Summary
Denna artikel beskriver isoleringen av musaortaklaffceller genom en tvåstegs kollagenasprocedur. Isolerade musventilceller är viktiga för att utföra olika analyser, såsom denna in vitro-förkalkningsanalys, och för att undersöka de molekylära vägarna som leder till aortaventilmineralisering.
Abstract
Förkalkning av aorta ventil celler är kännetecknet för aorta pylorusstenos och är associerad med ventil cusp fibros. Ventil interstitiella celler (VICs) spelar en viktig roll i förkalkningsprocessen i aorta stenos genom aktivering av deras dedifferentieringsprogram till osteoblastliknande celler. Mus-VICs är ett bra in vitro-verktyg för att belysa signalvägarna som driver mineraliseringen av aortaventilcellen. Metoden som beskrivs häri, framgångsrikt används av dessa författare, förklarar hur man får nyisolerade celler. En tvåstegs collagenase förfarande utfördes med 1 mg/mL och 4,5 mg/mL. Det första steget är avgörande för att ta bort det endotelcellsskiktet och undvika förorening. Den andra kollageninkubationen är att underlätta migreringen av VIC från vävnaden till plattan. Dessutom diskuteras en immunofluorescens färgning förfarande för fenotyp karakterisering av isolerade mus ventil celler. Dessutom utfördes förkalkningsanalysen in vitro med hjälp av kalciumreagensmätningsförfarandet och alizarinröd färgning. Användning av musventil cell primär kultur är avgörande för att testa nya farmakologiska mål för att hämma cellmineralisering in vitro.
Introduction
Calcified aorta ventil sjukdom (CAVD) är den vanligaste valvular hjärtsjukdomar i västra populationer, påverkar nästan 2,5% av äldre individer över 65 år1. CAVD påverkar över sex miljoner amerikaner och är förknippat med förändringar i de mekaniska egenskaperna hos broschyrerna som försämrar normalt blodflöde genom1,2. För närvarande finns det ingen farmakologisk behandling för att stoppa sjukdomsförloppet eller aktivera mineralregression. Den enda effektiva behandlingen för behandling av CAVD är aorta ventil ersättning genom kirurgi eller transcatheter aorta ventil ersättning3. Det är därför absolut nödvändigt att undersöka de molekylära mekanismer som leder till ventilmineralisering för att identifiera nya farmakologiska mål. Faktum är att icke-behandlad aortastenos har flera negativa konsekvenser som vänster ventrikel dysfunktion och hjärtsvikt4.
Aortaventilen består av tre lager som kallas fibrosa, spongiosa och ventrikulära, som innehåller VIC som den dominerande celltypen5. Fibrosa och Ventrikulärt är täckta av ett lager av vaskulär endotelceller (VEC)5. VECs reglerar permeabiliteten hos inflammatoriska celler samt parakrina signaler. Ökad mekanisk stress kan påverka VECs integritet och störa aortaventilens homeostas, vilket leder till inflammatorisk cellinvasion6. Scanning elektronmikroskopi analyser visade stört endotel i en mänsklig calcified aorta ventil7.
Histologiska analyser av förkalkad vävnad avslöjar förekomsten av osteoblaster och osteoklaster. Osteogenic differentiering av VIC observerades dessutom både in vitro och i mänskliga ventil vävnad8. Denna process orkestreras huvudsakligen av Den Runt-relaterade transkriptionsfaktorn 2 (Runx2) och benmorfogenetiska proteiner (BMPs)8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla djurförsök som beskrivs här har godkänts av Icahn School of Medicine vid Mount Sinai institutionella kärna och användningskommitté.
1. Förberedelse före isolering av ventilceller från vuxna möss
- Rengör och sterilisera alla kirurgiska instrument som visas i figur 1A med hjälp av 70 % v/v etanol och sedan autoklavera dem i 30 minuter.
- Tillsätt 500 μL penicillin-streptomycin till 50 ml 10 mm HEPES. Förbered en alikvot på 50 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Håll lösningarna på is.
- Förbered 1 mg/ml och 4,5 mg/ml kollagenaslösningar och använd 5 ml av varje lösning i 15 ml-rör för att utföra hela proceduren. För att förbereda 5 ml 1 mg/ml kollagenas, blanda 5 mg kollagenas med 2,5 ml Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM, fetala bovinserum (FBS)-fritt) och 2,5 ml 10 mM HEPES kompletterat med antibiotika (1% penicillin-streptomycin från steg 1, 2). Filtrera lösningarna genom ett filter på 0,22 μm för att avlägsna eventuell förorening.
OBS: Håll lösningarna på is för att skydda enzymerna. - Värm DMEM-lösningen till 37 °C innan du använder den i alla steg som beskrivs nedan. Förbered komplett medium genom att komplettera DMEM med 1% penicillin-streptomycin, 1% natrium pyruvat, 5 ml 200 mM L-glutamin, 1 ml mykoplasma eliminering reagens (se materialförteckningen)och 10% FBS.
2. Isolering av ventilceller
- För att få 106 celler för experimentet, använd fem 8 veckor gamla möss (minst tre). Placera musen i en induktionskammare tillsammans med ett litet vävnadspapper blött med 1 ml isofluran, men låt inte kontakt med vävnaden. För att bekräfta att djuret är helt sövt; kontrollera om tå nyp reflex, och sedan avliva musen genom massundersökning förskjutning. Använd isofluran för att lindra smärta före livmoderhalsen förskjutning som förfarandet beskrivs nedan är terminal.
- Placera musen på en dissekeringsplattform och fixa tassarna med kanyler för att hålla den på plats. Rengör bröstet och buken med etanol; öppna buken och bröstet med sax. Med liten kirurgisk sax, skär mellan vänster atrium och vänster ventrikel för att exsanguinate musen. Granska hjärtat med 10 ml kall 1x PBS för att avlägsna blod från hjärtat.
- Skär hjärtat och håll 3 mm från den stigande aortan enligt figur 1B. Dissekera aortaventilen under ett stereomikroskop. Skär hjärtat horisontellt i mitten av ventriklarna(bild 1C). Skär den vänstra ventrikeln mot aortan och dissekera försiktigt kolorektalventilen(figur 1D-F). Slå ihop ventilerna i en liten 35 mm vävnadskulturrätt.
- Tvätta de isolerade ventilerna i en 75 mm cellkulturrätt med 5 ml kall HEPES (10 mM) kompletterad med antibiotika (1% penicillin-streptomycin) för att avlägsna blod (Figur 2). Förbered två 15 ml rör av kollagenas 1 mg/ml och 4,5 mg/ml enligt beskrivningen ovan i steg 1.
OBS: Manipulera de isolerade ventilerna i en steril biosäkerhetshuv efter dissekeringen för att minimera kontaminering. - Inkubera ventilerna i kollagenas typ I (1 mg/ml) i 30 min vid 37 °C med kontinuerlig skakning(figur 2). Centrifugera röret i 5 min vid 150 × g, tvätta pelleten en gång med 2 ml HEPES (10 mM) och virvel i 30 s vid hög hastighet. Häll innehållet i detta rör i en 35 mm odlingsform och överför försiktigt fragmenten av vävnaden med tunna pincett till ett nytt rör.
OBS: I detta skede är VIC fortfarande inte dissocierade från vävnaden, och pelleten innehåller bitar av vävnad. För att undvika kontaminering med endotelceller, centrifugera inte efter virvel i steg 2.5. - Inkubera pelleten i ett 15 ml-rör med 5 ml kollagenas typ I (4,5 mg/ml) vid 37 °C under kontinuerlig omrörning i 35 min. Suspendera cellerna igen med en 1 ml pipett för att separera cellerna och centrifugera vid 150 × g i 5 min vid 4 °C.
- Kassera supernaten och sätt tillbaka pelleten i 2 ml komplett DMEM. Centrifugera vid 150 × g i 5 min vid 4 °C. Upprepa det här steget två gånger för att rengöra cellerna.
Pelleten har fortfarande vissa vävnadsfragment. - Suspendera pelleten i 1 ml komplett medium och plätera cellerna i en brunn i en 6-brunns cellkulturrätt i en minsta mängd medium för att underlätta deras fastsättning på odlingsrätten. Lämna cellerna ostörda i en inkubator på 37 °C med 5 % koldioxid.
- Efter 3 dagar, kontrollera cellerna under mikroskopet för att verifiera god tillväxt nära vävnadsresterna. När 1 000 celler är synliga under mikroskopet, ta försiktigt bort vävnadsskräpet med autoklaverade pincett och byt medium.
OBS: Plattan får inte störas; Om det önskade antalet celler inte observeras, placera cellkulturrätten tillbaka i inkubatorn i ytterligare 2 dagar. - När cellerna är 70% konfluenta (2,5 × 105),trypsinize och överför dem sedan till en 75 mm vävnadskulturrätt.
3. Analys av cellidentitet och morfologi
OBS: Immunofluorescens färgning användes för att studera cell morfologi och endotel cell kontaminering.
- Rengör huven med 70% v/v/ etanol. Placera sterila täcken (22 mm x 22 mm) i 6-brunnsplattor.
OBS: För att sterilisera täckena, tvätta dem med 70% etanol och förvara dem i huven över natten under ultraviolett ljus. - Frö 100 000 celler per brunn i en 6-brunnsplatta. Efter 24 timmar tvätta cellerna två gånger i 1x PBS och fixera dem i 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 min. Tvätta cellerna igen två gånger med 1x PBS.
OBS: Vid denna tidpunkt kunde cellerna hållas i PBS vid 4 °C fram till början av färgningsproceduren. - För att kontrollera vic:rnas renhet, använd alfa-glatt muskelaktin (αSMA), vimentin och kluster av differentiering 31 (CD31) för att upptäcka kontaminering med VEC.
- Förbered en alikvot för blockeringsbuffert genom att blanda 500 μL normalt serum (samma art som sekundärantikroppen), 9,5 ml 1x PBS och 30 μL Triton X-100. Inkubera cellerna i 2 ml av blockeringsbufferten i 1 timme.
- Bered antikroppsspädningsbufferten som innehåller 30 μL Triton X-100, 10 ml 1x PBS och 0,1 g bovint serumalbumin (BSA).
- Ta en tom tipslåda, fyll halva lådan med vatten för att skapa en fuktig kammare. Täck spetshållaren med en våt vävnad och sedan med ett ark parafilm.
- Ta 1 μL av den primära antikroppen och blanda den med 100 μL av utspädningsbufferten som bereds i steg 3.5. Placera 50 μL av den utspädda antikroppen på parafilmen. Ta täckena från brunnarna, vänd dem och placera dem på toppen av dropparna av antikroppar; inkubera cellerna över natten med antikroppen.
- Tillsätt 1 ml PBS i 6-brunnsplattan. Ta försiktigt ut täcket från parafilmen, vänd den och placera den i brunnen. Tvätta cellerna med en kontinuerlig mild omrörning i 5 min. Ersätt PBS med färsk PBS; tvätta cellerna 3 gånger.
- Inkubera cellerna med den utspädda sekundära antikroppen (1/500) (Alexa-488, Alexa-555) i 1 timme. Tillsätt 1 μL av den sekundära antikroppen till 500 μL av antikroppsutspädningsbufferten (beredd i steg 3.5). Täck plattan med aluminiumfolie. Tvätta cellerna 3 gånger med 1 ml 1x PBS med kontinuerlig agitation.
- Montera täckglasen med 50 μL 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI)-monteringsmedium och observera cellerna under mikroskopet för att analysera cellernas morfologi och VEC-förorening.
4. Analys av förkalkning in vitro
- Rengör huven med 70% etanol, värm DMEM-mediet till 37 °C.
- Frö 100 000 celler/tillstånd till 6-brunnsplattor i komplett DMEM och odling i 24 timmar vid 37 °C.
- Förbered förkalkningsmediet genom att blanda 2 mM NaH2PO4,10-7 M insulin och 50 μg/ml askorbinsyra i DMEM med 5% FBS. För 93 ml DMEM tillsätt 5 ml FBS, 1 ml antibiotika (slutlig koncentration 1%), 1 ml natrium pyruvat (100 mM), 27,5 mg NaH2PO4, 5, 8 μL insulin och 5 mg askorbinsyra.
OBS: Filtrera lösningen med ett filter på 0,22 μm före användning. - Efter 24 timmar, byt ut det övernaturliga mediet mot förkalkningsmediet. Inkubera cellerna i 7 dagar vid 37 °C. På 3rd-dagen, ersätt med färskt förkalkningsmedium och placera plattan tillbaka i inkubatorn för att slutföra de 7 behandlingsdagarna.
- Efter 7 dagar, ta bort mediet och tvätta cellerna två gånger med 2 ml 1x PBS. Inkubera cellerna i 1 ml 0,6 N saltsyra (HCl) i 24 timmar vid 37 °C. Samla HCl i ett 1,5 ml-rör och avdunsta det i en roterande förångare. Suspendera innehållet i alla rör i 60 μL HCl.
OBS: Torkproceduren är viktig för att koncentrera lösningen och ha samma volym för varje tillstånd. - Använd en 96-brunnsplatta för att mäta kalciumkoncentrationen med arsenazo III-reagens, som finns i ett färdigt kit (se materialförteckningen för mer information).
- Förbered en kalciumstandardlösning på 10 mg/dL koncentration. Väg 10 mg kalciumhydroxid (Ca(OH)2) och lös upp i 100 ml destillerat vatten.
- I en klar 96 brunnsplatta, rör 2 μL blindlösning (HCl, 0,6 N), standardlösningen, provet per brunn (10 mg/dL) och proverna. Utför experimentet i tre exemplar för att verifiera pipettingvariationen. Tillsätt 200 μL reagens för varje tillstånd.
OBS: Prover över 15 mg/dL ska spädas ut 1:1 med saltlösning, analyseras på nytt och resultatet multipliceras med två. - Inkubera reaktionen i 15 minuter vid rumstemperatur.
OBS: Reaktionen är stabil i 60 min. - Läs och registrera plattans absorbans vid 650 nm. Använd följande formel för att beräkna mängden kalcium i proverna:
Kalcium (mg/ml) = (Absorbans av prov/absorbans av standard) × Koncentration av standard
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eftersom murinaortatikventiler vanligtvis är 1 mm i diameter måste minst tre ventiler slås samman för att samla in en miljon livskraftiga celler för olika experimentella förfaranden. De olika stegen i VIC-isoleringsprocessen visas i figur 1 och figur 2. Eftersom det är svårt att manuellt skrapa ventilvävnaden är det att föredra att använda savspänning som skapas genom virvel för att ta bort VEC: erna. Resultaten av CD31-immunofluorescensfärgning visade att det inte fanns någon kontaminering av endotelceller (figur 3D). Dessutom uttrycker mus-VICs vimentin och α-SMA, som är de viktigaste markörerna för ventilceller (figur 3B, C).
Cellmineralisering in vitro
Ett kalciumreagenskit användes för att mäta kalciumkoncentrationen. celler som behandlats med förkalkningsmedium har högre kalciumkoncentration jämfört med icke-behandlade celler (figur 4A). Koncentrationen av kalcium normaliserades med den totala proteinkoncentrationen. Alizarin röd färgning bekräftade kalcium-reagens kit mätningar genom att visa röda positiva kalcium noder(figur 4B).
Bild 1: Beskrivning av ventilav dissekering. (A) Representativ bild av alla kirurgiska instrument som behövs för dissekeringen, sax 2 behövs för att öppna musens och saxens hud 3 för att öppna bröstet. Pincett 5 och 6 behövs för att hålla huden och öppna bröstet. B)Lämna 3 mm vävnad från aortan (svart pil). (C) Skär hjärtat i mitten av ventriklarna med sax nummer 4. (D) Öppna hjärtat mot aortaventilen med sax 3. Använd de tunna pincetterna 7 och 8 för att noggrant dissekera aortaventilen. Ventilen är synlig och har några svarta prickar som är karakteristiska för mössventilvävnad (blå pil). (E) Öka förstoringen för att bättre visualisera aortaventilen. Isolera ventilen med den lilla saxen 4; F) håll vävnaden med pincett 7. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Representativ beskrivning av isoleringen av musventilceller. Förkortningar: HEPES = 4-(2-hydroxyetyl)-1-piperazineethanesulfonsyra; RT = rumstemperatur; DMEM = Dulbeccos modifierade Eagle medium; FBS = fetala nötkreatur serum. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3: Fenotyp av musventilceller. Mikroskopisk vy över (A) nyisolerade ventilceller. Immunofluorescens färgning visar (B) vimentin-positiva celler och (C) α-SMA. Cellerna är negativa för( D) CD31 färgning. Skalstänger = 200 μm. Förkortningar: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole; CD31 = differentieringskluster 31; α-SMA = alfa-glatt muskelaktin. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4:Analys av förkalkning in vitro. (A) Fosfatrikt förkalkningsmedium inducerat VIC-förkalkning in vitro,som mättes med ett reagenssats. (B) Mikroskopisk bild som visar röd positiv färgning (höger) för kalciumnoder. (C) Alizarin röd färgning visade positiva kalcium noder (svart pil) av VIC som svar på förkalkning medium. Skalstänger = 100 μm. Förkortningar: CTL- = Control; mVICs = musvalvulära interstitiella celler. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den här artikeln presenterar ett detaljerat protokoll för musventil cell isolering för primär kultur. Tre aorta ventiler från 8 veckor gamla möss var poolade för att få ett tillräckligt antal celler. Dessutom beskriver detta protokoll karakteriseringen av VIC fenotyp och in vitro mineralisering analys. Metoden anpassades från det tidigare beskrivna protokollet från Mathieu et al.7.
Under isoleringen av kolorektalventiler måste man se till att undvika alla källor till eventuell smitta för att skydda cellerna från bakteriell eller mykoplasmaförorening. Det är faktiskt viktigt att autoklavera alla kirurgiska verktyg innan experimenten påbörjas. HEPES-lösningen bör kompletteras med 1% antibiotika för att minimera bakteriell infektion. Dessutom kan mykoplasma orsaka cytopatologi och följaktligen störa varje parameter som mäts i cellkultur10.
Plätering av celler i små odlingsrätter med lägre volym kulturmedium är avgörande för VIC-tillväxt och spridning. Att låta vävnaden sätta sig och hålla fast vid cellkulturrätten tillåter cellmigration från vävnaden till skålväggen. Med tanke på att isolerade celler från unga möss förökar sig snabbare, rekommenderas att överföra celler till en större odlingsrätt på 75 cm2 efter 5 dagars kultur. Att upprätthålla celler till 80% sammanflöde är avgörande för att minimera differentiering av VICs till en myofibroblast fenotyp8.
Som framgår av immunofluorescens imaging, de isolerade ventil cellerna visar en fibroblast-liknande fenotyp. VIC har en långsträckt cytoplasma och uttrycker både vimentin och αSMA enligt beskrivningen i tidigare studier. Det aktuella arbetet bekräftade att musen VIC fenotyp liknar den som tidigare beskrivits för svin VICs11 och mänskliga VICs12. De flesta in vitro-studier på aortastenos utförs på celler från stora djur8,11. Den viktigaste nackdelen med svin VICs är deras spontana differentiering till en osteoblast fenotyp in vitro även i normala medier13. Mus-VICs förkalkar dock inte spontant även vid högre passager.
Mus VICs skiljer sig från osteoblast fenotyp som svar på förkalkning medium med askorbinsyra, insulin och fosfat stimulering. Denna artikel beskriver en kvantitativ metod för kalciummätning med hjälp av ett kit och en kvalitativ metod med Alizarin röd färgning. Båda metoderna visade betydande ökning av förkalkning som svar på förkalkning medium behandling. Kalciummätningssatsen är guldstandardmetoden, som erbjuder en exakt kvantitativ kalciummätning14.
I Arsenazo III reagens förhindras magnesium interferens genom införandet av 8-hydroxyquinoline sulfonat. Kalcium reagerar med reagenset för att bilda ett lilafärgat komplex, som absorberar vid 650 nm. Färgens intensitet är proportionell mot kalciumkoncentrationen. Noggrannheten i Arsenazo-III reagenset validerades tidigare med atomabsorptionsspektrofotometri. Samma metod används i kliniska laboratorier för att mäta den totala kalciumkoncentrationen i biologiskavätskor 14. Förkalkningen i aortastenos är huvudsakligen hydroxyapatit, vilket visas med dispersiv röntgenenergiskanning elektronmikroskopianalys7,12,15. Det är faktiskt viktigt att analysera förkalkningen av cellmembranet snarare än fritt kalcium för att mer exakt efterlikna förkalkningen av aortaventilvävnaden.
Möss representerar en bra källa till VIC för studier av molekylära mekanismer som leder till aortaventilförkalkning. Tänk dock på att VIC in vitro inte liknar VIC i levande ventiler. En annan begränsning är det faktum att en pool av ventiler från 3-5 möss behövs för att göra en enda cellkultur. Poolen ska vara från kullmöss för att minimera variationer. Dessutom bör experiment utföras i tre exemplar för att bekräfta alla fynd. Användningen av hela aortaventilen i kulturen kan dock lindra denna begränsning. Dessa in vitro-studier måste dock valideras i mänsklig vävnad för att stärka resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
| Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
| Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit to measure the concentration of calcium |
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | A2916801 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mycoplasma elimination reagent |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
References
- Rostagno, C.
- Stewart, B. F., et al. Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study. Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).
- Marquis-Gravel, G., Redfors, B., Leon, M. B., Généreux, P.
- Spitzer, E., et al. Aortic stenosis and heart failure: disease ascertainment and statistical considerations for clinical trials. Cardiac Failure Review. 5 (2), 99-105 (2019).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Simionescu, D. T., Chen, J., Jaeggli, M., Wang, B., Liao, J. Form follows function: advances in trilayered structure replication for aortic heart valve tissue engineering. Journal of Healthcare Engineering. 3 (2), 179-202 (2012).
- Bouchareb, R., et al. Activated platelets promote an osteogenic programme and the progression of calcific aortic valve stenosis. European Heart Journal. 40 (17), 1362-1373 (2019).
- Rutkovskiy, A., et al. Valve interstitial cells: the key to understanding the pathophysiology of heart valve calcification. Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).
- Bosse, Y., Mathieu, P., Pibarot, P. Genomics: the next step to elucidate the etiology of calcific aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 51 (14), 1327-1336 (2008).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
- Richards, J., et al. Side-specific endothelial-dependent regulation of aortic valve calcification: interplay of hemodynamics and nitric oxide signaling. American Journal of Pathology. 182 (5), 1922-1931 (2013).
- Bouchareb, R., et al. Mechanical strain induces the production of spheroid mineralized microparticles in the aortic valve through a RhoA/ROCK-dependent mechanism. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 49-59 (2014).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Janssen, J. W., Helbing, A. R. Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum. European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).
- Ortlepp, J. R., et al. Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis. Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).
