Aqui, apresentamos um protocolo para estudar a competitividade do Aedes aegypti masculino utilizando corante fluorescente como marcador. Mosquitos fêmeas são expostos a machos marcados e não marcados para cópula. Após o acasalamento, seus espermatozoides são examinados sob um microscópio de fluorescência para determinar seu parceiro de acasalamento.
O sucesso de programas de supressão populacional estéril ou incompatível baseados em técnicas de insetos depende da capacidade dos machos soltos de competir por fêmeas do tipo selvagem e induzir a esterilidade na população-alvo. Assim, a avaliação laboratorial da competitividade do acasalamento masculino é essencial para avaliar a aptidão da cepa de liberação antes da liberação do campo. Convencionalmente, tal ensaio é realizado determinando a proporção de ovos viáveis produzidos pelas fêmeas após serem simultaneamente expostos a dois conjuntos de machos (tipo selvagem e cepas de liberação) para cópula. No entanto, esse processo é demorado e trabalhoso devido à necessidade de primeiro alimentar as fêmeas para a produção de ovos e, em seguida, eclodir e enumerar os ovos eclodidos para determinar a viabilidade dos ovos.
Além disso, este método não pode discernir o grau de competitividade entre duas linhas de mosquitos estéreis ou infectadas por Wolbachia,uma vez que mosquitos fêmeas do tipo selvagem só produzirão ovos não viáveis após o acasalamento com ambos. Para contornar essas limitações, este artigo descreve um método mais direto de medir a competitividade do acasalamento de mosquitos machos em ambientes laboratoriais usando o corante fluorescente, rhodamina B (RhB), que pode ser usado para marcar os machos alimentando-os em solução de sacarose contendo RhB. Após o ensaio de acasalamento, a presença de espermatozoides fluorescing na espermatozoide de uma fêmea pode ser usada para determinar seu parceiro de acasalamento. Este método é econômico, reduz o tempo experimental em 90% e permite a comparação da aptidão de acasalamento entre duas linhas estéreis ou infectadas por Wolbachia.
A criação e liberação de machos estéreis ou incompatíveis para supressão de populações de mosquitos Aedes está sendo avaliada no campo como uma nova ferramenta para prevenir surtos de dengue e outras doenças transmitidas pelo Aedes1. As estratégias de supressão de liberação masculina que estão atualmente em ensaios de campo incluem o uso do método genético2, irradiação (Técnica de Insetos Estéreis, SIT)3, bactérias endossembióticas Wolbachia (Técnica Incompatível de Insetos, IIT)4, ou uma combinação das duas últimas técnicas5,6. O sucesso dessas abordagens depende em grande parte da capacidade dos machos soltos de superar os machos selvagens e procurar fêmeas para garantir a cópula. Caso contrário, a esterilidade não pode ser induzida na população-alvo.
Em um programa clássico de SIT, por exemplo, o aptidão para o acasalamento masculino pode ser afetado por fatores como a dose de irradiação7,8,9, protocolo de criação em massa e a extensão da endogamia na colônia10,11,12,13,14. Além disso, estudos sobre a competitividade do acasalamento podem fornecer conhecimentos importantes sobre o comportamento do acasalamento de mosquitos que poderiam ser usados para informar estratégias de controle de vetores.
No SIT e IIT, a competitividade do acasalamento dos mosquitos machos é tipicamente avaliada, permitindo que tanto o tipo selvagem quanto a cepa de liberação competem por fêmeas do tipo selvagem em uma gaiola8,11,15,16. As fêmeas são então alimentadas com sangue e seus ovos eclodiram para determinar a viabilidade. Acredita-se que fêmeas que colocam ovos ou ovos não viáveis com baixa taxa de escotilha tenham acasalado com machos de cepa de liberação, enquanto as fêmeas que produzem ovos viáveis são consideradas acasaladas com machos do tipo selvagem. A competitividade do acasalamento é então calculada com o Índice Frito17. Infelizmente, este método é intensivo em recursos e demorado, e o Índice Frito global pode ser influenciado por fatores de confusão externos que afetam a viabilidade dos ovos, como o mau manuseio de ovos e a dessecação excessiva podem resultar em uma baixa taxa de escotilha na cruz de compatibilidade que pode, então, levar a um índice frito artificialmente baixo.
Além disso, este método não permite a comparação direta da competitividade do acasalamento entre mosquitos Aedes que são infectados com diferentes cepas de Wolbachia ou que estão expostos a diferentes doses de irradiação. Por isso, é necessário um método mais direto para enfrentar esses desafios. Estudos recentes18,19 demonstraram a eficácia do uso do corante fluorescente, RhB, para marcar o fluido seminal dos mosquitos machos. O fluido seminal marcado é transferido e armazenado no espermatozoide do mosquito fêmea após o sucesso do acasalamento, permitindo a medição direta da interação de acasalamento feminino com machos marcados. Rhodamine B é um corante de fluorone reativa de tiool comumente usado como biomarcador para estudos de pesquisa ecológica e comportamental em animais, incluindo insetos20. Para estudos de mosquitos, o RhB é introduzido pela alimentação com água de açúcar ou mel contendo pó de RhB dissolvido18,19,21,22,23,24. Após a absorção, o corante RhB se liga a proteínas, manchando o tecido corporal com uma mancha rosa-avermelhada que fluoresce laranja brilhante sob uma fonte de luz fluorescente.
O forte sinal de fluorescência e estabilidade da marcação, juntamente com sua capacidade de manchar fluidos seminal de insetos, permite o monitoramento da transferência de fluido seminal marcado do macho rotulado para os órgãos de armazenamento de esperma do inseto feminino para estudos de acasalamento18,19,21,24. O uso de RhB em um ensaio de competitividade de acasalamento masculino não só permite a medição direta da interação de acasalamento de fêmeas com machos marcados e não marcados, mas os resultados também podem ser obtidos dentro de 24h, pois evita o processo de determinação da viabilidade do ovo, que normalmente requer cerca de 10 a 14 dias. Além disso, esse método supera a perda potencial de dados quando os mosquitos fêmeas não se alimentam ou morrem antes da oposição. Isso é particularmente crucial porque em ensaios semi-campo, onde mosquitos fêmeas são propensos a danos e morte durante a coleta pós-acasalamento usando uma mochila ou aspirador mecânico. Para abordar as limitações atuais do uso da fertilidade feminina, apresentamos um método alternativo que usa a coloração do RhB para medir diretamente a competitividade do acasalamento de mosquitos machos. O método simplifica o fluxo de trabalho, encurta o tempo experimental de cerca de duas semanas para um dia, permitindo que mais réplicas experimentais sejam realizadas e permite a comparação entre duas cepas de liberação. Este protocolo será adequado para laboratórios que estão embarcando em programas de supressão populacional de mosquitos baseados em liberação masculina, e pode ser usado para controle de qualidade de rotina e avaliação de tensão.
A marcação é comumente usada em pesquisas entomológicas para estudar a dinâmica populacional de insetos, dispersão, comportamento e biologia do acasalamento26. Nos programas SIT e IIT, a marcação é realizada para diferenciar a cepa de liberação da população de campo para estudar sua dispersão e otimizar a razão de liberação. Os métodos de marcação utilizados incluem marcação genética27,28, incorporação de isótopos em alimentos larvais29,30, pó fluorescente31e corante32. Para a supressão de populações de mosquitos que utilizam SIT ou IIT, onde o acoplamento masculino é um componente crítico, corantes fluorescentes têm sido usados como marcadores para estudar a biologia do acasalamento de mosquitos18,19.
Convencionalmente, a avaliação da competitividade do acasalamento masculino da cepa de liberação tem sido avaliada utilizando ensaios de fertilidade feminina. No entanto, este ensaio é demorado e intensivo em mão-de-obra devido aos processos experimentais a jusante pós-acasalamento(Figura Suplementar S1). Esses processos incluem alimentação sanguínea das fêmeas, coleta de ovos, eclosão dos ovos e enumeração da proporção de ovos eclodidos para determinar a viabilidade dos ovos. Em média, este ensaio requer 30 horas-homem e duas semanas de trabalho experimental (a partir da criação das gaiolas de ensaio de competitividade) até a determinação final da competitividade do acasalamento masculino.
