Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Uppnå effektiv fragmentscreening vid XChem-anläggningen vid Diamond Light Source

Published: May 29, 2021 doi: 10.3791/62414
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1,2, 1,2, 1,2,3, 3,4, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3, 1,3, 3,5, 1, 1,2,3,4,6
1Diamond Light Source Ltd, Harwell Science and Innovation Campus, 2Research Complex at Harwell, Harwell Science and Innovation Campus, 3Structural Genomics Consortium, University of Oxford, 4Centre for Medicines Discovery, University of Oxford, 5Oxford Protein Informatics Group, Department of Statistics, Oxford University, 6Department of Biochemistry, University of Johannesburg
* These authors contributed equally

Summary

Detta dokument beskriver hela XChem-processen för kristallbaserad fragmentscreening, från ansökan om åtkomst och alla efterföljande steg till dataspridning.

Abstract

Vid fragmentbaserad läkemedelsutveckling testas hundratals eller ofta tusentals föreningar mindre än ~300 Da mot det protein som är av intresse för att identifiera kemiska enheter som kan utvecklas till potenta läkemedelskandidater. Eftersom föreningarna är små är interaktionerna svaga, och screeningmetoden måste därför vara mycket känslig. Dessutom tenderar strukturell information att vara avgörande för att utarbeta dessa träffar till blyliknande föreningar. Därför har proteinkristallografi alltid varit en gyllene standardteknik, men historiskt sett för utmanande för att hitta utbredd användning som primär skärm.

De första XChem-experimenten demonstrerades 2014 och testades sedan med akademiska och industriella samarbetspartners för att validera processen. Sedan dess har en stor forskningsinsats och betydande stråltid effektiviserat provberedningen, utvecklat ett fragmentbibliotek med snabba uppföljningsmöjligheter, automatiserat och förbättrat I04-1-strålrörets kapacitet för obevakad datainsamling och implementerat nya verktyg för datahantering, analys och träffidentifiering.

XChem är nu en anläggning för storskalig kristallografisk fragmentscreening, som stöder hela kristall-till-deponeringsprocessen, och är tillgänglig för akademiska och industriella användare över hela världen. Det referentgranskade akademiska användarprogrammet har utvecklats aktivt sedan 2016 för att rymma projekt från en så bred vetenskaplig omfattning som möjligt, inklusive välvaliderade såväl som utforskande projekt. Akademisk tillgång tilldelas genom halvårsvisa utlysningar för peer-reviewed förslag, och eget arbete arrangeras av Diamonds Industrial Liaison-grupp. Detta arbetsflöde har redan rutinmässigt tillämpats på över hundra mål från olika terapeutiska områden och identifierar effektivt svaga bindemedel (1%-30% träfffrekvens), som både fungerar som högkvalitativa utgångspunkter för substansdesign och ger omfattande strukturell information om bindningsställen. Processens motståndskraft visades genom fortsatt screening av SARS-CoV-2-mål under covid-19-pandemin, inklusive en 3-veckors handläggningstid för huvudproteaset.

Introduction

Fragment-Based Drug Discovery (FBDD) är en allmänt använd strategi för lead discovery, och sedan dess uppkomst för 25 år sedan har den levererat fyra läkemedel för klinisk användning och mer än 40 molekyler har avancerat till kliniska prövningar 1,2,3. Fragment är små kemiska enheter, vanligtvis med en molekylvikt på 300 Da eller mindre. De är utvalda för sin låga kemiska komplexitet, vilket ger goda utgångspunkter för utveckling av högligandeffektiva hämmare med utmärkta fysikalisk-kemiska egenskaper. Deras storlek innebär att de tar prover på proteiners bindningslandskap mer noggrant än bibliotek av större läkemedels- eller blyliknande föreningar, och därmed också avslöjar hot spots och förmodade allosteriska platser. I kombination med strukturell information ger fragment en detaljerad karta över de potentiella molekylära interaktionerna mellan protein och ligand. För att på ett tillförlitligt sätt detektera och validera de enheter som tenderar att binda svagt till målproteinet krävs dock en rad robusta och känsliga biofysiska screeningmetoder såsom ytplasmonresonans (SPR), kärnmagnetisk resonans (NMR) eller isotermisk titreringskalorimetri (ITC)4,5.

Röntgenkristallografi är en viktig del av FBDD-verktygslådan: den är tillräckligt känslig för att identifiera svaga bindemedel och ger direkt strukturell information om interaktionerna på molekylär nivå. Det är ett komplement till andra biofysikskärmar och vanligtvis nödvändigt för att utveckla fragmentträffar till ledande föreningar; det kräver kristallsystem av hög kvalitet, vilket innebär att kristallisation är mycket reproducerbar, och kristaller diffrakterar idealiskt till bättre än 2,8 Å upplösning.

Historiskt sett har det varit mycket svårt att använda kristallografi som primär fragmentskärm 6,7,8, vare sig inom akademin eller inom industrin. Däremot uppnådde synkrotroner storleksordningsförbättringar inom robotik, automatisering 9,10,11 och detektorteknik 12,13, och i kombination med lika accelererad datorkraft och algoritmer för databehandling14,15,16 kan kompletta diffraktionsdatauppsättningar mätas på några sekunder och ett stort antal av dem helt obevakade, vilket var banbrytande vid LillyCAT7 och senare MASSIF17,18 (European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)). Detta ledde till att synkrotroner utvecklade mycket strömlinjeformade plattformar för att göra kristallbaserad fragmentscreening som primär skärm tillgänglig för en bred användargrupp (XChem at Diamond; CrystalDirect på EMBL/ESRF19; BESSY på Helmholtz-Zentrum Berlin20; FragMax vid MaxIV21).

Denna artikel dokumenterar de protokoll som utgör XChem-plattformen för fragmentscreening med röntgenkristallografi, från provberedning till de slutliga strukturella resultaten av 3D-modellerade träffar. Pipelinen (figur 1) krävde utveckling av nya metoder för kristallidentifiering 22, blötläggning 23 och skörd 24, samt programvara för datahantering25 och ett algoritmiskt tillvägagångssätt för att identifiera fragment 26 som nu används i stor utsträckning i samhället. Kristallskördstekniken säljs nu av en leverantör (se Materialförteckning), och den öppna tillgängligheten av verktygen har gjort det möjligt för andra synkrotroner att anpassa dem för att sätta upp likvärdiga plattformar21. Pågående projekt handlar om dataanalys, modellkomplettering och dataspridning genom Fragalysis platform27. Provberedningslaboratoriet ligger i anslutning till strålröret I04-1, vilket förenklar logistiken för att överföra hundratals frysta prover till strålröret och dedikerad stråltid på I04-1 möjliggör snabb röntgenåterkoppling för att vägleda kampanjen.

XChem är en integrerad del av Diamonds användarprogram, med två utlysningar per år (början av april och oktober). Peer review-processen har förfinats i samråd med experter inom läkemedelsutveckling från akademi och industri. Tillsammans med ett starkt vetenskapligt argument kräver förslagsprocessen28 att sökande inte bara själva bedömer kristallsystemets beredskap, utan också sin expertis inom biokemiska och ortogonala biofysiska metoder och kapacitet att utveckla screeningträffar genom uppföljande kemi. Åtkomstsätten har också utvecklats för att tillgodose den tvärvetenskapliga användargruppen:

Nivå 1 (enskilt projekt) är för projekt i det förberedande skedet och hitvalideringsverktyg (biofysik eller biokemiska verktyg) och uppföljningsstrategier behöver inte finnas. Om projektet accepteras beviljas ett reducerat antal stråltidsförskjutningar, tillräckligt för att bevisa konceptet.

Nivå 2 (enskilt projekt) är för välvaliderade projekt och kräver att verktyg och uppföljningsstrategier finns på plats. Om projektet accepteras tilldelas det tillräckligt med stråltid för en fullständig fragmentscreeningskampanj. Enskilda projekt (nivå 1 eller nivå 2) ska slutföras inom de sex månaderna av tilldelningsperioden (antingen april till september eller oktober till mars).

Block Allocation Group (BAG) är för ett konsortium av grupper och projekt, där en robust process för val och prioritering av mål finns på plats inom BAG, tillsammans med en tydlig uppföljningspipeline. BAGs måste ha minst en fullt XChem-utbildad expert (superuser), som samordnar deras aktiviteter med Diamonds personal och utbildar BAG-medlemmarna. Det tilldelade antalet stråltidsförskjutningar definieras av antalet vetenskapligt starka projekt i BAG och omvärderas per tilldelningsperiod baserat på BAG:s rapport. Tillträdet gäller i 2 år.

XChem-experimentet är uppdelat i tre steg, med en beslutspunkt för var och en av dem: lösningsmedelstoleranstest, förscreening och huvudskärm (figur 2). Lösningsmedelstoleranstestet hjälper till att definiera blötläggningsparametrarna, mängden lösningsmedel (DMSO, etylenglykol eller andra kryoprotektiva medel om det behövs) som kristallsystemet tål och hur länge. Lösningsmedelskoncentrationerna varierar vanligtvis från 5%-30% över minst två tidpunkter. Diffraktionsdata samlas in och jämförs med kristallsystemets basdiffraktion; Detta kommer att bestämma blötläggningsparametrarna för följande steg. För förscreeningen blötläggs 100-150 föreningar med de förhållanden som bestäms i lösningsmedelstestet, och dess syfte är att bekräfta att kristallerna tål föreningarna under dessa förhållanden. Vid behov tillsätts kryoprotektionsmedlet till de droppar som redan innehåller fragmenten. Framgångskriterierna är att 80 % eller mer av kristallerna överlever tillräckligt bra för att ge diffraktionsdata av god och jämn kvalitet; Om detta misslyckas revideras blötläggningsförhållandena vanligtvis genom att ändra blötläggningstiden eller lösningsmedelskoncentrationen. Efter en lyckad förscreening kan resten av de föreningar som valts för experimentet ställas in med hjälp av de slutliga parametrarna.

Det DSI-förberedda biblioteket (se Materialförteckning) utformades avsiktligt för att möjliggöra snabb uppföljning med hjälp av balanserad kemi29 och har varit anläggningens arbetshästbibliotek. Den är tillgänglig för användare vid en koncentration av 500 mM i DMSO. Akademiska användare kan också få tillgång till andra bibliotek som tillhandahålls av samarbetspartners (över 2 000 föreningar totalt) vid koncentrationer på 100-500 mM i DMSO (en fullständig lista finns på webbplatsen28). En stor del av den totala kollektionen finns också i etylenglykol, för kristallsystem som inte tål DMSO. Användare kan också ta med sina egna bibliotek, förutsatt att de är i plattor som är kompatibla med det akustiska vätskehanteringssystemet (se materialförteckning).

För alla tre stegen i experimentet (lösningsmedelskarakterisering, förscreening eller helskärm) är följande provberedningsprocedurer identiska (figur 3): val av dispenseringsplats för föreningar genom avbildning och inriktning av kristallisationsdroppar med TeXRank22; Dosering i droppar med hjälp av det akustiska vätskedispenseringssystemet för både lösningsmedel och föreningar23; effektiv skörd av kristallerna med hjälp av Crystal shifter24; och uppladdning av exempelinformation till strålrörsdatabasen (ISPyB). Det nuvarande gränssnittet för experimentdesign och exekvering är en Excel-baserad applikation (SoakDB), som genererar nödvändiga indatafiler för plattformens olika utrustningar och spårar och registrerar alla resultat i en SQLite-databas. Streckkodsläsare används i olika skeden av processen för att spåra prover och dessa data läggs till i databasen.

Diffraktionsdata samlas in i obevakat läge med dedikerad stråltid på strålröret I04-1. Två centreringslägen är tillgängliga, nämligen optisk och röntgenbaserad17. För nål- och stavformade kristaller rekommenderas röntgencentrering, medan tjockare kristaller i allmänhet stöder optiskt läge, vilket är snabbare och därför gör det möjligt att samla in fler prover under den tilldelade stråltiden. Beroende på kristallernas upplösning (som etableras innan de går in på plattformen) kan datainsamlingen antingen vara 60 s eller 15 s total exponering. Datainsamling under lösningsmedelsteststeget informerar vanligtvis vilken kombination som fungerar bäst med strålrörets prestanda I04-1.

Den stora mängden dataanalys hanteras via XChemExplorer (XCE)25, som också kan användas för att starta träffidentifieringssteget med hjälp av PanDDA26. XCE är ett datahanterings- och arbetsflödesverktyg som stöder storskalig analys av protein-ligandstrukturer (figur 4); den läser alla resultat från automatisk bearbetning från data som samlats in vid Diamond Light Source (DIALS16, Xia214, AutoPROC30 och STARANISO31) och väljer automatiskt ett av resultaten baserat på datakvalitet och likhet med en referensmodell. Det är viktigt att modellen är representativ för det kristallsystem som används för XChem-screening och måste inkludera allt vatten eller andra lösningsmedelsmolekyler, såväl som alla co-faktorer, ligander och alternativa konformationer som är synliga i kristaller indränkta med endast lösningsmedel. Kvaliteten på denna referensmodell kommer direkt att påverka mängden arbete som krävs under modellbyggnads- och förfiningsfasen. PanDDA används för att analysera all data och identifiera bindningsplatser. Den anpassar strukturer till en referensstruktur, beräknar de statistiska kartorna, identifierar händelser och beräknar händelsekartor26,32. I PanDDA-paradigmet är det varken nödvändigt eller önskvärt att bygga den fullständiga kristallografiska modellen; Det som måste modelleras är bara bilden av proteinet där ett fragment är bundet (bound-state-modellen), så fokus behöver bara ligga på att bygga liganden och omgivande rester/lösningsmedelsmolekyler enligt händelsekartan32.

Protocol

1. Inlämning av projektförslag

  1. Förslagets innehåll: eftersom XChem-programmet är övertecknat är noggrann och fullständig information i förslaget avgörande för att klara peer-review.
    1. Argumentera för din sak! Presentera målets betydelse och sätt det i ett större sammanhang.
      1. Formulera strategin efter fragmentscreeningskampanjen: de ortogonala metoder som finns på plats för att validera träffarna och hur de ska gå vidare. Rada upp samarbetena om det behövs.
      2. På grund av den intensiva labb- och dataanalysdelen rekommenderas det starkt att tilldela en erfaren kristallograf i förväg.
      3. Ett robust kristallsystem är nyckeln till att eliminera teknisk variation och användare bör ta itu med dessa viktiga punkter.
        1. Se till att kristallisationsförhållandena ger reproducerbara droppar med kristaller av liknande diffraktionskvalitet i plattor som är lämpliga för användning på plattformen med en reservoarvolym på 30 μL (eller mindre) och en droppstorlek mellan 200-500 nL. Helst ska mer än 50 % av dropparna i en platta ha kristaller med en storlekpå minst 35 μm 33.
        2. Säkerställ konsekvent diffraktionskvalitet för kristaller (2.6 Å eller bättre).
        3. Kontrollera kristallsystemets lämplighet för fragmentscreening, inklusive kristallpackning och tillgänglighet till kända platser. Tidigare bevis på att en molekyl är bunden på dessa platser är ofta betryggande.

2. Förberedelser inför besöket

  1. Överföring av kristallisationsprotokoll för kristallisation på plats.
    1. Tillhandahåll 2 x 50 ml reservoarlösning, redo att användas.
    2. Tillhandahåll proteinlösningen i den koncentration som krävs för kristallisation, färdig att användas i alikvoter på 30-50 μL.
    3. Tillsätt 10 ml av proteinbuffertlösningen.
    4. Tillhandahåll frömaterial (även om det inte behövs i kristallisationsprotokollet).
      OBS: Sådd gynnar kristallisationens reproducerbarhet och påskyndar kärnbildningstiden33.
    5. Fyll i formuläret för kristalliseringsinformation som finns på XChem webwebbplats28.
    6. Ange lagringsinformationen i leveransformuläret som finns på XChems webbplats28.
  2. Installera NoMachine och konfigurera ett fjärrskrivbord till Diamond (https://www.diamond.ac.uk/Users/Experiment-at-Diamond/IT-User-Guide/Not-at-DLS/Nomachine.html).
  3. Generera och överföra en bra referensmodell, i samråd med en expert kristallograf eller XChem supportpersonal.

3. Experiment med fragmentscreening

  1. Definiera dispenseringsplatsen för föreningen.
    1. Avbildande kristallisationsplattor.
      1. Avbilda alla kristallplattor (se Materialtabell) som krävs för experimentet i kristallplattans avbildare (se Materialtabell). Med hjälp av imager-programvaran genererar du plåtnamn i rätt katalog för plåttypen i följande format Förslag Number_Plate Nummer.
      2. Skriv ut streckkoderna (högerklicka på plattans namn och välj från menyn), placera dem på motsatt sida av plattan från radbokstäverna, sätt in plattan/plattorna i lastporten med streckkoden vänd bort från användaren.
      3. Använd programvaran för kontroll av bilder, skanna laddningsporten, högerklicka på plåtar och välj sedan Bildplåtar.
      4. När avbildningen är klar tar du bort plattorna från kameran.
    2. Att välja kristaller och sammansatt plats
      OBS: Bilderna av kristallisationsdropparna bearbetas i Luigi-pipelinen med hjälp av TexRanks textons-baserade algoritm Ranker för att rangordna dropparna efter den troliga närvaron av kristaller22. Detta tar ca 10 min och bilderna kommer då att finnas tillgängliga i TexRank.
      1. Öppna TeXRank från en PC och välj kristallbrickan antingen från listan längst ner till höger eller genom att skriva streckkoden i rutan längst upp till vänster.
      2. Välj rätt bildformat och vyn med en brunn. Rör dig genom droppbilderna och när det finns en kristall som är lämplig att använda i ett experiment, högerklicka bort från kristallen men inuti droppen - målet är att rikta in sig på var i droppen för att tillsätta lösningsmedel/föreningar, så vill inte direkt träffa kristallen23.
      3. Fortsätt genom hela plattan och när du är klar väljer du Echo 1 Target-knappen ; Spara i Crystal Targets-katalogen under det relevanta besöket. Ändra inte filnamnet.
      4. Upprepa för eventuella ytterligare plattor.
  2. Dispensering av föreningar
    1. Generera filer för dispensering av sammansatta produkter
      1. I SoakDB anger du biblioteksval eller lösningsmedelsinformation i biblioteks-/lösningsmedelstabellen.
      2. Ange droppvolym och belastning i listan över målkristaller.
      3. Generera de batchar som krävs.
      4. Ange blötläggningsparametrarna. Klicka på Beräkna och sedan på knappen Exportera väntar . För lösningsmedel, tillsätt de olika koncentrationerna i tabellen. Detta genererar filerna för användning i den akustiska dispensern.
      5. Om du använder kryoprotektivt medel, ange koncentrationen och skapa filerna på samma sätt.
    2. Dispenseringslösningar med den akustiska dispensern (se materialförteckning)
      1. Ta strålskyddsplattan (föreningar eller lösningsmedel/kryoskyddsmedel) och snurra plattan i centrifugen i 2 minuter vid 1 000 x g.
      2. Vid dosering av lösningsmedel eller kryoskyddsmedel, pipettera 30 μL i den relevanta brunnen på en 384PP-platta; Täck med en mikrotätningsfilm och centrifugera sedan enligt ovan.
      3. Öppna programvaran; välj Ny och välj rätt källbrunnsplatta (384PP, 384LDV eller 1536LDV) och vätskeklass (DMSO, CP, BP eller GP). Se till att rätt plåttyp är vald som destinationsplatta. Markera sedan rutan Anpassad och fortsätt.
      4. Välj Importera och välj relevant batchfil. Slutför importstegen som uppmanas av programvaran.
      5. Använd plattkartorna för att kontrollera lösningen som ska dispenseras och destinationsplatserna.
      6. Kör protokollet och följ anvisningarna när de dyker upp. Lösningen/lösningarna från källplattan kommer att matas ut i de valda kristalldropparna.
      7. Förvara plattan i inkubatorn under önskad tid.
        OBS: Dessa parametrar bestäms i lösningsmedelskarakteriseringssteget, temperaturen kommer att vara antingen 4 °C eller 20 °C beroende på kristallens tillväxttemperatur och tiderna är vanligtvis mellan 1 h och 3 h.
  3. Skörda kristaller med hjälp av den halvautomatiska kristallskördsanordningen (se Tabell över material).
    OBS: Om kryoskydd krävs, upprepa steg 3.2.2 för tillsats av kryoskyddande lösningar på kristalldropparna innan proverna skördas.
    1. Förberedelse för skörd
      1. Förbered de filer som krävs för insamling i SoakDB. När du tillfrågas, bekräfta att blötläggningarna är klara och att satserna är klara.
      2. Skanna ut antalet puckar som krävs för experimentet under rätt förslagsnummer.
      3. Välj en bricka med öglor av lämplig storlek för kristallerna (35 μm, 75 μm eller 150 μm). Det är viktigt att välja en slingstorlek som matchar kristallens storlek så nära som möjligt för att möjliggöra den automatiska centreringen på strålröret för att bli mer exakt, förbättra datakvaliteten genom att minska bakgrunden och för att eliminera behovet av kryoskyddsmedel.
      4. Öppna relevant programvara och öppna fliken Arbetsflöde.
      5. Skanna puckarna i programvaran och bläddra tillbaka till toppen av listan och markera den första pucken.
      6. Placera puckarna i en skumdewar och kyl ner dem med flytande kväve.
      7. Välj Importera fil från SoakDB och välj den batch som ska skördas. Kontrollera om partiet är tilldelat till den vänstra hållaren. En arbetslista visas.
      8. Ta kristallplattan, ta bort tätningen och sätt i den vänstra hållaren; Flytta plattan till parkeringsläget.
    2. Skörda kristaller
      1. Gör det bekvämt för dig och tryck på knappen Starta arbetsflöde (skärmen är en pekskärm) för att flytta till den första valda brunnspositionen.
      2. Om kristallen har överlevt, montera kristallen i öglan och dyk ner i det flytande kvävet och placera den i position 1 i den första pucken i listan.
      3. Välj lämplig beskrivning för kristallen från gränssnittet (normal, smält, sprucken, gelé eller färgad).
      4. Om droppen är en sammansatt blötläggning, registrera beskrivningen av föreningstillståndet (klart, kristallint, utfällt, dålig dispensering eller fasseparation).
      5. Om kristallen har monterats väljer du Monterad , annars väljer du Fail.
      6. Plattan flyttas till nästa valda brunn. Fyll alla puckpositioner i följd (lämna inte en lucka om en kristall har misslyckats). Fortsätt till slutet av arbetsflödet.
      7. I slutet av arbetsflödet laddar du eventuella ytterligare batchar och fortsätter att fylla puckarna i ordning. Det finns ingen anledning att starta en ny puck för en ny omgång.
    3. Streckkodsspårning av skörderesultaten
      1. När alla kristaller har skördats, ta puckarna till streckkodsläsaren, placera en i taget i hållaren för att skanna pucken och nåla fast streckkoder.
      2. När detta är klart, sätt locken på puckarna och förvara i en förvaringsdewar.
      3. Läs in utdatafilen i SoakDB-gränssnittet.
    4. Registrera exempelinformation i ISPyB34,35,36
      1. Ladda upp exempeldata till ISPyB
        1. I SoakDB uppdaterar du strålröret genom att besöka Uppdatera för ISPyB och klicka på Exportera för att skapa filen som ska laddas upp till ISPyB.
        2. Öppet kitt. Logga in och bläddra till följande katalog: dls/labxchem/data/year/lbXXXX-1/processing/lab36/ispyb.
        3. Kör skriptet csv2ispyb (csv2ispyb lbXXXX-1-date.csv)
          Exemplen läses nu in i ISPyB.
      2. Registrera puckens placering och datainsamlingsstrategi.
        1. Anteckna detaljerna och placeringen av puckarna
          OBS: Det är viktigt att registrera detaljerna och placeringen av puckarna så att de kan lokaliseras och lastas på strålröret.
          1. I SoakDB öppnar du den andra fliken märkt Puckar.
          2. Fyll i uppgifterna i rutorna längst upp. Specifikt placering av puckar (lagringsdewar och käppar), datainsamlingsparametrar, inklusive förväntad upplösning och förslagsnummer.
          3. Klicka på knappen Spara så visas en lista över alla puckar i tabellen. Kopiera de nyligen fyllda puckarna.
          4. Öppna XChem-kökalkylbladet (genväg på skrivbordet) och klistra in informationen. Fyll i eventuell ytterligare relevant information.

4. Insamling av uppgifter

OBS: Data samlas in i ett obevakat läge och hanteras av XChem/strålrörsteamet.

  1. Minns felcentrerade prover.
    OBS: Dessa krävs när det har varit problem med datainsamlingen för vissa samples, troligen orsakade av att stiften inte har centrerats korrekt.
    1. Titta på provväxlarvyn i ISPyB, välj Rangordna efter AP för att gradera exemplen efter automatiskt bearbetad upplösning i en färggradering från grönt till rött.
    2. Klicka på proverna för att kontrollera om det finns några röda eller gula prover.
      OBS: Detta kommer att ta upp datainsamlingen.
    3. Kontrollera kristallögonblicksbilderna för att se om kristallen har centrerats.
    4. Anteckna alla de som inte har centrerat och skicka till den lokala kontakten som kommer att komma ihåg de saknade proverna.

5. Analys av data

  1. Hämta och analysera Diamonds resultat för automatisk bearbetning via XChemExplorer (XCE)25.
    1. I en terminal, gå till undermappen Processing: cd /dls/labxchem/data/year/visit/processing eller för XChem BAGs: cd /dls/labxchem/data/year/visit/processing/project/processing/.
    2. Använd aliaset xce för att öppna XChemExplorer.
    3. Välj knappen Uppdatera tabeller från datakälla .
    4. Under fliken Översikt finns en sammanfattning av experimentella data. Lägg till ytterligare kategorier med alternativet Välj kolumner att visa på menyn Datakälla .
    5. Under fliken Inställningar väljer du datainsamlingskatalogen (/dls/i04-1/data/year/visit/).
    6. Öppna fliken Datauppsättningar, välj målet från rullgardinsmenyn Välj mål, välj Get Nya resultat från automatisk bearbetning från Datauppsättningar rullgardinsmenyn och klicka på Kör.
      XCE kommer nu att analysera datainsamlingsbesöket för resultat av automatisk bearbetning. Detta kan ta lite tid första gången den körs, beroende på antalet datauppsättningar/kataloger som parsas.
    7. Kontrollera konsekvens och kvalitet på data genom att kontrollera upplösning, blankstegsgrupp och Rmerge. Uteslut data med lägre upplösning än 2,8 Å.
      Som standard baseras valet av datauppsättning på en poäng som beräknas utifrån I/sigI, fullständighet och antal unika reflektioner, men andra bearbetningsresultat kan väljas för användning25.
    8. Om du vill välja ett annat bearbetningsresultat för enskilda datauppsättningar klickar du på Exempel-ID och väljer önskat program/körning. Om du vill ändra bearbetningsförloppet för alla datauppsättningar väljer du Redigera inställningar på menyn Inställningar och ändrar Mekanism för val av datauppsättning.
    9. Om det behövs kan du bearbeta data igen via ISPyB37.
    10. Om inga bearbetade data för ett exempel är acceptabla anger du det som Det gick inte att undanta från vidare analys.
    11. När du är klar klickar du på Uppdatera tabeller från datakälla för att lägga till data i efterföljande tabeller.
  2. Beräkna initiala kartor med DIMPLE38.
    1. Öppna fliken Kartor , välj referensmodellen i listrutan och välj önskade datauppsättningar följt av Kör DIMPLE på valda MTZ-filer.
    2. XCE kör flera DIMPLE-jobb samtidigt på klustret på Diamond. Hitta status för dessa jobb under kolumnen Dimple Status och uppdatera med knappen Uppdatera tabeller från datakälla eller med kommandot qstat i Linux.
    3. När du är klar kontrollerar du om värdena Dimple Rcryst, Dimple Rfree och Space Group är acceptabla. Om det behövs (hög Rfree/fel blankstegsgrupp/stor skillnad i enhetscellvolym) ändrar du resultatet för automatisk bearbetning enligt beskrivningen tidigare och upprepar kartgenereringen för dessa datauppsättningar.
  3. Generera ligandbegränsningar med hjälp av grad39, AceDRG40 eller phenix.eLBOW41.
    1. Välj önskat program (Inställningar, Redigera inställningar, Begränsningsgenereringsprogram) och välj sedan datauppsättningar under fliken Kartor följt av att köra Skapa CIF/PDB/PNG-fil med VALDA föreningar från rullgardinsmenyn Kartor och begränsningar.
    2. Uppdatera statusen för dessa jobb som finns under kolumnen Sammansatt status med hjälp av knappen Uppdatera tabeller från datakälla .
  4. Skapa grundtillståndsmodellen (före körning)
    OBS: Termen grundtillståndsmodell representerar proteinets struktur i dess ligandfria form, som observerats i 100 datauppsättningar (detta antal väljs godtyckligt). Eftersom grundtillståndsmodellen används som referens för att bygga ligandbundet tillstånd är det viktigt att bygga en korrekt grundtillståndsmodell, inklusive alla lösningsmedels- och vattenmolekyler, före analysen av hela fragmentscreeningskampanjen. I det här steget används de hundra första högupplösta datauppsättningarna som markerats av PanDDA som saknar intressanta händelser (och därmed sannolikt ligandfria) för att generera grundtillståndsmedelkartan medan datauppsättningen med lägstR-fri väljs ut för förfining. Grundtillståndsmedelkartan är inte en kristallografisk karta, men det är viktigt att endast använda denna karta för att bygga grundtillståndsmodellen.
    1. Öppna fliken PanDDAs och uppdatera tabeller från datakällan om det behövs.
    2. Definiera utdatakatalogen (/dls/labxchem/data/year/visit/processing/analysis/panddas).
    3. Välj Förkörning för Ground State Model och klicka på Kör.
      OBS: Datauppsättningar med höga Rfree och oväntade utrymmesgrupper bör automatiskt uteslutas från analysen.
    4. Om du vill exkludera datauppsättningar manuellt med höga Rfree och oväntade utrymmesgrupper väljer du Ignorera helt.
    5. Kontrollera status för förkörningsjobbet med hjälp av qstat i ett terminalfönster.
    6. När du är klar väljer du Skapa grundtillståndsmodell och klickar på Kör.
      OBS: Detta öppnar Coot med PanDDA-medelkartan och en referensmodell/2Fo-Fc/Fo-Fc-kartor från datauppsättningen av bästa kvalitet för ommodellering och förfining med hjälp av Coot. Det är av yttersta vikt att endast PanDDA-medelkartan används för modellering.
  5. Identifiera träffar med PanDDA26
    1. PanDDA-analys
      Det kan ta lite tid att köra på klustret om det finns många datauppsättningar, enhetscellen är stor och det finns flera kopior av proteinet i den asymmetriska enheten.
      1. Upprepa de tidigare beskrivna stegen för Analysera resultat för automatisk DLS-bearbetning och Inledande kartberäkning. För kartberäkningen använder du grundtillståndsmodellen som referens: Uppdatera referensfillistan > Ange ny referens och generera ligandbegränsningar efter behov för nya data (steg 6.1-6.3).
      2. Under fliken PanDDAs ser du till att utdatakatalogen är inställd som tidigare och kör pandda.analyse från rullgardinsmenyn Träffidentifiering .
      3. Kontrollera jobbets status i Linux-terminalen med kommandot qstat.
    2. PanDDA-inspektion – kontrollera/skapa bindningshändelser
      1. Under fliken PanDDAs i XCE kör du pandda.inspect från rullgardinsmenyn Träffidentifiering för att öppna Coot42 med PanDDA-kontrollpanelen.
        Kontrollpanelen pandda.inspect ger en sammanfattning av PanDDA-statistik och gör det möjligt för användare att navigera genom bindande händelser/webbplatser. En sammanfattande HTML-fil med resultaten genereras också och kan uppdateras under inspektionen genom att välja Uppdatera HTML.
      2. Om du vill modellera en ligand klickar du på Sammanfoga ligand med modell och Spara modell innan du navigerar till en annan händelse för att undvika att förlora ändringar i den bundna tillståndsmodellen.
        OBS: Endast modeller som har uppdaterats och sparats kommer att exporteras för förfining i ett senare skede.
      3. Använd fältet Händelsekommentar för att kommentera bindningshändelsen och Registrera webbplatsinformation för att kommentera bindningsplatser.
      4. Belastningsmedelvärde och 2mFo-DFc-kartor (från DIMPLE) för jämförelse med händelsekartan och modellen.
        1. När alla livskraftiga ligander har modellerats, sammanslagits och sparats baserat på händelsekartan, stäng pandda.inspect.
    3. PanDDA export och förädling
      OBS: Följande PanDDA-inspektionsmodeller exporteras tillbaka till projektkatalogen och en första omgång av förfining startas. Det finns för närvarande två tillgängliga pipelines för att göra det under fliken PANDDAs i XCE.
      1. Exportera NYA/ALLA/VALDA PANDDA-modeller genererar en ensemble av de bundna och obundna modellerna för förfining och genererar närvarobegränsningsparametrar för Refmac43.
        OBS: Ensemblemodellen kommer att användas för förfining, men endast modellen med bundet tillstånd kommer att uppdateras i Coot och deponeras i PDB. Den här pipelinen används bäst för datauppsättningar med fragment med låg beläggning och betydande ändringar i proteinmodellen.
      2. Förfina NEW/ALL-modellerna med BUSTER förfinar bound-state endast med Buster44.
        OBS: Detta används bäst med ligander/datauppsättningar med hög beläggning med minimala förändringar i proteinmodellen.
  6. Förfina träffarna (alla datauppsättningar som valts för förfining visas nu på fliken Förfining). Välj Open COOT - BUSTER Refinement eller Open COOT - REFMAC Refinement från rullgardinsmenyn Refinement för att öppna Coot med XCE Refinement-kontrollpanelen.
    1. Välj status för de exempel som ska förfinas från rullgardinsmenyn Välj prover (vanligtvis 3 - i förfining) och klicka på GO.
      XCE-kontrollpanelen ger en sammanfattning av antalet datauppsättningar för den kategorin och gör det möjligt att navigera mellan datauppsättningar samtidigt som den ger en sammanfattning av förfiningsstatistik.
    2. Kommentera ligandkonfidensen i XCE-kontrollpanelen: 0 - ingen ligand närvarande - Fragmentet har inte bundit; 1 - Låg konfidens- Fragment har möjligen bundit men är inte särskilt övertygande; 2 - Korrekt ligand, svag densitet - Användaren är säker på att fragmentet har bundits men det är låg beläggning/det finns vissa problem med kartorna; 3 - Tydlig densitet, oväntad ligand- Kartor indikerar tydligt ligandbindning som inte korrelerar med tillhandahållen kemisk struktur; 4 - Hög konfidens- Ligand är entydigt bunden.
    3. Gör nödvändiga ändringar i modellen i det här skedet och initiera ytterligare förfining med hjälp av knappen Förfina .
    4. Använd knappen Visa att göra-lista för MolProbity för att komma åt MolProbity45-analys som körs på alla förfiningscykler.
    5. Om det behövs kan du lägga till förfiningsparametrar, t.ex. för anisotropa temperaturfaktorer, tvillingdata eller förfining av beläggning genom att välja knappen Förfiningsparametrar .
      OBS: Databehandlingsstatistik finns också i XCE under fliken Förfining och om förfining utförs med Buster-pipelinen tillhandahålls Buster-rapporter, inklusive MOGUL-analys46.
    6. Ändra status för en datauppsättning när den fortskrider genom förfining både i XCE:s huvudfönster under fliken Förfining eller i Coot XCE-kontrollpanelen . När du är nöjd med att modellen är korrekt runt liganden och lämplig att delas för ytterligare analys ändrar du statusen till CompChem Ready. När förfiningen är klar och modellen är redo för uppladdning till PDB ändrar du statusen till Deposition ready.

6. Insättning av data

OBS: Alla datauppsättningar från en fragmentskärm och den grundtillståndsmodell som används för att generera PanDDA-händelsekartorna kan deponeras i PDB med hjälp av gruppdepositioner.

  1. Konvertera alla PanDDA-händelsekartor till MTZ-format genom att köra Event Map ->SF från menyn Träffidentifiering .
  2. Ange ytterligare metadata, till exempel författare och metoder, genom att välja Deposition > Redigera information. Fyll i alla nödvändiga objekt och klicka på Spara i databas och spara sedan denna information för deponering av grundtillståndsmodellen. Gör detta efter att modellens status har ändrats till Deposition Ready.
  3. På fliken Deposition väljer du knappen Prepare mmcif för att generera mmcif-filer med strukturfaktor för alla datauppsättningar som är klara för deponering . Följande meddelande kommer att visas i terminalfönstret när detta är klart: Slutförd förberedelse av mmcif-filer för wwPDB-deponering.
  4. Välj knappen Kopiera mmcif för att kopiera alla dessa filer till ett enda bzippat tar-arkiv i gruppdepositionskatalogen för besöket.
  5. Gå till https://deposit-group-1.rcsb.rutgers.edu/groupdeposit; Logga in med användarnamn: GroupTester och lösenord: !2016rcsbpdb. Skapa en session och ladda upp filen ligand-bound.tar.bz2 från gruppdepositionskatalogen.
  6. Efter framgångsrik inlämning av de ligandbundna strukturerna skickas ett e-postmeddelande med PDB-koderna. Välj Uppdatera databas med PDB-koder på menyn Deponering . kopiera och klistra in informationen från det här e-postmeddelandet i popup-fönstret och klicka på Uppdatera databas för att lägga till PDB-ID.
  7. För att deponera grundtillståndsmodellen som används av PanDDA, välj relevant PanDDA-katalog i XCE och kör apo->mmcif från menyn Träffidentifiering .
    XCE kommer godtyckligt att välja en högupplöst struktur med låg Rfree som modell för deponeringspaketet och sedan kompilera alla mmcif-filer med strukturfaktor till en enda fil.
  8. På fliken Deposition väljer du knappen Lägg till i databas under avsnittet Gruppdeponering av marktillståndsmodell .
  9. Ange metadata för grundtillståndsmodellen (återigen genom att välja Deposition > Redigera information), ladda föregående fil och Spara i databas.
  10. Förbered mmcif-filen för grundtillstånd genom att köra Förbered mmcif från avsnittet Gruppdeponering av grundtillståndsmodell och när du är klar kopierar du mmcif till katalogen Gruppdeposition genom att välja knappen Kopiera mmcif från samma avsnitt.
  11. Som tidigare, gå till https://deposit-group-1.rcsb.rutgers.edu/groupdeposit; Logga in med användarnamn: GroupTester och lösenord: !2016rcsbpdb. Skapa en session och ladda upp filen ground_state_structures.tar.bz2 från gruppdepositionskatalogen.

Representative Results

XChems pipeline för fragmentscreening med röntgenkristallografi har effektiviserats i stor utsträckning, vilket gör det möjligt för det vetenskapliga samfundet att ta upp den (figur 5). Denna process har validerats på över 150 screeningkampanjer med en träfffrekvens som varierar mellan 1 % och 30 %47,48,49,50,51,52 och av många återkommande användare. Kristallsystem som inte är lämpliga (låg upplösning, inkonsekvent i kristallisation eller i diffraktionskvalitet) eller inte tål vare sig DMSO eller etylenglykol elimineras tidigt i processen, vilket sparar tid, ansträngning och resurser. Framgångsrika kampanjer ger en tredimensionell karta över potentiella interaktionsställen på målproteinet; ett typiskt utfall är XChem-skärmen av huvudproteaset till SARS-CoV-2 (figur 6). Vanligtvis finns fragmentträffar i: (a) kända platser av intresse, såsom enzymaktiva platser och subfickor48; b) Förmodade allosteriska platser, t.ex. i protein-proteininteraktioner53. c) Gränsytor för kristallpackning, som i allmänhet betraktas som falskt positiva (figur 6). Dessa strukturella data utgör i allmänhet en grund för sammanslagning, länkning eller växande fragmentträffar till blyliknande små molekyler 1,3.

Figure 1
Bild 1: XChem-pipelinen. Plattformen representeras schematiskt från projektförslag till provberedning, datainsamling och träffidentifiering. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Strategi för screening. Arbetsflödet anger syftet med varje milstolpe, experimentets krav och beslutspunkterna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Bild 3: Arbetsflöde för provberedning. Kritiska steg för provberedningen representeras av information från varje steg som registreras i en SQLite-databas. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Dataanalys med XCE. Kritiska steg i dataanalysen representeras av ett arbetsflödesdiagram med relevanta programvarupaket. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Utveckling av användarprogrammet XChem: Diagrammet visar användningen och konsolideringen av användarprogrammet från 2015 till 2019 med skapandet av BAGs 2019 och plattformens motståndskraft under covid-19-pandemin 2020. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Representativa resultat av XChem-fragmentskärmen. SARS-CoV2 huvudproteas (Mpro) dimeren representeras i ytan med aktiva platsträffar som visas i gult, förmodade allosteriska träffar visas i magenta och yt-/kristallpackande artefakter visas i grönt. Figuren gjordes med hjälp av Chimera- och Mpro PDB-poster från gruppdepositions G_1002156. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Processen som beskrivs i detta dokument har testats utförligt av användargemenskapen och anpassningsförmågan hos de protokoll som beskrivs här är nyckeln till att hantera de många olika projekt som vanligtvis förekommer på plattformen. Några förutsättningar för kristallsystemet är dock nödvändiga.

För alla fragmentscreeningskampanjer som utförs med hjälp av röntgenkristallografi är ett reproducerbart och robust kristallsystem avgörande. Eftersom XChem-standardprotokollet innebär att fragmentet läggs direkt till kristalldroppen, bör optimeringen fokusera på antalet droppar som innehåller kristaller av hög kvalitet snarare än det totala antalet kristaller. Om droppar innehåller flera kristaller är de effektivt överflödiga även om de kan lindra skördeprocessen. Dessutom kan det vara en utmaning att överföra kristallisationsprotokollet från heminstitutet till anläggningar på plats. Detta uppnås i allmänhet bäst med hjälp av kristallsådd för att främja reproducerbar kärnbildning54, och därför är det en god praxis för användare att tillhandahålla frölager tillsammans med sina protein- och kristallisationslösningar.

För att säkerställa god föreningslöslighet och stöd, tillhandahålls de höga blötläggningskoncentrationerna som är avsedda att driva bindning av svaga fragment, fragmentbibliotek i organiska lösningsmedel, särskilt DMSO och etylenglykol. Tillhandahållande av två olika lösningsmedel ger användarna ett alternativ för kristaller som inte tolererar DMSO alls, eller där det blockerar bindningen av fragment på ett ställe av intresse. Användare kan tillhandahålla alternativa bibliotek i vattenhaltig buffert: föreningar kommer att dispensera bra förutsatt att de är helt upplösta och formaterade i plattor som är kompatibla med vätskedispenseringsroboten.

För projekt där det inte är möjligt att hitta ett lämpligt organiskt lösningsmedel som både skulle solubilisera biblioteket och tolereras av kristallsystemet, är ett alternativt förfarande att använda torkade föreningar enligt BESSY55.

I samhället finns det länge en fråga om att kunna suga in föreningar i kristaller som odlas under kristallisationsförhållanden som innehåller höga saltkoncentrationer. Praktiskt observeras mer utfällning av föreningarna och snabb bildning av saltkristaller i skördestadiet, vilket reduceras genom att applicera en fuktig miljö runt skördeområdet. Generellt sett ger screeningkampanjer i kristallsystem från höga saltkristallisationsförhållanden en jämförbar träfffrekvens med låga saltförhållanden.

De inledande stadierna av XChem-processen (lösningsmedelstoleranstestning och förscreening) är relativt småskaliga och snabba experiment, men tillåter tydliga go/no go-beslut för projektet. Det mest smärtsamma är att alternativa kristallsystem måste hittas om inget av lösningsmedlen tolereras, eller om förscreeningen resulterar i en mycket låg träfffrekvens. Däremot, om de är framgångsrika, informerar resultaten direkt om blötläggningsförhållandena som ska användas för screeningexperimentet och den bästa strategin för datainsamling. Eftersom kvaliteten på data, särskilt upplösningen, kommer att påverka kvaliteten på elektrontätheten för träffidentifiering och analys, är målet att suga vid högsta möjliga föreningskoncentration som inte har en skadlig effekt på diffraktionskvaliteten (med majoriteten av datauppsättningarna (~80%) som diffrakterar till en upplösning på 2,8 Å eller bättre).

Dataanalysprocessen effektiviseras inom XChemExplorer, som förlitar sig på PanDDA-programvaran för detektering av svaga bindemedel och gör det möjligt för användare att snabbt visualisera och granska resultaten av screeningkampanjen. XChemExplorer importerar databehandlingsresultat från de paket som finns tillgängliga på Diamond (DIALS 16, autoPROC30, STARANISO31 och Xia214) med upplösningsgränser som bestäms av standardmetoden för varje paket (dvs. CC1/2 = 0,3). Som standard baseras valet av datauppsättning på en poäng som beräknas utifrån I/sigI, fullständighet och ett antal unika reflektioner, men specifika bearbetningsresultat kan väljas för användning både globalt eller för enskilda prover25. Data utesluts också från analys av PanDDA baserat på kriterier inklusive upplösning,R-fri och skillnad i enhetscellvolym mellan referens- och måldata (standardvärden är 3,5 Å, 0,4 respektive 12 %), så att dåligt diffrakterande, felcentrerade eller felindexerade kristaller inte påverkar analysen.

PanDDA-algoritmen drar nytta av det stora antalet datauppsättningar som samlats in under en fragmentkampanj för att upptäcka ligander av partiell beläggning som inte är synliga i vanliga kristallografiska kartor. Till att börja med använder PanDDA data som samlats in under lösningsmedelstoleranstestningen och förscreeningsstegen för att förbereda en karta över genomsnittlig densitet som sedan används för att skapa en grundtillståndsmodell. Eftersom denna modell kommer att användas för alla efterföljande analyssteg är det viktigt att den korrekt representerar det oliganderade proteinet under de förhållanden som används för fragmentscreeningen. PanDDA använder sedan en statistisk analys för att identifiera bundna ligander och genererar en händelsekarta för kristallens bundna tillstånd. En händelsekarta genereras genom att subtrahera den obundna fraktionen av kristallen från datauppsättningen för partiell beläggning och presenterar vad som skulle observeras om liganden var bunden vid full beläggning. Även fragment som ser tydliga ut i konventionella 2mFo-DF c-kartor kan vara felmodellerade om händelsekartorna inte konsulteras32. Även om PanDDA är en kraftfull metod för att identifiera datauppsättningar som skiljer sig från de genomsnittliga kartorna (vilket vanligtvis är en indikation på fragmentbindning) och mätvärden som RSCC, RSZD, B-faktorförhållande och RMSD under förfining tillhandahålls till användarens fördel, är användaren i slutändan ansvarig för att avgöra om den observerade densiteten korrekt visar den förväntade liganden och den mest lämpliga konformationen.

Efter dataanalys och förfining är det möjligt för alla användare att samtidigt deponera flera strukturer i Protein Data Bank (PDB) med hjälp av XChemExplorer. För varje fragmentskärm görs två gruppavsättningar. Den första deponeringen innehåller alla fragmentbundna modeller, med koefficienter för beräkning av PanDDA-händelsekartor som ingår i MMCIF-filer. Den andra depositionen ger den medföljande grundtillståndsmodellen, tillsammans med de uppmätta strukturfaktorerna för alla datauppsättningar i experimentet: dessa data kan användas för att reproducera PanDDA-analysen och för att utveckla framtida algoritmer. När det gäller träffarnas strukturer, när fragmentbeläggningen är låg, beter sig förfining bättre om modellerna är en sammansättning av de ligandbundna och förvirrande grundtillståndsstrukturerna32; Ändå är praxis att endast deponera de bundna fraktionerna, eftersom de fullständiga sammansatta modellerna i allmänhet är komplexa och svåra att tolka. Till följd av detta är vissa kvalitetsindikatorer som räknats om i det preliminära budgetförslaget (särskilt R/Rfree) ibland något förhöjda. Det är också möjligt att tillhandahålla all rådata med hjälp av plattformar som Zenodo56, även om detta för närvarande inte stöds av XChem-pipelinen.

Sammantaget, sedan den togs i drift 2016, kunde fragmentligander identifieras i över 95 % av målen med hjälp av detta förfarande. Erfarenheten från de många projekt som XChem har stöttat destillerades till bästa praxis för kristallpreparering33, medan ett fragmentbibliotek utvecklades som implementerade det balanserade konceptet för att hjälpa till med fragmentprogression29, vilket också hjälpte till att etablera praxis för att göra bibliotekskomposition offentlig. Plattformen har visat vikten av väl underhållen infrastruktur och dokumenterade processer, som beskrivs här, och gjort det möjligt att utvärdera andra fragmentbibliotek57,58, att jämföra bibliotek48 och att informera utformningen av det kollaborativa EUOpenscreen-DRIVE-biblioteket 59,60.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.

Acknowledgments

Detta arbete representerar en stor gemensam insats mellan Diamond Light Source och Structure Genomic Consortium. Författarna vill tacka Diamonds olika stödgrupper och MX-grupp för deras bidrag till automatiseringen av i04-1-strålröret och för att tillhandahålla strömlinjeformad datainsamling och automatiska bearbetningspipelines, som vanligtvis körs över alla MX-strålrör. De vill också tacka SGC PX-gruppen för deras uthållighet som de första användarna att testa installationen och Evotec för att vara den första seriösa industriella användaren. Detta arbete stöddes av iNEXT-Discovery (Grant 871037) finansierat av Europeiska kommissionens Horizon 2020-program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DSI-poised library Enamine DSI-896 fragment library
Echo 550 and 650 series Beckman-Coulter acoustic dispensing system
Echo microplates Beckman-Coulter 001-12380; 001-8768; 001-6025 1536-well and 384-well microplates
Shifter Oxford Lab Technology harvesting device
Microplate centrifuge with a swing-out rotor Sigma model 11121 microplate centrifuge
3-drops crystallisation plates Swissci 3W96T-UVP Crystallisation plates
Formulatrix plate imager and Rockmaker software Formulatrix Crystallisation plates imaging device

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erlanson, D. A., Fesik, S. W., Hubbard, R. E., Jahnke, W., Jhoti, H. Twenty years on: The impact of fragments on drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 605-619 (2016).
  2. Jacquemard, C., Kellenberger, E. A bright future for fragment-based drug discovery: what does it hold. Expert Opinion on Drug Discovery. 14 (5), 413-416 (2019).
  3. Jahnke, W., et al. Fragment-to-lead medicinal chemistry publications in 2019. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (24), 15494-15507 (2019).
  4. Li, Q. Application of fragment-based drug discovery to versatile targets. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 180 (2020).
  5. Kirsch, P., Hartman, A. M., Hirsch, A. K. H., Empting, M. Concepts and core principles of fragment-based drug design. Molecules. 24 (23), Basel, Switzerland. 4309 (2019).
  6. Patel, D., Bauman, J. D., Arnold, E. Advantages of crystallographic fragment screening: functional and mechanistic insights from a powerful platform for efficient drug discovery. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 116 (2-3), 92-100 (2014).
  7. Wasserman, S., et al. Automated synchrotron crystallography for drug discovery: the LRL-CAT beamline at the APS. Acta Crystallographica Section A Foundations of Crystallography. 67 (1), 46-47 (2011).
  8. Hartshorn, M. J. Fragment-based lead discovery using X-ray crystallography. Journal of Medicinal Chemistry. 48 (2), 403-413 (2005).
  9. Arzt, S., et al. Automation of macromolecular crystallography beamlines. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 89 (2), 124-152 (2005).
  10. Beteva, A. High-throughput sample handling and data collection at synchrotrons: Embedding the ESRF into the high-throughput gene-to-structure pipeline. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 62, Pt 10 1162-1169 (2006).
  11. Papp, G., et al. FlexED8: The first member of a fast and flexible sample-changer family for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 10 841-851 (2017).
  12. Casanas, A., et al. EIGER detector: Application in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D, Structural Biology. 72, Pt 9 1036-1048 (2016).
  13. Henrich, B., et al. PILATUS: A single photon counting pixel detector for X-ray applications. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 607 (1), 247-249 (2009).
  14. Winter, G., Lobley, C. M. C., Prince, S. M. Decision making in xia2. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 69, Pt 7 1260-1273 (2013).
  15. Winter, G., McAuley, K. E. Automated data collection for macromolecular crystallography. Methods. 55 (1), 81-93 (2011).
  16. Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D, Structural Biology. 74, Pt 2 85-97 (2018).
  17. Bowler, M. W. MASSIF-1: A beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
  18. Von Stetten, D., et al. ID30A-3 (MASSIF-3) - A beamline for macromolecular crystallography at the ESRF with a small intense beam. Journal of Synchrotron Radiation. 27, Pt 3 844-851 (2020).
  19. Cipriani, F., et al. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 68, Pt 10 1393-1399 (2012).
  20. Helmholtz Zentrum Berlin. , Available from: https://www.helmholtzberlin.de/forschung/oe/np/gmx/fragment-screening/index_en.html (2021).
  21. Lima, G. M. A., et al. FragMAX: the fragment-screening platform at the MAX IV Laboratory. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 76 (8), 771-777 (2020).
  22. Ng, J. T., Dekker, C., Kroemer, M., Osborne, M., Von Delft, F. Using textons to rank crystallization droplets by the likely presence of crystals. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 70, Pt 10 2702-2718 (2014).
  23. Collins, P. M., et al. Gentle, fast and effective crystal soaking by acoustic dispensing. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 3 246-255 (2017).
  24. Wright, N. D., et al. The low-cost Shifter microscope stage transforms the speed and robustness of protein crystal harvesting. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 77, Pt 1 62-74 (2021).
  25. Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein-ligand structure determination. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 3 267-278 (2017).
  26. Pearce, N. M., et al. A multi-crystal method for extracting obscured crystallographic states from conventionally uninterpretable electron density. Nature Communications. 8, 15123 (2017).
  27. Fragalysis. , Available from: https://fragalysis.diamond.ac.uk (2021).
  28. Diamond Light Source Ltd. , Available from: https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Fragment-Screening.html (2021).
  29. Cox, O. B., et al. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7 (3), 2322-2330 (2016).
  30. Vonrhein, C., et al. Data processing and analysis with the autoPROC toolbox. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 67, Pt 4 293-302 (2011).
  31. Vonrhein, C., et al. Advances in automated data analysis and processing within autoPROC , combined with improved characterisation, mitigation and visualisation of the anisotropy of diffraction limits using STARANISO. Acta Crystallographica Section A: Foundations and Advances. 74 (1), 360 (2018).
  32. Pearce, N. M., Krojer, T., Von Delft, F. Proper modelling of ligand binding requires an ensemble of bound and unbound states. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 3 265-266 (2017).
  33. Collins, P. M., et al. Achieving a good crystal system for crystallographic x-ray fragment screening. Methods in Enzymology. 610, 251-264 (2018).
  34. Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
  35. Fisher, S. J., Levik, K. E., Williams, M. A., Ashton, A. W., McAuley, K. E. SynchWeb: a modern interface for ISPyB. Journal of Applied Crystallography. 48, Pt 3 927-932 (2015).
  36. Ginn, H. M., et al. SynchLink: an iOS app for ISPyB. Journal of Applied Crystallography. 47, Pt 5 1781-1783 (2014).
  37. Diamond Light Source Ltd. , Available from: https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Common/Common-Manual/Data-Analysis/Reprocessing-in-ISPyB.html (2021).
  38. Wojdyr, M., Keegan, R., Winter, G., Ashton, A. DIMPLE - a pipeline for the rapid generation of difference maps from protein crystals with putatively bound ligands. Acta Crystallographica. Section A, Foundations of Crystallography. 69, 299 (2013).
  39. Global Phasing Limited. , Available from: http://www.globalphasing.com (2021).
  40. Long, F., et al. AceDRG: A stereochemical description generator for ligands. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, Pt 3 112-122 (2017).
  41. Moriarty, N. W., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Electronic ligand builder and optimization workbench (eLBOW): A tool for ligand coordinate and restraint generation. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 65, Pt 10 1074-1080 (2009).
  42. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).
  43. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 53, Pt 3 240-255 (1997).
  44. Bricogne, G., et al. Buster version 2.10.3. Global Phasing Ltd. , Cambridge, United Kingdom. (2017).
  45. Chen, V. B., et al. MolProbity: All-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66, Pt 1 12-21 (2010).
  46. Bruno, I. J., et al. Retrieval of crystallographically-derived molecular geometry information. Journal of Chemical Information and Computer Sciences. 44 (6), 2133-2144 (2004).
  47. Delbart, F., et al. An allosteric binding site of the α7 nicotinic acetylcholine receptor revealed in a humanized acetylcholine-binding protein. TheJournal of Biological Chemistry. 293, 2534-2545 (2018).
  48. Douangamath, A., et al. Crystallographic and electrophilic fragment screening of the SARS-CoV-2 main protease. Nature Communications. 11 (1), 5047 (2020).
  49. Guo, J., et al. In crystallo-screening for discovery of human norovirus 3C-like protease inhibitors. Journal of Structural Biology: X. 4, 100031 (2020).
  50. Keedy, D. A., et al. An expanded allosteric network in PTP1B by multitemperature crystallography, fragment screening, and covalent tethering. eLife. 7, 36307 (2018).
  51. McIntyre, P. J., et al. Characterization of three druggable hot-spots in the aurora-a/tpx2 interaction using biochemical, biophysical, and fragment-based approaches. ACS Chemical Biology. 12 (11), 2906-2914 (2017).
  52. Thomas, S. E., et al. Structure-guided fragmentbased drug discovery at the synchrotron: Screening binding sites and correlations with hotspot mapping. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 377 (2147), 20180422 (2019).
  53. Nichols, C., et al. Mining the PDB for tractable cases where x-ray crystallography combined with fragment screens can be used to systematically design protein-protein inhibitors: Two test cases illustrated by IL1β-IL1R and p38α-TAB1 complexes. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (14), 7559-7568 (2020).
  54. D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned. Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, Pt 9 1117-1126 (2014).
  55. Wollenhaupt, J., et al. F2X-Universal and F2X-Entry: Structurally diverse compound libraries for crystallographic fragment screening. Structure. 28 (6), 694-706 (2020).
  56. Zenodo. , Available from: https://zenodo.org (2021).
  57. Foley, D. J., et al. Synthesis and demonstration of the biological relevance of sp(3) -rich scaffolds distantly related to natural product frameworks. Chemistry. 23 (60), Weinheim an der Bergstrasse. Germany. 15227-15232 (2017).
  58. Kidd, S. L., et al. Demonstration of the utility of DOS-derived fragment libraries for rapid hit derivatisation in a multidirectional fashion. Chemical Science. 11 (39), 10792-10801 (2020).
  59. EU-openscreen ERIC. , Available from: https://www.eu-openscreen.eu/ (2021).
  60. Schuller, M., et al. Fragment binding to the Nsp3 macrodomain of SARS-CoV-2 identified through crystallographic screening and computational docking. bioRxiv. 393405, (2020).

Tags

Effektiv fragmentscreening XChem-anläggning diamantljuskälla fragmentbaserad läkemedelsupptäckt proteinkristallografi primär skärm initiala XChem-experiment provberedning fragmentbibliotek I04-1-strålrör datainsamling datahantering träffidentifiering storskalig kristallografisk fragmentscreening akademiska och industriella användare peer-reviewed akademiskt användarprogram
Uppnå effektiv fragmentscreening vid XChem-anläggningen vid Diamond Light Source
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Douangamath, A., Powell, A., Fearon, … More

Douangamath, A., Powell, A., Fearon, D., Collins, P. M., Talon, R., Krojer, T., Skyner, R., Brandao-Neto, J., Dunnett, L., Dias, A., Aimon, A., Pearce, N. M., Wild, C., Gorrie-Stone, T., von Delft, F. Achieving Efficient Fragment Screening at XChem Facility at Diamond Light Source. J. Vis. Exp. (171), e62414, doi:10.3791/62414 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter