Burada, erkek Aedes aegypti’nin çiftleşme rekabet gücünün bir işaretleyici olarak floresan boyası kullanılarak incelenmesi için bir protokol sunuyoruz. Dişi sivrisinekler çiftleşme için hem işaretli hem de işaretlenmemiş erkeklere maruz kalır. Çiftleşme sonrası spermathecae’leri çiftleşme partnerlerini belirlemek için floresan mikroskop altında incelenir.
Steril veya uyumsuz böcek tekniğine dayalı popülasyon bastırma programlarının başarısı, serbest bırakılan erkeklerin vahşi tip dişiler için rekabet etme ve hedef popülasyonda steriliteyi teşvik etme yeteneğine bağlıdır. Bu nedenle, erkek çiftleşme rekabet gücünün laboratuvar değerlendirmesi, serbest bırakma suşunun saha salınmadan önceki kondisyonunu değerlendirmek için gereklidir. Geleneksel olarak, böyle bir test, çiftleşme için iki erkek kümesine (vahşi tip ve serbest bırakma suşları) aynı anda maruz kaldıktan sonra dişiler tarafından üretilen canlı yumurtaların oranını belirleyerek gerçekleştirilir. Bununla birlikte, bu işlem, yumurta üretimi için dişileri önce kanla besleme ve daha sonra yumurta canlılığını belirlemek için yumurtadan çıkan yumurtaları yumurtadan çıkarıp numaralandırma ihtiyacı nedeniyle zaman alıcı ve zahmetlidir.
Dahası, bu yöntem iki steril veya Wolbachiaenfekte sivrisinek hattı arasındaki rekabet derecesini ayırt edemez, çünkü vahşi tip dişi sivrisinekler sadece her ikisiyle çiftleştiğinde canlı olmayan yumurtalar üretecektir. Bu sınırlamaları aşmak için, bu makale, erkekleri RhB içeren sakkaroz çözeltisinde besleyerek işaretlemek için kullanılabilecek floresan boya rhodamine B (RhB) kullanarak laboratuvar ortamlarında erkek sivrisinek çiftleşme rekabet gücünü ölçmenin daha doğrudan bir yöntemini açıklar. Çiftleşme testinden sonra, bir dişinin spermathecae’sinde floresan spermlerin varlığı, çiftleşme eşini belirlemek için kullanılabilir. Bu yöntem uygun maliyetlidir, deneysel süreyi% 90 azaltır ve iki steril veya Wolbachiaenfekte hat arasında çiftleşme zindeliğinin karşılaştırılmasına izin verir.
Aedes sivrisinek popülasyonlarının bastırılması için steril veya uyumsuz erkeklerin yetiştirilmesi ve salınması şu anda alanda dang ve diğer Aedeskaynaklı hastalık salgınlarını önlemek için yeni bir araç olarak değerlendirilmektedir1. Şu anda saha denemelerinde olan erkek salınımlı bastırma stratejileri arasında genetik yöntem2, ışınlama (Steril Böcek Tekniği, SIT)3, end ösymbiyotik bakteri Wolbachia (Böcek Uyumsuz Tekniği, IIT)4veya ikinci iki tekniğin bir kombinasyonu5,6. Bu yaklaşımların başarısı büyük ölçüde serbest bırakılan erkeklerin vahşi tip erkekleri alt etme ve çiftleşmeyi güvence altına almak için kadın arama yeteneğine bağlıdır. Aksi takdirde, hedef popülasyonda sterilite indüklenemez.
Klasik bir SIT programında, örneğin, erkek çiftleşme zindeliği ışınlama dozu7,8,9,kitle yetiştirme protokolü ve kolonideki akraba evliliği kapsamı10 , 11,12,13,14gibi faktörlerden etkilenebilir. Ayrıca, çiftleşme rekabet gücü üzerine yapılan çalışmalar, vektör kontrol stratejilerini bilgilendirmek için kullanılabilecek sivrisinek çiftleşme davranışı hakkında önemli bilgiler sağlayabilir.
SIT ve IIT’de, erkek sivrisineklerin çiftleşme rekabet gücü tipik olarak hem vahşi tip hem de serbest bırakma suşunun 8 ,11, 15,16kafesteki vahşi tip dişiler için rekabet etmesine izin vererek değerlendirilir. Dişiler daha sonra kanla beslenir ve yumurtaları canlılığı belirlemek için yumurtadan çıkar. Canlı olmayan yumurtaları veya yumurtaları düşük yumurta oranına sahip bırakan dişilerin serbest bırakma suşu erkeklerle çiftleştiği varsayılırken, canlı yumurta üreten kadınların vahşi tip erkeklerle çiftleştiği varsayılır. Çiftleşme rekabet gücü daha sonra Fried Index17ile hesaplanır. Ne yazık ki, bu yöntem kaynak yoğun ve zaman alıcıdır ve genel Fried Index, zayıf yumurta kullanımı ve aşırı desiccation gibi yumurta canlılığını etkileyen dış kafa karıştırıcı faktörlerden etkilenebilir, uyumluluk çaprazında düşük bir tarama oranına neden olabilir ve daha sonra yapay olarak düşük bir Fried Index’e yol açabilir.
Dahası, bu yöntem, Wolbachia’nın farklı suşlarıyla enfekte olan veya farklı ışınlama dozlarına maruz kalan Aedes sivrisinekleri arasında çiftleşme rekabet gücünün doğrudan karşılaştırılmasına izin vermez. Bu nedenle, bu zorlukları ele almak için daha doğrudan bir yöntem gereklidir. Son çalışmalar18,19, erkek sivrisineklerin seminal sıvısını işaretlemek için floresan boya olan RhB’yi kullanmanın etkinliğini göstermiştir. İşaretli seminal sıvı, başarılı çiftleşme üzerine dişi sivrisineklerin spermathecae’sinde aktarılır ve saklanır ve işaretli erkeklerle kadın çiftleşme etkileşiminin doğrudan ölçülmasına izin verir. Rhodamine B, böcekler de dahil olmak üzere hayvanlarda ekolojik ve davranışsal araştırma çalışmaları için biyobelirteç olarak yaygın olarak kullanılan tiyol reaktif florone boyasıdır20. Sivrisinek çalışmaları için, RhB çözünmüş RhB tozu 18 , 19 ,21,22,23,24içeren şeker veya bal suyu ile beslenerek tanıtılır. Alımdan sonra, RhB boyası proteinlere bağlanır ve floresan bir ışık kaynağı altında parlak turuncuyu floresanlayan kırmızımsı pembe bir leke ile vücut dokusunu lekeler.
İşaretin güçlü floresan sinyali ve stabilitesi, böcek seminal sıvılarını lekeleme yeteneği ile birleştiğinde, çiftleşme çalışmaları için işaretli seminal sıvının etiketli erkekten dişi böceğin sperm depolama organlarına transferinin izlenmesini sağlar18,19,21,24. RhB’nin bir erkek çiftleşme rekabetinde kullanılması, sadece kadınların işaretli ve işaretlenmemiş erkeklerle çiftleşme etkileşiminin doğrudan ölçülmesine izin vermekle kalmaz, aynı zamanda sonuçlar, tipik olarak yaklaşık 10 ila 14 gün gerektiren yumurta canlılığını belirleme sürecini ortadan kaldırırken 24 saat içinde de elde edilebilir. Ayrıca, bu yöntem, dişi sivrisinekler yumurtlamadan önce kan beslemediğinde veya ölmediğinde potansiyel veri kaybının üstesinden gelir. Bu özellikle çok önemlidir, çünkü dişi sivrisineklerin çiftleşme sonrası toplama sırasında sırt çantası veya mekanik aspiratör kullanarak hasara ve ölüme eğilimli olduğu yarı saha denemelerinde. Kadın doğurganlığını kullanmanın mevcut sınırlamalarını ele almak için, erkek sivrisinek çiftleşme rekabet gücünü doğrudan ölçmek için RhB boyama kullanan alternatif bir yöntem sunuyoruz. Yöntem, iş akışını basitleştirir, deneysel süreyi yaklaşık iki haftadan bir güne kısaltır, daha deneysel çoğaltmaların gerçekleştirilmesine izin verir ve iki serbest bırakma suşu arasında karşılaştırmaya izin verir. Bu protokol, erkek salınıma dayalı sivrisinek popülasyonu bastırma programlarına başlayan laboratuvarlar için uygun olacak ve rutin kalite kontrol ve gerinim değerlendirmesi için kullanılabilir.
İşaretleme, böcek popülasyon dinamiklerini, dağılım, davranış ve çiftleşme biyolojisini incelemek için entomolojik araştırmalarda yaygın olarak kullanılır26. SIT ve IIT programlarında, dağılımlarını incelemek ve serbest bırakma oranını optimize etmek için serbest bırakma suşunu alan popülasyonundan ayırt etmek için işaretleme gerçekleştirilir. Kullanılanişaretleme yöntemleri arasında larva gıda29, 30,floresan toz 31 ve boya32izotopları içeren genetik işaretleme 27 ,28bulunur. Erkek çiftleşme zindeliğinin kritik bir bileşen olduğu SIT veya IIT kullanarak sivrisinek popülasyonlarının bastırılması için, floresan boyalar sivrisinek çiftleşme biyolojisini incelemek için belirteçler olarak kullanılmıştır18,19.
Geleneksel olarak, serbest bırakma suşunun erkek çiftleşme rekabet gücünün değerlendirilmesi, kadın doğurganlık tahlilleri kullanılarak değerlendirilmiştir. Bununla birlikte, bu test çiftleşme sonrası aşağı akış deneysel süreçler nedeniyle zaman alıcı ve emek yoğundur (Ek Şekil S1). Bu işlemler arasında dişilerin kan beslemesi, yumurta toplanması, yumurtaların kuluçkalanması ve yumurtanın canlılığını belirlemek için yumurtadan çıkan yumurtaların oranının numaralandırı. Ortalama olarak, bu test 30 adam-saat ve iki haftalık deneysel çalışma gerektirir (rekabet gücü test kafeslerinin kurulmasından başlayarak) erkek çiftleşme rekabet gücünün nihai belirlenmesine kadar.
makalesi, dişiler ve RhB işaretli erkekler arasındaki çiftleşme etkileşimlerini doğrudan ölçmek için floresan boya, RhB, (sivrisineklere% 0.2 RhB-sakkaroz olarak beslenir, Ek Şekil S2)kullanımını sunar. Bu protokol floresan stereo mikroskop gerektirirken, yukarıda belirtilen zaman alıcı deneysel prosedürleri gerçekleştirme ihtiyacını ortadan ortadan alır. Ortalama olarak, bu RhB tabanlı tahlil, kadın doğurganlık tahlillerinden buna eşdeğer verileri elde etmek için yaklaşık 10 erkek saati ve yaklaşık bir gün gerektirir. Bu >90% zaman tasarrufu, araştırmacıların birden fazla deneysel çoğaltma gerçekleştirmesine izin vererek erkek çiftleşme zindeliğinin daha sağlam bir şekilde doğrulanmasını sağlar. Ek olarak, bu test iki steril veya Wolbachia enfekte sivrisinek hattı arasındaki çiftleşme rekabet gücünü karşılaştırmak için kullanılabilir.
Bu tür bir karşılaştırma geleneksel kadın doğurganlık tahlilleri ile mümkün değildir, çünkü dişiler bu tür her iki çizgiyle çiftleşmede canlı olmayan yumurtalar verirler. Buna rağmen, deneydeki herhangi bir karışık çiftleşme, hem RhB işaretli hem de işaretlenmemiş erkeklerden seminal sıvı içeren kadın spermathecae’deki işaretsiz spermleri tanımlamak zor olduğu için işaretli popülasyona karşı önyargıya neden olacaktır. Benzer bir sonuç, RhB18kullanılarak Anopheles gambiae’nin çiftleşme rekabet gücünü değerlendiren bir çalışmada yapıldı, böylece çiftleşme testinde kadınların daha büyük bir kısmının işaretli erkekler tarafından çiftleştiği tespit edildi. Poliandry daha önce yarıda kesilmiş bir çiftleşme33ile uğraşan kadınlarda ortaya çıkma olasılığı daha yüksek olduğundan, bu deneylerde daha büyük bir kafes hacminde (0.216 m3)daha az sivrisinek (20 erkek ila 10 kadın) kullanılarak bu çalışmada bunun gerçekleşme olasılığı azaltılmıştır.
Sonuçlar, RhB işaretli nüfusa karşı önyargı göstermedi ve karışık çiftleşmenin sınırlı olduğunu gösterdi. Özetle, erkekleri çiftleşme rekabetinde işaretlemek için RhB’nin dahil olması, erkek çiftleşme kondisyonunu değerlendirmenin ekonomik ve hızlı bir yoludur. Bu yöntem ayrıca, farklı ışınlama dozlarına maruz kalan, farklı yetiştirme rejimlerinde yetiştirilen veya wolbachia’nınfarklı suşları ile enfekte olanlar arasında çiftleşme rekabet gücünün doğrudan karşılaştırılmasını sağlar , herhangi bir erkek salınımlı sivrisinek popülasyonu bastırma programı için erkek çiftleşme uygunluğunun değerlendirilmesi için değerli bir araçtır.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Singapur Ulusal Çevre Ajansı (NEA) tarafından finanse edildi. Çalışmanın yayınlanmasına onay verdiği için NEA İcra Kurulu Başkan Yardımcısı (Halk Sağlığı) Bay Chew Ming Fai’ye ve bu çalışmaya verdiği destek için NEA Grup Direktörü (Çevre Sağlığı Enstitüsü Grubu) A/Prof Ng Lee Ching’e teşekkür ederiz. Ayrıca Dr Shuzhen Sim ve Dr Denise Tan’a taslağı düzelttikleri için teşekkür ederiz.
Compound light microscope | Olympus | CX23 | To score for spermathecae insemination |
Dissection forceps | Bioquip | Rubis forceps (4524) | |
Fluorescence stereo-light microscope with RFP1 filter | Olympus | SZX16 | To check for Rhodamine B fluorescence signal |
Mosquito cages | Bugdorm | 4F3030 | W 32.5 cm x D 32.5 cm x H 32.5 cm; mesh size of 150 x 150; 160 µm aperture For holding of male and female adult mosquitoes prior to mating assay |
6M610 | W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm; mesh size of 44 x 32; 650 µm aperture For mating competitiveness assay |
||
Mosquito netting | 150 x 150, 160 µm aperture | ||
Rhodamine B | Sigma Aldrich | R6626 | ≥95% (HPLC) |
Stereo-light microscope | Olympus | SZ61 | For spermathecae dissection |
Sucrose | MP Biomedicals | SKU 029047138 | Food grade |
TetraMin tropical flakes | Tetra | 77101 | Fish food for feeding larvae |