seu artigo apresenta o uso de um corante fluorescente, RhB, (alimentado como 0,2% rhb-sacarose para os mosquitos, Figura Suplementar S2) para medir diretamente as interações de acasalamento entre fêmeas e machos marcados por RhB. Embora este protocolo exija um microscópio estéreo de fluorescência, ele evita a necessidade de realizar os procedimentos experimentais demorados mencionados acima. Em média, este ensaio baseado em RhB requer aproximadamente 10 horas-homem e cerca de um dia para obter dados equivalentes aos de ensaios de fertilidade feminina. Isso > 90% de economia de tempo permite que pesquisadores realizem múltiplas réplicas experimentais, proporcionando uma validação mais robusta do aptidão masculina de acasalamento. Além disso, este ensaio pode ser usado para comparar a competitividade do acasalamento entre duas linhas de mosquitos estéreis ou infectados por Wolbachia.
Esse tipo de comparação não é possível com os ensaios convencionais de fertilidade feminina, pois as fêmeas produziriam ovos não viáveis ao acasalar com ambas as linhas. Não obstante, qualquer acasalamento misto no experimento resultará em viés em relação à população marcada, pois é difícil identificar espermatozoides não marcados em espermatozoides fêmeas que contêm fluido seminal tanto de machos marcados por RhB quanto não marcados. Uma conclusão semelhante foi feita em estudo que avaliou a competitividade do acasalamento de Anopheles gambiae utilizando RhB18, pelo qual uma maior proporção de fêmeas no ensaio de acasalamento foi encontrada acasalada por machos marcados. Como a poliandria é mais provável de ocorrer em fêmeas que anteriormente haviam se envolvido em um acasalamento interrompido33, a probabilidade de isso ocorrer foi reduzida neste estudo por meio do uso de menos mosquitos (20 machos a 10 fêmeas) em um volume maior de gaiola (0,216 m3) nesses experimentos.
Os resultados não mostraram viés em relação à população marcada por RhB, indicando que o acasalamento misto era limitado. Em resumo, a incorporação do RhB para marcar os machos em um ensaio de competitividade de acasalamento é uma maneira econômica e rápida de avaliar o condicionamento físico do acasalamento masculino. Este método também permite a comparação direta da competitividade do acasalamento entre machos expostos a diferentes doses de irradiação, criados em diferentes regimes de criação, ou aqueles infectados com diferentes cepas de Wolbachia,tornando-se uma ferramenta valiosa para a avaliação da aptidão de acasalamento masculino para qualquer programa de supressão populacional de mosquitos baseado em liberação masculina.
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi financiado pela Agência Nacional do Meio Ambiente (NEA), em Cingapura. Agradecemos ao sr. Chew Ming Fai, Vice-Diretor Executivo (Saúde Pública), NEA, por sua aprovação para publicar o estudo, e A/Prof Ng Lee Ching, Diretor do Grupo (Environmental Health Institute Group), NEA, por seu apoio neste estudo. Agradecemos também ao Dr. Shuzhen Sim e à Dra Denise Tan por revisarem o manuscrito.
Compound light microscope | Olympus | CX23 | To score for spermathecae insemination |
Dissection forceps | Bioquip | Rubis forceps (4524) | |
Fluorescence stereo-light microscope with RFP1 filter | Olympus | SZX16 | To check for Rhodamine B fluorescence signal |
Mosquito cages | Bugdorm | 4F3030 | W 32.5 cm x D 32.5 cm x H 32.5 cm; mesh size of 150 x 150; 160 µm aperture For holding of male and female adult mosquitoes prior to mating assay |
6M610 | W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm; mesh size of 44 x 32; 650 µm aperture For mating competitiveness assay |
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Mosquito netting | 150 x 150, 160 µm aperture | ||
Rhodamine B | Sigma Aldrich | R6626 | ≥95% (HPLC) |
Stereo-light microscope | Olympus | SZ61 | For spermathecae dissection |
Sucrose | MP Biomedicals | SKU 029047138 | Food grade |
TetraMin tropical flakes | Tetra | 77101 | Fish food for feeding larvae |