توضح هذه المقالة عزل خلايا الصمام الأبهري للفأرة بواسطة إجراء كولاجيناز من خطوتين. خلايا صمام الماوس المعزولة مهمة لإجراء فحوصات مختلفة، مثل هذا المقايسة تكلس المختبر، والتحقيق في المسارات الجزيئية المؤدية إلى تمعدن الصمام الأبهري.
تكلس خلايا الصمام الأبهري هو السمة المميزة للتضيق الأبهري ويرتبط مع تليف أعتاب الصمام. تلعب الخلايا الخلالية للصمامات (VICs) دورا مهما في عملية تكلس تضيق الأبهر من خلال تفعيل برنامجها للتمايز إلى خلايا تشبه الأرومة العظمية. MOUSE VICs هي أداة جيدة في المختبر لتوضيح مسارات الإشارات التي تقود تمعدن خلية الصمام الأبهري. الطريقة الموصوفة هنا، التي استخدمها هؤلاء المؤلفون بنجاح، تشرح كيفية الحصول على خلايا معزولة حديثا. تم إجراء عملية كولاجيناز من خطوتين مع 1 ملغم/مل و4.5 ملغم/مل. الخطوة الأولى حاسمة لإزالة طبقة الخلية البطانية وتجنب أي تلوث. حضانة الكولاجين الثانية هي تسهيل هجرة VICs من الأنسجة إلى اللوحة. بالإضافة إلى ذلك ، تتم مناقشة إجراء تلطيخ immunofluorescence لتوصيف النمط الظاهري لخلايا صمام الماوس المعزولة. وعلاوة على ذلك، تم إجراء فحص تكلس في المختبر باستخدام إجراء قياس كاشف الكالسيوم وتلطيخ أحمر alizarin. استخدام الخلايا صمام الماوس الثقافة الأولية أمر ضروري لاختبار أهداف الدوائية الجديدة لمنع تمعدن الخلايا في المختبر.
مرض الصمام الأبهري المتكلس (CAVD) هو مرض القلب الصمامي الأكثر انتشارا في السكان الغربيين ، ويؤثر على ما يقرب من 2.5٪ من الأفراد المسنين الذين تزيد أعمارهم عن 65 عاما. CAVD يؤثر على أكثر من ستة ملايين أميركي ويرتبط مع التغيرات في الخصائص الميكانيكية للمنشورات التي تضعف تدفق الدم العادي من خلال1،2. حاليا، لا يوجد علاج دوائي لوقف تطور المرض أو لتنشيط الانحدار المعدني. العلاج الفعال الوحيد لعلاج CAVD هو استبدال الصمام الأبهري عن طريق الجراحة أو استبدال الصمام الأبهري عبر القسطرة3. ولذلك فمن الضروري التحقيق في الآليات الجزيئية المؤدية إلى تمعدن الصمام لتحديد أهداف دوائية جديدة. في الواقع، تضيق الأبهر غير المعالجة له عدة عواقب سلبية مثل ضعف البطين الأيسر وفشل القلب4.
يتكون الصمام الأبهري من ثلاث طبقات تعرف باسم فيروسا وسبونغيوسا والبطين ، والتي تحتوي على VICs كنوع الخلية السائد5. وتغطي فيبرسا البطين بطبقة من الخلايا البطانية الوعائية (VECs)5. تنظم VECs نفاذية الخلايا الالتهابية وكذلك إشارات الباراكورين. زيادة الإجهاد الميكانيكي قد تؤثر على سلامة VECs وتعكر صفو التوازن من الصمام الأبهري، مما يؤدي إلى غزو الخلايا الالتهابية6. أظهرت تحليلات المجهر الإلكتروني المسح الضوئي تعطل بطانة الرحم في صمام الأبهر المتكلس الإنسان7.
تكشف التحليلات النسيجية للأنسجة المتكلسة عن وجود أوبلاستات والعظام. وعلاوة على ذلك، لوحظ التمايز العظمي للمركبات VICs في المختبر وفي أنسجة الصمام البشري8. يتم تنظيم هذه العملية بشكل رئيسي من قبل عامل النسخ المرتبط رونت 2 (Runx2) والبروتينات مورفوجينية العظام (BMPs)8،9.
تقدم هذه المقالة بروتوكول مفصل عزل خلية صمام الماوس للثقافة الأساسية. تم تجميع ثلاثة صمامات الأبهر من الفئران البالغة من العمر 8 أسابيع للحصول على عدد كاف من الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، يصف هذا البروتوكول توصيف النمط الظاهري في مركز فيينا الدولي ومقايسة التمعدن في المختبر. تم تك…
3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit to measure the concentration of calcium |
Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
CD31 | Novusbio | ||
Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
FBS | Gibco 16000044 | ||
Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mycoplasma elimination reagent |
PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
Vimentin | abcam |