Summary
מאמר זה מתאר את הבידוד של תאי שסתום אבי העורקים עכבר על ידי הליך collagenase דו שלבי. תאי שסתום עכבר מבודדים חשובים לביצוע מבדקים שונים, כגון בדיקה זו של הסתיידות במבחנה, ולחקירת המסלולים המולקולריים המובילים מינרליזציה שסתום אבי העורקים.
Abstract
הסתיידות של תאי שסתום אבי העורקים הוא סימן ההיכר של היצרות אבי העורקים והוא קשור פיברוזיס סף שסתום. תאים ביניים שסתום (VICs) לשחק תפקיד חשוב בתהליך הסתיידות היצרות אבי העורקים באמצעות ההפעלה של תוכנית הדיפרנציאציה שלהם לתאים דמויי אוסטאובלסט. עכבר VICs הם כלי במבחנה טובה עבור ההבהרה של מסלולי איתות המניעים מינרליזציה של תא שסתום אבי העורקים. השיטה המתוארת כאן, בשימוש מוצלח על ידי מחברים אלה, מסבירה כיצד להשיג תאים מבודדים טריים. הליך קולגנאז דו-שלטי בוצע עם 1 מ"ג/מ"ל ו-4.5 מ"ג/מ"ל. השלב הראשון הוא חיוני כדי להסיר את שכבת התא אנדותל ולהימנע כל זיהום. הדגירה השנייה של קולגנאז היא להקל על נדידת אח"מים מהרקמה לצלחת. בנוסף, נדון הליך הכתמת אימונופלואורסצנטיות לאפיון הפנוטיפ של תאי שסתום העכבר המבודדים. יתר על כן, בדיקת הסתיידות בוצעה במבחנה באמצעות הליך מדידת ריאגנט סידן והכתמה אדומה alizarin. השימוש בתרבית הראשית של תאי שסתום העכבר חיוני לבדיקת מטרות פרמקולוגיות חדשות לעיכוב מינרליזציה של תאים במבחנה.
Introduction
מחלת שסתום אבי העורקים מסוידת (CAVD) היא מחלת הלב valvular הנפוצה ביותר באוכלוסיות המערביות, המשפיעה על כמעט 2.5% מהקשישים מעל גיל65 . CAVD משפיע על יותר משישה מיליון אמריקאים והוא קשור לשינויים בתכונות המכניות של העלונים הפוגעים בזרימת הדם הרגילה עד1,2. נכון לעכשיו, אין טיפול תרופתי כדי לעצור את התקדמות המחלה או להפעיל רגרסיה מינרלית. הטיפול היעיל היחיד לטיפול CAVD הוא החלפת שסתום אבי העורקים על ידי ניתוח או החלפת שסתום אבי העורקים transcatheter3. לכן חובה לחקור את המנגנונים המולקולריים המובילים מינרליזציה שסתום כדי לזהות מטרות פרמקולוגיות חדשות. אכן, היצרות בוני העורקים שאינה מטופלת יש כמה השלכות שליליות כגון תפקוד לקוי החדר השמאלי ואי ספיקת לב4.
שסתום אבי העורקים מורכב משלוש שכבות המכונות פיברוסה, ספונגיוסה, חדרית, אשר מכילים VICs כמו סוג התא השולט5. הפיברוסה וה חדרית מכוסים בשכבה של תאי אנדותל וסקולריים (VECs)5. VECs לווסת את החדירות של תאים דלקתיים, כמו גם אותות paracrine. מתח מכני מוגבר עשוי להשפיע על שלמות VECs ולהפריע הומאוסטזיס של שסתום אבי העורקים, המוביל לפלישה לתא דלקתי6. סריקת ניתוחי מיקרוסקופיה אלקטרונים הראתה אנדותל משובש בשסתום אבי העורקים מסויד אנושי7.
ניתוחים היסטולוגיים של רקמה מסוידת חושפים את נוכחותם של אוסטאובלסטים ואוסטאוקלסטים. יתר על כן, הבחנה אוסטאוגנית של VICs נצפתה הן במבחנה והן ברקמת שסתום אנושי8. תהליך זה מתוזמר בעיקר על ידי גורם שעתוק הקשורים גונט 2 (Runx2) ואת חלבונים מורפוגנטי עצם (BMPs)8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל ההליכים בבעלי חיים המתוארים כאן אושרו על ידי בית הספר לרפואה איקאן בהר סיני הליבה המוסדית וועדת השימוש.
1. הכנה לפני בידוד תא שסתום מעכברים בוגרים
- נקו ועקרו את כל המכשירים הכירורגיים המוצגים באיור 1A באמצעות 70% v/v אתנול ולאחר מכן תעבדו אותם אוטומטית למשך 30 דקות. נקו את סביבת העבודה הכירורגית עם 70% אתנול.
- הוסף 500 μL של פניצילין-סטרפטומיצין ל 50 מ"ל של 10 מ"מ HEPES. הכן aliquot של 50 מ"ל של תמיסת מלח פוספט 1x חוצץ (PBS). שמור את הפתרונות על קרח.
- הכן 1 מ"ג / מ"ל ו 4.5 מ"ג / מ"ל פתרונות collagenase, ולהשתמש 5 מ"ל של כל פתרון בצינורות 15 מ"ל כדי לבצע את ההליך כולו. להכנת 5 מ"ל של קולגנאז מ"ג/מ"ל, יש לערבב 5 מ"ג קולגנאז עם 2.5 מ"ל של מדיום הנשר המעודכן (DMEM), סרום בקר עוברי (FBS) ללא) ו-2.5 מ"ל של 10 מ"ר HEPES בתוספת אנטיביוטיקה (1% פניצילין-סטרפטומיצין משלב 1.2). סנן את הפתרונות באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר כדי להסיר כל זיהום.
הערה: שמור את הפתרונות על הקרח כדי להגן על האנזימים. - חמם את פתרון DMEM ל- 37 °C (70 °F) לפני השימוש בכל השלבים המתוארים להלן. הכן מדיום מלא על ידי שכשהם DMEM עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1% נתרן פירובט, 5 מ"ל של 200 מ"ל L-גלוטמין, 1 מ"ל של ריאגנט חיסול מיקופלסמה (ראה טבלת החומרים),ו -10% FBS.
2. בידוד של תאי שסתום
- כדי להשיג 106 תאים לניסוי, השתמש בחמישה עכברים בני 8 שבועות (מינימום שלושה). מניחים את העכבר בתא אינדוקציה יחד עם פיסת נייר טישו קטנה ספוגה ב-1 מ"ל של איזופלוראן, אך אל תאפשרו מגע עם הרקמה. כדי לאשר כי החיה היא מרדים לחלוטין; בדוק אם יש רפלקס צביטת בוהן, ולאחר מכן להרדים את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם. השתמש isoflurane כדי להקל על כל כאב לפני פריקת צוואר הרחם כמו ההליך המתואר להלן הוא סופני.
- הנח את העכבר על פלטפורמת ניתוח, ותקן את כפות הרגליים עם קנולס כדי להחזיק אותו במקומו. לנקות את החזה ואת הבטן עם אתנול; פתח את הבטן ואת החזה עם מספריים. עם מספריים כירורגיים קטנים, לחתוך בין האטריום השמאלי לחדר השמאלי כדי לחתוך את העכבר. לטפטף את הלב עם 10 מ"ל של PBS 1x קר כדי להסיר דם מהלב.
- חותכים את הלב ושומרים על 3 מ"מ מאב העורקים העולה כפי שמוצג באיור 1B. לנתח את שסתום אבי העורקים תחת סטריאוטימיקורוסקופ. חותכים את הלב אופקית באמצע החדרים(איור 1C). חותכים את החדר השמאלי לכיוון אבי העורקים, וניתחו בזהירות את שסתום אביהעורקים (איור 1D-F). איחדו את השסתומים בצלחת תרבית רקמות קטנה של 35 מ"מ.
- לשטוף את השסתומים המבודדים בצלחת תרבית תאים 75 מ"מ עם 5 מ"ל של HEPES קר (10 מ"מ) בתוספת אנטיביוטיקה (1% פניצילין-סטרפטומיצין) כדי להסיר דם(איור 2). הכן שני צינורות 15 מ"ל של collagenase 1 מ"ג / מ"ל ו 4.5 מ"ג / מ"ל כפי שתואר לעיל בשלב 1.3.
הערה: לאחר הניתוח, לתפעל את השסתומים המבודדים במכסה בטיחות ביולוגית סטרילי כדי למזער את הזיהום. - לדגור את השסתומים בסוג קולגנאז I (1 מ"ג/מ"ל) למשך 30 דקות ב 37 °C עם רעד מתמשך(איור 2). צנטריפוגות הצינור במשך 5 דקות ב 150 × גרם,לשטוף את הכדור פעם אחת עם 2 מ"ל של HEPES (10 מ"מ), ומערבולת עבור 30 s במהירות גבוהה. יוצקים את התוכן של צינור זה לתוך צלחת תרבות 35 מ"מ, ולהעביר בזהירות את שברי הרקמה באמצעות פינצטה דקה לתוך צינור חדש.
הערה: בשלב זה, VICs עדיין לא מנותקים מהרקמה, והכדור מכיל חתיכות של רקמה. כדי למנוע זיהום עם תאי אנדותל, לא צנטריפוגה לאחר מערבולת בשלב 2.5. - לדגור את הכדור בצינור 15 מ"ל עם 5 מ"ל של קולגנאז סוג I (4.5 מ"ג / מ"ל) ב 37 °C תחת תסיסה מתמשכת במשך 35 דקות. להשעות מחדש את התאים עם פיפטה של 1 מ"ל כדי להפריד את התאים, וצנטריפוגה ב 150 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F).
- השלך את supernatant, ולהשעות מחדש את הכדור ב 2 מ"ל של DMEM מלא. צנטריפוגה ב 150 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F). חזור על שלב זה פעמיים כדי לנקות את התאים.
הערה: לכדור עדיין יהיו כמה שברי רקמה. - להשעות מחדש את הכדור ב 1 מ"ל של מדיום מלא, צלחת את התאים בבאר אחת של צלחת תרבית תאים 6-well בכמות מינימלית של מדיום כדי להקל על ההתקשרות שלהם לצלחת התרבות. השאירו את התאים, ללא הפרעה, באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
- לאחר 3 ימים, בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ כדי לאמת צמיחה טובה קרוב לפסולת הרקמה. ברגע ש-1,000 תאים נראים מתחת למיקרוסקופ, הסירו בזהירות את פסולת הרקמות עם פינצטה אוטומטית, ושנו את המדיום.
הערה: אין להפריע לצלחת; אם לא נצפו מספר התאים הנדרש, הנח את צלחת תרבית התא בחזרה לאינקובטור למשך יומיים נוספים. - כאשר התאים הם 70% confluent (2.5 × 105), טריפסיניזציה ולאחר מכן להעביר אותם צלחת תרבית רקמות 75 מ"מ.
3. ניתוח זהות התא והמורפולוגיה
הערה: כתמי אימונופלואורסצנטיות שימשו לחקר מורפולוגיה של תאים וזיהום תאי אנדותל.
- נקה את מכסה המנוע עם 70% v / v / אתנול. מניחים כיסויים סטריליים (22 מ"מ x 22 מ"מ) בלוחות 6-well.
הערה: כדי לעקר את כיסויים, לשטוף אותם עם 70% אתנול, ולשמור אותם בשכונה לילה תחת אור אולטרה סגול. - זרע 100,000 תאים לבאר בצלחת 6-בארות. לאחר 24 שעות, לשטוף את התאים פעמיים ב 1x PBS, ולתקן אותם ב 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 20 דקות. לשטוף את התאים שוב פעמיים עם 1x PBS.
הערה: בשלב זה, התאים יכולים להישמר PBS ב 4 °C (70 °F) עד תחילת הליך הכתם. - כדי לאמת את טוהר ה- VICs, השתמש באקטין שרירים חלק אלפא (αSMA), וימנטין ואשכול של בידול 31 (CD31) כדי לזהות זיהום עם VECs.
- הכן aliquot של חיץ חסימה על ידי ערבוב 500 μL של סרום רגיל (אותו מין כמו הנוגדן המשני), 9.5 מ"ל של 1x PBS, ו 30 μL של טריטון X-100. לדגור על התאים ב 2 מ"ל של מאגר חסימה עבור 1 שעות.
- הכן את מאגר דילול הנוגדנים המכיל 30 μL של טריטון X-100, 10 מ"ל של 1x PBS, ו 0.1 גרם של אלבומין סרום בקר (BSA).
- קח קופסת טיפים ריקה, מלא חצי מהקופסה במים כדי ליצור תא לח. מכסים את מחזיק הקצה ברקמה רטובה ולאחר מכן עם גיליון של parafilm.
- קח 1 μL של הנוגדן העיקרי, ולערבב אותו עם 100 μL של מאגר דילול מוכן בשלב 3.5. מניחים 50 μL של הנוגדן מדולל על parafilm. קח את כיסויים מן בארות, להפוך אותם, ומניחים אותם על החלק העליון של טיפות של נוגדן; לדגור על התאים בן לילה עם הנוגדן.
- הוסף 1 מ"ל של PBS בצלחת 6-טוב. מוציאים בזהירות את כיסויי המכסה מהפרפילם, הופכים אותו ומניחים אותו בבאר. לשטוף את התאים עם עצבנות עדינה מתמשכת במשך 5 דקות. החלף את ה-PBS ב-PBS טרי; לשטוף את התאים 3 פעמים.
- לדגור על התאים עם הנוגדן המשני מדולל (1/500) (Alexa-488, Alexa-555) עבור 1 שעה. הוסף 1 μL של הנוגדן המשני ל 500 μL של מאגר דילול הנוגדנים (מוכן בשלב 3.5). מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום. לשטוף את התאים 3 פעמים עם 1 מ"ל של 1x PBS עם תסיסה מתמשכת.
- הר את כיסויי עם 50 μL של 4′,6-diamidino-2-פנילינדול (DAPI) הרכבה בינונית, ולצפות בתאים מתחת למיקרוסקופ כדי לנתח את המורפולוגיה של תאים וזיהום VEC.
4. במבחנה הסתיידות
- נקה את מכסה המנוע עם 70% אתנול, חמם את ה- DMEM בינוני עד 37 °C (77 °F).
- זרע 100,000 תאים /מצב לתוך לוחות 6-בארות ב- DMEM מלא, ותרבות עבור 24 שעות ב 37 °C (7 °F).
- הכן את המדיום הסתיידות על ידי ערבוב 2 mM של NaH2PO4,10-7 M אינסולין, ו 50 מיקרוגרם / מ"ל חומצה אסקורבית ב- DMEM עם 5% FBS. עבור 93 מ"ל של DMEM, להוסיף 5 מ"ל של FBS, 1 מ"ל של אנטיביוטיקה (ריכוז סופי 1%), 1 מ"ל של נתרן פירובט (100 mM), 27.5 מ"ג של NaH2PO4, 5.8 μL של אינסולין, ו 5 מ"ג של חומצה אסקורבית.
הערה: סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר לפני השימוש. - לאחר 24 שעות, להחליף את המדיום supernatant עם מדיום הסתיידות. לדגור על התאים במשך 7 ימים ב 37 °C (50 °F). ביוםהשלישי, להחליף עם מדיום הסתיידות טרי, ומניחים את הצלחת בחזרה בחממה כדי להשלים את 7 ימי הטיפול.
- לאחר 7 ימים, להסיר את המדיום, לשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל של 1x PBS. לדגור על התאים 1 מ"ל של 0.6 N חומצה הידרוכלורית (HCl) עבור 24 שעות ב 37 °C (7 °F). לאסוף את HCl בצינור 1.5 מ"ל, ולאדות אותו מאיד סיבובי. להשעות מחדש את התוכן של כל הצינורות ב 60 μL של HCl.
הערה: הליך הייבוש חשוב לרכז את הפתרון ולהשתתפות באותו נפח עבור כל תנאי. - השתמש בצלחת 96 באר כדי למדוד ריכוז סידן באמצעות ריאגנט Arsenazo III, זמין בערכה מוכנה לשימוש (עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים נוספים).
- הכן פתרון סטנדרטי סידן של 10 מ"ג / ד"ל ריכוז. שוקלים 10 מ"ג סידן הידרוקסיד (Ca(OH)2) ומתמוססים ב-100 מ"ל של מים מזוקקים.
- בצלחת ברורה של 96 באר, צינור 2 μL של פתרון ריק (HCl, 0.6 N), הפתרון הסטנדרטי, המדגם לבאר (10 מ"ג / ד"ל), ואת הדגימות. בצע את הניסוי במשולש כדי לאמת את השונות בצינורות. הוסף 200 μL של ריאגנט עבור כל תנאי.
הערה: דגימות מעל 15 מ"ג / ד"ל צריך להיות מדולל 1:1 עם מלוחים, re-assayed, ואת התוצאה מוכפלת על ידי שניים. - לדגור על התגובה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: התגובה יציבה במשך 60 דקות. - קרא ותיעד את ספיגת הצלחת ב 650 ננומטר. השתמש בנוסחה הבאה כדי לחשב את כמות הסידן בדגימות:
סידן (מ"ג/מ"ל) = (ספיגה של מדגם/ספיגה של תקן) × ריכוז סטנדרטי
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כמו שסתומי אבי העורקים מורין הם בדרך כלל 1 מ"מ קוטר, לפחות שלושה שסתומים חייב להיות מלומה כדי לאסוף מיליון תאים קיימא עבור הליכים ניסיוניים שונים. השלבים השונים של תהליך הבידוד של VIC מוצגים באיור 1 ובאיור 2. כפי שקשה לגרד באופן ידני את רקמת השסתום, עדיף להשתמש מתח גמירה שנוצר על ידי מערבולת כדי להסיר את VECs. ואכן, תוצאות הכתמת האימונופלואורסצנטיות של CD31 הראו היעדר זיהום תאי אנדותל(איור 3D). בנוסף, מחשבי מעכבר מבטאים וימנטין ו- α-SMA, שהם הסמנים העיקריים של תאי שסתום (איור 3B, C).
מינרליזציה של תאים במבחנה
ערכת ריאגנט סידן שימשה למדידת ריכוז הסידן; בתאים שטופלו במדיום מסויד יש ריכוז סידן גבוה יותר בהשוואה לתאים שאינם מטופלים (איור 4A). ריכוז הסידן היה מנורמל עם ריכוז החלבון הכולל. כתמים אדומים של אליזרין אישרו את מדידות ערכת הסידן-ריאגנט על ידי הצגת צמתי סידן חיוביים אדומים(איור 4B).
איור 1: תיאור של ניתוח שסתום. (A) תמונה מייצגת של כל המכשירים הכירורגיים הדרושים לניתוח, מספריים 2 נדרשים כדי לפתוח את העור של העכבר ומספריים 3 כדי לפתוח את החזה. פינצטה 5 ו -6 נדרשים כדי להחזיק את העור ולפתוח את החזה. (B)להשאיר 3 מ"מ של רקמה מבי העורקים (חץ שחור). (ג)לחתוך את הלב באמצע החדרים עם מספריים מספר 4. (D)פתח את הלב לכיוון שסתום אבי העורקים עם מספריים 3. השתמש פינצטה דקה 7 ו 8 כדי לנתח בזהירות את שסתום אבי העורקים. השסתום גלוי ויש לו כמה נקודות שחורות האופייניות לרקמת שסתום העכברים (חץ כחול). (E)להגדיל את ההגדלה כדי לדמיין טוב יותר את שסתום אבי העורקים. לבודד את השסתום עם המספריים הקטנים 4; (ו)לשמור על הרקמה עם פינצטה 7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תיאור מייצג של בידוד תא שסתום עכבר. קיצורים: HEPES = 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזינתאנסולניק; RT = טמפרטורת החדר; DMEM = מדיום הנשר המותאם של דולבק; FBS = סרום בקר עוברי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: פנוטיפ תא שסתום עכבר. מבט מיקרוסקופי של (A)תאי שסתום מבודדים טריים. כתמי אימונופלואורסצנטיות מראים (B)תאים חיוביים vimentin ו - (C) α-SMA. התאים שליליים להכתמת CD31 (D). סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר. קיצורים: DAPI = 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול; CD31 = אשכול של בידול 31; α-SMA = אקטין שרירים חלק אלפא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: במבחנה הסתיידות אסאי. (A)פוספט עשיר בהסתיידות בינונית של VIC במבחנה,שנמדדה בערכת ריאגנט. (B)תמונה מיקרוסקופית המציגה כתמים חיוביים אדומים (מימין) לצמתי סידן. (C)הכתמים האדומים של אליזרין הראו צמתי סידן חיוביים (חץ שחור) של VICs בתגובה למדיום הסתיידות. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: CTL- = בקרה; mVICs = תאי ביניים valvular עכבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט של בידוד תא שסתום עכבר עבור התרבות הראשית. שלושה שסתומי אבי העורקים מעכברים בני 8 שבועות אוגדו כדי להשיג מספר מספיק של תאים. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר את האפיון של פנוטיפ VIC ואת in vitro mineralization assay. השיטה הותאמה מהפרוטוקול שתואר קודם לכן מאתיו ואח'7.
במהלך הבידוד של שסתומי אבי העורקים, יש לנקוט זהירות כדי למנוע את כל מקורות ההדבקה האפשרית כדי להגן על התאים מפני זיהום חיידקי או mycoplasma. ואכן, חיוני לכלכל את כל הכלים הכירורגיים לפני תחילת הניסויים. הפתרון HEPES צריך להיות נוסף עם 1% אנטיביוטיקה כדי למזער זיהום חיידקי. יתר על כן, mycoplasma עלול לגרום ציטופתולוגיה וכתוצאה מכך להפריע לכל פרמטר נמדד בתרבות התא10.
ציפוי תאים במנות תרבות קטנות עם נפח נמוך יותר של מדיום תרבות הוא קריטי לצמיחה והתפשטות VIC. לתת לרקמה להתיישב ולדבוק בצלחת תרבית התאים מאפשרת העברת תאים מהרקמה לקיר הכלים. בהתחשב בכך שתאים מבודדים מעכברים צעירים מתרבים מהר יותר, מומלץ להעביר תאים למנת תרבות גדולה יותר של 75 ס"מ2 לאחר 5 ימים של תרבות. שמירה על תאים ל 80% מפגש הוא חיוני כדי למזער את הבידול של VICs פנוטיפ myofibroblast8.
כפי שמוצג על ידי הדמיית אימונופלואורסצנטיות, תאי השסתום המבודדים מראים פנוטיפ דמוי פיברובלסט. VICs יש ציטופלסמה מוארכת להביע הן vimentin ו αSMA כפי שתואר על ידי מחקרים קודמים. העבודה הנוכחית אישרה כי פנוטיפ VIC העכבר דומה לזה שתואר בעבר עבור VICs חזיר11 ו- VICs אנושי12. רוב מחקרי במבחנה על היצרות העורקים מבוצעים על תאים מבעלי חיים גדולים8,11. החיסרון העיקרי של אח"מים חזיריים הוא ההבחנה הספונטנית שלהם פנוטיפ osteoblast במבחנה אפילו במדיה רגילה13. עם זאת, מחשבי ה- VICs של העכבר אינם מסוידים באופן ספונטני אפילו במעברים גבוהים יותר.
עכבר VICs להבדיל פנוטיפ osteoblast בתגובה בינוני מסויד באמצעות חומצה אסקורבית, אינסולין, גירוי פוספט. מאמר זה מתאר שיטה כמותית של מדידת סידן באמצעות ערכה ושיטה איכותית באמצעות כתמים אדומים Alizarin. שתי השיטות הראו עלייה משמעותית בהסתיידות בתגובה לטיפול בינוני מסויד. ערכת מדידת הסידן היא השיטה הסטנדרטית לזהב, המציעה מדידת סידן כמותית מדויקת14.
בריגנט ארסנזו השלישי, הפרעות מגנזיום נמנעות על ידי הכללה של 8-הידרוקסיקווינולין גופרתי. סידן מגיב עם ריאגנט כדי ליצור קומפלקס בצבע סגול, אשר נספג ב 650 ננומטר. עוצמת הצבע פרופורציונלית לריכוז הסידן. הדיוק של ריאגנט ארסנזו-III אומת בעבר עם ספקטרופוטומטריית ספיגה אטומית. אותה שיטה משמשת במעבדות קליניות למדידת ריכוז הסידן הכולל בנוזלים ביולוגיים14. הסתיידות היצרות העורקים היא בעיקר הידרוקסיאפטיט, כפי שמוצג עם אנרגיה רנטגן מפוזרת סריקת ניתוח מיקרוסקופיה אלקטרונים7,12,15. ואכן, חשוב לנתח את הסתיידות קרום התא ולא סידן חינם כדי לחקות בצורה מדויקת יותר את הסתיידות של רקמת שסתום אבי העורקים.
עכברים מייצגים מקור טוב של VICs לחקר מנגנונים מולקולריים המובילים הסתיידות שסתום אבי העורקים. עם זאת, יש לזכור כי VICs במבחנה אינם דומים VICs בשסתומים חיים. מגבלה נוספת היא העובדה כי מאגר של שסתומים מ 3-5 עכברים נדרש כדי להפוך את תרבות תא יחיד. הבריכה צריכה להיות מעכברים המלטה כדי למזער וריאציות. בנוסף, ניסויים צריכים להתבצע משולש כדי לאשר את כל הממצאים. עם זאת, השימוש של שסתום אבי העורקים כולו בתרבות יכול להקל על מגבלה זו. עם זאת, מחקרי במבחנה אלה חייבים להיות מאומתים ברקמת האדם כדי לחזק את הממצאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
| Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
| Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit to measure the concentration of calcium |
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | A2916801 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mycoplasma elimination reagent |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
References
- Rostagno, C.
- Stewart, B. F., et al. Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study. Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).
- Marquis-Gravel, G., Redfors, B., Leon, M. B., Généreux, P.
- Spitzer, E., et al. Aortic stenosis and heart failure: disease ascertainment and statistical considerations for clinical trials. Cardiac Failure Review. 5 (2), 99-105 (2019).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Simionescu, D. T., Chen, J., Jaeggli, M., Wang, B., Liao, J. Form follows function: advances in trilayered structure replication for aortic heart valve tissue engineering. Journal of Healthcare Engineering. 3 (2), 179-202 (2012).
- Bouchareb, R., et al. Activated platelets promote an osteogenic programme and the progression of calcific aortic valve stenosis. European Heart Journal. 40 (17), 1362-1373 (2019).
- Rutkovskiy, A., et al. Valve interstitial cells: the key to understanding the pathophysiology of heart valve calcification. Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).
- Bosse, Y., Mathieu, P., Pibarot, P. Genomics: the next step to elucidate the etiology of calcific aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 51 (14), 1327-1336 (2008).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
- Richards, J., et al. Side-specific endothelial-dependent regulation of aortic valve calcification: interplay of hemodynamics and nitric oxide signaling. American Journal of Pathology. 182 (5), 1922-1931 (2013).
- Bouchareb, R., et al. Mechanical strain induces the production of spheroid mineralized microparticles in the aortic valve through a RhoA/ROCK-dependent mechanism. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 49-59 (2014).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Janssen, J. W., Helbing, A. R. Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum. European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).
- Ortlepp, J. R., et al. Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis. Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).
