Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Zebrafisk model af neuroblastom metastase

Published: March 14, 2021 doi: 10.3791/62416
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic College of Medicine, Mayo Clinic Cancer Center

Summary

Dette papir introducerer metoden til at udvikle, karakterisere og spore i realtid tumormetastasen i zebrafiskmodellen af neuroblastom, specifikt i den transgene zebrafisklinje med overekspression af MYCN og LMO1, som udvikler metastase spontant.

Abstract

Zebrafisk har vist sig som en vigtig dyremodel til at studere menneskelige sygdomme, især kræft. Sammen med de robuste transgene og genomredigeringsteknologier, der anvendes i zebrafiskmodellering, gør den lette vedligeholdelse, produktiviteten med højt udbytte og kraftfuld levende billeddannelse zebrafisken til et værdifuldt modelsystem til at studere metastase og cellulære og molekylære baser, der ligger til grund for denne proces in vivo. Den første zebrafisk neuroblastom (NB) model af metastase blev udviklet ved at overudtrykke to onkogener, MYCN og LMO1, under kontrol af dopamin-beta-hydroxylase (dβh) promotoren. Co-overudtrykt MYCN og LMO1 førte til reduceret latenstid og øget penetrans af neuroblastomagenese samt accelereret fjern metastase af tumorceller. Denne nye model gentager pålideligt mange nøgletræk ved human metastatisk NB, herunder inddragelse af klinisk relevante og metastase-associerede genetiske ændringer; naturlig og spontan udvikling af metastase in vivo; og bevarede steder af metastaser. Derfor har zebrafiskmodellen unikke fordele ved at dissekere den komplekse proces med tumormetastase in vivo.

Introduction

Zebrafisk har været meget udbredt og anvendt på flere forskningsområder, især inden for kræft. Denne model giver mange fordele - såsom dens robuste reproduktion, omkostningseffektive vedligeholdelse og alsidige visualisering af tumorvækst og metastase - som alle gør zebrafisk til et kraftfuldt værktøj til at studere og undersøge de cellulære og molekylære baser af tumorgenese og metastase. Nye teknikker til kortlægning af genomkortlægning i stor skala, transgenese, gener overekspression eller knockout, celletransplantation og kemiske skærme har enormt øget zebrafiskemodellens kraft1. I løbet af de sidste par år er mange zebrafisklinjer blevet udviklet til at studere tumorgenese og metastase af en række humane kræftformer, herunder, men ikke begrænset til, leukæmi, melanom, rhabdomyosarkom og hepatocellulært carcinom2,3,4,5. Derudover blev den første zebrafiskmodel af neuroblastom (NB) genereret ved at overudtrykke MYCN, et onkogen, i det perifere sympatiske nervesystem (PSNS) under kontrol af dopamin-beta-hydroxylase (dβh) promotoren. Med denne model blev det yderligere påvist, at aktiveret ALK kan synergisere med MYCN for at fremskynde tumordebut og øge tumorpenetrans in vivo6.

NB er afledt af sympatodyrerne i de neurale kamceller og er en meget metastatisk kræft hos børn7. Det er ansvarligt for 10 % af de pædiatriske kræftrelaterede dødsfald8. Bredt metastaseret ved diagnosen kan NB klinisk præsenteres som tumorer, der primært stammer fra kæden af de sympatiske ganglier og binyremedulla af PSNS9,10. MYCN-forstærkning er almindeligvis forbundet med dårlige resultater hos NB-patienter11,12. Desuden er LMO1 blevet identificeret som et kritisk NB-modtagelighedsgen i højrisikotilfælde13,14. Undersøgelser viste, at den transgene coexpression af MYCN og LMO1 i PSNS i zebrafiskmodellen ikke kun fremmer tidligere debut af NB, men også inducerer udbredt metastase til væv og organer, der ligner steder, der almindeligvis ses hos patienter med højrisiko NB13. For nylig er en anden metastatisk fænotype af NB også blevet observeret i en nyere zebrafiskmodel af NB, hvor både MYCN og Lin28B, der koder for et RNA-bindende protein, overudtrykkes under kontrol af dβh-promotoren16.

Den stabile transgene tilgang i zebrafisk bruges ofte til at undersøge, om overekspression af et gen af interesse kan bidrage til den normale udvikling og sygdomspatogenese14,15. Denne teknik er blevet anvendt med succes til at demonstrere betydningen af flere gener og veje til NB tumorgenese6,16,17,18,19,20. Dette papir vil introducere, hvordan den transgene fiskelinje, der overudtrykker både MYCN og LMO1 i PSNS, blev oprettet, og hvordan det blev påvist, at samarbejdet mellem disse to onkogener fremskynder starten på NB-tumorgenese og metastase13. For det første blev den transgene linje, der overudtrykker EGFP-MYCN under kontrol af dβh-promotoren (betegnet MYCN-linjen), udviklet ved at injicere dβh-EGFP-MYCN-konstruktionen i encellestadiet af vildtype(WT) AB-embryoner, som tidligere beskrevet6,17. En separat transgen linje, der overudtrykker LMO1 i PSNS (betegnet LMO1-linjen), blev udviklet ved at sammensmelte to DNA-konstruktioner, dβh-LMO1 og dβh-mCherry, i WT-embryoner på encellestadiet13. Det er tidligere blevet påvist, at sammenfaldende dobbelte DNA-konstruktioner kan sammensmeltes i fiskegenomet; derfor er LMO1 og mCherry coudtrykt i PSNS-cellerne hos de transgene dyr. Når de injicerede F0-embryoner nåede seksuel modenhed, blev de derefter krydset med WT-fisk til identifikation af positive fisk med transgen (er) integration. Kort fortalt blev F1-afkomene først screenet ved fluorescerende mikroskopi for mCherry-ekspression i PSNS-cellerne. Kimlineintegrationen af LMO1 i mCherry-positive fisk blev yderligere bekræftet af genomisk PCR og sekventering. Efter en vellykket identifikation af hver transgen linje blev afkom af heterozygote MYCN- og LMO1-transgene fisk blandet ind i hinanden for at generere en sammensat fiskelinje, der udtrykte både MYCN og LMO1 (betegnet MYCN; LMO1-linje). Tumorbærende MYCN; LMO1-fisk blev overvåget ved fluorescerende mikroskopi hver anden uge for tegn på metastatiske tumorer i de regioner, der er fjernt fra det primære sted, interrenal kirtelregion (IRG, zebrafisk ækvivalent med human binyre)13. At bekræfte metastasen af tumorer i MYCN; LMO1 fisk, histologiske og immunhistokemiske analyser blev anvendt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forskningsmetoder ved hjælp af zebrafisk og dyrepleje / vedligeholdelse blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer på Mayo Clinic.

