Aquí, presentamos un protocolo para estudiar la competitividad de apareamiento del Aedes aegypti macho utilizando tinte fluorescente como marcador. Los mosquitos hembra están expuestos a machos marcados y no marcados para la cópula. Después del apareamiento, sus espermatozoides se examinan bajo un microscopio de fluorescencia para determinar su compañero de apareamiento.
El éxito de los programas de supresión de poblaciones basados en técnicas de insectos estériles o incompatibles depende de la capacidad de los machos liberados para competir por las hembras de tipo salvaje e inducir la esterilidad en la población objetivo. Por lo tanto, la evaluación de laboratorio de la competitividad del apareamiento masculino es esencial para evaluar la aptitud de la cepa de liberación antes de la liberación en el campo. Convencionalmente, dicho ensayo se realiza determinando la proporción de huevos viables producidos por las hembras después de ser expuestas simultáneamente a dos conjuntos de machos (cepas de tipo salvaje y de liberación) para la cópula. Sin embargo, este proceso requiere mucho tiempo y es laborioso debido a la necesidad de alimentar primero a las hembras para la producción de huevos y luego eclosionar y enumerar los huevos eclosionados para determinar la viabilidad de los huevos.
Además, este método no puede discernir el grado de competitividad entre dos líneas de mosquitos estériles o infectados con Wolbachia,ya que los mosquitos hembra de tipo silvestre solo producirán huevos no viables al aparearse con ambos. Para eludir estas limitaciones, este documento describe un método más directo para medir la competitividad del apareamiento de mosquitos machos en entornos de laboratorio utilizando el tinte fluorescente, rodamina B (RhB), que se puede usar para marcar a los machos alimentándolos en solución de sacarosa que contiene RhB. Después del ensayo de apareamiento, la presencia de espermatozoides fluorescentes en el espermateca de una hembra se puede utilizar para determinar su pareja de apareamiento. Este método es rentable, reduce el tiempo experimental en un 90% y permite la comparación de la aptitud de apareamiento entre dos líneas estériles o infectadas con Wolbachia.
La cría y liberación de machos estériles o incompatibles para la supresión de las poblaciones de mosquitos Aedes se está evaluando actualmente en el campo como una herramienta novedosa para prevenir brotes de dengue y otras enfermedades transmitidas por Aedes1. Las estrategias de supresión de liberación masculina que se encuentran actualmente en ensayos de campo incluyen el uso del método genético2,irradiación (Sterile Insect Technique, SIT)3,bacteria endosimbiótica Wolbachia (Insect Incompatible Technique, IIT)4,o una combinación de estas dos últimas técnicas5,6. El éxito de estos enfoques depende en gran medida de la capacidad de los machos liberados para superar a los machos de tipo salvaje y buscar hembras para asegurar la cópula. De lo contrario, la esterilidad no puede ser inducida en la población objetivo.
En un programa clásico de SIT, por ejemplo, la aptitud de apareamiento masculino puede verse afectada por factores como la dosis de irradiación7,8,9,el protocolo de cría en masa y el grado de endogamia en la colonia10,11,12,13,14. Además, los estudios sobre la competitividad del apareamiento pueden proporcionar un conocimiento importante sobre el comportamiento de apareamiento de los mosquitos que podrían utilizarse para informar las estrategias de control de vectores.
En SIT e IIT, la competitividad de apareamiento de los mosquitos machos se evalúa típicamente permitiendo que tanto la cepa de tipo salvaje como la de liberación compitan por las hembras de tipo salvaje en una jaula8,11,15,16. Las hembras son alimentadas con sangre y sus huevos eclosionados para determinar la viabilidad. Se supone que las hembras que ponen huevos no viables o huevos con baja tasa de eclosión se han apareado con machos de cepa de liberación, mientras que se supone que las hembras que producen huevos viables se han apareado con machos de tipo salvaje. La competitividad del apareamiento se calcula entonces con el Índice Fried17. Desafortunadamente, este método consume muchos recursos y requiere mucho tiempo, y el índice frito general puede verse influenciado por factores de confusión externos que afectan la viabilidad del huevo, como el manejo deficiente del huevo y la desecación excesiva, puede resultar en una baja tasa de eclosión en el cruce de compatibilidad que luego puede conducir a un índice frito artificialmente bajo.
Además, este método no permite la comparación directa de la competitividad del apareamiento entre mosquitos Aedes que están infectados con diferentes cepas de Wolbachia o que están expuestos a diferentes dosis de irradiación. Por lo tanto, se requiere un método más directo para abordar estos desafíos. Estudios recientes18,19 han demostrado la eficacia del uso del tinte fluorescente, RhB, para marcar el líquido seminal de los mosquitos machos. El líquido seminal marcado se transfiere y almacena en la espermateca de los mosquitos hembra tras el apareamiento exitoso, lo que permite la medición directa de la interacción de apareamiento de las hembras con los machos marcados. La rodamina B es un colorante fluorona tiol-reactivo comúnmente utilizado como biomarcador para estudios de investigación ecológica y conductual en animales, incluidos insectos20. Para los estudios de mosquitos, rhB se introduce alimentándose con azúcar o agua de miel que contiene polvo de RhB disuelto18,19,21,22,23,24. Tras la absorción, el tinte RhB se une a las proteínas, teñiendo el tejido corporal con una mancha de color rosa rojizo que fluorescencia de color naranja brillante bajo una fuente de luz fluorescente.
La fuerte señal de fluorescencia y la estabilidad del marcado, junto con su capacidad para teñir los fluidos seminales de los insectos, permite el monitoreo de la transferencia del líquido seminal marcado del macho marcado a los órganos de almacenamiento de esperma del insecto hembra para estudios de apareamiento18,19,21,24. El uso de RhB en un ensayo de competitividad de apareamiento masculino no solo permite la medición directa de la interacción de apareamiento de las hembras con machos marcados y no marcados, sino que los resultados también se pueden obtener dentro de las 24 h, ya que evita el proceso de determinación de la viabilidad del huevo, que generalmente requiere alrededor de 10 a 14 días. Además, este método supera la posible pérdida de datos cuando los mosquitos hembra no se alimentan con sangre o mueren antes del oviposicionamiento. Esto es particularmente crucial porque en los ensayos de semi-campo, donde los mosquitos hembra son propensos a daños y muerte durante la recolección posterior al apareamiento con una mochila o aspirador mecánico. Para abordar las limitaciones actuales del uso de la fertilidad femenina, presentamos un método alternativo que utiliza la tinción rhB para medir directamente la competitividad del apareamiento de mosquitos machos. El método simplifica el flujo de trabajo, acortando el tiempo experimental de aproximadamente dos semanas a un día, lo que permite realizar réplicas más experimentales y permite la comparación entre dos cepas de liberación. Este protocolo será adecuado para los laboratorios que se están embarcando en programas de supresión de la población de mosquitos basados en la liberación de machos, y puede usarse para el control de calidad de rutina y la evaluación de cepas.
El marcado se usa comúnmente en la investigación entomológica para estudiar la dinámica de la población de insectos, la dispersión, el comportamiento y la biología del apareamiento26. En los programas SIT e IIT, el marcado se realiza para diferenciar la cepa liberadora de la población de campo para estudiar su dispersión y optimizar la relación de liberación. Los métodos de marcado utilizados incluyen el marcado genético27,28,la incorporación de isótopos en los alimentos larvales29,30,polvo fluorescente31y colorante32. Para la supresión de las poblaciones de mosquitos utilizando SIT o IIT, donde la aptitud de apareamiento masculino es un componente crítico, se han utilizado colorantes fluorescentes como marcadores para estudiar la biología del apareamiento de mosquitos18,19.
Convencionalmente, la evaluación de la competitividad del apareamiento masculino de la cepa de liberación se ha evaluado utilizando ensayos de fertilidad femenina. Sin embargo, este ensayo requiere mucho tiempo y mano de obra debido a los procesos experimentales posteriores al apareamiento(Figura suplementaria S1). Estos procesos incluyen la alimentación con sangre de las hembras, la recolección de huevos, la eclosión de los huevos y la enumeración de la proporción de huevos eclosionados para determinar la viabilidad del huevo. En promedio, este ensayo requiere 30 horas-hombre y dos semanas de trabajo experimental (desde la creación de las jaulas de ensayo de competitividad) hasta la determinación final de la competitividad del apareamiento de los machos.
su artículo presenta el uso de un tinte fluorescente, RhB, (alimentado como 0.2% RhB-sacarosa a los mosquitos, Figura Suplementaria S2)para medir directamente las interacciones de apareamiento entre las hembras y los machos marcados con RhB. Si bien este protocolo requiere un microscopio estereoscópico de fluorescencia, evita la necesidad de realizar los procedimientos experimentales que consumen mucho tiempo mencionados anteriormente. En promedio, este ensayo basado en RhB requiere aproximadamente 10 horas-hombre y aproximadamente un día para obtener datos equivalentes a los de los ensayos de fertilidad femenina. Este >90% de ahorro de tiempo permite a los investigadores investigadores realizar múltiples réplicas experimentales, proporcionando una validación más robusta de la aptitud de apareamiento masculino. Además, este ensayo se puede utilizar para comparar la competitividad del apareamiento entre dos líneas de mosquitos estériles o infectados con Wolbachia.
Este tipo de comparación no es posible con los ensayos convencionales de fertilidad femenina, ya que las hembras producirían óvulos no viables al aparearse con ambas líneas. No obstante, cualquier apareamiento mixto en el experimento resultará en un sesgo hacia la población marcada, ya que es difícil identificar espermatozoides no marcados en espermatozoides femeninos que contienen líquido seminal de machos marcados con RhB y no marcados. Una conclusión similar se hizo en un estudio que evaluó la competitividad del apareamiento de Anopheles gambiae utilizando RhB18, porel cual se encontró que una mayor proporción de hembras en el ensayo de apareamiento estaban apareadas por machos marcados. Como la poliandria es más probable que ocurra en hembras que previamente habían participado en un apareamiento interrumpido33,la probabilidad de que esto ocurra se redujo en este estudio al usar menos mosquitos (20 machos a 10 hembras) en un mayor volumen de jaula (0.216 m3)en estos experimentos.
Los resultados no mostraron ningún sesgo hacia la población marcada con RhB, lo que indica que el apareamiento mixto fue limitado. En resumen, la incorporación de RhB para marcar a los machos en un ensayo de competitividad de apareamiento es una forma económica y rápida de evaluar la aptitud de apareamiento de los machos. Este método también permite la comparación directa de la competitividad del apareamiento entre machos expuestos a diferentes dosis de irradiación, criados en diferentes regímenes de cría, o aquellos infectados con diferentes cepas de Wolbachia,lo que lo convierte en una herramienta valiosa para la evaluación de la aptitud de apareamiento masculino para cualquier programa de supresión de la población de mosquitos basado en la liberación de machos.
The authors have nothing to disclose.
Este estudio fue financiado por la Agencia Nacional de Medio Ambiente (NEA), Singapur. Agradecemos al Sr. Chew Ming Fai, Director Ejecutivo Adjunto (Salud Pública), NEA, por su aprobación para publicar el estudio, y a A/Prof Ng Lee Ching, Director del Grupo (Grupo del Instituto de Salud Ambiental), NEA, por su apoyo en este estudio. También agradecemos al Dr. Shuzhen Sim y a la Dra. Denise Tan por revisar el manuscrito.
Compound light microscope | Olympus | CX23 | To score for spermathecae insemination |
Dissection forceps | Bioquip | Rubis forceps (4524) | |
Fluorescence stereo-light microscope with RFP1 filter | Olympus | SZX16 | To check for Rhodamine B fluorescence signal |
Mosquito cages | Bugdorm | 4F3030 | W 32.5 cm x D 32.5 cm x H 32.5 cm; mesh size of 150 x 150; 160 µm aperture For holding of male and female adult mosquitoes prior to mating assay |
6M610 | W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm; mesh size of 44 x 32; 650 µm aperture For mating competitiveness assay |
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Mosquito netting | 150 x 150, 160 µm aperture | ||
Rhodamine B | Sigma Aldrich | R6626 | ≥95% (HPLC) |
Stereo-light microscope | Olympus | SZ61 | For spermathecae dissection |
Sucrose | MP Biomedicals | SKU 029047138 | Food grade |
TetraMin tropical flakes | Tetra | 77101 | Fish food for feeding larvae |