在这里,我们提出了一个协议,研究雄性 伊蚊 的交配竞争力使用荧光染料作为标记。雌性蚊子接触有标记和无标记的雄性进行交配。交配后,在荧光显微镜下检查他们的精子,以确定他们的交配伙伴。
无菌或不相容的昆虫技术为基础的种群抑制计划的成功取决于被释放的雄性竞争野生型雌性的能力,并诱发目标种群的不育。因此,实验室评估男配竞争力对于在野外释放前评估释放菌株的体能至关重要。通常,这种检测是通过确定雌性在同时接触两组雄性(野生型和释放菌株)进行交配后产生的活卵的比例来进行的。然而,这个过程是耗时和费力的,因为需要首先血液喂养女性的卵子生产,然后孵化和列举孵化的鸡蛋,以确定鸡蛋的生存能力。
此外,这种方法无法辨别两种无菌或 沃尔巴契亚感染的蚊子线之间的竞争力,因为野生型雌性蚊子只有在与两种蚊子交配后才会产生不可行的卵子。为了规避这些限制,本文描述了一种更直接的方法,利用荧光染料Rhodamine B(RhB)测量雄性蚊子在实验室环境中的交配竞争力,这种染料可用于用含有RhB的蔗糖溶液喂养雄性蚊子来标记雄性蚊子。交配后,女性精子中是否有荧光精子可用于确定其交配伙伴。这种方法具有成本效益,将实验时间缩短了90%,并允许比较两条无菌或 沃尔巴契亚感染线之间的交配体能。
目前,该领域正在评估饲养和释放无菌或不相容的雄性以抑制伊蚊种群,这是预防登革热和其他伊蚊传播疾病爆发的新工具。目前正在实地试验的男性释放抑制策略包括使用遗传方法2,辐照(无菌昆虫技术,SIT)3,内同体菌沃尔巴契亚(昆虫不相容技术,IIT)4,或后两种技术的组合5,6。这些方法的成功在很大程度上取决于被释放的雄性的能力,以超越野生类型的男性,并寻求女性,以确保交配。否则,目标人群不能诱发不育。
例如,在经典的 SIT 计划中,男配体能可能受到辐射剂量7 、 8 、 9 、大规模饲养协议和10 、 11 、 12 、 13 、 14等群体近亲繁殖程度等因素的影响。此外,关于交配竞争力的研究可以提供有关蚊子交配行为的重要知识,可用于为病媒控制策略提供信息。
在SIT和IIT中,雄性蚊子的交配竞争力通常通过允许野生蚊子和释放菌株在8、11、15、16号笼子中争夺野生型雌性蚊子来评估。然后,女性被血液喂养,他们的卵子孵化,以确定生存能力。产下不可行的卵子或孵化率低的卵子的雌性被认为与释放菌株雄配,而产下可行卵子的女性则被认为与野生型雄配。然后用弗里德指数17计算交配竞争力。不幸的是,这种方法是资源密集型和耗时的,整体 Fried 指数可能受到影响鸡蛋生存能力的外部混淆因素的影响,如鸡蛋处理不良和过度干燥可能导致兼容叉的低孵化率,然后可能导致人为地降低油炸指数。
此外,这种方法不允许直接比较感染不同菌株的沃尔巴契亚或暴露于不同剂量辐照的伊蚊之间的交配竞争力。因此,需要一种更直接的方法来应对这些挑战。最近的研究18,19已经证明使用荧光染料RhB,以标记雄性蚊子的开创性液体的有效性。标记的开创性液体在成功交配后被转移到雌性蚊子的精子中,从而能够直接测量雌配与标记的雄配。罗达明B是一种硫醇反应氟染料,常用于昆虫等动物的生态和行为研究的生物标志物。在蚊子研究方面,RhB是通过用含溶解RhB粉18、19、21、22、23、24的糖或蜂蜜水喂养而引入的。吸收后,RhB 染料与蛋白质结合,用发红粉色的污渍染色身体组织,在荧光光源下荧光明亮的橙色。
强烈的荧光信号和稳定的标记,加上它的能力,染色昆虫的开创性液体,允许监测标记的开创性液体从标记的男性转移到精子储存器官的女性昆虫交配研究18,19,21,24。在雄配竞争力测试中使用 RhB 不仅能够直接测量雌性与有标记和无标记的雄配相互作用,而且结果也可以在 24 小时内获得,因为它可以避免确定卵子生存能力的过程,这通常需要大约 10 至 14 天。此外,当雌性蚊子不喂血或在放血前死亡时,这种方法克服了数据的潜在损失。这一点尤其重要,因为在半场试验中,雌性蚊子在交配后使用背包或机械吸气器容易受到损害和死亡。为了解决目前使用女性生育能力的局限性,我们提出了一种替代方法,使用RhB染色直接测量雄性蚊子交配的竞争力。该方法简化了工作流程,将实验时间从大约两周缩短到一天,允许进行更多的实验复制,并允许对两个释放菌株进行比较。该协议将适用于正在开展基于男性释放的蚊子种群抑制计划的实验室,并可用于日常质量控制和菌株评估。
标记常用于昆虫种群动力学、分散性、行为学和交配生物学的研究。在 SIT 和 IIT 计划中,进行标记以区分释放应变与现场人群,以研究其分散性和优化释放率。使用的标记方法包括遗传标记27,28,在幼虫食物29,30,荧光尘埃31和染料32中加入同位素。为了抑制蚊子种群使用 SIT 或 IT ,其中男配健身是一个关键组成部分,荧光染料已被用作标记,研究蚊子交配生物学18 , 19 。
通常,使用女性生育力测定评估释放菌株的男配竞争力。然而,由于交配后的下游实验过程(补充图S1),这种检测是耗时和劳动密集型的。这些过程包括女性的血液喂养、卵子采集、卵子孵化以及孵化卵子的比例的列举,以确定卵子的生存能力。平均而言,这种检测需要 30 小时和两周的实验工作(从建立竞争力检测笼开始),到最终确定男配竞争力。
他的论文介绍了使用荧光染料RhB(喂0.2%的RhB-蔗糖蚊子, 补充图S2)直接测量女性和RhB标记的雄性之间的交配相互作用。虽然此协议需要荧光立体显微镜,但它无需执行上述耗时的实验程序。平均而言,这种基于RhB的检测需要大约10个工时和大约一天才能从女性生育力检测中获取与此相当的数据。这 & gt ; 90% 的时间节省,使研究人员能够进行多个实验复制,提供男配体能更有力的验证。此外,这种检测可用于比较两条无菌或沃尔巴契亚感染蚊子线之间的交配竞争力。
这种类型的比较是不可能与传统的女性生育力测定,因为女性会产生不可行的卵子交配时,这两个这样的线。 尽管如此,实验中的任何混合交配都会导致对有标记人群的偏向,因为很难识别女性精子中含有来自 RhB 标记和无标记男性的的无标记精子。在一项使用 RhB18评估阿诺菲莱斯甘比亚交配竞争力的研究中也得出了类似的结论,根据该研究,在交配测定中,有较大比例的女性被发现由有标记的雄配。由于多变更可能发生在以前参与中断交配33的女性中,因此在这项研究中,通过在这些实验中使用较少的蚊子(20个雄性到10个雌性)来降低这种交配的概率。
结果显示,对RhB标记的种群没有偏见,表明混合交配是有限的。总之,将 RhB 纳入交配竞争力测定中,是评估男配体能的一种经济和快速的方法。这种方法还允许直接比较在不同饲养制度下接受不同剂量辐照的雄性或感染了不同菌株 的沃尔巴契亚的雄性之间的交配竞争力,使其成为评估男配适应任何男性释放型蚊子种群抑制计划的宝贵工具。
The authors have nothing to disclose.
这项研究由新加坡国家环境局(NEA)资助。我们感谢国家卫生局(卫生署)副行政总裁周明辉先生批准发表这项研究,以及国家环境局环境健康研究所组长吴丽清教授对这项研究的支持。我们也感谢辛淑贞博士和谭德瑞博士校对手稿。
Compound light microscope | Olympus | CX23 | To score for spermathecae insemination |
Dissection forceps | Bioquip | Rubis forceps (4524) | |
Fluorescence stereo-light microscope with RFP1 filter | Olympus | SZX16 | To check for Rhodamine B fluorescence signal |
Mosquito cages | Bugdorm | 4F3030 | W 32.5 cm x D 32.5 cm x H 32.5 cm; mesh size of 150 x 150; 160 µm aperture For holding of male and female adult mosquitoes prior to mating assay |
6M610 | W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm; mesh size of 44 x 32; 650 µm aperture For mating competitiveness assay |
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Mosquito netting | 150 x 150, 160 µm aperture | ||
Rhodamine B | Sigma Aldrich | R6626 | ≥95% (HPLC) |
Stereo-light microscope | Olympus | SZ61 | For spermathecae dissection |
Sucrose | MP Biomedicals | SKU 029047138 | Food grade |
TetraMin tropical flakes | Tetra | 77101 | Fish food for feeding larvae |