1. Forberedelse og mikroinjektion af transgene konstruktioner til udvikling af LMO1 transgen zebrafiskelinje med overekspression i PSNS

  1. For at udvikle LMO1-pDONR221-indgangsklonen skal den kodende region af human LMO1 fra cDNA opnået fra human cellelinje ved hjælp af PCR.
    1. Lav en 25 μL reaktion som beskrevet her: 2,5 μL 10x standard Taq Reaction Buffer, 0,125 μL Taq DNA Polymerase, 0,5 μL af 10 mM dNTPs, 2 μL cDNA skabelon, 0,5 μL af 10 μM fremad LMO1 ATTB1 primer, 0,5 μL af 10 μM omvendt LMO1 ATTB2 primer og 18,875 μL vand.
      BEMÆRK: Brug fremadrettet LMO1 ATTB1-primer: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACAC-3'.
      CATGATGGTGCTGGACAAGGAGGA-3' og omvendt LMO1 ATTB2-primer: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTACT
      GAACTTGGGATTCAAAGGT-3'
    2. Amplify ved hjælp af følgende program: 1 cyklus på 94 °C, 2 min; efterfulgt af 30 cyklusser på (94 °C, 30 s, 55 °C, 30 s, 72 °C, 1 min)) og 72 °C, 7 min.
  2. Klon LMO1 PCR-produkt i pDONR221 gateway-donorvektoren ved BP-rekombinasereaktion6,13 (PCR-fragment + donorvektor = indgangsklon).
    1. Til en 10 μL-reaktion blandes 1 μL oprenset LMO1 PCR-produkt (150 ng/μL), 1 μL (150 ng/μL) pDONR221-donorvektor og 6 μL TE-buffer (pH 8,0) med 2 μL BP-enzymblanding, inkuberes i 1 time ved 25 °C og omdannes til TOP10-kompetent E. coli ved hjælp af producentens protokol.
    2. Derefter spredes 50-200 μL fra transformationshætteglasset på en Luria Broth (LB) agarplade indeholdende 50 μg / ml kanamycin og inkuberes ved 37 ° C natten over.
    3. Vælg kloner ved at inokulere en enkelt koloni i 2-5 ml LB med 50 μg/ml kanamycin og dyrke natten over (16-18 timer) ved 37 °C.
    4. Brug 2 ml bakteriekultur natten over til plasmidisolering i henhold til producentens protokol. For at verificere LMO1-plasmidet sendes plasmidprøven ud til sekventering med M13-F-primer (5- GTAAAACGACGGCCAG-3').
  3. For at generere en dβh-pDONRP4-P1R-indgangsklon opnås dβh PCR-produkt6,13 ved at forstærke 5,2-kb promotorregionen ved hjælp af CH211-270H11 BAC-klonen som skabelon til fremstilling af en 20 μL-reaktion som tidligere beskrevet i trin 1.1.1. Brug følgende PCR-programparametre: 94 °C, 2 min; 10 cyklusser på 94 °C, 15 s, 50 °C, 30 s, 68 °C, 8 min 30 cyklusser på 94 °C, 15 s, 53 °C, 30 s, 68 °C, 8 min 68 °C, 4 min (med fremadrettet primer 5'GGGGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTC
    CCCCTTTTTAGG-3' og omvendt primer 5'-GGGGACTGCTTTTTTTGTTTGTTGTGTTGCTTTG
    TCGTCTTTTGA-3').
    BEMÆRK: På grund af de lange DNA-skabeloner i dette trin skal du sikre brugen af et passende PCR-system til nøjagtig PCR-amplifikation.
  4. Klon dβh PCR-produkt i pDONRP4-P1R-gatewaydonorvektoren ved BP-rekombinasereaktion6,13 (PCR-fragment + donorvektor = indgangsklon).
    1. 1 μL oprenset dβh PCR-produkt (172 ng/uL), 1 μL (150 ng/μL) pDONRP4-P1R-donorvektor og 6 μL TE-buffer (pH 8,0) med 2 μL BP-enzymblanding i i alt 10 μL-reaktion, inkuber i 1 time ved 25 °C.
    2. Transformer til TOP10 kompetent E. coli i henhold til producentens protokol. Plasmidet som beskrevet i trin 1.2.2-1.2.4 isoleres, og plasmid verificeres ved sekventering med grunderne M13-F (5'-GTAAAACGACGGCCAG-3') og M13-R (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3').
  5. Generer dβh:LMO1-udtrykskonstruktionen .
    1. Kombiner 1 μL af hver indgangsklon (dβh-pDONRP4-P1R, LMO1-pDONR221 og p3E-polyA11) (20 fmol hver), 1 μL (60 ng/μL) modificeret destinationsvektor med I-SceI-genkendelsessteder og 4 μL TE-buffer (pH 8,0) indeholdende 2 μL af LR-rekombinaseenzymblandingen. Inkuber denne blanding i 1 time ved 25 °C.
    2. Mens du følger producentens protokol, omdannes bakterier til kemisk kompetent TOP10 E. coli. Plasmid som beskrevet i trin 1.2.2-1.2.4 isoleres, og plasmid verificeres ved sekventering med DBH Forward (5'-GAAGCTGTCACAGGGTTGTG-3') og LMO1 (5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA-3') primere.
  6. Generer dβh:mCherry DNA-konstruktion med et gateway-system ved at kombinere indgangskloner af en 5,2-kb dβh-promotor, pME-mCherry og p3E-polyA i den modificerede destinationsvektor, der indeholder I-SceI-genkendelsessteder som tidligere nævnt i trin 1.5.16. Plasmid som beskrevet i trin 1.2.2-1.2.4 isoleres, og plasmid verificeres ved sekventering med DBH Forward-primer (5'-GAAGCTGTCACAGGGTTGTG-3').
  7. Lineærisere dβh:LMO1 DNA-konstruktion og dβh:mCherry DNA-konstruktion (i henholdsvis et 3:1-forhold) i alt et 15 μL reaktionsvolumen med 1 μL I-SceI-enzym (5 U/μL) og 0,75 μL buffer (10x) og inkubere ved stuetemperatur i mindst 4 timer eller natten over. Sørg for, at DNA-koncentrationen ikke overstiger 750 ng i reaktion.
  8. Næste dag og efter linearisering af konstruktioner tilsættes 0,5 μL frisk I-SceI-enzym (5 U / μL) og 0,5 μL 0,5% phenolrødt til 5 μL af den samlede DNA-blanding fra forrige trin på 1,7. Mikroinjekter den samlede opløsning (af 50-80 pg lineariseret DNA) i en-celle-fase vildtype AB-embryoner (og så mange som 500 embryoner) ved hjælp af glasmikropipettenål med en diameter på 1,0 mm som tidligere beskrevet17. Den resterende DNA-blanding opbevares ved -20 °C til fremtidige injektioner.

2. Screene og verificere LMO1 transgen fiskelinje til kimlinjeoverførsel af LMO1 og mCherry

  1. Ved 3-4 dage efter befrugtning (dpf) skal injicerede embryoner med 0,02% tricain og screene dem for fluorescerende mCherry-ekspression, som præsenterer overalt i fiskekroppen på grund af mosaiktransgenesen. Overfør mKirserkidspositive embryoner til en petriskål med frisk æggevand og hæv embryoner til seksuel modenhed i overensstemmelse med zebrafiskebogen21.
    BEMÆRK: Forvent, at forholdet mellem positive fisk varierer afhængigt af forskningspersonalets ekspertise og erfaring. For eksempel kan begyndende amatører have en lav integrationsrate på 10% sammenlignet med en eksperts på ≥50%.
  2. For at bestemme grundlæggerfisken med dβh:LMO1 og dβh:mCherry transgener integreret i kimceller, skal du krydse enkelte par injicerede mCherry-positive F0 seksuelt modnede fisk fra forrige trin (2.1) med WT AB fisk. ScreenE F1-generationen for mCherry-positive embryoner ved 3-4 dpf.
  3. For at bekræfte, at de mCherry-positive fisk bærer LMO1-transgen , isoleres gDNA fra F1 mCherry-positivt enkelt embryo ved hjælp af gDNA-ekstraktionsbufferen, som indeholder: 12,5 μL 4x lysisbuffer (500 μL af 1 M Tris med pH på 8,4, 2,5 ml 1 M kaliumchlorid og 47 ml renset vand), 35 μL renset vand, og 2,5 μL proteinase K ved 10 mg/ml. Prøven inkuberes i 16 timer ved 55 °C efterfulgt af 10 minutter ved 98 °C.
  4. Anvend det ekstraherede gDNA (2 μL) som skabelon for genolysnings-PCR med primere: LMO1 FW: 5'-GGCATTGGACAAGTACTGGCA -3' og LMO1 RV: 5'-CGAAGGCTGGGATCAGCTTG -3' og følgende PCR-program: 1 cyklus på 94 °C, 10 min; 35 cyklusser på (94 °C i 30 s, 60 °C i 30 s; 68 °C, 30 s) og 68 °C i 7 min. Bekræft det forstærkede 182 bp fragment ved sekventering.
  5. Efter bekræftelse af genotypen hæves de resterende mCherry-positive F1-embryoner til modenhed i overensstemmelse med standardretningslinjerne i zebrafiskebogen21. Finklip og genotype dem ved 2-3 måneders alderen ved hjælp af trin 2.3-2.4 fra protokollen ovenfor for yderligere at bekræfte integrationen af LMO1-transgenet i fisken.
    BEMÆRK: Den LMO1-positive F1-fisk vil være den stabile transgene fisk [Tg(dβh:LMO1),Tg(dβh:mCherry)] (betegnet som LMO1-linje ).
  6. Opdræt F1 LMO1 stabile transgene fisk med WT fisk og gentag efter behov for at formere denne linje.

3. Udkrydsning af LMO1 og MYCN transgene linjer for at skabe metastatisk model

  1. Når den transgene LMO1-zebrafiskeline er genereret, krydser den med MYCN-line6,17 for at udvikle heterozygot transgen fiskeline, der overudtrykker både MYCN og LMO1.
  2. Ved 1 dpf sorteres afkom af outcross for EGFP-ekspression med stereoskopisk fluorescensmikroskop, der præsenterer som EGFP-positive punkter i baghjerneområdet.
    BEMÆRK: Alternativt, hvis ikke alle embryoner sorteres efter MYCN ved 1 dpf, hæves embryonerne til voksenalderen og genotypen ved finklipning og ved hjælp af tidligere angivne retningslinjer fra trin 2.3-2.4 for gDNA-isolering og PCR-genotypning med primere: MYCN-F (5'-ATT CAC CAT CAC TGT GCG TCC-3'); MYCN-R (5'-TGC ATC CTC ACT CTC CAC GTA-3' og følgende program med standard Taq-polymerase : 1 cyklus på 94 °C i 3 minutter, 35 cyklusser (94 °C i 30 s, 60 °C i 30 s og 68 °C i 3 minutter) og 68 °C i 7 minutter med forventet ampliconstørrelse på 145 bp.
  3. Efter sortering for EGFP ved 1 dpf isoleres screenede embryoner i separate petriskåle og mærker fade som: MYCN+ (EGFP-positiv) eller MYCN- (EGFP-negativ).
  4. Ved 3-4 dpf visualiseres og sorteres embryoner fra begge grupper (trin 3.3) til LMO1-ekspression med et stereoskopisk fluorescensmikroskop. Kig efter rød fluorescerende proteinekspression som pletter i både den overlegne cervikale ganglion og ikke-PSNS dopaminerge neuronale celler i hovedområdet, især i oblongata medulla i baghjernen6,13.
    BEMÆRK: Skærm for mCherry/LMO1, før embryoner når 5 dpf, fordi luftfyldte svømmeblærer udvikler sig fuldt ud inden da og vil få embryonerne til at flyde, hvilket resulterer i vanskelig mikroskopisk fokusering af PSNS-cellerne under sorteringsprocessen.
  5. Når sorteringen er afsluttet, isoleres sorteret fisk i fire grupper af forskellige genotyper og mærkes som nedenfor. Hæv de sorterede fisk under identiske forhold i henhold til standardprotokollerne fra zebrafiskebogen21.
    1. Kun MYCN (EGFP-positiv),
    2. LMO1-kun (mCherry-positiv),
    3. MYCN; LMO1 (EGFP og mCherry dobbelt positiv),
    4. WT (EGFP og mCherry dobbelt negativ).

4. Visualisering af tumorbyrde i transgene zebrafisklinjer

  1. Ved 4 uger-efter-befrugtning (wpf) anæstesi sorteret fisk fra trin 3,5 med 0,02% tricain i en petriskål.
  2. Visualiser tumorer med et stereoskopisk fluorescensmikroskop ved forsigtigt at vende fisk med en metalspatel på begge laterale sider for at se tumor. Forvent tumorer at præsentere som enkelt EGFP-, enkelt mCherry- eller dobbelt EGFP-og-mCherry-positive masser, der stammer fra interrenal kirtelområdet (nær hoved og nyre).
    BEMÆRK: Det er muligt, at den indledende tumordebut typisk præsenteres med en lysere og større fluorescenspositiv masse på den ene side af interrenal kirtel, hvorfor det er afgørende at visualisere begge sider af fisken for at undgå manglende tidlig tumordebut.
  3. Efter identifikation af den mulige tumorbærende fisk isoleres fisk i en separat tank med passende etiketter, som omfatter fødselsdato, dato, hvor tumor screenet og genotype.
  4. Ved 6 wpf gentages de foregående trin 4.1-4.3 for at screene tumorbærende fisk og ikke-tumorbærende fisk igen for at bekræfte tilstedeværelsen af tumorer for tidligere screenede tumorbærende fisk eller identificere henholdsvis nye mulige tumorbærende fisk. Se efter vedvarende eller øget størrelse af fluorescens-positiv masse i bekræftet tumorbærende fisk.
  5. Efter at have identificeret tumorbærende fisk, skal du overvåge dem hver anden uge for tegn på tumorcellemigration, som præsenterer sig som små EGFP- og / eller mCherry-positive tumormasser langt fra det primære sted for tumorgenese (interrenal kirtelregion). Isoler disse fisk i separate tanke efter behov og mærk passende for at indikere mulig metastase.
  6. For yderligere at bekræfte metastasen skal du fortsætte med at spore disse fisk regelmæssigt (hver anden uge), indtil de fjerne fluorescenspositive tumormasser viser klart øget størrelse, hvilket indikerer vækst af tumorer i de metastatiske steder.

5. Vævsbehandling og paraffinsnit af tumorbærende fisk

BEMÆRK: Udfør dette trin for at karakterisere de spontant udviklede primære og / eller metastatiske tumorer i MYCN og MYCN; LMO1 transgen fisk.

  1. Efter identifikation og verifikation af tumorbærende fisk ofres fisk fra trin 4.6 i en petriskål ved at nedsænke fisk i 0,02% tricain for først at bedøbe og derefter øge trikaindosis, indtil fisken ikke længere respirerer. Skær fisken i to stykker - med et stykke indeholdende hovedet og en del af kroppens midterste sektion (inklusive tumor) og et andet stykke med resten af fiskens midterste sektion og hale.
  2. Fastgør begge fiskesektioner med 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS i 1 time ved stuetemperatur på en vippe. For at øge fikseringseffektiviteten skal du udskifte bufferen med frisk 4% PFA for at øge penetransen til de indre organer effektivt og hurtigt. Lad fisk stå med frisk fikseringsbuffer på en vippe ved 4 °C natten over eller i 48 timer.
    FORSIGTIG: PFA er giftigt. Da forsigtighedsprocedurer og korrekt bortskaffelse af reagens afhænger af din institutions regler, skal du søge passende retningslinjer, inden du bruger og bortskaffer reagens.
  3. Før behandlingen anbringes prøve(r) i 100 % hurtig afkalkningsmiddelopløsning i 15-20 minutter ved stuetemperatur. Sørg for at bruge en ikke-metalbeholder og kontrollere prøve (r) under inkubation for at forhindre overforkalkning. Hvis prøvevævet ser stærkt nedbrudt ud, anbringes prøven i vand eller ved 4 °C for at bremse afkalkningsprocessen.
  4. Når den er fastgjort og afkalket, vaskes fiskeprøve(r) med rindende ledningsvand i 1 time og anbringes i processorkassette(r). Hvis der er mere end en prøve, skal du adskille hver i sin egen kassette.
  5. Dehydrere og forberede vævet til paraffinindlejring ved at anbringe kassette(r) med fisk i vævsprocessoren, hvor prøven/prøverne er nedsænket i forskellige opløsninger, henholdsvis som følger: 70 % ethanol (60 min, 40 °C), 85 % ethanol (50 min, 40 °C), 95 % ethanol (40 minutter, 40 °C) to gange, 100 % ethanol (30 min, 40 °C), en anden frisk opløsning af 100 % ethanol (50 min. 40 °C) to gange, xylen (30 min, 40 °C), en anden frisk opløsning af xylen (50 min, 40 °C), en anden frisk xylen (50 min, 45 °C), paraffin (30 min, 45 °C), paraffin (20 min, 58 °C) tre gange.
  6. Når vævet er behandlet, skal du aflæse kassetten (e) fra processormaskinen, samtidig med at organiseringen af hver kassette opretholdes og sørger for at forhindre blanding af fiskeprøverne.
  7. Vælg den passende størrelse form baseret på fiskens størrelse, og sørg for, at formen passer til hele kassetten med fiskeprøven. Dæk bunden af formen med flydende paraffin ved 60 °C.
  8. Placer straks kassetten med fisken oven på formen (sørg for, at fisken lægges på sin flade laterale side til sagittale sektioner) med flydende paraffin, og afslut med at fylde med paraffin til toppen af formen for at indlejre fisken fuldstændigt.
  9. Anbring den færdige form på den kolde plade af sektioneringsmikrotomet, indtil paraffinen er hærdet.
  10. Når paraffinblokken er hård, hvilket kan bedømmes ved visuelt at observere højere opacitet og et fast tryk på blokken, skal du forsigtigt fjerne blokken fra formen. Skrab forsigtigt overskydende paraffin af fra kassettens sider.
  11. Sektion af den paraffinindlejrede fiskeblok skytten ved 4 mikron på mikrotomet og flyd sektionerne på et varmtvandsbad ved 40 °C indeholdende destilleret vand.
  12. Overfør forsigtigt sektionerne på positivt ladede dias og bages i ovnen ved 60 ° C i 30 minutter før farvning, inden du fortsætter til enten trin 6, 7 eller 8.

6. Hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning af paraffinsektioner til patologisk gennemgang

  1. Anbring dias med paraffinsektioner fra trin 5.12 i en diasholder. Inde i en kemisk røghætte deparaffiniseres med xylen 3 gange, 5 minutter hver. Kassér opløsningen efter hver brug.
  2. Rehydrer sektioner med 100% ethanol i 3 minutter, og gentag to gange med frisk 100% ethanol. Udskift 100% ethanol med 95% ethanol i 3 min og derefter 80% ethanol i 3 min.
  3. Skyl sektioner med destilleret vand i 5 min. Mens sektionerne vaskes i vand, skal du sørge for at fjerne oxiderede partikler fra hæmatoxylin ved enten at filtrere eller skumme overfladen af hæmatoxylin med en fnugfri aftørring.
  4. Blot det overskydende vand fra diasholderen med fnugfri professionelle klude, og plet glider i 50% hæmatoxylin (1: 1 fortynding med destilleret vand) i 2-5 minutter afhængigt af ønsket farvningspræference og reagensforringelse. Kassér hæmatoxylin, når opløsningsfarven skifter fra blomme til blå/brun, eller når farvningstiden bliver for lang. Skyl rutsjebanerne med rindende postevand i 20 min.
  5. Affarv sektionerne i 1% sur ethanol (3,3 ml saltsyre med 50 ml 70% ethanol) ved hurtigt at dyppe diasene flere gange. Slides kan dyppes op til 3 s, men jo længere diasene dyppes, jo lettere bliver sektionerne.
  6. Skyl rutsjebanerne i ledningsvand to gange i 1 minut hver, og en gang med deioniseret vand. Som en mulighed kan dias efterlades natten over på dette stadium og blødgøres i vand.
  7. Nedsænk sektionerne i 1,36% lithiumcarbonatopløsning (47 g lithiumcarbonat, 3500 ml vand) i 3 s. Sørg for ikke at overinkubere sektionerne, da jo længere tid i lithiumcarbonatopløsning, jo mere sandsynligt vil vævet flyde.
  8. Skyl sektionerne i postevand i 5 minutter, og tør det overskydende vand fra glideholderen med fnugfri servietter af professionel kvalitet.
  9. Modbehold diasene i 100% klar til brug eosin i 15-30 s, og dehydreres straks med 95% ethanol to gange i 5 minutter hver. Udskift med 100% ethanol to gange i 5 minutter hver, og kassér opløsningerne efter hver brug.
  10. Ryd sektionerne i xylen i 15 minutter og gentag to gange i alt 3 gange. Eventuelt kan diasene efterlades i xylen natten over ved stuetemperatur for bedre at rydde overskydende vand.
  11. Lad gliderne lufttørre i den kemiske røghætte, og monter derefter en dækseddel ved hjælp af monteringsmediet for at forsegle vævsprøven.
  12. Visualiser og image de farvede vævssektioner under mikroskopi. Undersøg omhyggeligt tumorerne på det primære sted (den interrenale kirtelregion i hovednyren) og de fjerne sporadiske metastaser i andre væv og organer i fisken. Send farvede dias til vævssektioner, der skal gennemgås af patologer. Baseret på fiskemodellens lignende patologiske træk som humant neuroblastom, forvent de tumorer, der opstod i MYCN-only eller MYCN; LMO1-fisk , der først skal diagnosticeres som neuroblastom af patologer.

7. Immunohistokemisk analyse (IHC) med antistoffer mod NB-markør og overudtrykte transgener for yderligere at bekræfte spredningen af tumor og deres sympatoydrenal afstamningsegenskab

  1. Farvning med fuldautomatisk farvningssystem
    1. For bedre at sammenligne IHC-resultatet med H&E-farvning skal du vælge tilstødende dias fra trin 5.12 til IHC-farvning.
      BEMÆRK: Selvom et automatiseret farvningssystem giver mulighed for hurtigere og mindre besværlige resultater, kan en manuel protokol til IHC-farvning anvendes i mangel af sådanne ved at henvise til trin i underafsnit 7.2.
    2. Fortynd det primære antistof mod tyrosinhydroxylase (TH) (1:500), en neuroblastommarkør, baseret på ønsket koncentration og den samlede mængde, der er nødvendig med det automatiserede systems tilsvarende primære antistoffortyndingsstof.
      BEMÆRK: Optimale antistofkoncentrationer kan variere afhængigt af antistof og væv.
    3. Da det automatiserede system bruger indbygget varmeinduceret antigenhentning med epitophentningsopløsning i 20 minutter og systemets tilsvarende detektionsreagens, skal du sikre, at parametrene for maskinen er indstillet som: Peroxidaseblokering, 5 min; Primært antistof med ønsket koncentration, 15 min; biotinyleret anti-kanin IgG sekundært antistof (1:500), 8 min; Streptavidin HRP, 8 min; blandet DAB intenst substrat, 5 min; og hæmatoxylin, 5 min.
    4. Når indstillingerne er indstillet, skal du placere antistofbakken i maskinen. Konfigurer diasene ved at oprette en ny sag, som vil mærke diasene. Maskinen er nu læsset og klar til at køre (afvoksning, farvning og modfarvning).
    5. Når diasene er afvokset, farvet og modfarvet ved hjælp af den automatiserede maskine, dehydreres diasene i ethanolgradienter på 70%, 95% og 100% i 5 minutter hver. Sænk dias af sektioner i 100% frisk ethanol igen i 5 minutter.
    6. Ryd sektionerne i xylen i 5 minutter, to gange, eller lad dias i xylen natten over for bedre at rydde overskydende vand.
    7. Lad gliderne lufttørre i den kemiske røghætte, og monter derefter en dækseddel ved hjælp af et monteringsmedium. Visualiser og image de farvede vævssektioner med mikroskopi.
    8. For at bekræfte metastasen i fiskemodellen skal du sammenligne diasene farvet med antistoffer mod neuroblastommarkør fra trin 7 med dem, der er farvet af H & E fra trin 6.
      BEMÆRK: Forvent at se positiv farvning for neuroblastommarkør, TH, i alle tumorceller identificeret ved H & E-farvning. Forvent heller ingen positiv farvning for TH i tilstødende væv, hvor de metastatiske tumorer blev identificeret i LMO1; MYCN fisk. Sørg for at vælge kontrolfisk, der kun er WT og MYCN, og som er af samme alder som MYCN; LMO1 fisk til denne analyse for at udelukke muligheden for, at de metastatiske tumorer er multifokale primære tumorer.
  2. Manuel farvning uden automatiseret IHC-farvningssystem
    1. Når diasene er bagt, skal du vælge tilstødende dias fra trin 5.12 for at muliggøre bedre sammenligning mellem H & E og IHC farvning for at afparaffinisere. Inde i en kemisk røghætte skal du devokse og rehydrere diasene med xylen ved hjælp af henholdsvis de foregående trin 6.1 og 6.2.
    2. Efter deparaffinisering og rehydrering suges dias i endogen peroxidblokerende opløsning (1x PBS indeholdende 0,1% natriumazid og 0,3% hydrogenperoxid) i 5 minutter ved stuetemperatur. Vask dias i frisk 1x PBS i 3 min og gentag to gange i alt 3 gange.
      FORSIGTIG: Natriumazid er akut giftigt. Sørg for at praktisere forsigtighedsprocedurer og korrekt bortskaffelse af reagens afhængigt af din institutions regler.
    3. Hent antigen ved at inkubere dias i opløsning med proteinase K (1:500 i 1x PBS) i 10 minutter ved stuetemperatur. Vask dias 3 gange med 1x PBS i 3 min hver.
    4. Bloker dias ved at inkubere med 5% gedeserum i 1x PBS i 30 min ved stuetemperatur på vippen. Vask dias med frisk 1x PBS to gange i 3 min hver.
    5. Tilsæt 4 dråber Avidin-blokerende opløsning direkte på diaset og inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur. Efter vask af dias med frisk 1x PBS to gange i 3 minutter hver, tilsættes 4 dråber Biotin-blokerende opløsning og inkuberes ved stuetemperatur i 15 minutter.
    6. Efter blokering af dias inkuberes det primære antistof af tyrosinhydroxylase (TH) (1:500) i 45-60 minutter ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C.
      BEMÆRK: Plet med yderligere antistoffer mod transgener og andre relevante markører til behandling af fysiologi og aktivitet af primær tumor og andre metastatiske steder. Optimale antistofkoncentrationer kan variere afhængigt af antistof og væv.
    7. Vask dias med frisk 1x PBS i 3 min, gentag to gange med i alt 3 gange.
    8. Inkuber dias i sekundært antistof af biotinyleret anti-kanin IgG sekundært antistof (1:500) fortyndet i blokerende opløsning i 45-60 minutter ved stuetemperatur. Gentag tidligere vasketrin 7.2.7.
    9. Tilsæt HRP konjugeret Avidin (1:300 i 1x PBS), og inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur. Vask dias 3 gange med frisk 1x PBS i 5 min hver.
    10. Forbered 3,3'-diaminobenzidin (DAB) opløsning (2,5 ml destilleret vand, 1 dråbe kitbuffer, 1 dråbe hydrogenperoxid og 2 dråber DAB fra kit), og læg dråber DAB direkte på dias nær et mikroskop. Når du har tilføjet DAB, skal du observere farveændringsreaktionen på diasene under mikroskop. Når den ønskede farvningsintensitet er nået, skal du stoppe reaktionen ved at placere glidesektioner i koldt destilleret vand.
    11. Modbehold diasene med frisk 50% hæmatoxylin ved at nedsænke eller dyppe prøver i et par korte sekunder og placere dem tilbage i destilleret vand. Gentag efter ønske, men normalt skal en gang være nok, da vævssektionerne er tynde.
    12. Dehydrere vævsprøver på dias i alkoholgradient som tidligere beskrevet i trin 7.1.5 og fortsæt gennem de resterende trin (med det sidste trin som 7.1.8) for at afslutte IHC-analysen.

8. Picrosirius rød farvning af paraffin dias til kollagen akkumulering i tumorer som mekanisme undersøgelse

  1. Gentag trin 6.1-6.3 for at afvokse, hydrere og vaske paraffinsektioner på dias.
  2. Efter at have blottet det overskydende vand fra diasholderen med fnugfri klude af professionel kvalitet, pletter i 50% hæmatoxylin i 10 minutter. Skyl rutsjebanerne med rindende postevand i 10 min.
  3. Overfør diasene til Picrosirius Red og inkuber ved stuetemperatur i 1 time.
  4. Vask rutsjebanerne i forsuret vand (5 ml iseddike i 1 liter hane eller destilleret vand) to gange, inkubation i 5 minutter på shaker.
  5. Dekanter det meste af vandet fra dias først, før du fysisk ryster og blotter sektioner på dias for at fjerne så meget vand som muligt.
  6. Placer hurtigt dias i tre ændringer af 100% ethanol for at dehydrere paraffinsektioner.
  7. Gentag trin 6.10 og 6.11 for at rydde dias i xylen og montere prøven. Dernæst billede med sammensat mikroskop, der er udstyret med et kamera.
  8. Brug ImageJ til at tælle picrosirius rød-positive kollagenfibre i mindst tre tilfældige felter for hvert afsnit. Sammenlign mellem dias af MYCN og MYCN; LMO1 fisk sektioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at afgøre, om LMO1 synergiserer med MYCN for at påvirke NB-patogenese, blev transgene konstruktioner, der driver ekspression af enten LMO1 (dβh: LMO1 og dβh: mCherry) eller MYCN (dβh: EGFP-MYCN) i PSNS-cellerne under kontrol af dβh-promotoren injiceret i zebrafiskembryoner13. Som illustreret i figur 1A blev heterozygote MYCN- og LMO1-fisk indavlet efter udviklingen af stabile transgene linjer og validering af deres genotyper. Deres afkom blev sorteret efter MYCN (EGFP+) eller LMO1 (mCherry+) ekspression ved henholdsvis 1 dpf eller 3-4 dpf. MYCN-overekspression har vist sig at undertrykke PSNS-udvikling6. EGFP-MYCN-ekspressionen er således mere fremtrædende i de ikke-PSNS dopaminerge neuronale celler ved 1 dpf6, såsom de kraniale ganglier (CA), ærke-associerede catecholaminergiske neuroner (AAC) og medulla oblongata (MO). På grund af ustabiliteten af EGFP-MYCN-protein bliver EGFP-signalet svagere efter 2 dage. I modsætning hertil er mCherry-ekspressionen fremtrædende i begge PSNS-celler, såsom den overlegne cervikale ganglion og ikke-PSNS dopaminerge neuronale celler, som omfatter CA, AAC og MO, fra 3 dpf og fremefter6. Derfor sorteres afkom af MYCN og LMO1 parring ved 1 dpf for MYCN (EGFP+) og ved 3 dpf for LMO1 (mCherry+). De sorterede fisk blev adskilt i forskellige genotypiske grupper som følger: i) MYCN, ii) LMO1, iii) MYCN; LMO1 og iv) WT og hævet under de samme forhold. Begyndende ved 4 wpf blev afkomene screenet hver anden uge for tegn på tumorer ved fluorescerende mikroskopi. Fluorescerende positive tumormasser blev påvist i væv og organer fjernt fra det primære tumorsted i den sammensatte transgene fisk med overekspression af både MYCN og LMO1, men ikke i de transgene fisk med ekspression af MYCN alene (figur 1B).

For yderligere at verificere metastasen hos disse transgene dyr, tumorbærende MYCN og MYCN; LMO1 transgene fisk ved 5 til 9 måneders alderen blev udsat for paraffinsektionering og immunohistokemiske analyser med et antistof mod neuroblastommarkøren, TH. De repræsentative resultater for et MYCN; LMO1 fisk er vist i figur 2. H & E-farvning af sagittalsektionerne viste, at den primære tumor opstod fra interrenal kirtelområdet, zebrafiskens ækvivalent med den humane binyrerne, som er det mest almindelige sted for primær sygdom hos neuroblastompatient12,22 (figur 2A,B). Sammensat af små, udifferentierede og runde kræftceller med hyperkromatiske kerner dannede tumoren ofte lag, der histologisk lignede de humane neuroblastomer som beskrevet tidligere6 (figur 2A,B). I overensstemmelse med observationen ved fluorescerende mikroskopi (figur 1B) blev der påvist udbredte tumormasser fjernt fra den internyrenekirtel i flere regioner, herunder: distal del af nyrerne (zebrafiskens primære voksne hæmatopoietiske niche og sammenlignelig med pattedyrets knoglemarv23) (figur 2A,C), bane (figur 2A,D), gælle (analog med pattedyrlungen24) (figur 2A, E), milt (analog med pattedyrs lymfeknude25) (figur 2A og 2F) og indre væg i atriekammeret i hjertet (figur 2G). Mange af disse metastaser rekapitulerer de almindelige steder for metastaser, der ses hos patienter med højrisikoneuroblastom, som omfatter knoglemarv, lymfeknude, kredsløbsregion og lunge13,23,24,25. Yderligere immunhistokemi med antistoffet mod TH bekræftede PSNS-neuroblastafstamning af tumorceller ved den primære tumor og alle de metastatiske steder (figur 2H-M).

I et forsøg på bedre at forstå de mekanismer, der ligger til grund for synergien mellem MYCN og LMO1 i at fremskynde tumormetastatisk spredning, blev det opdaget, at ekspressionsniveauerne for et panel af gener involveret i tumorcelle til ekstracellulær matrixinteraktion var signifikant forhøjet i fisketumorerne med overekspression af både MYCN og LMO113. For at undersøge, om den ekstracellulære matrix faktisk blev påvirket af den ændrede genekspression i LMO1-overekspression af tumorer, der førte til forbedret tumorspredning eller migration, paraffinsektionerne fra MYCN-only og MYCN; LMO1-tumorer blev farvet med Picrosirius rød (PSR), en meget selektiv plet for kollagenfibre, for at vurdere kollagenaflejring og ekstracellulær matrixstivhed (ECM)27. Som vist i figur 3A-E var der signifikant forstærkede mængder og øget tykkelse af PSR-farvede kollagenfibre fundet i MYCN; LMO1-tumorer, sammenlignet med tumorerne, der kun udtrykker MYCN alene. Tilsammen viser disse resultater, at overekspressionen af LMO1 kan ombygge tumoren ECM for at øge dens stivhed og dermed lette tumorcelleformidling.

Figure 1
Figur 1: Illustration af tumorscreeningsassay på afkom fra opdræt af MYCN og LMO1 transgene zebrafiskelinjer. A) Skematisk illustration af sortering og tumorscreening af MYCN og/eller LMO1-overekspression af stabile transgene fisk til neuroblastomundersøgelse. Øverste paneler: Repræsentative billeder af EGFP-MYCN+ embryoner 1 dag efter befrugtning (dpf) (dorsal visning til venstre og lateral visning til højre). Nederste paneler: Repræsentative billeder af mCherry-LMO1+ embryoner ved 3 dpf (sideværts visning til venstre og ventral visning til højre). AAC, ærke-associerede catecholaminergiske neuroner; CA, kraniale ganglier; og MO, medulla oblongata. Vægtstang, 100 μm. Oprettet med BioRender.com (B) Coexpression af LMO1 og MYCN fremmer neuroblastommetastase. Til venstre: Transgen fisk, der overudtrykker MYCN alene (MYCN) med EGFP-ekspressive tumor (hvid pil) ved 36 måneders alderen. Til højre: Transgene fisk, der overudtrykker både MYCN og LMO1 (MYCN; LMO1) med en mCherry-positiv tumormasse på det primære sted (IRG, hvid pil) og flere metastatiske steder (faste pilespidser) ved 36 måneders alderen. Skalabjælke, 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Co-overekspression af MYCN og LMO1 fremmer fjerne metastaser af neuroblastom i transgen zebrafiskmodel. (A-G) H&E-farvede sagittale sektioner af MYCN; LMO1 transgene fisk, mens de er 6 måneder gamle. (H-M) Forstørrede visninger af immunohistokemiske analyser af MYCN; LMO1 transgen fisk i sagittale vævssektioner, ved anvendelse af tyrosinhydroxylase (TH) antistof. Hvid boks skitserer den interrenale kirtel (b, h) med forstørrede visninger i panelerne B og H. Disseferede tumorceller blev fundet i nyremarv (c, i, C og I med faste sorte pilespidser), øjets sclera (d, j, D og J med sorte skitserede og hvide fyldte åbne pile), gællen (e, k, E og K med sort skitseret og hvidfyldte åbne pilespidser), milten (f, l, F og L med faste sorte pile), og hjertekammeret (G og M med sort skitseret og hvidfyldte dobbelte pilespidser). Vægtstænger, 100 μm (A) og 50 μm (B-M). Dette tal er blevet modificeret fra Zhu, S. et al. LMO1 Synergiserer med MYCN for at fremme neuroblastomainitiering og metastase. Kræftcelle. 32, 310-323 (2017)13. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Øget LMO1-ekspression fremmer kollagenaflejring og ECM-stivhed, hvilket fører til lettere tumorcelleformidling i zebrafiskmodeller. (A-D) Repræsentative lysmikroskopibilleder af kollagenfibre farvet af Picrosirius rød (PSR) kun i MYCN (A,B) eller MYCN; LMO1 (C,D) transgen zebrafisk. (B) og (D) forstørres fra de indrammede områder af (A) og (C) ved hjælp af pile (A og B) og pilespidser (C og D) for at angive de PSR-positive kollagenfibre. Vægtstænger, 100 μm (A og C) og 50 μm (B og D). (E) Kvantificering af PSR-farvede områder på tumorsektioner af MYCN alene eller MYCN; LMO1 transgen fisk. Resultaterne blev normaliseret til gennemsnittet af PSR-farvede områder i MYCN-eneste tumorer. Statistikken præsenterer som gennemsnittet ± SD for tre MYCN-only eller tre MYCN; LMO1 tumorer; p = 0,02 ved tohalet t-test. Dette tal er blevet modificeret fra Zhu, S. et al. LMO1 Synergiserer med MYCN for at fremme neuroblastomainitiering og metastase. Kræftcelle. 32, 310-323 (2017)13. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Zebrafisk har været almindeligt anvendt i forskning i de sidste par årtier, især inden for kræftforskning, af åbenlyse grunde, såsom dens lette vedligeholdelse, robuste reproduktion og klare fordele ved in vivo-billeddannelse1,28. Zebrafiskemodellen kan let manipuleres embryonalt på grund af deres ydre befrugtning og udvikling, som supplerer godt til pattedyrs modelorganismer, såsom rotter og mus, til store genetiske undersøgelser1,2,3. Desuden har zebrafiskens genom ligheder på højt niveau med det menneskelige genom. Sammenlignet med de detaljerede anmærkninger af zebrafiskens genom med det menneskelige referencegenom har ca. 70 % af de menneskelige gener vist sig at opnå en zebrafiskortolog29. Derudover er andre anvendelser af zebrafisk i forskning blevet udvidet til lægemiddelopdagelse og patientavatarer til individualiseret kræftbehandling30,31. Akkumulerende undersøgelser har vist, at tumorer induceret i zebrafisk ligner humane tumorer på de histologiske og molekylære niveauer, hvilket kan hjælpe med dissektion af tumorinitiering, progression og heterogenitet32,33. Tilsammen viser zebrafisken et enormt potentiale som en værdifuld dyremodel, der kan bruges til at studere metastase og belyse mulige onkogene veje involveret i sygdomspatogenese.

Ved hjælp af den transgene zebrafiskemodel med overekspression af både LMO1 og MYCN er samarbejdet mellem disse to onkogener i NB-tumorigenese og metastase blevet tydeligt demonstreret. Med dagens tilgængelighed af kraftfulde levende billeddannelsesteknikker kan tumorskærme let udføres hver anden uge, og metastase kan spores over tid. Den udbredte metastase kan også bekræftes yderligere ved paraffinsektionering og antistoffarvning. Påfaldende nok er metastaserne detekteret i MYCN; LMO1 zebrafisk korrelerer godt med de almindelige metastasesteder, der ses i højrisiko-NB-tilfælde, såsom i knoglemarven, lymfeknuder, kredsløb og lunge34,35, hvilket yderligere understøtter zebrafisk som en gennemførlig og gavnlig model til metastaseundersøgelse.

På grund af relativt lille kropsstørrelse kan hele zebrafisken desuden sektioneres fuldstændigt, hvilket er endnu en klar fordel ved denne model, hvilket muliggør grundig karakterisering af den primære tumor sammen med metastaserne i andre områder af kroppen. Den picrosirius røde farvning af tumorsektioner har tydeligt fremhævet kollagennetværkene i fisketumorer og demonstrerer den øgede stivhed af ekstracellulær matrix i tumorer med LMO1-overekspression. Selvom denne teknik ikke er unik for zebrafisk, kan dens anvendelse sammen med screeningen med høj gennemstrømning på zebrafiskembryoner, der er genetisk modificeret eller transplanteret med tumorceller, give et nyt middel til screening for effektive forbindelser, der kan målrette ekstracellulær matrixombygning, hvilket er en kritisk proces involveret i tumorcellemetastase.

Stabile transgene zebrafiskmodeller er meget nyttige for os at forstå kandidatens onkogeners bidrag til tumorudvikling in vivo, selvom det kan være udfordrende og besværligt at udvikle disse linjer. Oprettelse af en stabil transgen linje kræver en lang periode, da flere generationer skal erhverves før linjeudbredelse. Desuden kan udbredelsen af disse linjer være kedelig, og strategiske parringsplaner kan være nødvendige. For eksempel reduceres produktiviteten af en MYCN transgen fisk ofte markant, når tumoren har udviklet sig, og homozygote MYCN transgene fisk overlever ikke langt ind i voksenalderen. For bedre at opretholde MYCN's transgene fiskelinje anbefales det derfor at overskride den heterozygote ikke-tumorbærende MYCN-transgene fisk i en yngre alder med WT eller andre genetisk manipulerede fiskelinjer, såsom LMO1 transgen fiskelinje. For at overvinde udfordringerne med at udvikle og opretholde stabile transgene fiskelinjer kan mosaiktransient transgenese være en alternativ tilgang til hurtigt og effektivt at vurdere bidraget fra et enkelt gen eller en kombination af gener til tumorinitiering og progression i primært injiceret fisk. Desuden kan mosaikmønsteret for transgen integration i den primære injicerede fisk bedre efterligne sygdomspatogenesen, især dem, der induceres af somatiske hændelser36.

Men som enhver anden dyremodel, der anvendes i forskning til at studere kræft, har zebrafisken også sine ulemper. For eksempel er antistoffer specifikt mod zebrafiskproteiner fortsat stort set underudviklede, selvom flere antistoffer mod neuroblastommarkørgener - såsom tyrosinhydroxylase, synaptophysin og HuC - heldigvis fungerer godt i zebrafisk6,13. For at bekæmpe dette problem er mange leverandører begyndt at teste deres produkter og forudsige potentialet i deres antistoffer til at krydsreagere med zebrafiskproteiner. Mere information om validerede antistoffer kan også findes i zebrafish information network (ZFIN). Med disse bestræbelser vil flere og flere antistoffer, der specifikt kan detektere zebrafiskproteiner, snart blive tilgængelige for zebrafiskesamfundet. En anden udfordring ved at bruge zebrafisk som en genetisk model til at dissekere samspillet mellem komplekse signalveje i NB-patogenese er dets delvist duplikerede genom. En sådan genomduplikering, som fandt sted i zebrafiskens naturlige herkomst37,38, kan ofte føre til mere end én variant af zebrafiskhomologer til mennesker. Dette kan medføre en udviklet gevinst af nye genfunktioner eller unikke ekspressionsmønstre i dyremodellen39. Derfor, når man studerer gener med potentielle roller i tumorundertrykkelse, kan det være nødvendigt, at flere alleler af de duplikerede gener slås ud på samme tid for at demonstrere deres tumorundertrykkelsesfunktion, hvilket kan være en potentielt tidskrævende og en teknisk udfordrende indsats.

Ikke desto mindre kan den transgene zebrafiskmodel trofast rekapitulere alle stadier af tumormetastase in vivo og har klare fordele for genetisk analyse og realtidsbilleddannelse af tumorformidling. Dette modelsystem tilbyder derfor et unikt værktøj for os til at løse mange skræmmende spørgsmål på området, såsom hvad de molekylære og cellulære begivenheder, der ligger til grund for flertrinsprocessen med tumorformidling og metastase in vivo , er, når NB-cellerne spredes fra primære tumorer, og hvordan tumormikromiljø bidrager til NB-metastase. Med zebrafiskens robusthed til screening og testning af lægemidler vil fiskemodellen også være et værdifuldt middel til evaluering af effektiviteten af nye agenser og hæmmere til forebyggelse eller behandling af metastatisk NB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af et tilskud R01 CA240323 (S.Z.) fra National Cancer Institute; et tilskud W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) fra det amerikanske forsvarsministerium (DoD); en V Scholar-pris fra V Foundation for Cancer Research (S.Z.) og et Platform Grant fra Mayo Center for Biomedical Discovery (S.Z.); og støtter fra Mayo Clinic Cancer Center og Center for Individualized Medicine (S.Z.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit Vector SK-4100
Acetic Acid Fisher Scientific / Acros Organic 64-19-7
Agarose GP2 Midwest Scientific 009012-36-6
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody Pel-Freez P40101
Avidin/Biotin Blocking Kit Vector SP-2001
BOND Intense R Detection Leica Biosystems DS9263
BOND primary antibody diluent Leica Biosystems Newcastle, Ltd. AR9352
BOND-MAX IHC instrument Leica Biosystems Newcastle, Ltd. N/A fully automated IHC staining system
CH211-270H11 BAC clone BACPAC resources center (BRFC) N/A
Compound microscope equipped with DP71 camera Olympus AX70
Cytoseal XYL (xylene based mounting medium) Richard-Allan Scientific 8312-4
Eosin Leica 3801601 ready-to-use (no preparation needed)
Ethanol Carolina 86-1263
Expand Long Template PCR System Roche Applied Science, IN 11681834001
Gateway BP Clonase II enzyme mix Invitrogen, CA 11789-020
Gateway LR Clonase II enzyme mix Invitrogen, CA 11791-100
Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated) Dako E0432
Hematoxylin Solution, Harris Modified Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC HHS-32-1L
HRP Avidin D Vector A-2004
Hydrochloric Acid Aqua Solutions 4360-1L
Hydrogen Peroxide, 3% Fisher Scientific H324-500
I-SceI enzyme New England Biolabs, MA R0694L
Kanamycin sulfate Teknova, Inc. K2150
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Fisher Scientific 34133
Lithium Carbonate Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC 554-13-2
Microtome for sectioning Leica Biosystems RM2255
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen C404006
p3E-polyA  Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah N/A a generous gift
(Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.)
Parafin wax Surgipath Paraplast 39603002 Parrafin to parafin
Paraformaldehyde Alfa Aesar A11313
pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites) Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany N/A a generous gift
pDONR 221 gateway donor vector Thermo Fisher Scientific 12536-017
pDONRP4-P1R donor vector  Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah N/A a generous gift
Phenol red, 0.5% Sigma Aldrich  P0290
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X BioRad 1610780
Picrosirrius red stain kit Polysciences 24901-250
pME-mCherry Addgene 26028
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Roche 21712520
QIAprep Spin MiniPrep Kit Qiagen 27104
RDO Rapid Decalcifier Apex Enginerring RDO04
Sodium Azide (NaN3) Sigma Aldrich 26628-22-8
Stereo fluorescence microscope Leica MZ10F
Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging Nikon SMZ-1500
Taq DNA Polymerase New England Biolabs, MA M0273L
Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor Sakura N/A Model #: VIP-6-A1
Tricaine-S Western Chemical Incorporated 20513
Xylene Thermo Fisher Scientific X3P1GAL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Veldman, M., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).
  2. Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Research. 6 (5), 694 (2008).
  3. Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2010).
  4. Benjamin, D. C., Hynes, R. O. Intravital imaging of metastasis in adult Zebrafish. BMC Cancer. 17 (1), 660 (2017).
  5. Kim, I. S., et al. Microenvironment-derived factors driving metastatic plasticity in melanoma. Nature Communications. 8, 14343 (2017).
  6. Zhu, S., et al. Activated ALK collaborates with MYCN in neuroblastoma pathogenesis. Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).
  7. Maris, J. M., Hogarty, M. D., Bagatell, R., Cohn, S. L. Neuroblastoma. Lancet. 369 (9579), London, England. 2106-2120 (2007).
  8. Park, J. R., et al. Children's oncology group's 2013 blueprint for research: neuroblastoma. Pediatric Blood and Cancer. 60 (6), 985-993 (2013).
  9. Hoehner, J. C., et al. A developmental model of neuroblastoma: differentiating stroma-poor tumors' progress along an extra-adrenal chromaffin lineage. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 75 (5), 659-675 (1996).
  10. Tsubota, S., Kadomatsu, K. Origin and initiation mechanisms of neuroblastoma. Cell and Tissue Research. 372 (2), 211-221 (2018).
  11. Tolbert, V. P., Matthay, K. K. Neuroblastoma: Clinical and biological approach to risk stratification and treatment. Cell and Tissue Research. 372 (2), 195-209 (2018).
  12. Maris, J. M. Recent advances in neuroblastoma. New England Journal of Medicine. 362 (23), 2202-2211 (2010).
  13. Zhu, S., et al. LMO1 Synergizes with MYCN to promote neuroblastoma initiation and metastasis. Cancer Cell. 32, 310-323 (2017).
  14. Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).
  15. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
  16. Tao, T., et al. LIN28B regulates transcription and potentiates MYCN-induced neuroblastoma through binding to ZNF143 at target gene promotors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (28), 16516-16526 (2020).
  17. Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (97), e52567 (2015).
  18. Zhang, X., et al. Critical role for GAB2 in neuroblastoma pathogenesis through the promotion of SHP2/MYCN cooperation. Cell Reports. 18 (12), 2932-2942 (2017).
  19. Zimmerman, M. W., et al. MYC drives a subset of high-risk pediatric neuroblastomas and is activated through mechanisms including enhancer hijacking and focal enhancer amplification. Cancer Discovery. 8 (3), 320-335 (2018).
  20. Koach, J., et al. Drugging MYCN oncogenic signaling through the MYCN-PA2G4 binding interface. Cancer Research. 79 (21), 5652-5667 (2019).
  21. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  22. DuBois, S. G., et al. Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival. Journal of pediatric hematology/oncology. 21 (3), 181-189 (1999).
  23. Wattrus, S. J., Zon, L. I. Stem cell safe harbor: The hematopoietic stem cell niche in zebrafish. Blood Advances. 2 (21), 3063-3069 (2018).
  24. Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicologic Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
  25. Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: Zebrafish and vertebrate immunity. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
  26. Junqueira, L. C., Cossermelli, W., Brentani, R. Differential staining of collagens type I, II and III by Sirius Red and polarization microscopy. Archivum histologicum Japonicum (Nihon Soshikigaku Kiroku). 41 (3), 267-274 (1978).
  27. Sweat, F., Puchtler, H., Rosenthal, S. I. Sirius red F3BA as a stain for connective tissue. Archives of Pathology. 78, 69-72 (1964).
  28. Ignatius, M. S., Hayes, M., Langenau, D. M. In vivo imaging of cancer in zebrafish. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 219-237 (2016).
  29. Howe, C. K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  30. Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 20 (5), 263-273 (2020).
  31. Yoganantharjah, P., Gibert, Y. The Use of the zebrafish model to aid in drug discovery and target validation. Current Topics in Medicinal Chemistry. 17 (18), 2041-2055 (2018).
  32. Ignatius, M. S., et al. In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 21 (5), 680-693 (2012).
  33. Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (44), 17406-17411 (2007).
  34. Ahmed, S., et al. Neuroblastoma with orbital metastasis: ophthalmic presentation and role of ophthalmologists. Eye. 20 (4), London, England. 466-470 (2006).
  35. Papaioannou, G., McHugh, K. Neuroblastoma in childhood: review and radiological findings. Cancer Imaging Society. 5 (1), 116-127 (2005).
  36. Langenau, D. M., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
  37. Amores, A., et al. Zebrafish hox clusters and vertebrate genome evolution. Science. 282 (5394), New York, N.Y. 1711-1714 (1998).
  38. Postlethwait, J. H., et al. Vertebrate genome evolution and the zebrafish gene map. Nature Genetics. 18 (4), 345-349 (1998).
  39. Opazo, J. C., et al. Whole-genome duplication and the functional diversification of teleost fish hemoglobins. Molecular Biology and Evolution. 30 (1), 140-153 (2013).

Tags

Kræftforskning udgave 169
Zebrafisk model af neuroblastom metastase
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Her, Z. P., Yeo, K. S., Howe, C.,… More

Her, Z. P., Yeo, K. S., Howe, C., Levee, T., Zhu, S. Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis. J. Vis. Exp. (169), e62416, doi:10.3791/62416 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter