Summary
אנו מתארים את השיטה לניתוח כמותי של ההתפלגות של אספרגילוס פומיגאטוס קונידיה (3 מיקרומטר בגודל) דרכי הנשימה של עכברים. השיטה יכולה לשמש גם לניתוח של חלקיקים מיקרו חלקיקים וחלוקת ננו-חלקיקים בדרכי הנשימה במודלים שונים של מצב פתולוגי.
Abstract
אספרגילוס פומיגאטוס קונידיה הם פתוגנים מוטסים שיכולים לחדור דרכי הנשימה האנושיות. אנשים אימונו-מוכשרים ללא אלרגיות מפגינים עמידות וסובלנות חיסונית, ואילו בחולים אימונו-קום, קונידיה יכולה ליישב דרכי הנשימה ולגרום להפרעות נשימה פולשניות חמורות. תאים שונים בתאי דרכי הנשימה השונים מעורבים בתגובה החיסונית המונעת פלישה פטרייתית; עם זאת, ההיבטים המרחבי-זמניים של חיסול פתוגן עדיין לא מובנים לחלוטין. הדמיה תלת ממדית (3D) של איברים בעלי הרכבה מלאה שנוקתה אופטית, במיוחד הריאות של עכברים ניסיוניים, מאפשרת זיהוי של פתוגנים בעלי תווית פלואורסצנטית בדרכי הנשימה בנקודות זמן שונות לאחר ההדבקה. במחקר הנוכחי, אנו מתארים התקנה ניסיונית לביצוע ניתוח כמותי של הפצת קונידיה A. fumigatus בנתיבי הנשימה. באמצעות מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית פלואורסצנטית (CLSM), איתרנו את המיקום של קונידיה שכותרתו פלואורסצנטית בענפי הסימפונות ובתא המכתשי 6 שעות לאחר יישום oropharyngeal לעכברים. הגישה המתוארת כאן שימשה בעבר לזיהוי מיקום הפתוגן המדויק וזיהוי התאים האינטראקטיביים של הפתוגן בשלבים שונים של התגובה החיסונית. ההתקנה הניסיונית יכולה לשמש להערכת הקינטיקה של חיסול הפתוגן בתנאים פתולוגיים שונים.
Introduction
על בסיס יומי, אנשים שואפים פתוגנים מוטסים, כולל נבגים של פטריות אופורטוניסטיות אספרגילוס פומיגאטוס (A. fumigatus conidia) שיכולים לחדור את דרכיהנשימה 1. דרכי הנשימה של היונקים היא מערכת של דרכי הנשימה של דורות שונים המאופיינים במבנים השונים של קירות דרכיהנשימה 2,3,4. קירות קנה הנשימה מורכבים ממספר סוגי תאים ביניהם תאים ססיליים המספקים את הסיווג הרירי5. ב alveoli, אין תאים ciliated ואת פתוגנים בחלל המצף חודר לא ניתן לחסל על ידי אישור רירית6. יתר על כן, כל ייצור דרכי הנשימה הוא נישה עבור אוכלוסיות תאי חיסון מרובות ותת קבוצות של אוכלוסיות אלה ייחודיות לתאי דרכי הנשימה מסוימים. לפיכך, מקרופאגים מכתשיים שוכנים בתאים מכתשיים, בעוד הן קנה הנשימה והן דרכי הנשימה המוליכות מרופדים בתאים דנדריטיים תוך-אפיטליים7,8.
הגודל המשוער של קונידיה A. fumigatus הוא 2-3.5 מיקרומטר9. מאז הקוטר של דרכי הנשימה הקטנות בבני אדם ואפילו בעכברים עולה על 3.5 מיקרומטר, הוצע כי conidia יכול לחדור את החלל המהשתי2,10,11. למעשה, בדיקה היסתולוגית הראתה את הצמיחה הפטרייתית ב alveoli של החולים הסובלים אספרגילוזיס12. Conidia זוהו גם alveoli של עכברים נגועים באמצעות הדמיה חיה של פרוסות הריאה העבה13. בו זמנית, conidia זוהו בצד הזוהר של אפיתל הסימפונות של עכברים14.
הדמיה תלת מימדית (3D) של ריאות העכבר המלא שנוקתה אופטית מאפשרת ניתוח מורפומטרי של דרכיהנשימה 15. במיוחד, הניתוח הכמותי של התפלגות עצב pleural הקרביים בוצע באמצעות אופטית ניקה דגימות ריאות עכבר15. לאחרונה, Amich ואח' 16 חקר את הצמיחה הפטרייתית לאחר יישום תוך נאוי של conidia לעכברים immunocompromised באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של דגימות ריאות עכבר נקי אופטית. המיקום המדויק של conidia המנוחה בדרכי הנשימה בנקודות זמן שונות לאחר הזיהום חשוב לזיהוי אוכלוסיות התאים שיכולים לספק הגנה אנטי פטרייתית מספקת בשלבים מסוימים של דלקת. עם זאת, בשל הגודל הקטן יחסית, ההיבטים המרחבי-זמניים של התפלגות קונידיה A. fumigatus בנתיבי הנשימה מאופיינים בצורה גרועה.
כאן, אנו מציגים מערך ניסיוני לניתוח כמותי של הפצת קונידיה A. fumigatus בנתיבי הנשימה של עכברים נגועים. באמצעות מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית פלואורסצנטית (CLSM) של ריאות מנוקות אופטית של עכברים שקיבלו יישום oropharyngeal של conidia A. fumigatus, אנו מקבלים תמונות תלת-ממדיות ומבצעים את עיבוד התמונה. באמצעות הדמיה תלת-ממדית של אונת הריאות כולה, הראינו בעבר את ההתפלגות של קונידיה A. fumigatus בנתיב האוויר של עכברים 72 שעות לאחר יישום conidia8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות הנוגעות לחיות מעבדה המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) במכון שמיאקין ואובצ'יניקוב לכימיה ביואורגנית, האקדמיה הרוסית למדעים (פרוטוקול מספר 226/2017).
1. א. יישום קונידיה של פומיגטוס
- כדי להשיג פלואורסצנטית שכותרתו A. fumigatus conidia, לתקן 5 × 108 conidia על ידי הוספת 1 מ"ל של 3% paraformaldehyde לכדור conidia. דגירה במבחנה של 50 מ"ל למשך 2 שעות על שייקר בטמפרטורת החדר.
- לשטוף conidia עם 20 מ"ל של תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS): צנטריפוגה ב 1,000 x g במשך 15 דקות, בעדינות להסיר את supernatant, ולהוסיף PBS טרי בנפח של 20 מ"ל. חוזר.
- להמיס את conidia ב 900 μL של 0.1 M NaHCO3.
- ממיסים את אסתר הסוצ'ינימידיל של צבע פלואורסצנטי 594 ננומטר ב 100 μL של דימתיל סולפוקסיד ולהוסיף conidia.
- לדגור את conidia עם הצבע במשך 1 שעה על שייקר ב 150 סל"ד בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את conidia פעמיים עם 20 מ"ל של PBS בצנטריפוגה ב 1,000 x g במשך 15 דקות.
- לדלל את conidia לריכוז של 1 × 108 conidia / mL ב PBS ולאחסן ב 4 °C (77 °F).
- תירדים את העכבר עם 0.5-3% אדים איזופלוריין. שים את העכבר על המחזיק, תקן את הלשון במלקחיים חלקים, והחזק את ה- nares. קח pipette ערוץ יחיד ולהחיל 50 μL של השעיית conidia על הלוע העכבר. חכה עד שההשעיה תשאוף.
2. הכנת דגימה
- הכן את מבחנה 50 מ"ל ולמלא אותו עם 15 מ"ל של 2% paraformaldehyde טרי. מניחים את המכשירים הרפואיים (מלקחיים ניתוח שיניים 15 ס"מ, מלקחיים עדינים 8 ס"מ ומספריים 10 ס"מ עם קצוות קהים) לתמיסת אתנול 70%.
- המת חסד העכבר בהתאם לפרוטוקול IACUC. לאחר מכן למקם את העכבר במצב גבעול ולתקן את כפות העכבר עם מחטים.
הערה: אם משתמשים בפריקה צוואר הרחם להמתת חסד, להבטיח את שלמות קנה הנשימה.- לטפל בעכבר עם 70% אתנול באמצעות מרסס.
- הפוך חתך אורך חציוני בעור הגחון מן כפות הרגליים האחוריות אל forepaws ואת הסנטר.
- להפריד את העור מן הרקמה התת עורית באמצעות מלקחיים שיניים ומספריים סגורות. לתקן את הקצוות העליונים של העור עם מחטים.
- לעשות חתכים בדופן הבטן ולהפריד את הכבד מן הסרעפת. בזהירות לבחור את הסרעפת עם מספריים סגורים ולאחר מכן לחתוך את הסרעפת.
- הפוך חתך מנדלי של בית החזה ורקמות חיבור הצוואר עד קנה הנשימה גלוי.
- הפעל חוט משי מתחת קנה הנשימה ולעשות קשר כירורגי באמצעות שני מלקחיים.
הערה: לחלופין, השתמש בחוט דנטלי במקום בחוט משי.- בזהירות למשוך את החוט ולחתוך את הריאות מרקמת החיבור עם מספריים. החזק את המספריים בניצב לשולחן.
- שים את הריאות במבחנה 50 מ"ל עם 2% paraformaldehyde. להשאיר חוט מסתיים מחוץ לצינור, לשים את הכיסוי חזק, ולהפוך את הצינור כדי לכסות את הריאות עם paraformaldehyde. החזק את הריאות לילה ב 4 °C (5 °F).
- לנתח את אונות הריאות מהלב וזה את זה עם אזמל.
- שים את אונות הריאות בצלחת 24 היטב, עם כל אונה בבאר נפרדת. לשטוף את אונות הריאות ב 1 מ"ל של תמיסת מלח (TBS) pH 7.4, 5 פעמים עבור 1 שעה כל אחד על שייקר ב 150 סל"ד.
- החלף 1 מ"ל של TBS עם 1 מ"ל של מאגר חסימה (1% Triton X 100, 5% אבקת חלב ב- TBS) ולהשאיר את הדגימה לילה בטמפרטורת החדר על שייקר.
- החלף את מאגר החסימה עם 1 מ"ל של סטרפטאבידין-488- ננומטר פלואורכרום מצומד 1:30 ב- TBS. השאר את הדגימה לפחות 72 שעות בטמפרטורת החדר על שייקר (150 סל"ד).
- לשטוף את הדגימה 5 פעמים במשך 1 שעה כל אחד ב 1 מ"ל של TBS בטמפרטורת החדר על שייקר (150 סל"ד). מעבירים את הדגימה לבארות החדשות ומכסים אותה ב-2% פרפורמלדהיד לילה ב-4 מעלות צלזיוס לאחר קיבעון.
3. ניקוי אופטי של אונת הריאה של העכבר
- מניחים את הדגימה בבקבוק זכוכית 5 מ"ל מלא 3 מ"ל של 50% פתרון מי מתנול ולשים אותו על מערבל מדגם בטמפרטורת החדר במשך 1 שעה.
- החלף 3 מ"ל של 50% מתנול עם 3 מ"ל של 100% מתנול ולשים אותו על מערבל מדגם במשך 2 שעות. הכן תערובת 1:2 v/v של בנזיל אלכוהול ובנזיל בנזואט (BABB) בנפח כולל של 1 מ"ל.
- מעבירים את הדגימה לצלחת של 24 באר ומכסים ב-1 מ"ל של תערובת BABB למשך 30 דקות לפחות. אין להשאיר את הדגימה ב- BABB במשך זמן רב; BABB יכול לפגוע בצלחת הפלסטיק ולהפוך את הדגימה נוקשה מדי.
- שים את הדגימה בתא כיסוי הדמיית התא. הדגימה מוכנה להדמיה.
4. הדמיית אונות ריאות עכבר עם CLSM
- תדליק את מערכת המיקרוסקופ. פתח את תוכנת המיקרוסקופ. הפעל את נורית השידור בכרטיסיה איתור. בחר את המטרה 10x.
הערה: לניתוח מפורט יותר, השתמש במטרה 20x, אך היא מגדילה את זמן הניסוי ואת גודל קובץ התמונה. - שים את התא עם הדגימה במחזיק שקופית הכיסוי. שים את המחזיק על במת XY מעל המטרה. מרכז את הדגימה באמצעות פקדי XY של הבמה מעל המטרה. השתמש באור השידור ובעין כדי למצוא ידנית את דגימת Z-plane.
- עבור את התוכנה לכרטיסיה רכישה. בחר CLSM λ-mode. הפעל את הלייזרים 488 ננומטר ו- 561 ננומטר. בחר את המראה הדיכרואית 488/561 ננומטר. שנה את הטווח הספקטרלי של הגלאי ל 490-695 ננומטר. כוונן את כוח הלייזר לטווח המתאים (10-50 μW). התאם את רווח הגלאי בין טווח 750-900.
הערה: הגדרות רווח גבוהות יותר אינן רצויות עקב רעש. - צמצם את חור הסיכה ליחידה אוורירית אחת על-ידי לחיצה על לחצן AU אחד. הגדר את רזולוציית הפיקסלים ל- 512 × 512 פיקסלים.
- התחל את מצב מחסנית Z. התחל הדמיה חיה. בחר את מישור המוקד שבו שני הצבעים גלויים.
הערה: במידת הצורך, להתאים את כוח הלייזר כדי לנרמל את הבהירות של שני צבעים פלואורסצנטיים. השתמש בגלריה ובמצב ערוץ יחיד, כדי להימנע מחיתוך ולהתאים במדויק את עוצמת הפלואורסצנטיות. - הרחב את חלונית מחסנית Z הופיעה. השתמש בגלגל המיקוד ומצא את המישור הנמוך ביותר של הדגימה. השתמש בלחצן הראשון בחלונית מחסנית Z. הזז את מישור המוקד כלפי מעלה כדי למצוא את הגבול העליון של הדגימה ולשמור את המיקום באמצעות לחצן Last. בדוק את הייצוג של עומק המדגם בחלונית מחסנית Z.
הערה: ייצוג של עומק המדגם יופיע בחלונית מחסנית Z לאחר בחירת המיקום הראשון והאחרון. - מקם את המטרה באמצעות גלגל המיקוד ליד החלק התחתון של הדגימה, על-ידי התבוננות בחלונית מחסנית Z. זה בערך 20 מיקרומטר מתחתית הדגימה.
- כבה את מצב מחסנית Z וההפעלה של מצב סריקת אריחים. השג את התמונה עם מספר מתאים של אריחים לגודל הדגימה. 5 × 5 אריחים הם נקודת התחלה טובה.
- כווננו את מספר האריחים ואת מיקום ה-XY עד שכל הריאה תתאים לתמונה המרוחנת. בדוק שוב את הנכונות של מיקומי מחסנית Z עם המיקום XY החדש שהושג של מרכז המדגם.
- הפעל את מצבי סריקת Z-stack ו-Tile. הגדר שלב Z (בחלונית מחסנית Z) ל- 5 מיקרומטר. הגדר את מהירות הסריקה ל- 6. הפעל את הפונקציה שמירה אוטומטית. הפעל את האפשרות שמירת אריחים נפרדים. תן שם לקובץ. לחץ על לחצן התחל ניסוי.
- ודא שהניסוי אינו חורג מהזמן שהוקצה במיקרוסקופ; אם כן - להתאים את המהירות.
הערה: גודל הקובץ המשוער הוא יותר מ- 10 Gb; ודא שיש מספיק מקום בכונן הקשיח.
5. ביטול ותפירה ספקטרליים
- השתמש בתוכנה לעיבוד התמונה ההתחלתי. עבור ביטול ספקטרלי, בחר באפשרות בטל מיקסינג. בחר שני אזורים המתאימים לסטרפטאבידין / דרכי הנשימה וקונידיה כדי לרכוש את הספקטרום מהתמונה. לחץ על התחל לבטל את ההמהמה.
הערה: לחלופין, השתמש בספקטרום הקיים עבור פלואורוכרום 488 ו- 594 ננומטר. - פתח את הקובץ עבור עיבוד התמונה ובחר בכרטיסיה עיבוד. במקטע שיטות, בחר גיאומטרי ותפירה . במקטע פרמטר, בחר באפשרות פלט חדש וסמן את האפשרות אריחי נתיכים. השתמש במצב ההפניה עם הערוץ שנבחר המתאים לפלורסצנטיות דרכי הנשימה. החל את התפירה על-ידי לחיצה על החל.
6. עיבוד תמונה: עיבוד פני השטח
- פתחו את התמונה כתצוגת מעבר תלת-ממדי. צור משטח דרכי הנשימה באמצעות האפשרות Surface עבור הערוץ ששימש להדמיה של דרכי הנשימה. בחר בפרמטר החלקה של 10 מיקרומטר.
הערה: בחר גם את ערך הסף האוטומטי. - תבדוק חזותית את פני השטח. בחר את הסף כדי להפחית את האות החיצוני. הסר את המשטחים של pleura וכלי.
- צרו מסיכה למשטח הנשימה באמצעות אפשרויות עריכה ומסיכת הכל. בחר את ערוץ דרכי הנשימה והגדר את Voxels מחוץ לפני השטח ל- 0.001.
- שמור את הקובץ עם מסיכת דרכי הנשימה כסדרת TIFF בתיקיה. שמור את הקובץ עם ערוץ conidia כסדרת TIFF בתיקיה הנפרדת.
7. עיבוד תמונה: תיקון מסיכה
- פתח את הקובץ עם מסיכת דרכי הנשימה בפלטפורמת קוד פתוח לניתוח תמונה ביולוגית17 כתמונה של 8 סיביות. הפוך את התמונה לבינארית על-ידי לחיצה על תהליך | | בינארי הפוך בינארי.
הערה: במידת הצורך, תקן את המסיכה: הסר את המשטחים המוגזמים באמצעות הבחירה במצולע והכרטיסיה מחק. לחלופין, השתמש בכלי מילוי הצפה. - צייר את המשטחים החסרים באמצעות מספר פעמים להרחיב (3D): לחץ על תוספים | תהליכי | להתרחב (3D). מלא את החורים על-ידי לחיצה על תהליך | | בינארי מלא חורים. השתמש באינטרפולציה של מנהל הבחירה וההחזר על תנאי כדי למלא את שאריות החורים במסכה באופן ידני. החל מספר אפשרויות לשחוק (3D) (תוספים | תהליכי | לשחוק (3D)) כדי לדגום מחדש את עובי המסכה.
הערה: יצירת פקודות מאקרו באמצעות תוספים | אפשרויות פקודות מאקרו לחזרות מרובות של דילול (תלת-ממד) ו-Erode (3D).
ודא שמספר השחוק (3D) שווה למספר יישומי דילול (3D). - שמור את המסיכה בתיקיה חדשה כסדרת TIFF.
8. קונידיה ניתוח כמותי
- פתח את האפליקציה בפלטפורמת התכנות והמחשוב המספרי: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/84525-conidia_counter.
- לחץ על לחצן הוסף קבצים. בחר את התיקיה מסיכת דרכי הנשימה ואת התיקיה conidia.
- הגדר סף מותאם אישית בין 0 ל- 1. לחץ על לחצן אישור.
- שמור את טבלת הפלט בקובץ .xls המותאם אישית.
- נתח את הנתונים באמצעות תוכנה לניתוח סטטיסטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעקבות הפרוטוקול לעיל, התמונה 3D מראה את דרכי הנשימה ו A. fumigatus conidia באונה הריאות של עכבר הושגה (איור 1A). סטרפטאבידין (ששימש להדמיה של דרכי הנשימה) שכותרתו סימפונות וסימפונות15. בנוסף, כלי השיט הגדולים, שניתן להבחין ביניהם בקלות מדבורי הנשימה על ידי המורפולוגיה שלהם, ופלורה מוצגים בערוץ דרכי הנשימה (איור 1A-C). יצירת פני השטח והמסכה של דרכי הנשימה אפשרו הסרה של כלי השיט והתחזיות pleura בערוץ דרכי הנשימה; עם זאת, שלמות פני הנשימה נהרסת בשל האות החלש של סטרפטאבידין במספר ענפי סימפונות(איור 1B-C). העיבוד הנוסף של מסכת דרכי הנשימה מאפשר לתקן את השברים החסרים(איור 1D).
ההתפלגות של A. fumigatus conidia בריאות של עכברים הוערך באמצעות אונות ריאות מעולה שמאל או ימין בנקודות זמן שונות לאחר יישום conidia. עבור אונת הריאות העליונה הימנית, התמונה מורכבת מכ -30 אריחים וכ -250 ערימות Z. לאחר התפירה, התמונה שנרכשה ברזולוציה 512 × 512 הייתה בגודל תמונה של 2360 × 2815 פיקסלים והגודל של פיקסל אחד הוא 2.77 מיקרומטר × 2.77 מיקרומטר, הדומה לגודל של קונידיה A. fumigatus שהוא 2-3.5 מיקרומטר9.
התמונה המוגדלת של אזור דרכי הנשימה הדיסטליות מדגימה כי זיהוי המיקום המדויק של conidia (בתוך או מחוץ לענפי הסימפונות) הוא די קשה בשל המורכבות של התמונה ואת הגודל הקטן של conidia ביחס לגודל דרכי הנשימה (איור 2A). בדיקה מדויקת העלתה כי קונידיה ממוקמת בתוך ומחוץ לענפי הסימפונות(איור 2B-C).
הגדרות הסף של ערוץ conidia משפיעות מאוד על מספר הקונידיה המתקבל(איור 2B-C). כדי לבצע את הניתוח הכמותי הבלתי משוחד פיתחנו אפליקציה בפלטפורמת התכנות והמחשוב המספרי המאפשרת להפוך את מספר הקונידיה בתוך ומחוץ למסכת דרכי הנשימה, תוך הימנעות מהגדרת הסף הידנית. האפליקציה פועלת על סמך האלגוריתם הבא. ראשית, ערוץ conidia מחולק לערימת תמונות תלת-ממדית בינארית באמצעות ערך סף אופטימלי. כפי שתואר לעיל, רזולוציית ההדמיה שנבחרה מאפשרת זיהוי של קונידיום אחד כפיקסל אחד. השימוש בסטרפטאבידין לתיוג דרכי הנשימה מאפשר הדמיה של סימפונות אך לא alveoli15. לכן, conidia המתגוררים ברונכי מוגדרים פיקסלים conidia בתוך מסכת דרכי הנשימה, בעוד conidia המתגוררים alveoli מוגדרים כמו פיקסלים conidia מחוץ מסכת דרכי הנשימה. בהתחשב בכך, בשלב הבא של האלגוריתם, פעולה בינארית ובוצעת עבור תמונת מסכת דרכי הנשימה ואת התמונה conidia כדי לחלץ פיקסלים של conidia המתגוררים ברונכי. באופן דומה, הפיקסלים conidia הנותרים מופקים כדי להשיג את מספר conidia ב alveoli. האחוז המתקבל של conidia בסימפונות ו alveoli ביחס לכמות הכוללת של conidia בריאה מוצג בתרשים עמודות ואת טבלת הפלט של ממשק המשתמש של האפליקציה.
באמצעות גישה זו, הניתוח הכמותי של התפלגות conidia בנתיבי הנשימה של עכברים בוצע עבור נקודת הזמן של 6 שעות לאחר יישום conidia (איור 2D). הנתונים מראים כי על יישום oropharyngeal, רוב conidia לחדור את החלל המכתשי ולאתר שם בתחילת התגובה החיסונית הדלקתית.
איור 1. העיקרון של עיבוד תמונה דרכי הנשימה. (A)תמונה תלת-ממדית של אונת הריאות העליונה הימנית של עכבר, 24 שעות לאחר יישום conidia המציג מבנים עשירים ביוטין (סטרפטאבידין, לבן) ו A. fumigatus conidia (מגנטה). כלי שיט גדולים חיוביים Steptavidin מסומנים עם חצים עדינים. (B,C) המשטח (ירוק) והמסכה (כתומה) לדיבי הנשימה. שברי דרכי הנשימה החסרים במשטח והמסכה מסומנים בחצים; המבנים המוגזמים עם ראשי החצים. סרגל קנה המידה הוא 1000 מיקרומטר. (D)מסכת דרכי הנשימה לאחר התיקונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. עיבוד תמונה קונידיה וניתוח כמותי. (A)תמונה מוגדלת של דרכי הנשימה הדיסטליות (סטרפטאבידין, גוונים אפורים) ו- A. fumigatus conidia (מגנטה) המוצגים באיור 1A. סרגל קנה המידה הוא 300 מיקרומטר B, C. תמונה מוגדלת שרירותית בקופסה (A) מיוצגת כ- Z-slice עם סף גבוה (B) וערך סף נמוך (C). Conidia בתוך דרכי הנשימה מסומנים עם חצים, ובחוץ עם ראשי חץ. סרגל קנה המידה הוא 150 מיקרומטר. (D)ניתוח כמותי של קונידיה בענפי הסימפונות ובמרחב המכתשי. הנתונים מוצגים כטווח החציוני והבין-קוויטרי עבור 4 עכברים, 6 שעות לאחר קבלת קונידיה A. fumigatus. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדמיה תלת-ממדית של איבר שלם מאפשרת קבלת הנתונים ללא ניתוח של הדגימה, שהיא בעלת חשיבות רבה לחקירת ההיבטים המרחביים של ההתפלגות האנטומית של הפתוגן באורגניזם. ישנן מספר טכניקות ושינויים של ניקוי אופטי רקמה המסייעים להתגבר על פיזור אור הלייזר ולאפשר הדמיה של איברים שלמים15,16,18,19. אחת הגישות מותאמות אישית לניקוי רקמות מורכבת מהתייבשות רקמות מבוססת מתנול והתזות ואחריה ניקוי אופטי עם BABB. הגישה פותחה לפני יותר מ -100 שנה ויש לה מספר שינויים. בעבודתנו, אנו משתמשים בשינוי הפשוט ביותר שתואר על ידי סקוט ואח '. 15 גישה כזו היא אופטימלית לשימוש עם פתוגנים שכותרתו פלואורסצנטית. יתר על כן, פלואורכרום עם פוטושוט גבוה עדיפים על הדמיה ממושכת. למרבה הצער, הדמיה של TdTomato A. conmigatus conidia מהונדס אינה אפשרית בשיטה זו, בשל הרגישות הגבוהה של TdTomato ל- BABB (נתונים שאינם מוצגים). לכן, הגישה שאנו מתארים כאן מאפשרת זיהוי מוצלח של פתוגנים נחים או קבועים, אך לא ניתן להשתמש בה להדמיה של גידול A. fumigatus conidia או hyphae. בנוסף, הכתמה אימונוהיסטוכימית של הדגימה עם חומרים מחייבים זיקה גבוהה עדיפה. לכן, התמודדנו גם עם בעיות בניסיון ליישם את הנוגדנים המסומנים באופן פלואורסצנטי כדי לדמיין כלי דם ולימפטיקה בדגימות של אונת ריאות מלאה. עם זאת, סקוט ואח '. 15 סיבי עצב חזותיים באמצעות כתמים דו-שלביים בנוגדנים נגד PGP 9.5. זה מציין כי נוגדנים מסוימים יכולים לשמש להכתמת עם הסליקה האופטית הבאה באמצעות BABB. איבדנו גם את האות הפלואורסצנטי מחלקיקי הלטקס פלואורסצנטיים 0.1 מיקרומטר לאחר ניקוי BABB, בעוד שהשימוש בפתרון סליקה תלת-ממדי (Ce3D) משופר סליקה18 לא השפיע על האות הפלואורסצנטי של החלקיקים.
בגישה הנוכחית, אנו משתמשים בסטרפטאבידין כדי לסמן דרכי הנשימה. סטרפטאבידין קושר ביוטין אנדוגני שנחשב לבוא לידי ביטוי בתאי קלרה (ותאי האפיתל מסוג II המכתשיים במידה פחותה)20. כמו תאי קלרה (הידוע גם בשם תאי מועדון) בהיעדר דלקת מתגוררים ברונכי וסימפונות, אבל לא בתא מכתשי, כתמי סטרפטאבידין מדמיין רק ענפי סימפונות. לכן, בגישה הנוכחית, כל הקונידיה מחוץ דרכי הנשימה המסומנות על ידי סטרפטאבין נקבעו כמי שנמצאות בחלל המכתשי. לגילוי מדויק יותר של מיקום conidia, כמה סמנים אחרים דרכי הנשימה, כגון SOX9, יש להשתמש3. במקרה, כאשר השימוש בנוגדנים הוא הכרחי Ce3D או הדמיה תלת ממדית של איברים ממסים (3DISCO)19 טכניקות מתאימים יותר מאשר ניקוי אופטי מבוסס BAAB. עם זאת, סליקה אופטית BABB היא הגישה הפשוטה ביותר וגוזלת זמן, ולכן היא היתרון ביותר עבור זיהוי conidia מראש תווית פלואורסצנטית מסומנת עם דרכי הנשימה סטרפטאבידין.
הדמיה תלת ממדית של ריאות העכבר יכולה להתבצע גם באמצעות טומוגרפיה הקרנה אופטית משולבת מיקרוסקופיה3. עם זאת, בשל המגבלה ברזולוציה של טומוגרפיה, CLSM מתאים יותר הדמיה סימולטנית של דרכי הנשימה ו 3 מיקרומטר conidia. במקרה שלנו, קונידיום אחד נתפס כפיקסל אחד. עיבוד של תמונות כאלה אפשר כימות של conidia בתוך ומחוץ לענפי הסימפונות. השיטה יכולה גם להיות מיושמת כדי להשוות את התפלגות הקונידיה האנטומית בעכברים האימונונו-קומנטיים והאימונוקום. הגישה יכולה לשמש גם כדי להעריך את הקינטיקה של חיסול conidia מדפנות הנשימה של עכברים. יתר על כן, השילוב של הגישה של כל morphometry דרכי הנשימה שפותח על ידי סקוט ואח '. 15 עם האלגוריתם לניתוח כמותי conidia משוחד יכול להיות מועיל במיקום המדויק של קונידיה A. fumigatus וחלקיקים אחרים בגודל דומה בדורות שונים של עץ הסימפונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אינם מדווחים על ניגודי עניינים בעבודה זו.
Acknowledgments
המחברים מודים לפרופ' סוון קרפמן (בית החולים האוניברסיטאי ארלנגן ו-FUA ארלנגן-נורנברג, גרמניה) על אספקת זן הקונידיה אספרגילוס פומיגטוס AfS150. המחברים מודים למשרד העיתונות MIPT. V.B. מכיר משרד המדע וההשכלה הגבוהה של הפדרציה הרוסית (#075-00337-20-03, פרויקט FSMG-2020-0003). העבודה לגבי הדמיה וכימות של קונידיה A. fumigatus נתמכה על ידי RSF No 19-75-00082. העבודה לגבי הדמיית דרכי הנשימה נתמכה על ידי RFBR No 20-04-60311.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 NHS Ester | ThermoFisher | A20004 | |
| Aspergillus fumigatus conidia | ATCC | 46645 | The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative |
| Benzyl alcohol | Panreac | 141081.1611 | 98.0-100 % |
| Benzyl benzoate | Acros | AC10586-0010 | 99+% |
| C57Bl/6 mice | Pushchino Animal Breeding Centre (Russia) | Male. 12 - 30 week old. | |
| Catheter | Venisystems | G715-A01 | 18G |
| Cell imaging coverglass-bottom chamber | Eppendorf | 30742028 | 4 or 8 well chamber with coverglass bottom |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Any centrifuge provided 1000 g can be used |
| Confocal laser scanning microscope | ZEISS | ZEISS LSM780 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | ≥99.9% |
| FIJI image processing package | FIJI | Free software | |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD557R | Toothed |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD321R | Fine-tipped |
| Forcep | Bochem | 1727 | Smooth |
| Glass bottle | DURAN | 242101304 | With ground-in lid |
| Graphic Editor Photoshop | Adobe Inc | Adobe Photoshop CS | |
| GraphPad Software | GraphPad | Prism 8 | |
| Imaris Microscopy Imaging Software | Oxford Instruments | Free trial is available https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial | |
| Isoflurane | Karizoo | ||
| NaHCO3 | Panreac | 141638 | |
| Objective | ZEISS | 420640-9800-000 | Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS | Paneco | P060Π | |
| Pipette | ProLine | 722020 | 5 to 50 μL |
| Powdered milk | Roth | T145.2 | |
| Sample mixer | Dynal | MXIC1 | |
| Scissors | B. Braun | BC257R | Blunt |
| Shaker | Apexlab | GS-20 | 50-300 rpm |
| Skalpel | Bochem | 12646 | |
| Silk thread | B. Braun | 3 USP | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Test tube | SPL Lifesciences | 50050 | 50 mL |
| Tris (hydroxymethyl aminomethane) | Helicon | H-1702-0.5 | Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1 |
| Triton X-100 | Amresco | Am-O694-0.1 | |
| ZEN microscope software | ZEISS | ZEN2012 SP5 | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html |
References
- O'Gorman, C. M. Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis. Fungal Biology Reviews. 25 (3), 151-157 (2011).
- Hyde, D. M., et al. Asthma: A comparison of animal models using stereological methods. European Respiratory Review. 15 (101), 122-135 (2006).
- Alanis, D. M., Chang, D. R., Akiyama, H., Krasnow, M. A., Chen, J. Two nested developmental waves demarcate a compartment boundary in the mouse lung. Nature Communications. 5, (2014).
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Donohue, J. F. Targeted drug-aerosol delivery in the human respiratory system. Annual Review of Biomedical Engineering. 10, (2008).
- Bustamante-Marin, X. M., Ostrowski, L. E.
- Fröhlich, E., Salar-Behzadi, S. Toxicological assessment of inhaled nanoparticles: Role of in vivo, ex vivo, in vitro, and in Silico Studies. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4795-4822 (2014).
- Patel, V. I., Metcalf, J. P. Airway macrophage and dendritic cell subsets in the resting human lung. Critical Reviews in Immunology. 38 (4), 303-331 (2018).
- Bogorodskiy, A. O., et al. Murine intraepithelial dendritic cells interact with phagocytic cells during Aspergillus fumigatus-Induced Inflammation. Frontiers in Immunology. 11, (2020).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous fuman fungal pathogen. PLoS Pathogens. 9 (12), 1-4 (2013).
- Overton, N., Gago, S., Bowyer, P. Immunogenetics of chronic and allergic aspergillosis. Immunogenetics of Fungal Diseases. , 153-171 (2017).
- Thiesse, J., et al. Lung structure phenotype variation in inbred mouse strains revealed through in vivo micro-CT imaging. Journal of Applied Physiology. 109 (6), 1960-1968 (2010).
- Tochigi, N., et al. Histopathological implications of Aspergillus infection in lung. Mediators of Inflammation. 2013, (2013).
- Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin rodA. PLoS Pathogens. 6 (4), 1-18 (2010).
- Shevchenko, M. A., et al. Aspergillus fumigatus infection-induced neutrophil recruitment and location in the conducting airway of immunocompetent, neutropenic, and immunosuppressed mice. Journal of Immunology Research. 2018, 5379085 (2018).
- Scott, G. D., Blum, E. D., Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Tissue optical clearing, three-dimensional imaging, and computer morphometry in whole mouse lungs and human airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 1 (51), 43-55 (2014).
- Amich, J., et al. Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-aspergillus fumigatus interactions. mBio. 11 (1), (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. High-dimensional cell-level analysis of tissues with Ce3D multiplex volume imaging. Nat Protoc. 14 (6), 1708-1733 (2019).
- Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J Vis Exp. (89), e51382 (2014).
- Kuhn, C. Biotin stores in rodent lungs: Localization to Clara and type II alveolar cells. Experimental Lung Research. 14 (4), 527-536 (1988).
