Summary
本文介绍了实时开发、表征和跟踪斑马鱼神经母细胞瘤模型肿瘤转移的方法,特别是在 MYCN 和 LMO1过表达的转基因斑马鱼品系中,该谱系自发地发生转移。
Abstract
斑马鱼已成为研究人类疾病,特别是癌症的重要动物模型。除了应用于斑马鱼建模的强大转基因和基因组编辑技术外,易于维护,高产量生产力和强大的实时成像功能使斑马鱼成为研究转移以及体内该过程背后的细胞和分子基础的有价值的模型系统。第一个斑马鱼神经母细胞瘤(NB)转移模型是通过在多巴胺-β-羟化酶(dβh)启动子的控制下过度表达两个癌基因MYCN和LMO1而开发的。共过表达的MYCN和LMO1导致神经母细胞发生率降低和外显率增加,以及肿瘤细胞的加速远处转移。这种新模型可靠地重申了人类转移性NB的许多关键特征,包括临床相关和转移相关遗传改变的参与;体内转移的自然和自发发展;和转移的保守部位。因此,斑马鱼模型具有剖析体内肿瘤转移复杂过程的独特优势。
Introduction
斑马鱼已被广泛使用并应用于多个研究领域,特别是在癌症方面。该模型提供了许多优点 - 例如其强大的繁殖,经济高效的维护以及肿瘤生长和转移的多功能可视化 - 所有这些都使斑马鱼成为研究和研究肿瘤发生和转移的细胞和分子基础的强大工具。用于大规模基因组图谱、转基因、基因过表达或敲除、细胞移植和化学筛选的新技术极大地增强了斑马鱼模型的力量1。在过去的几年中,已经开发了许多斑马鱼系来研究各种人类癌症的肿瘤发生和转移,包括但不限于白血病,黑色素瘤,横纹肌肉瘤和肝细胞癌2,3,4,5。此外,第一个斑马鱼神经母细胞瘤(NB)模型是通过在多巴胺-β-羟化酶(dβh)启动子的控制下在外周交感神经系统(PSNS)中过度表达MYCN(一种癌基因)而产生的。通过该模型,进一步证明激活的ALK可以与MYCN协同作用,以加速肿瘤发作并增加体内肿瘤外显率6。
NB源自神经嵴细胞的交感肾上腺谱系,是儿童中高度转移的癌症7。它占儿科癌症相关死亡的10%8。NB在诊断时广泛转移,临床上可表现为主要起源于交感神经节链和PSNS9,10的肾上腺髓链的肿瘤。 MYCN 扩增通常与 NB 患者的不良结局相关11,12。此外, LMO1 已被确定为高风险病例中的关键NB易感基因13,14。研究发现,在斑马鱼模型的PSNS中 ,MYCN 和 LMO1 的转基因共表达不仅促进了NB的早期发作,而且还诱导了与高危NB13患者常见的相似部位的组织和器官的广泛转移。最近,在较新的NB斑马鱼模型中也观察到了NB的另一种转移表型,其中编码RNA结合蛋白的 MYCN 和 Lin28B 在 dβh 启动子的控制下都过度表达16。
斑马鱼的稳定转基因方法通常用于研究目的基因的过表达是否有助于正常发育和疾病发病机制14,15。该技术已成功用于证明多个基因和途径对NB肿瘤发生的重要性6,16,17,18,19,20。本文将介绍如何在PSNS中产生过表达MYCN和LMO1的转基因鱼系,以及如何证明这两种癌基因的合作加速了NB肿瘤发生和转移的发生13。首先,通过将dβh-EGFP-MYCN构建体注射到野生型(WT)AB胚胎的单细胞阶段,开发了在dβh-EGFP-MYCN(指定为MYCN系)控制下过表达EGFP-MYCN的转基因系,如前所述6,17。通过将两个DNA构建体dβh-LMO1和dβh-mCherry在单细胞阶段13中共注射到WT胚胎中,开发了一种在PSNS(指定的LMO1系)中过表达LMO1的单独转基因系。先前已经证明,共注射的双DNA构建体可以共同整合到鱼类基因组中;因此,LMO1和mCherry在转基因动物的PSNS细胞中共表达。一旦注射的F0胚胎达到性成熟,它们就会与WT鱼杂交,以鉴定具有转基因整合的阳性鱼。简而言之,F1后代首先通过荧光显微镜筛选PSNS细胞中的mCherry表达。通过基因组PCR和测序进一步证实了MCherry阳性鱼中LMO1的种系整合。在成功鉴定各转基因品系后,将杂合MYCN和LMO1转基因鱼的后代杂交,生成表达MYCN和LMO1的复合鱼系(指定MYCN;改性活生物体1系)。含肿瘤的MYCN;通过荧光显微镜每两周监测一次LMO1鱼,以寻找远离原发部位的区域,即腺间区域(IRG,相当于人类肾上腺的斑马鱼)转移性肿瘤的证据13。确认MYCN中肿瘤的转移;应用改性活生物体1鱼组织学和免疫组化分析。
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Protocol
所有使用斑马鱼和动物护理/维护的研究方法均按照梅奥诊所的机构指南进行。
1. PSNS中过表达的转基因构建体开发 转基因 构建体的制备和显微注射
- 为了开发 LMO1-pDONR221 进入克隆,使用PCR扩增从人细胞系获得的cDNA中人类 LMO1 的编码区域。
- 制作25μL反应,详见:2.5μL1标准Taq反应缓冲液,0.125μLTaq DNA聚合酶,0.5μL10mM dNTPs,2μLcDNA模板,0.5μL1前向LMO1 ATTB1引物,0.5μL1逆转录MO1 ATTB2引物和18.875μL水。
注意:使用前向LMO1 ATTB1引物:5'-GGGGACAAGTTGTACAAAAAAGCAGGCTACAC-3'。
CATGATGGTGCTGGACAAGGAGGA-3' 和反向 LMO1 ATTB2 引物: 5'-GGGGACCACTTTACAAGAAAGCTGGTTTTACT
GAACTTGGGATTCAAAGGT-3' - 使用以下程序放大:94°C循环1次,2分钟;随后进行30次循环(94°C,30秒,55°C,30秒,72°C,1分钟)和72°C,7分钟。
- 制作25μL反应,详见:2.5μL1标准Taq反应缓冲液,0.125μLTaq DNA聚合酶,0.5μL10mM dNTPs,2μLcDNA模板,0.5μL1前向LMO1 ATTB1引物,0.5μL1逆转录MO1 ATTB2引物和18.875μL水。
- 通过BP重组酶反应将 LMO1 PCR产物克隆到 pDONR221 网关供体载体中6,13 (PCR片段+供体载体=进入克隆)。
- 对于10μL反应,将1μL纯化的 LMO1 PCR产物(150ng / μL),1μL(150ng / μL) pDONR221 供体载体和6μL TE缓冲液(pH 8.0)与2μLBP酶混合物混合,在25°C下孵育1小时,并使用制造商的方案转化为TOP10合格的 大肠杆菌 。
- 接下来,将50-200μL从转化小瓶中铺展到含有50μg/ mL卡那霉素的Luria肉汤(LB)琼脂平板上,并在37°C下孵育过夜。
- 通过将单个菌落接种到2-5mLLB中,加入50μg/ mL卡那霉素并在37°C下培养过夜(16-18小时)来选择克隆。
- 根据制造商的协议,使用2 mL过夜细菌培养物进行质粒分离。为了验证LMO1质粒,将质粒样品送出用M13-F引物(5-GTAAAACGGGCCAG-3')进行测序。
- 要生成dβh-pDONRP4-P1R进入克隆,通过使用CH211-270H11 BAC克隆作为模板扩增5.2 kb启动子区域来制备20μL反应,如步骤1.1.1所述,获得dβh PCR产物6,13。使用以下PCR程序参数:94°C,2分钟;10 次循环 94 °C, 15 s, 50 °C, 30 s, 68 °C, 8 min;30 次循环 94 °C, 15 s, 53 °C, 30 s, 68 °C, 8 min;68 °C,4 分钟(使用前期引物 5'GGGGACAACTTTATAGAAAAGTTGGCGTACTC
CCCCTTTTTAGG-3' 和反向引物 5'-GGGGACTGCTTTTTTTACAAACTTGTGTGTTGCTTTG
TCGTCTTTTGA-3')。
注意:由于此步骤中的DNA模板很长,请确保使用适当的PCR系统进行准确的PCR扩增。 - 通过BP重组酶反应将 dβh PCR产物克隆到 pDONRP4-P1R 网关供体载体中6,13 (PCR片段+供体载体=进入克隆)。
- 将1μL纯化的 dβh PCR产物(172ng / uL),1μL(150ng / μL)pDONRP4-P1R供体载体和6μL TE缓冲液(pH 8.0)与2μLBP酶混合物混合在总共10μL反应中混合,在25°C下孵育1小时。
- 根据制造商的协议转换为TOP10合格的 大肠杆菌 。按照步骤1.2.2-1.2.4中所述分离质粒,并通过用M13-F(5'-GTAAAACGCCAG-3')和M13-R(5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3')引物进行测序来验证质粒。
- 生成 dβh:LMO1 表达式构造。
- 将每个进入克隆(dβh-pDONRP4-P1R,LMO1-pDONR221和p3E-polyA11)(每个20 fmole),1μL(60ng / μL)的修饰目标载体与I-SceI识别位点和4μL含有2μLLR重组酶混合物的TE缓冲液(pH 8.0)混合。将该混合物在25°C下孵育1小时。
- 在遵循制造商协议的同时,将细菌转化为化学能力强的TOP10 大肠杆菌。按照步骤1.2.2-1.2.4中所述分离质粒,并通过使用DBH Forward(5'-GAAGCTGTCACAGGGTTGTG-3')和LMO1(5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA-3')引物进行测序来验证质粒。
- 通过将5.2-kb dβh启动子,pME-mCherry和p3E-polyA的入口克隆组合到包含I-SceI识别位点的修饰目标载体中,使用网关系统生成dβh:mCherry DNA构建体,如前所述,在步骤1.5.16中提到。按照步骤1.2.2-1.2.4中所述分离质粒,并通过使用DBH前向引物(5'-GAAGCTGTCACAGGGTTGTG-3')进行测序来验证质粒。
- 用 1μL I-SceI 酶(5 U / μL)和0.75μL缓冲液(10x)在总共15μL反应体积中线性化 dβh: LMO1 DNA构建体和dβh:mCherry DNA构建体(分别以3:1的比例),并在室温下孵育至少4小时或过夜。确保反应中的DNA浓度不超过750 ng。
- 第二天和构建物线性化后,将0.5μL新鲜I-SceI酶(5 U / μL)和0.5μL0.5%酚红加入5μL总DNA混合物中,来自上一步1.7。如前所述,使用直径为1.0 mm的玻璃微量移液管针将整个溶液(50-80pg的线性DNA)微注射到单细胞阶段的野生型AB胚胎(以及多达500个胚胎)中17。将剩余的DNA混合物储存在-20°C以备将来注射。
2. 筛选和验证改性活生物体1转基因鱼品系对改性活生物体1和mCherry种系传播的影响
- 在受精后3-4天(dpf)处,用0.02%三卡因麻醉注射的胚胎,并筛选它们是否有荧光mCherry表达,由于镶嵌转基因,这种表达出现在鱼体内的任何地方。将mCherry阳性胚胎转移到装有新鲜卵子水的培养皿中,并根据斑马鱼书21将胚胎提高到性成熟。
注意:预计阳性鱼的比例会根据研究人员的专业知识和经验而有所不同。例如,新手业余爱好者的整合率可能低至10%,而专家的整合率≥50%。 - 为了确定将 dβh:LMO1 和 dβh:mCherry 转基因整合到生殖细胞中的创始人鱼,将上一步(2.1)中注射的mCherry阳性F0性成熟鱼的单对与WT AB鱼杂交。筛选F1代中3-4 dpf的mCherry阳性胚胎。
- 为了确认mCherry阳性鱼携带 LMO1 转基因,使用gDNA提取缓冲液从F1 mCherry阳性单胚胎中分离gDNA,该缓冲液含有:12.5μL4x裂解缓冲液(500μL1M Tris,pH值为8.4,2.5mL1M氯化钾和47mL纯化水),35μL纯化水, 和2.5μL蛋白酶K在10mg / mL。将样品在55°C孵育16小时,然后在98°C下孵育10分钟。
- 使用提取的gDNA(2μL)作为使用引物进行基因分型PCR的模板: LMO1 FW:5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA -3'和 LMO1 RV:5'-CGAAGGCTGGCAGCTTG -3',以及以下PCR程序:1个94°C循环,10分钟;35 次循环 (94 °C 持续 30 秒,60 °C 持续 30 秒;68 °C,30 s);并在68°C下7分钟。通过测序确认扩增的182 bp片段。
- 在确认基因型后,根据斑马鱼书的标准指南将剩余的mCherry阳性F1胚胎提高到成熟21。在2-3个月大时使用上述方案中的步骤2.3-2.4对它们进行鳍夹和基因分型,以进一步确认 改性活生物体1 转基因在鱼体内的整合。
注: 改性活生物体1阳性的F1鱼将是稳定的转基因鱼[Tg(dβh:LMO1),Tg(dβh:mCherry)](指定为 LMO1 品系)。 - 用WT鱼繁殖 F1 LMO1 稳定的转基因鱼,并根据需要重复繁殖该品系。
3. 改性活生物体1 和 MYCN 转基因品系的外杂交,创建转移模型
- 一旦改 性活体1 转基因斑马鱼品系生成,与 MYCN 品系6,17 杂交,开发杂合转基因鱼品系,过度表达 MYCN 和 LMO1。
- 在1 dpf时,用立体荧光显微镜对EGFP表达的外杂交后代进行排序,其表现为后脑区域的EGFP阳性点。
注意:或者,如果不是所有胚胎都以1 dpf的速度进行 MYCN 分类,则通过鳍夹并将胚胎提高到成年期和基因型,并使用 先前声明的步骤2.3-2.4 中的指南进行gDNA分离和PCR基因分型,引物: MYCN-F(5'-ATT CAC CAT CAC TGT GCG TCC-3'); MYCN-R (5'-TGC ATC CTC ACT CTC CAC GTA-3',以及以下标准 Taq 聚合酶程序:1个循环94°C持续3分钟,35个循环(94°C持续30秒,60°C持续30秒,68°C持续3分钟),68°C持续7分钟,预期扩增子大小为145 bp。 - 在以1 dpf分选EGFP后,将筛选的胚胎分离到单独的培养皿中,并将培养皿标记为: MYCN +(EGFP阳性)或 MYCN-(EGFP阴性)。
- 在3-4 dpf下,用立体荧光显微镜对两组的胚胎进行可视化和分类(步骤3.3)以进行 LMO1 表达。寻找头部区域上颈神经节和非PSNS多巴胺能神经元细胞中的红色荧光蛋白表达作为斑点,特别是在后脑的长方形髓中6,13。
注意:在胚胎达到5 dpf之前筛选mCherry / LMO1,因为到那时充满空气的游泳膀胱完全发育并会导致胚胎漂浮,导致在分选过程中PSNS细胞难以微观聚焦。 - 分拣完成后,将分拣的鱼分离成四组不同的基因型,并标记如下。根据斑马鱼书21中的标准协议,在相同的条件下饲养分类的鱼。
- 仅 MYCN(EGFP 阳性),
- 仅LMO1(mCherry阳性),
- 迈克; LMO1 (EGFP和mCherry双阳性),
- WT(EGFP和mCherry双阴性)。
4. 转基因斑马鱼品系肿瘤负荷的可视化
- 在受精后4周(wpf)处,在培养皿中用0.02%的三卡因麻醉步骤3.5中的分类鱼。
- 用立体荧光显微镜将鱼用金属刮刀轻轻翻转到两侧以查看肿瘤,从而可视化肿瘤。预计肿瘤表现为单个EGFP-,单个mCherry或双重EGFP和mCherry阳性肿块,这些肿块来自腺间区域(靠近头部和肾脏)。
注意:最初的肿瘤发病通常可能在腺体间的一侧呈现出更亮,更大的荧光阳性肿块,这就是为什么可视化鱼的两侧以避免错过早期肿瘤发作至关重要的原因。 - 在鉴定出可能的肿瘤鱼后,将鱼分离到具有适当标签的单独水箱中,其中包括出生日期,肿瘤筛查日期和基因型。
- 在6 wpf处,重复先前的步骤4.1-4.3以再次筛选含肿瘤鱼和非肿瘤鱼,以确认先前筛查的含瘤鱼是否存在肿瘤或识别新的可能的荷瘤鱼。在确诊的含肿瘤鱼类中寻找持续或增加的荧光阳性肿块大小。
- 在识别出含肿瘤的鱼后,每两周监测一次它们以寻找肿瘤细胞迁移的证据,其表现为远离肿瘤发生原发部位(腺体间区域)的微小EGFP和/或mCherry阳性肿瘤肿块。根据需要将这些鱼隔离到单独的水箱中,并适当标记以指示可能的转移。
- 为了进一步确认转移,继续定期(每两周)跟踪这些鱼,直到远处荧光阳性肿瘤肿块明显增加,表明转移部位肿瘤的生长。
5. 肿瘤鱼的组织处理和石蜡切片
注意:执行此步骤以表征MYCN和MYCN中自发发展的原发性和/或转移性肿瘤 ;改性活生物体转基因 鱼。
- 在鉴定和验证含肿瘤的鱼后,将鱼浸没在0.02%的三卡因中,首先麻醉,然后增加三卡因的剂量,直到鱼不再呼吸,从而在培养皿中牺牲从步骤4.6开始的鱼。将鱼切成两块 - 一块包含头部和身体中间部分(包括肿瘤)的一部分,另一块包含鱼的中间部分和尾巴的其余部分。
- 在摇臂上用4%多聚甲醛(PFA)在室温下在1x PBS中固定两个鱼段1小时。为了提高固定效率,用新鲜的4%PFA代替缓冲液,以有效和快速地增加对内脏器官的外显率。将鱼留在摇臂上,在4°C下过夜或48小时。
注意:PFA是有毒的。由于预防性程序和试剂的正确处置取决于您所在机构的规定,因此在使用和处置试剂之前寻求适当的指南。 - 在处理之前,将样品置于室温下100%快速脱钙剂溶液中15-20分钟。确保使用非金属容器,并在整个孵育过程中检查样品,以防止过度脱钙。如果样品组织看起来严重降解,请将样品置于水中或4°C以减缓脱钙过程。
- 固定并脱钙后,用流动的自来水清洗鱼样品1小时,然后将其放入处理器盒中。如果有多个样品,请将每个样品分离到自己的暗盒中。
- 将带有鱼的盒放入组织处理器中,将样品分别浸没在各种溶液中,如下:70%乙醇(60分钟,40°C),85%乙醇(50分钟,40°C),95%乙醇(40分钟,40°C)两次,100%乙醇(30分钟,40°C),另一种100%乙醇(50分钟,50分钟, 40°C)两次,二甲苯(30分钟,40°C),另一种新鲜二甲苯溶液(50分钟,40°C),另一种新鲜二甲苯(50分钟,45°C),石蜡(30分钟,45°C),石蜡(20分钟,58°C)三次。
- 处理完组织后,从处理器机器上卸下盒,同时保持每个盒的组织并确保防止鱼样品混淆。
- 根据鱼的大小选择合适尺寸的模具,确保模具适合整个盒式磁带和鱼样品。在60°C下用液体石蜡覆盖模具底部。
- 立即将装有鱼的盒放在模具顶部(确保鱼放在其平坦的侧面,用于矢状部分),并用液体石蜡完成填充到模具顶部以完全嵌入鱼。
- 将完成的模具放在切片机的冷板上,直到石蜡硬化。
- 一旦石蜡块变硬,可以通过视觉观察更高的不透明度和对块的牢固触摸来判断,轻轻地将块从模具中取出。小心地从盒的侧面刮掉任何多余的石蜡。
- 将石蜡包埋的鱼块以4微米的距离在切片机上以4微米的速度进行切片,并将切片漂浮在含有蒸馏水的40°C温水浴上。
- 小心地将切片转移到带正电荷的载玻片上,并在染色前在60°C的烤箱中烘烤30分钟,然后继续步骤6,7或8。
6. 石蜡切片的血红素和曙红(H&E)染色,用于病理学审查
- 将包含步骤5.12中石蜡截面的载玻片放入载玻片支架中。在化学通风橱内,用二甲苯脱蜡3次,每次5分钟。每次使用后丢弃溶液。
- 用100%乙醇再水合切片3分钟,并用新鲜的100%乙醇重复两次。用95%乙醇代替100%乙醇3分钟,然后用80%乙醇代替3分钟。
- 用蒸馏水冲洗各部分5分钟。当切片在水中洗涤时,确保通过过滤或脱脂苏木精表面用无绒毛擦拭来去除苏木精中的氧化颗粒。
- 用不起毛的专业级湿巾将载玻片支架中的多余水分印迹,并根据所需的染色偏好和试剂劣化,在50%苏木精(用蒸馏水1:1稀释)中染色载玻片2-5分钟。当溶液颜色从李子色变为蓝色/棕色或染色时间过长时,丢弃苏木精。用自来水冲洗载玻片20分钟。
- 通过多次快速浸渍载玻片,在1%酸乙醇(3.3mL盐酸与50 mL 70%乙醇)中使切片脱色。载玻片可以浸渍到3秒,但载玻片浸渍的时间越长,部分就越轻。
- 用自来水冲洗载玻片两次,每次1分钟,用去离子水冲洗一次。作为一种选择,滑梯可以在这个阶段过夜,浸泡在水中。
- 将切片浸入1.36%碳酸锂溶液(47克碳酸锂,3500毫升水)中3秒。确保不要过度孵育切片,因为碳酸锂溶液中的时间越长,组织漂浮的可能性就越大。
- 在自来水中冲洗切片5分钟,然后用不起毛的专业级湿巾擦拭载玻片支架上的多余水分。
- 将载玻片在100%即用型曙红中复染15-30秒,并立即用95%乙醇脱水两次,每次5分钟。用100%乙醇替换两次,每次5分钟,每次使用后丢弃溶液。
- 在二甲苯中清除切片15分钟,并重复两次,共3次。或者,载玻片可以在室温下在二甲苯中放置过夜,以更好地清除多余的水。
- 让载玻片在化学通风橱中风干,然后使用安装介质安装盖玻片以密封组织样品。
- 在显微镜下观察和成像染色的组织切片。仔细检查原发部位(头肾腺间区域)的肿瘤和鱼的其他组织和器官中的远处散发性转移。发送染色的载玻片,供病理学家检查组织切片。基于鱼类模型与人类神经母细胞瘤相似的病理特征,预计仅在 MYCN或MYCN中出现的肿瘤 ;LMO1 鱼首先被病理学家诊断为神经母细胞瘤。
7. 免疫组化分析(IHC)与针对NB标志物和过表达的转基因的抗体,进一步证实肿瘤的扩散及其交感肾上腺谱系特性
- 使用全自动染色系统进行染色
- 为了更好地将IHC结果与H&E染色的结果进行比较,请从步骤5.12中选择相邻的载玻片进行IHC染色。
注意:虽然自动染色系统可以更快,更省力地获得结果,但在没有IHC染色的情况下,可以通过参考第7.2小节的步骤使用手动协议进行IHC染色。 - 使用自动化系统的相应一抗稀释剂,根据所需浓度和所需总量稀释针对神经母细胞瘤标志物酪氨酸羟化酶 (TH) (1:500) 的一抗稀释。
注意:最佳抗体浓度可能因抗体和组织而异。 - 由于自动化系统使用机载热诱导抗原检索与表位检索溶液和系统相应的检测试剂20分钟,确保机器的参数设置为:过氧化物酶阻断,5分钟;具有所需浓度的一抗,15分钟;生物素化抗兔IgG二抗(1:500),8分钟;链霉亲和素HRP,8分钟;混合DAB强底物,5分钟;和苏木精,5分钟。
- 设置设置后,将抗体托盘放入机器中。通过创建新案例来设置幻灯片,该案例将标记幻灯片。机器现在已加载并准备运行(脱蜡,染色和复染)。
- 使用自动机器对载玻片进行脱蜡,染色和复染后,以70%,95%和100%的乙醇梯度对载玻片进行脱水,每次5分钟。将切片的载玻片再次浸入100%新鲜乙醇中5分钟。
- 在二甲苯中清除切片5分钟,两次,或将载玻片在二甲苯中过夜,以更好地清除多余的水。
- 让载玻片在化学通风橱中风干,然后使用安装介质安装盖玻片。用显微镜观察和成像染色的组织切片。
- 为了坚定地确认鱼类模型中的转移,将步骤7中用针对神经母细胞瘤标志物的抗体染色的载玻片与步骤6中H&E染色的载玻片进行比较。
注意:期望在H&E染色鉴定的所有肿瘤细胞中看到神经母细胞瘤标志物TH的阳性染色。预计在LMO1中鉴定出转移性肿瘤的邻近组织中,TH不会出现阳性染色 ;霉菌 毒素。确保选择与 MYCN年龄相似的控制WT和仅 MYCN鱼;LMO1 鱼进行这种分析,以排除转移性肿瘤是多灶性原发性肿瘤的可能性。
- 为了更好地将IHC结果与H&E染色的结果进行比较,请从步骤5.12中选择相邻的载玻片进行IHC染色。
- 手动染色,无需自动 IHC 染色系统
- 烘焙载玻片后,从步骤5.12中选择相邻载玻片,以便更好地比较H&E和IHC染色以脱蜡。在化学通风橱内,分别使用前面的步骤6.1和6.2.用二甲苯对载玻片进行脱蜡和再水化。
- 脱蜡和再水化后,将载玻片浸泡在内源性过氧化物封闭溶液(1x含有0.1%叠氮化钠和0.3%过氧化氢的PBS)中,在室温下浸泡5分钟。用新鲜的1x PBS洗涤载玻片3分钟,重复两次,共3次。
注意:叠氮化钠具有急性毒性。确保根据您所在机构的规定,采取预防措施并正确处置试剂。 - 通过在室温下将载玻片与蛋白酶K(1:500在1x PBS中)在溶液中孵育10分钟来检索抗原。用 1 次 PBS 洗涤载玻片 3 次,每次 3 分钟。
- 在室温下在摇杆上用5%山羊血清在1x PBS中孵育30分钟来阻断载玻片。用新鲜的1x PBS洗涤载玻片两次,每次3分钟。
- 将4滴Avidin阻断溶液直接加入载玻片上,并在室温下孵育15分钟。用新鲜的1x PBS洗涤载玻片后,每次3分钟,加入4滴生物素阻断溶液,并在室温下孵育15分钟。
- 阻塞载玻片后,在室温下孵育酪氨酸羟化酶(TH)(1:500)的一抗45-60分钟,或在4°C下过夜。
注意:用针对转基因和其他相关标志物的附加抗体染色,以解决原发肿瘤和其他转移部位的生理学和活性。最佳抗体浓度可能因抗体和组织而异。 - 用新鲜的1x PBS洗涤载玻片3分钟,重复两次,总共3次。
- 将载玻片孵育在生物素化的抗兔IgG二抗(1:500)中,在室温下在封闭溶液中稀释45-60分钟。重复上一个洗涤步骤7.2.7。
- 加入HRP偶联的Avidin(1x PBS中为1:300),并在室温下孵育20分钟。用新鲜的1x PBS清洗载玻片3次,每次5分钟。
- 准备3,3'-二氨基联苯胺(DAB)溶液(2.5毫升蒸馏水,1滴试剂盒缓冲液,1滴过氧化氢和2滴DAB),并将DAB滴剂直接滴在显微镜附近的载玻片上。加入DAB后,观察显微镜下载玻片上的颜色变化反应。一旦达到所需的染色强度,通过将玻片部分置于冷蒸馏水中来停止反应。
- 用新鲜的50%苏木精将样品浸没或浸渍短短几秒钟,然后放回蒸馏水中,用新鲜的50%苏木精复染载玻片。根据需要重复,但通常,一次应该足够了,因为组织切片很薄。
- 如前所述在步骤7.1.5中以酒精梯度对载玻片上的组织样品进行脱水,并继续完成其余步骤(最后一步为7.1.8)以完成IHC分析。
8. 石蜡载玻片红染色对肿瘤胶原蛋白积累的机制研究
- 重复步骤6.1-6.3以脱蜡,水合和洗涤载玻片上的石蜡部分。
- 用专业级无绒湿巾擦拭载玻片支架上的多余水分后,在50%苏木精中染色10分钟。用流动的自来水冲洗载玻片10分钟。
- 将载玻片转移到Picrosirius Red中并在室温下孵育1小时。
- 将载玻片在酸化水(5 mL冰醋酸在1L自来水或蒸馏水中)洗涤两次,在摇摇杯上孵育5分钟。
- 首先从载玻片中倒出大部分水,然后物理摇晃并吸走载玻片上的部分,以尽可能多地除去水。
- 快速将载玻片放入三个变化的100%乙醇中以脱水石蜡部分。
- 重复步骤6.10和6.11以清除二甲苯中的载玻片并安装样品。接下来,使用配备相机的复合显微镜进行成像。
- 使用ImageJ,在每个部分的至少三个随机字段中计算picrosirius红阳性胶原纤维。比较MYCN和MYCN的幻灯片;改性活生物体鱼类切片。
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Representative Results
为了确定LMO1是否与MYCN协同作用以影响NB发病机制,将驱动在dβh启动子控制的PSNS细胞中表达LMO1(dβh:LMO1和dβh:mCherry)或MYCN(dβh:EGFP-MYCN)表达的转基因构建体注射到斑马鱼胚胎中13。如图1A所示,在开发稳定的转基因品系并验证其基因型后,杂合MYCN和LMO1鱼进行了杂交。他们的后代分别在1 dpf或3-4 dpf下对MYCN(EGFP +)或LMO1(mCherry +)表达进行分类。MYCN过表达已被证明可以抑制PSNS的发展6。因此,EGFP-MYCN表达在1 dpf6的非PSNS多巴胺能神经元细胞中更为突出,例如颅神经节(CA),弓相关儿茶酚胺能神经元(AAC)和延髓(MO)。由于EGFP-MYCN蛋白的不稳定性,EGFP信号在2天后变暗。相比之下,从3 dpf及以后开始,mCherry表达在两个PSNS细胞中都很突出,例如上宫颈神经节和非PSNS多巴胺能神经元细胞,包括CA,AAC和MO。因此,MYCN和LMO1交配的后代对MYCN(EGFP+)的分类为1 dpf,对LMO1(mCherry +)的分类为3 dpf。将分类的鱼分为不同的基因型组,如下:i)MYCN,ii)LMO1,iii)MYCN;LMO1和iv)WT,并在相同的条件下升高。从4 wpf开始,后代每两周通过荧光显微镜筛查肿瘤的证据。在MYCN和LMO1过表达的复合转基因鱼中远离原发肿瘤部位的组织和器官中检测到荧光阳性肿瘤肿块,但在仅表达MYCN的转基因鱼中未检测到(图1B)。
为了进一步验证这些转基因动物的转移,含肿瘤的MYCN和MYCN;在5至9个月大时对LMO1转基因鱼进行石蜡切片和免疫组织化学分析,并使用针对神经母细胞瘤标志物TH的抗体进行免疫组织化学分析。MYCN的代表性结果;LMO1鱼如图2所示。矢状面的H&E染色显示,原发性肿瘤起源于腺间区域,斑马鱼相当于人类肾上腺,这是神经母细胞瘤患者中最常见的原发性疾病部位12,22(图2A,B)。肿瘤由具有高色核的微小,未分化和圆形癌细胞组成,通常形成组织学上与前面描述的人神经母细胞瘤相似的层6(图2A,B)。与荧光显微镜观察结果一致(图1B),在多个区域检测到远离肾间腺的广泛肿瘤肿块,包括:肾脏的远端部分(斑马鱼的原发性成年造血生态位,可与哺乳动物骨髓相媲美23)(图2A,C),眼眶(图2A,D),鳃(类似于哺乳动物肺24)(图2A,E),脾脏(类似于哺乳动物淋巴结25)(图2A和2F)和心房内壁(图2G)。这些转移中的许多都概括了高危神经母细胞瘤患者中常见的转移部位,包括骨髓,淋巴结,眼眶区域和肺13,23,24,25。使用针对TH的抗体进一步免疫组织化学证实了原发性肿瘤和所有转移位点处肿瘤细胞的PSNS神经母细胞谱系(图2H-M)。
为了更好地了解MYCN和LMO1在加速肿瘤转移扩散方面的协同作用背后的机制,发现在MYCN和LMO113过表达的情况下,参与肿瘤细胞与细胞外基质相互作用的一组基因的表达水平显着升高。为了检查细胞外基质是否确实受到LMO1过表达肿瘤中基因表达改变的影响,导致肿瘤扩散或迁移增强,仅MYCN和MYCN的石蜡切片;用Picrosirius red(PSR)染色LMO1肿瘤,这是一种对胶原纤维的高选择性染色剂,以评估胶原沉积和细胞外基质(ECM)硬度26,27。如图3A-E所示,在MYCN中发现的PSR染色胶原纤维的量显着扩增和厚度增加;LMO1肿瘤,与仅单独表达MYCN的肿瘤相比。总之,这些结果表明,LMO1的过表达可以重塑肿瘤ECM以增加其硬度,从而促进肿瘤细胞扩散。
图1: MYCN 和 LMO1 转基因斑马鱼品系育种后代肿瘤筛查试验图示。 (A) MYCN 和/或 LMO1过表达稳定转基因鱼用于神经母细胞瘤研究的分选和肿瘤筛查示意图。 上图:受精后1天EGFP-MYCN + 胚胎的代表性图片(dpf)(左侧为背视图,右侧为侧视图)。 下图:3 dpf下mCherry-LMO1 + 胚胎的代表性图片(左侧为侧视图,右侧为腹侧视图)。AAC,弓相关的儿茶酚胺能神经元;CA,颅神经节;和MO,延髓。比例尺,100 μm。用 BioRender.com(B)共表达 LMO1 和 MYCN 创建,促进神经母细胞瘤转移。 左图:36月龄时, 单纯MYCN(MYCN)过度表达并伴有表达EGFP的肿瘤(白色箭头)。 右图:转基因鱼类过度表达 MYCN 和 LMO1(MYCN;LMO1)在36月龄时在原发部位(IRG,白色箭头)和多个转移位点(实心箭头)具有mCherry阳性肿瘤肿块。比例尺,1 毫米。 请单击此处查看此图的大图。
图2: MYCN 和 LMO1 的共过表达促进转基因斑马鱼模型中神经母细胞瘤的远处转移。 (A-G)MYCN的H&E染色矢状切片 ;改性活生物体1 转基因鱼在6个月大时。(H-M)MYCN免疫组织化学分析的放大视图 ;LMO1 转基因鱼在矢状组织切片中,使用酪氨酸羟化酶(TH)抗体。白色框勾勒出腺间腺体(b,h),在 B 和 H面板中具有放大视图。在肾骨髓(c,i, C和 I ,带有纯黑色箭头),眼睛的巩膜(d,j, D和 J ,黑色轮廓和白色填充的开放箭头),鳃(e,k, E和 K ,黑色轮廓和白色填充的开放箭头),脾脏(f, l, F和 L ,带有纯黑色箭头),中发现了播散性肿瘤细胞, 和心室(G 和 M ,黑色轮廓和白色填充的双箭头)。比例尺,100 μm (A) 和 50 μm (B-M)。该图由Zhu,S.等人修改,LMO1与MYCN协同促进神经母细胞瘤的发生和转移。癌细胞。32, 310-323 (2017)13. 请点击此处查看此图的放大版本。
图3:在斑马鱼模型中,LMO1表达的增加促进了胶原沉积和ECM僵硬,从而促进了肿瘤细胞的扩散。 (A-D)仅由MYCN(A,B)或MYCN中由Picrosirius red(PSR)染色的胶原纤维的代表性光学显微镜图像;LMO1(C,D)转基因斑马鱼。(B)和(D)从(A)和(C)的盒装区域放大,分别使用箭头(A和B)和箭头(C和D)来表示PSR阳性胶原纤维。比例尺,100 μm(A 和 C)和 50 μm(B 和 D)。(E)仅对MYCN或MYCN肿瘤切片上的PSR染色区域进行定量;改性活生物体转基因鱼。结果归一化为仅MYCN肿瘤中PSR染色区域的平均值。统计数据显示为仅三个MYCN或三个MYCN的平均±SD;LMO1肿瘤;p = 0.02 通过双尾 t 检验。该图由Zhu,S.等人修改,LMO1与MYCN协同促进神经母细胞瘤的发生和转移。癌细胞。32, 310-323 (2017)13.请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
在过去的几十年里,斑马鱼一直被普遍用于研究,特别是在癌症研究中,原因显而易见,例如其易于维护,强大的繁殖以及 体内成像的 明显优势1,28。由于斑马鱼模型的外部受精和发育,它们可以很容易地在胚胎上纵,这与哺乳动物模式生物(如大鼠和小鼠)相辅相成,用于大规模的遗传研究 1 , 2 , 3 。此外,斑马鱼基因组与人类基因组具有高度的相似性。将斑马鱼基因组的详细注释与人类参考基因组进行比较,大约70%的人类基因已被证明可以获得斑马鱼正交菌29。此外,斑马鱼在研究中的其他用途已扩展到药物发现和患者化身,以进行个体化癌症治疗30,31。越来越多的研究表明,斑马鱼中诱导的肿瘤在组织学和分子水平上与人类肿瘤相似,这可以帮助解剖肿瘤的起始,进展和异质性32,33。总之,斑马鱼作为一种有价值的动物模型显示出巨大的潜力,可用于研究转移并阐明与疾病发病机制有关的可能的致癌途径。
利用转基因斑马鱼模型,同时对LMO1和MYCN进行过表达,这两种癌基因在NB肿瘤发生和转移中的合作已经得到明确证明。随着当今强大的现场成像技术的可用性,肿瘤筛查可以每两周进行一次,并且可以随着时间的推移追踪转移。广泛的转移也可以通过石蜡切片和抗体染色进一步确认。引人注目的是,在MYCN中检测到转移;LMO1 斑马鱼与高危 NB 病例中常见的转移部位(如骨髓、淋巴结、眼眶和肺)的相关性良好,进一步支持斑马鱼作为转移研究的可行和有益模型。
此外,由于体型相对较小,整个斑马鱼可以完全切片,这是该模型的另一个明显优势,可以彻底表征原发性肿瘤以及身体其他区域的转移。肿瘤切片的短静脉红染色清楚地突出了鱼类肿瘤中的胶原网络,并显示出 LMO1 过表达肿瘤中细胞外基质的硬度增加。虽然这种技术并非斑马鱼所独有,但它的应用与对经过基因改造或移植肿瘤细胞的斑马鱼胚胎的高通量化合物筛选相结合,可能为筛选可能靶向细胞外基质重塑的有效化合物提供一种新方法,这是肿瘤细胞转移的关键过程。
稳定的转基因斑马鱼模型对于我们了解候选癌基因对体内肿瘤发展的贡献非常有帮助,尽管开发这些品系可能具有挑战性和费力。创建稳定的转基因品系需要很长一段时间,因为在品系传播之前必须获得多代。此外,传播这些品系可能很繁琐,可能需要战略交配计划。例如,一旦肿瘤发展,MYCN转基因鱼的生产力通常会显着降低,并且纯合MYCN转基因鱼不能很好地存活到成年期。因此,为了更好地维持MYCN转基因鱼系,建议在较年轻时用WT或其他转基因鱼系(如LMO1转基因鱼系)超越杂合子非肿瘤MYCN转基因鱼系。为了克服开发和维持稳定的转基因鱼系的挑战,镶嵌瞬时转基因可能是快速有效地评估单个基因或基因组合对主要注射鱼的肿瘤启动和进展的贡献的替代方法。此外,原代注射鱼中转基因整合的镶嵌模式可能更好地模仿疾病发病机制,特别是由体细胞事件诱导的发病机制36。
然而,就像研究癌症的任何其他动物模型一样,斑马鱼也有其缺点。例如,专门针对斑马鱼蛋白的抗体在很大程度上仍未开发,尽管几种针对神经母细胞瘤标记基因的抗体(如酪氨酸羟化酶、突触素和HuC)在斑马鱼中表现良好6,13。为了解决这个问题,许多供应商已经开始测试他们的产品,并预测他们的抗体与斑马鱼蛋白交叉反应的潜力。有关经过验证的抗体的更多信息也可以在斑马鱼信息网络(ZFIN)中找到。通过这些努力,越来越多的能够特异性检测斑马鱼蛋白的抗体将很快被斑马鱼社区所接受。使用斑马鱼作为遗传模型来剖析NB发病机制中复杂信号通路的相互作用的另一个挑战是其部分复制的基因组。这种基因组复制发生在斑马鱼的自然祖先中37,38,通常会导致斑马鱼同系物的多种变异到人类。这可能导致动物模型中新基因功能或独特表达模式的进化增益39。因此,在研究在肿瘤抑制中具有潜在作用的基因时,可能需要同时敲除重复基因的多个等位基因以证明其肿瘤抑制功能,这可能是一项可能耗时且技术上具有挑战性的工作。
尽管如此,转基因斑马鱼模型可以忠实地概括 体内肿瘤转移的所有阶段,在肿瘤播散的遗传分析和实时成像方面具有明显的优势。因此,该模型系统为我们提供了一个独特的工具,可以解决该领域的许多令人生畏的问题,例如肿瘤扩散和 体内 转移的多步骤过程背后的分子和细胞事件是什么,NB细胞何时从原发性肿瘤扩散,以及肿瘤微环境如何导致NB转移。由于斑马鱼在药物筛选和测试方面的稳健性,鱼类模型还将为评估新型药物和抑制剂预防或治疗转移性NB的功效提供有价值的手段。
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Disclosures
作者声明他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了国家癌症研究所的R01 CA240323(S.Z.)资助;美国国防部(DoD)的拨款W81XWH-17-1-0498(S.Z.);V癌症研究基金会(S.Z.)的V学者奖和梅奥生物医学发现中心(S.Z.)的平台资助;以及梅奥诊所癌症中心和个性化医学中心(S.Z.)的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit | Vector | SK-4100 | |
Acetic Acid | Fisher Scientific / Acros Organic | 64-19-7 | |
Agarose GP2 | Midwest Scientific | 009012-36-6 | |
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Pel-Freez | P40101 | |
Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
BOND Intense R Detection | Leica Biosystems | DS9263 | |
BOND primary antibody diluent | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | AR9352 | |
BOND-MAX IHC instrument | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | N/A | fully automated IHC staining system |
CH211-270H11 BAC clone | BACPAC resources center (BRFC) | N/A | |
Compound microscope equipped with DP71 camera | Olympus | AX70 | |
Cytoseal XYL (xylene based mounting medium) | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
Eosin | Leica | 3801601 | ready-to-use (no preparation needed) |
Ethanol | Carolina | 86-1263 | |
Expand Long Template PCR System | Roche Applied Science, IN | 11681834001 | |
Gateway BP Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11789-020 | |
Gateway LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11791-100 | |
Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated) | Dako | E0432 | |
Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | HHS-32-1L | |
HRP Avidin D | Vector | A-2004 | |
Hydrochloric Acid | Aqua Solutions | 4360-1L | |
Hydrogen Peroxide, 3% | Fisher Scientific | H324-500 | |
I-SceI enzyme | New England Biolabs, MA | R0694L | |
Kanamycin sulfate | Teknova, Inc. | K2150 | |
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 34133 | |
Lithium Carbonate | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | 554-13-2 | |
Microtome for sectioning | Leica Biosystems | RM2255 | |
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
p3E-polyA | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.) |
Parafin wax | Surgipath Paraplast | 39603002 | Parrafin to parafin |
Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 | |
pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites) | Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany | N/A | a generous gift |
pDONR 221 gateway donor vector | Thermo Fisher Scientific | 12536-017 | |
pDONRP4-P1R donor vector | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift |
Phenol red, 0.5% | Sigma Aldrich | P0290 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X | BioRad | 1610780 | |
Picrosirrius red stain kit | Polysciences | 24901-250 | |
pME-mCherry | Addgene | 26028 | |
Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Roche | 21712520 | |
QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
RDO Rapid Decalcifier | Apex Enginerring | RDO04 | |
Sodium Azide (NaN3) | Sigma Aldrich | 26628-22-8 | |
Stereo fluorescence microscope | Leica | MZ10F | |
Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging | Nikon | SMZ-1500 | |
Taq DNA Polymerase | New England Biolabs, MA | M0273L | |
Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor | Sakura | N/A | Model #: VIP-6-A1 |
Tricaine-S | Western Chemical Incorporated | 20513 | |
Xylene | Thermo Fisher Scientific | X3P1GAL |
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