysis/panddas).
    3. Vælg Pre-run for Ground State Model og klik på Kør.
      BEMÆRK: Datasæt med grupper med høj Rfri og uventet mellemrum bør automatisk udelukkes fra analysen.
    4. Hvis du manuelt vil ekskludere datasæt med grupper med høj Rfree og uventede mellemrum, skal du vælge Ignorer fuldstændigt.
    5. Kontroller status for pre-run-jobbet ved hjælp af qstat i et terminalvindue.
    6. Når du er færdig, skal du vælge Byg jordtilstandsmodel og klikke på Kør.
      BEMÆRK: Dette åbner Coot med PanDDA-middelkortet og en referencemodel/2Fo-Fc/Fo-Fc-kort fra datasæt af bedste kvalitet til ommodellering og forfining ved hjælp af Coot. Det er yderst vigtigt, at kun PanDDA-middelkortet bruges til modellering.
  5. Identificering af hits ved hjælp af PanDDA26
    1. PanDDA-analyse
      BEMÆRK: Det kan tage lidt tid at køre på klyngen, hvis der er mange datasæt, enhedscellen er stor, og der er flere kopier af proteinet i den asymmetriske enhed.
      1. Gentag de tidligere beskrevne trin for Analysér DLS-resultater til automatisk behandling og Indledende kortberegning. Til kortberegningen skal du bruge jordtilstandsmodellen som reference: Opdater referencefilliste > Angiv ny reference , og generer ligandbegrænsninger efter behov for de nye data (trin 6.1-6.3).
      2. Under fanen PanDDA'er skal du sikre dig, at outputmappen er indstillet som før, og køre pandda.analyse fra rullemenuen Hitidentifikation .
      3. Kontroller status for jobbet i Linux-terminalen ved hjælp af kommandoen qstat.
    2. PanDDA inspektion - kontrol/opbygning af bindingshændelser
      1. Under fanen PanDDA'er i XCE skal du køre pandda.inspect fra rullemenuen Hitidentifikation for at åbne Coot42 med PanDDA-kontrolpanelet.
        BEMÆRK: Kontrolpanelet pandda.inspect giver en oversigt over PanDDA-statistikker og giver brugerne mulighed for at navigere gennem bindende begivenheder / websteder. Der genereres også en HTML-oversigtsfil over resultaterne, som kan opdateres under inspektionen ved at vælge Opdater HTML.
      2. For at modellere en ligand skal du klikke på Flet ligand med model og gem model , før du navigerer til en anden begivenhed for at undgå at miste ændringer i grænsetilstandsmodellen.
        BEMÆRK: Kun modeller, der er blevet opdateret og gemt, eksporteres til forbedring på et senere tidspunkt.
      3. Brug feltet Hændelseskommentar til at anmærke bindingshændelsen og Postwebstedsoplysninger til at anmærke bindingssteder.
      4. Indlæs gennemsnit og 2mFo-DFc-kort (fra DIMPLE) til sammenligning med hændelseskortet og modellen.
        1. Når alle levedygtige ligander er modelleret, flettet og gemt baseret på hændelseskortet, skal du lukke pandda.inspect.
    3. PanDDA eksport og raffinement
      BEMÆRK: Efter PanDDA-inspektion eksporteres modeller tilbage til projektmappen, og en indledende raffinement lanceres. Der er i øjeblikket to tilgængelige pipelines til at gøre det under fanen PANDDA'er i XCE.
      1. Eksport af NEW/ALL/SELECTED PANDDA-modeller genererer et ensemble af bundne og ubundne modeller til raffinement og genererer parametre for fastholdelse af belægning for Refmac43.
        BEMÆRK: Ensemblemodellen vil blive brugt til forbedring, men kun bound-state-modellen vil blive opdateret i Coot og deponeret i PDB. Denne pipeline bruges bedst til datasæt med fragmenter med lav belægning og væsentlige ændringer i proteinmodellen.
      2. Finjuster NYE/ALLE bound-state-modeller med BUSTER forfiner kun bound-state med Buster 44.
        BEMÆRK: Dette bruges bedst med ligander/datasæt med høj belægning med minimale ændringer i proteinmodellen.
  6. Finjustering af hits (alle datasæt, der er valgt til finjustering, vil nu være synlige under fanen Finjustering). Vælg Åbn COOT - BUSTER Refinement eller Open COOT - REFMAC Refinement i rullemenuen Forfining for at åbne Coot med XCE Refinement-kontrolpanelet.
    1. Vælg status for de prøver, der skal raffineres, fra rullemenuen Vælg prøver (normalt 3 - i forfining), og klik på GO.
      BEMÆRK: XCE-kontrolpanelet giver en oversigt over antallet af datasæt for den pågældende kategori og tillader navigation mellem datasæt, samtidig med at det giver en oversigt over finjusteringsstatistikker.
    2. Kommenter ligandtilliden til XCE-kontrolpanelet: 0 - ingen ligand til stede- Fragment har ikke bundet; 1 - Lav tillid- Fragment har muligvis bundet, men er ikke særlig overbevisende; 2 - Korrekt ligand, svag tæthed- Brugeren er sikker på, at fragmentet er bundet, men det er lav belægning / der er nogle problemer med kortene; 3 - Klar tæthed, uventet ligand- Kort angiver tydeligt ligandbinding, der ikke korrelerer med forudsat kemisk struktur; 4 - Høj tillid- Ligand er entydigt bundet.
    3. Foretag de nødvendige ændringer af modellen på dette tidspunkt, og start yderligere forbedringer ved hjælp af knappen Finjuster .
    4. Brug knappen Vis MolProbity opgaveliste til at få adgang til MolProbity 45-analyse, der køres på alle forbedringscyklusser.
    5. Tilføj om nødvendigt finjusteringsparametre, f.eks. for anisotropiske temperaturfaktorer, sammenflettede data eller justering af belægning, ved at vælge knappen Justeringsparametre .
      BEMÆRK: Databehandlingsstatistikker leveres også i XCE under fanen Forfining , og hvis der udføres forbedringer med Buster-rørledningen, leveres Buster-rapporter, herunder MOGUL-analyse46.
    6. Skift status for et datasæt, efterhånden som det skrider frem gennem finjustering, både i XCE-hovedvinduet under fanen Forbedring eller i Coot XCE-kontrolpanelet . Når du er overbevist om, at modellen er nøjagtig omkring liganden og egnet til at blive delt til yderligere analyse, skal du ændre status til CompChem Ready. Når finjusteringen er fuldført, og modellen er klar til upload til PDB, skal du ændre status til Deposition ready.

6. Deponering af data

BEMÆRK: Alle datasæt fra en fragmentskærm og den jordtilstandsmodel, der bruges til at generere PanDDA-hændelseskortene, kan deponeres i PDB ved hjælp af gruppeaflejringer.

  1. Konverter alle PanDDA-hændelseskort til MTZ-format ved at køre Event Map ->SF fra menuen Hitidentifikation .
  2. Angiv yderligere metadata, f.eks. forfattere og metoder, ved at vælge Aflejring > Rediger oplysninger. Udfyld alle de nødvendige elementer, og klik på Gem i database , og gem derefter disse oplysninger til deponering af jordtilstandsmodellen. Gør dette, når modelstatus er blevet ændret til Deposition Ready.
  3. På fanen Aflejring skal du vælge knappen Forbered mmcif for at generere strukturfaktor mmcif-filer for alle Deposition Ready-datasæt . Følgende meddelelse vises i terminalvinduet, når dette er fuldført: Færdig med at forberede mmcif-filer til wwPDB-deponering.
  4. Vælg knappen Kopier mmcif for at kopiere alle disse filer til et enkelt bzippet tjærearkiv i besøgets gruppedeponeringsmappe .
  5. Gå til https://deposit-group-1.rcsb.rutgers.edu/groupdeposit; Log ind med brugernavn: GroupTester og adgangskode: !2016rcsbpdb. Opret en session, og upload den ligandbundne .tar.bz2-fil fra gruppedeponeringsmappen.
  6. Efter vellykket indsendelse af de ligandbundne strukturer sendes en e-mail med PDB-koderne. Vælg Opdater DB med PDB-koder i menuen Aflejring ; kopier og indsæt oplysningerne fra denne e-mail i pop op-vinduet, og klik på Opdater database for at tilføje PDB-id'er.
  7. For at deponere den jordtilstandsmodel, der bruges af PanDDA, skal du vælge den relevante PanDDA-mappe i XCE og køre apo->mmcif fra menuen Hitidentifikation .
    BEMÆRK: XCE vælger vilkårligt en struktur med høj opløsning med lav Rfree som model for deponeringsbundtet og kompilerer derefter alle strukturfaktor mmcif-filer til en enkelt fil.
  8. På fanen Deposition skal du vælge knappen Føj til database under afsnittet Gruppedeponering af jordtilstandsmodel .
  9. Indtast metadataene for jordtilstandsmodellen (igen ved at vælge Aflejring > Rediger oplysninger), indlæs den forrige fil og Gem i database.
  10. Forbered mmcif-filen med jordtilstand ved at køre Forbered mmcif fra sektionen Gruppedeponering af jordtilstandsmodel, og når du er færdig, skal du kopiere mmcif til mappen Gruppedeponering ved at vælge knappen Kopier mmcif fra samme sektion.
  11. Som før, gå til https://deposit-group-1.rcsb.rutgers.edu/groupdeposit; Log ind med brugernavn: GroupTester og adgangskode: !2016rcsbpdb. Opret en session, og upload filen ground_state_structures.tar.bz2 fra gruppedeponeringsmappen.

Representative Results

XChem-pipelinen til fragmentscreening ved hjælp af røntgenkrystallografi er blevet strømlinet betydeligt, hvilket gør det muligt for det videnskabelige samfund at tage den til sig (figur 5). Denne proces er blevet valideret på over 150 screeningskampagner med en hitrate, der varierer mellem 1% og 30%47,48,49,50,51,52 og af mange gentagne brugere. Krystalsystemer, der ikke er egnede (lav opløsning, inkonsekvent i krystallisering eller diffraktionskvalitet) eller ikke tåler hverken DMSO eller ethylenglycol, elimineres tidligt i processen, hvilket sparer tid, kræfter og ressourcer. Vellykkede kampagner giver et tredimensionelt kort over potentielle interaktionssteder på målproteinet; et typisk resultat er XChem-skærmen for SARS-CoV-2's hovedprotease (figur 6). Typisk findes fragmenthits i: (a) kendte steder af interesse, såsom enzymaktive steder og underlommer48; b) formodede allosteriske steder, f.eks. i protein-protein-interaktioner53 c) grænseflader til krystalpakning, der almindeligvis betragtes som falske positiver (figur 6). Disse strukturelle data giver generelt et grundlag for sammenlægning, sammenkædning eller voksende fragmenthits til blylignende små molekyler 1,3.

Figure 1
Figur 1: XChem-rørledningen. Platformen er skematisk repræsenteret fra projektforslag gennem prøveforberedelse, dataindsamling og hitidentifikation. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Screeningstrategi. Arbejdsprocessen angiver formålet med hver milepæl, eksperimentets krav og beslutningspunkterne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Arbejdsproces for prøveforberedelse. Kritiske trin til prøveforberedelsen repræsenteres med oplysninger fra hvert trin, der registreres i en SQLite-database. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Dataanalyse ved hjælp af XCE. Kritiske trin i dataanalysen repræsenteres af et workflowdiagram med de relevante softwarepakker. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Udviklingen af XChem-brugerprogrammet: Diagrammet viser optagelsen og konsolideringen af brugerprogrammet fra 2015 til 2019 med oprettelsen af BAG'er i 2019 og platformens modstandsdygtighed gennem COVID-19-pandemien i 2020. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Repræsentative resultater af XChem-fragmentskærmen. SARS-CoV2 hovedprotease (Mpro) dimer er repræsenteret i overfladen med aktive site hits vist i gule, formodede allosteriske hits vist i magenta og overflade / krystalpakning artefakter vist i grønt. Figuren blev lavet ved hjælp af Chimera og Mpro PDB poster fra gruppe deposition G_1002156. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Processen, der er skitseret i dette papir, er blevet grundigt testet af brugerfællesskabet, og tilpasningsevnen af de protokoller, der er beskrevet her, er nøglen til håndtering af den brede vifte af projekter, der typisk opstår på platformen. Imidlertid er nogle få forudsætninger for krystalsystemet nødvendige.

For enhver fragmentscreeningskampagne, der udføres ved hjælp af røntgenkrystallografi, er et reproducerbart og robust krystalsystem kritisk. Da standard XChem-protokollen involverer tilsætning af fragmentet direkte til krystaldråben, bør optimering fokusere på antallet af dråber, der indeholder krystaller af høj kvalitet snarere end det samlede antal krystaller. Hvis dråber indeholder flere krystaller, er de effektivt overflødige, selvom de kan lindre høstprocessen. Desuden kan overførsel af krystalliseringsprotokollen fra hjemmeinstituttet til faciliteter på stedet være udfordrende. Dette opnås generelt bedst ved hjælp af krystalsåning for at fremme reproducerbar kimdannelse54, og derfor er en god praksis, at brugerne leverer frøbestande sammen med deres protein- og krystalliseringsopløsninger.

For at sikre god sammensat opløselighed og støtte, de høje blødgøringskoncentrationer, der er beregnet til at drive binding af svage fragmenter, tilvejebringes fragmentbiblioteker i organiske opløsningsmidler, specifikt DMSO og ethylenglycol. Tilvejebringelse af to forskellige opløsningsmidler giver brugerne et alternativ til krystaller, der slet ikke tåler DMSO, eller hvor det udelukker binding af fragmenter på et interessant sted. Brugere kan levere alternative biblioteker i vandig buffer: forbindelser dispenseres godt, forudsat at de er fuldstændigt opløst og formateret i plader, der er kompatible med væskedispenseringsrobotten.

For projekter, hvor det ikke er muligt at finde et passende organisk opløsningsmiddel, der både opløser biblioteket og tolereres af krystalsystemet, er en alternativ procedure at anvende tørrede forbindelser som fastlagt i BESSY55.

I samfundet er der et langvarigt spørgsmål om at være i stand til at suge forbindelser i krystaller dyrket under krystalliseringsbetingelser, der indeholder høje saltkoncentrationer. Praktisk set observeres mere udfældning af forbindelserne og hurtig dannelse af saltkrystaller i høstfasen, hvilket reduceres ved at anvende et fugtigt miljø omkring høstområdet. Generelt giver screeningskampagner i krystalsystemer fra høje saltkrystalliseringsbetingelser en sammenlignelig hitrate med lave saltforhold.

De indledende faser af XChem-processen (test af opløsningsmiddeltolerance og præ-screening) er relativt små og hurtige eksperimenter, men giver mulighed for klar go/no go-beslutning for projektet. Mest smertefuldt skal alternative krystalsystemer findes, hvis hverken opløsningsmiddel tolereres, eller forskærmen resulterer i en meget lav hitrate. I modsætning hertil, hvis de lykkes, informerer resultaterne direkte blødgøringstilstanden, der skal bruges til screeningseksperimentet, og den bedste strategi for dataindsamling. Da kvaliteten af dataene, især opløsningen, vil påvirke kvaliteten af elektrondensiteten til hitidentifikation og analyse, er målet at suge ved den højest mulige sammensatte koncentration, der ikke har en skadelig effekt på diffraktionskvaliteten (hvor størstedelen af datasæt (~ 80%) diffrakterer til en opløsning på 2,8 Å eller bedre).

Dataanalyseprocessen er strømlinet i XChemExplorer, som er afhængig af PanDDA-softwaren til påvisning af svage bindemidler og giver brugerne mulighed for hurtigt at visualisere og gennemgå resultaterne af screeningskampagnen. XChemExplorer importerer databehandlingsresultater fra de pakker, der er tilgængelige på Diamond (DIALS16, autoPROC 30, STARANISO31 og Xia214) med opløsningsgrænser bestemt af standardmetoden for hver pakke (dvs.CC1/2 = 0,3). Som standard er valg af datasæt baseret på en score beregnet ud fra I/sigI, fuldstændighed og en række unikke refleksioner, men specifikke behandlingsresultater kan vælges til brug både globalt eller for individuelle eksempler25. Data er også udelukket fra analyse af PanDDA baseret på kriterier, herunder opløsning,R-fri og forskel i enhedscellevolumen mellem reference- og måldata (standardindstillinger er henholdsvis 3,5 Å, 0,4 og 12%), så dårligt diffrakterende, forkert centrerede eller forkert indekserede krystaller ikke påvirker analysen.

PanDDA-algoritmen udnytter det betydelige antal datasæt, der indsamles under en fragmentkampagne, til at registrere ligander med delvis belægning, der ikke er synlige på standardkrystallografiske kort. Indledningsvis bruger PanDDA data indsamlet under opløsningsmiddeltolerancetesten og præ-screen-trin til at udarbejde et gennemsnitstæthedskort, som derefter bruges til at oprette en jordtilstandsmodel. Da denne model vil blive brugt til alle efterfølgende analysetrin, er det afgørende, at den nøjagtigt repræsenterer det ikke-liganderede protein under de betingelser, der anvendes til fragmentskærmen. PanDDA bruger derefter en statistisk analyse til at identificere bundne ligander, hvilket genererer et begivenhedskort for krystallens bundne tilstand. Et hændelseskort genereres ved at trække den ubundne fraktion af krystallen fra datasættet for delvis belægning og præsenterer, hvad der ville blive observeret, hvis liganden var bundet ved fuld belægning. Selv fragmenter, der vises tydelige i konventionelle 2mFo-DF c-kort , kan blive fejlmodelleret, hvis begivenhedskortene ikke konsulteres32. Mens PanDDA er en kraftfuld metode til at identificere datasæt, der adskiller sig fra de gennemsnitlige kort (som normalt er tegn på fragmentbinding), og målinger som RSCC, RSZD, B-faktorforhold og RMSD under forfining leveres til brugerens fordel, er brugeren i sidste ende ansvarlig for at beslutte, om den observerede tæthed nøjagtigt viser den forventede ligand og den mest egnede konformation.

Efter dataanalyse og forfining er det muligt for alle brugere samtidig at deponere flere strukturer i Protein Data Bank (PDB) ved hjælp af XChemExplorer. For hver fragmentskærm foretages to gruppeaflejringer. Den første deponering indeholder alle fragmentbundne modeller med koefficienter til beregning af PanDDA-begivenhedskort inkluderet i MMCIF-filer. Den anden aflejring giver den ledsagende jordtilstandsmodel langs de målte strukturfaktorer for alle datasæt i eksperimentet: disse data kan bruges til at reproducere PanDDA-analysen og til udvikling af fremtidige algoritmer. Med hensyn til hits-strukturerne, når fragmentbelægningen er lav, opfører raffinement sig bedre, hvis modeller er en sammensætning af de ligandbundne og forvirrende jordtilstandsstrukturer32; Ikke desto mindre er praksis kun at deponere bound-state fraktionerne, da de fulde sammensatte modeller generelt er komplekse og vanskelige at fortolke. Som følge heraf er nogle kvalitetsindikatorer, der er genberegnet af FBF (navnlig R/Rfree), undertiden let forhøjede. Det er også muligt at levere alle rådata ved hjælp af platforme som Zenodo56, selvom dette i øjeblikket ikke understøttes af XChem-rørledningen.

Samlet set kunne fragmentligander siden driften i 2016 identificeres i over 95% af målene ved hjælp af denne procedure. Erfaringer fra de mange projekter, som XChem har støttet, blev destilleret til bedste praksis for krystalforberedelse33, mens der blev udviklet et fragmentbibliotek, der implementerede det klare koncept til at hjælpe fragmentprogression29, hvilket også hjalp med at etablere praksis med at offentliggøre bibliotekskomposition. Platformen har demonstreret vigtigheden af velholdt infrastruktur og dokumenterede processer, der er beskrevet her, og gjort det muligt at evaluere andre fragmentbiblioteker57,58, sammenligne biblioteker48 og informere designet af det kollaborative EUOpenscreen-DRIVE-bibliotek 59,60.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde repræsenterer en stor fælles indsats mellem Diamond Light Source og Structure Genomic Consortium. Forfatterne vil gerne anerkende Diamonds forskellige støttegrupper og MX-gruppe for deres bidrag til automatiseringen af i04-1 beamline og for at levere strømlinede dataindsamlings- og autobehandlingsrørledninger, som almindeligvis køres på tværs af alle MX-strålelinjer. De vil også gerne takke SGC PX-gruppen for deres modstandsdygtighed ved at være de første brugere til at teste opsætningen og Evotec for at være den første seriøse industrielle bruger. Dette arbejde blev støttet af iNEXT-Discovery (Grant 871037) finansieret af Europa-Kommissionens Horizon 2020-program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DSI-poised library Enamine DSI-896 fragment library
Echo 550 and 650 series Beckman-Coulter acoustic dispensing system
Echo microplates Beckman-Coulter 001-12380; 001-8768; 001-6025 1536-well and 384-well microplates
Shifter Oxford Lab Technology harvesting device
Microplate centrifuge with a swing-out rotor Sigma model 11121 microplate centrifuge
3-drops crystallisation plates Swissci 3W96T-UVP Crystallisation plates
Formulatrix plate imager and Rockmaker software Formulatrix Crystallisation plates imaging device

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erlanson, D. A., Fesik, S. W., Hubbard, R. E., Jahnke, W., Jhoti, H. Twenty years on: The impact of fragments on drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 605-619 (2016).
  2. Jacquemard, C., Kellenberger, E. A bright future for fragment-based drug discovery: what does it hold. Expert Opinion on Drug Discovery. 14 (5), 413-416 (2019).
  3. Jahnke, W., et al. Fragment-to-lead medicinal chemistry publications in 2019. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (24), 15494-15507 (2019).
  4. Li, Q. Application of fragment-based drug discovery to versatile targets. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 180 (2020).
  5. Kirsch, P., Hartman, A. M., Hirsch, A. K. H., Empting, M. Concepts and core principles of fragment-based drug design. Molecules. 24 (23), Basel, Switzerland. 4309 (2019).
  6. Patel, D., Bauman, J. D., Arnold, E. Advantages of crystallographic fragment screening: functional and mechanistic insights from a powerful platform for efficient drug discovery. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 116 (2-3), 92-100 (2014).
  7. Wasserman, S., et al. Automated synchrotron crystallography for drug discovery: the LRL-CAT beamline at the APS. Acta Crystallographica Section A Foundations of Crystallography. 67 (1), 46-47 (2011).
  8. Hartshorn, M. J. Fragment-based lead discovery using X-ray crystallography. Journal of Medicinal Chemistry. 48 (2), 403-413 (2005).
  9. Arzt, S., et al. Automation of macromolecular crystallography beamlines. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 89 (2), 124-152 (2005).
  10. Beteva, A. High-throughput sample handling and data collection at synchrotrons: Embedding the ESRF into the high-throughput gene-to-structure pipeline. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 62, Pt 10 1162-1169 (2006).
  11. Papp, G., et al. FlexED8: The first member of a fast and flexible sample-changer family for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 10 841-851 (2017).
  12. Casanas, A., et al. EIGER detector: Application in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D, Structural Biology. 72, Pt 9 1036-1048 (2016).
  13. Henrich, B., et al. PILATUS: A single photon counting pixel detector for X-ray applications. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 607 (1), 247-249 (2009).
  14. Winter, G., Lobley, C. M. C., Prince, S. M. Decision making in xia2. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 69, Pt 7 1260-1273 (2013).
  15. Winter, G., McAuley, K. E. Automated data collection for macromolecular crystallography. Methods. 55 (1), 81-93 (2011).
  16. Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D, Structural Biology. 74, Pt 2 85-97 (2018).
  17. Bowler, M. W. MASSIF-1: A beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
  18. Von Stetten, D., et al. ID30A-3 (MASSIF-3) - A beamline for macromolecular crystallography at the ESRF with a small intense beam. Journal of Synchrotron Radiation. 27, Pt 3 844-851 (2020).
  19. Cipriani, F., et al. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 68, Pt 10 1393-1399 (2012).
  20. Helmholtz Zentrum Berlin. , Available from: https://www.helmholtzberlin.de/forschung/oe/np/gmx/fragment-screening/index_en.html (2021).
  21. Lima, G. M. A., et al. FragMAX: the fragment-screening platform at the MAX IV Laboratory. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 76 (8), 771-777 (2020).
  22. Ng, J. T., Dekker, C., Kroemer, M., Osborne, M., Von Delft, F. Using textons to rank crystallization droplets by the likely presence of crystals. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 70, Pt 10 2702-2718 (2014).
  23. Collins, P. M., et al. Gentle, fast and effective crystal soaking by acoustic dispensing. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 3 246-255 (2017).
  24. Wright, N. D., et al. The low-cost Shifter microscope stage transforms the speed and robustness of protein crystal harvesting. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 77, Pt 1 62-74 (2021).
  25. Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein-ligand structure determination. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 3 267-278 (2017).
  26. Pearce, N. M., et al. A multi-crystal method for extracting obscured crystallographic states from conventionally uninterpretable electron density. Nature Communications. 8, 15123 (2017).
  27. Fragalysis. , Available from: https://fragalysis.diamond.ac.uk (2021).
  28. Diamond Light Source Ltd. , Available from: https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Fragment-Screening.html (2021).
  29. Cox, O. B., et al. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7 (3), 2322-2330 (2016).
  30. Vonrhein, C., et al. Data processing and analysis with the autoPROC toolbox. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 67, Pt 4 293-302 (2011).
  31. Vonrhein, C., et al. Advances in automated data analysis and processing within autoPROC , combined with improved characterisation, mitigation and visualisation of the anisotropy of diffraction limits using STARANISO. Acta Crystallographica Section A: Foundations and Advances. 74 (1), 360 (2018).
  32. Pearce, N. M., Krojer, T., Von Delft, F. Proper modelling of ligand binding requires an ensemble of bound and unbound states. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 3 265-266 (2017).
  33. Collins, P. M., et al. Achieving a good crystal system for crystallographic x-ray fragment screening. Methods in Enzymology. 610, 251-264 (2018).
  34. Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
  35. Fisher, S. J., Levik, K. E., Williams, M. A., Ashton, A. W., McAuley, K. E. SynchWeb: a modern interface for ISPyB. Journal of Applied Crystallography. 48, Pt 3 927-932 (2015).
  36. Ginn, H. M., et al. SynchLink: an iOS app for ISPyB. Journal of Applied Crystallography. 47, Pt 5 1781-1783 (2014).
  37. Diamond Light Source Ltd. , Available from: https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Common/Common-Manual/Data-Analysis/Reprocessing-in-ISPyB.html (2021).
  38. Wojdyr, M., Keegan, R., Winter, G., Ashton, A. DIMPLE - a pipeline for the rapid generation of difference maps from protein crystals with putatively bound ligands. Acta Crystallographica. Section A, Foundations of Crystallography. 69, 299 (2013).
  39. Global Phasing Limited. , Available from: http://www.globalphasing.com (2021).
  40. Long, F., et al. AceDRG: A stereochemical description generator for ligands. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 3 112-122 (2017).
  41. Moriarty, N. W., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Electronic ligand builder and optimization workbench (eLBOW): A tool for ligand coordinate and restraint generation. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 65, Pt 10 1074-1080 (2009).
  42. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).
  43. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 53, Pt 3 240-255 (1997).
  44. Bricogne, G., et al. Buster version 2.10.3. Global Phasing Ltd. , Cambridge, United Kingdom. (2017).
  45. Chen, V. B., et al. MolProbity: All-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66, Pt 1 12-21 (2010).
  46. Bruno, I. J., et al. Retrieval of crystallographically-derived molecular geometry information. Journal of Chemical Information and Computer Sciences. 44 (6), 2133-2144 (2004).
  47. Delbart, F., et al. An allosteric binding site of the α7 nicotinic acetylcholine receptor revealed in a humanized acetylcholine-binding protein. TheJournal of Biological Chemistry. 293, 2534-2545 (2018).
  48. Douangamath, A., et al. Crystallographic and electrophilic fragment screening of the SARS-CoV-2 main protease. Nature Communications. 11 (1), 5047 (2020).
  49. Guo, J., et al. In crystallo-screening for discovery of human norovirus 3C-like protease inhibitors. Journal of Structural Biology: X. 4, 100031 (2020).
  50. Keedy, D. A., et al. An expanded allosteric network in PTP1B by multitemperature crystallography, fragment screening, and covalent tethering. eLife. 7, 36307 (2018).
  51. McIntyre, P. J., et al. Characterization of three druggable hot-spots in the aurora-a/tpx2 interaction using biochemical, biophysical, and fragment-based approaches. ACS Chemical Biology. 12 (11), 2906-2914 (2017).
  52. Thomas, S. E., et al. Structure-guided fragmentbased drug discovery at the synchrotron: Screening binding sites and correlations with hotspot mapping. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 377 (2147), 20180422 (2019).
  53. Nichols, C., et al. Mining the PDB for tractable cases where x-ray crystallography combined with fragment screens can be used to systematically design protein-protein inhibitors: Two test cases illustrated by IL1β-IL1R and p38α-TAB1 complexes. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (14), 7559-7568 (2020).
  54. D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned. Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, Pt 9 1117-1126 (2014).
  55. Wollenhaupt, J., et al. F2X-Universal and F2X-Entry: Structurally diverse compound libraries for crystallographic fragment screening. Structure. 28 (6), 694-706 (2020).
  56. Zenodo. , Available from: https://zenodo.org (2021).
  57. Foley, D. J., et al. Synthesis and demonstration of the biological relevance of sp(3) -rich scaffolds distantly related to natural product frameworks. Chemistry. 23 (60), Weinheim an der Bergstrasse. Germany. 15227-15232 (2017).
  58. Kidd, S. L., et al. Demonstration of the utility of DOS-derived fragment libraries for rapid hit derivatisation in a multidirectional fashion. Chemical Science. 11 (39), 10792-10801 (2020).
  59. EU-openscreen ERIC. , Available from: https://www.eu-openscreen.eu/ (2021).
  60. Schuller, M., et al. Fragment binding to the Nsp3 macrodomain of SARS-CoV-2 identified through crystallographic screening and computational docking. bioRxiv. 393405, (2020).

Tags

Effektiv fragmentscreening XChem-facilitet diamantlyskilde fragmentbaseret lægemiddelopdagelse proteinkrystallografi primær skærm indledende XChem-eksperimenter prøveforberedelse fragmentbibliotek I04-1 strålelinje dataindsamling datastyring hitidentifikation storskala krystallografisk fragmentscreening akademiske og industrielle brugere peer-reviewed akademisk brugerprogram
Opnåelse af effektiv fragmentscreening på XChem-facilitet ved Diamond Light Source
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Douangamath, A., Powell, A., Fearon, … More

Douangamath, A., Powell, A., Fearon, D., Collins, P. M., Talon, R., Krojer, T., Skyner, R., Brandao-Neto, J., Dunnett, L., Dias, A., Aimon, A., Pearce, N. M., Wild, C., Gorrie-Stone, T., von Delft, F. Achieving Efficient Fragment Screening at XChem Facility at Diamond Light Source. J. Vis. Exp. (171), e62414, doi:10.3791/62414 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter