Summary
Wir beschreiben die Methode zur quantitativen Analyse der Verteilung von Aspergillus fumigatus conidia (3 μm groß) in den Atemwegen von Mäusen. Die Methode kann auch für die Analyse von Mikropartikeln und Nanopartikelagglomeratverteilung in den Atemwegen in verschiedenen pathologischen Zustandsmodellen verwendet werden.
Abstract
Aspergillus fumigatus conidia sind luftgetragene Krankheitserreger, die in die menschlichen Atemwege eindringen können. Immunkompetente Menschen ohne Allergien zeigen Resistenz und immunologische Toleranz, während bei immungeschwächten Patienten Konidien die Atemwege besiedeln und schwere invasive Atemwegserkrankungen verursachen können. Verschiedene Zellen in verschiedenen Atemwegskompartimenten sind an der Immunantwort beteiligt, die das Eindringen von Pilzen verhindert; die räumlich-zeitlichen Aspekte der Erregereliminierung sind jedoch noch nicht vollständig verstanden. Die dreidimensionale (3D) Bildgebung von optisch gereinigten Ganzkörperorganen, insbesondere der Lunge von Versuchsmäusen, ermöglicht den Nachweis fluoreszierend markierter Krankheitserreger in den Atemwegen zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion. In der vorliegenden Studie beschreiben wir einen Versuchsaufbau, um eine quantitative Analyse der Verteilung von A. fumigatus conidia in den Atemwegen durchzuführen. Mit Hilfe der fluoreszierenden konfokalen Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) verfolgten wir die Lage fluoreszierend markierter Konidien in den Bronchialästen und im Alveolarkompartiment 6 Stunden nach oropharyngealer Anwendung bei Mäusen. Der hier beschriebene Ansatz wurde bisher zum Nachweis des genauen Erregerortes und zur Identifizierung der pathogen-interagierenden Zellen in verschiedenen Phasen der Immunantwort verwendet. Der Versuchsaufbau kann verwendet werden, um die Kinetik der Erregerelimination unter verschiedenen pathologischen Zuständen abzuschätzen.
Introduction
Täglich atmen Menschen luftgetragene Krankheitserreger ein, darunter Sporen opportunistischer Pilze Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia), die in die Atemwege eindringen können1. Die Atemwege von Säugetieren sind ein System von Atemwegen verschiedener Generationen, die durch die unterschiedlichen Strukturen der Atemwegswände2,3,4gekennzeichnet sind . Tracheobronchialwände bestehen aus mehreren Zelltypen, darunter Flimmerzellen, die die mukokoziläre Clearancebereitstellen 5. In den Alveolen gibt es keine Flimmerzellen und die eindringenden Alveolarraumerreger können durch die mukopoliliare Clearance nicht eliminiert werden6. Darüber hinaus ist jede Atemwegsgeneration eine Nische für mehrere Immunzellpopulationen, und Untergruppen dieser Populationen sind für bestimmte Atemwegskompartimente einzigartig. So befinden sich alveoläre Makrophagen in den Alveolarkompartimenten, während sowohl die Luftröhre als auch die leitenden Atemwege mit den intraepithelialen dendritischen Zellen ausgekleidet sind7,8.
Die ungefähre Größe von A. fumigatus conidia beträgt 2-3,5 μm9. Da der Durchmesser kleiner Atemwege beim Menschen und sogar bei Mäusen 3,5 μm überschreitet, wurde vermutet, dass Konidien in den Alveolarraum eindringen können2,10,11. Tatsächlich zeigte die histologische Untersuchung das Pilzwachstum in den Alveolen der Patienten, die an Aspergilloselitten 12. Konidien wurden auch in den Alveolen infizierter Mäuse mit Live-Bildgebung der dicken Lungenscheiben nachgewiesen13. Gleichzeitig wurden Konidien in der luminalen Seite des Bronchialepithels von Mäusennachgewiesen 14.
Die dreidimensionale (3D) Bildgebung der optisch gereinigten Ganzknierungs-Mauslunge ermöglicht eine morphometrische Analyse der Atemwege15. Insbesondere wurde die quantitative Analyse der viszeralen Pleuranervenverteilung mit optisch gereinigten Mauslungenprobendurchgeführt 15. Kürzlich untersuchten Amich et al.16 das Pilzwachstum nach intranataler Anwendung von Konidien auf die immungeschwächten Mäuse mit einer Lichtblattfluoreszenzmikroskopie von optisch gereinigten Mauslungenproben. Die genaue Lage der Ruhekonidien in den Atemwegen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion ist wichtig, um die Zellpopulationen zu identifizieren, die in bestimmten Entzündungsphasen eine ausreichende antimykotische Abwehr bieten können. Aufgrund der relativ geringen Größe sind jedoch die räumlich-zeitlichen Aspekte der Verteilung von A. fumigatus conidia in den Atemwegen schlecht charakterisiert.
Hier stellen wir einen Experimentellen Aufbau zur quantitativen Analyse der Verteilung von A. fumigatus conidia in den Atemwegen infizierter Mäuse vor. Mit hilfe der fluoreszierenden konfokalen Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) von optisch gereinigten Lungen von Mäusen, die eine oropharyngeale Anwendung der fluoreszierend markierten A. fumigatus conidia erhielten, erhalten wir 3D-Bilder und führen die Bildverarbeitung durch. Mit Hilfe der 3D-Bildgebung des ganz montierten Lungenlappens haben wir zuvor die Verteilung von A. fumigatus conidia in den leitenden Atemwegen von Mäusen 72 Stunden nach Conidienanwendung gezeigt8.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden für Versuchstiere wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences (Protokollnummer 226/2017) genehmigt.
1. A. fumigatus conidia Anwendung
- Um fluoreszierend markierte A. fumigatus conidia zu erhalten, fixieren Sie 5 × 108 Konidien, indem Sie dem Conidia-Pellet 1 ml 3% Paraformaldehyd hinzufügen. Inkubieren Sie in einem 50 mL Reagenzglas für 2 h auf einem Shaker bei Raumtemperatur.
- Conidia mit 20 mL Phosphatpuffersalzlösung (PBS) waschen: Zentrifuge bei 1.000 x g für 15 min, den Überstand vorsichtig entfernen und frisches PBS in einem Volumen von 20 ml hinzufügen. Wiederholen.
- Die Konidien werden in 900 μL 0,1 M NaHCO3aufgelöst.
- Den Succinimidylester des 594 nm Fluoreszenzfarbstoffs in 100 μL Dimethylsulfoxid auflösen und zu Konidien geben.
- Inkubieren Sie die Konidien mit dem Farbstoff für 1 h auf einem Shaker bei 150 U / min bei Raumtemperatur.
- Die Konidien zweimal mit 20 mL PBS in der Zentrifuge bei 1.000 x g für 15 min waschen.
- Die Konidien auf eine Konzentration von 1 × 108 Konidien/ml in PBS verdünnen und bei 4 °C lagern.
- Betäuben Sie die Maus mit 0,5-3% Isoflurandampf. Setzen Sie die Maus auf den Halter, fixieren Sie die Zunge mit einer glatten Zette und halten Sie die Nares. Nehmen Sie eine einkanalige Pipette und tragen Sie 50 μL Konidiensuspension auf den Mausparynx auf. Warten Sie, bis die Suspension eingeatmet ist.
2. Probenvorbereitung
- Bereiten Sie das 50 ml Reagenzglas vor und füllen Sie es mit 15 ml frischem 2% Paraformaldehyd. Legen Sie die medizinischen Instrumente (15 cm gezahnte Sezierzette, 8 cm feinspitzige Stoßzette und 10 cm Schere mit stumpfen Enden) in 70% ige Ethanollösung.
- Euthanasiern Sie die Maus gemäß dem IACUC-Protokoll. Dann legen Sie die Maus in die rückenale Position und fixieren Sie die Mauspfoten mit Nadeln.
HINWEIS: Wenn Sie zervikale Dislokation für die Euthanasie verwenden, stellen Sie die Integrität der Luftröhre sicher.- Behandeln Sie die Maus mit 70% Ethanol mit einem Sprühgerät.
- Machen Sie einen mittleren Längsschnitt in der Bauchhaut von den Hinterpfoten bis zu den Vorpfoten und dem Kinn.
- Trennen Sie die Haut mit einer Zahnzette und einer geschlossenen Schere vom Unterhautgewebe. Fixieren Sie die oberen Enden der Haut mit Nadeln.
- Machen Sie einen Schnitt in der Bauchdecke und trennen Sie die Leber vom Zwerchfell. Wählen Sie vorsichtig die Membran mit einer geschlossenen Schere aus und schneiden Sie dann die Membran ab.
- Machen Sie einen medialen Schnitt des Thorax- und Nackensewattgewebes, bis die Luftröhre sichtbar ist.
- Führen Sie einen Seidenfaden unter die Luftröhre und machen Sie einen chirurgischen Knoten mit zwei Zetten.
HINWEIS: Alternativ verwenden Sie Zahnseide anstelle von Seidenfaden.- Ziehen Sie vorsichtig den Faden und schneiden Sie die Lunge mit einer Schere vom Bindegewebe ab. Halten Sie die Schere senkrecht zum Tisch.
- Legen Sie die Lunge in das 50 ml Reagenzglas mit 2% Paraformaldehyd. Lassen Sie die Fadenenden außerhalb des Rohrs, legen Sie die Abdeckung fest und drehen Sie das Rohr um, um die Lunge mit Paraformaldehyd zu bedecken. Halten Sie die Lunge über Nacht bei 4 °C.
- Sezieren Sie die Lungenlappen vom Herzen und untereinander mit einem Skalpell.
- Legen Sie die Lungenlappen in eine 24-Well-Platte, wobei jeder Lappen in einen separaten Brunnen passt. Waschen Sie die Lungenlappen in 1 ml Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) pH 7,4, 5 mal für jeweils 1 h auf einem Shaker bei 150 U / min.
- Ersetzen Sie 1 ml TBS durch 1 ml des Sperrpuffers (1% Triton X 100, 5% Milchpulver in TBS) und lassen Sie die Probe über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Shaker stehen.
- Ersetzen Sie den Sperrpuffer durch 1 ml Streptavidin-488-nm-Fluorchrom-Konjugat, verdünnt 1:30 in TBS. Lassen Sie die Probe mindestens 72 h bei Raumtemperatur auf einem Shaker (150 U /min).
- Waschen Sie die Probe 5 mal für jeweils 1 h in 1 ml TBS bei Raumtemperatur auf einem Shaker (150 U/min). Die Probe in die neuen Vertiefungen überführen und über Nacht bei 4 °C zur Nachfixierung mit 2% Paraformaldehyd bedecken.
3. Optische Reinigung des Lungenlappens der Maus
- Legen Sie die Probe in die 5 mL Glasflasche, die mit 3 mL 50% Methanol-Wasser-Lösung gefüllt ist, und legen Sie sie bei Raumtemperatur für 1 h auf den Probenmischer.
- Ersetzen Sie 3 mL 50% Methanol durch 3 mL 100% Methanol und legen Sie es für 2 h auf den Probenmischer. Bereiten Sie eine 1:2 v/v Mischung aus Benzylalkohol und Benzylbenzoat (BABB) in einem Gesamtvolumen von 1 ml vor.
- Die Probe auf eine 24-Well-Platte geben und mit 1 ml BABB-Mischung für mindestens 30 min abdecken. Lassen Sie die Probe nicht lange in BABB; BABB kann die Kunststoffplatte beschädigen und die Probe zu steif machen.
- Legen Sie die Probe in die Zellbildgebungsabdeckungglasbodenkammer. Die Probe ist bereit für die Bildgebung.
4. Maus-Lungenlappen-Bildgebung mit CLSM
- Schalten Sie das Mikroskopsystem ein. Öffnen Sie die Mikroskopsoftware. Schalten Sie die Durchlichtleuchte auf der Registerkarte Suchen ein. Wähle das 10-fache Ziel aus.
HINWEIS: Für eine detailliertere Analyse verwenden Sie das 20-fache Objektiv, aber es erhöht die Zeit des Experiments und die Größe der Bilddatei. - Legen Sie die Kammer mit der Probe in den Deckel-Diahalter. Setzen Sie den Halter auf die XY-Stufe über das Objektiv. Zentrieren Sie die Probe mit den XY-Steuerelementen der Bühne auf dem Objektiv. Verwenden Sie das Transmissionslicht und das Okular, um die Z-Ebene manuell zu finden.
- Wechseln Sie die Software auf die Registerkarte Erfassung. Wählen Sie CLSM λ-mode. Schalten Sie die 488-nm- und 561-nm-Laser ein. Wählen Sie den dichroitischen Spiegel 488/561 nm aus. Ändern Sie den Spektralbereich des Detektors auf 490-695 nm. Stellen Sie die Laserleistung auf den entsprechenden Bereich (10-50 μW) ein. Stellen Sie die Detektorverstärkung zwischen 750-900 ein.
HINWEIS: Höhere Verstärkungseinstellungen sind aufgrund von Rauschen unerwünscht. - Schmalen Sie das Loch auf 1 Airy-Einheit, indem Sie auf die Taste 1 AU klicken. Stellen Sie die Pixelauflösung auf 512 × 512 Pixel ein.
- Schalten Sie den Z-Stack-Modus ein. Starten Sie Live Imaging. Wählen Sie die Fokusebene aus, in der beide Farbstoffe sichtbar sind.
HINWEIS: Passen Sie bei Bedarf die Laserleistung an, um die Helligkeit der beiden fluoreszierenden Farbstoffe zu normalisieren. Verwenden Sie den Galerie- und Einkanalmodus, um Clipping zu vermeiden und die Fluoreszenzintensität genau anzupassen. - Erweitern Sie den angezeigten Z-Stack-Bereich. Verwenden Sie das Fokussierungsrad und suchen Sie die unterste Ebene der Probe. Verwenden Sie die Schaltfläche Erste im Bereich Z-Stapel. Bewegen Sie die Fokusebene nach oben, um die obere Berandung der Probe zu finden, und speichern Sie die Position mithilfe der Schaltfläche Letzte. Überprüfen Sie die Darstellung der Probentiefe im Bereich Z-Stack.
HINWEIS: Eine Darstellung der Probentiefe wird im Z-Stapelfenster angezeigt, nachdem die erste und die letzte Position ausgewählt wurden. - Positionieren Sie das Objektiv mit dem Fokussierenrad in der Nähe der Unterseite der Probe, indem Sie auf die Z-Stapelscheibe schauen. Dies ist ungefähr 20 μm vom Boden der Probe entfernt.
- Schalten Sie den Z-Stack-Modus aus und aktivieren Sie den Kachelscan-Modus. Erfassen Sie das Bild mit einer angemessenen Anzahl von Kacheln für die Größe der Probe. 5 × 5 Kacheln sind ein guter Ausgangspunkt.
- Passen Sie die Anzahl der Kacheln und die XY-Position der Probe an, bis die gesamte Lunge in das gekachelten Bild passt. Überprüfen Sie erneut die Richtigkeit der Z-Stapelpositionen mit der neu erhaltenen XY-Position der Mitte der Probe.
- Aktivieren Sie sowohl den Z-Stack- als auch den Tile-Scan-Modus. Stellen Sie den Z-Schritt (im Z-Stack-Bereich) auf 5 μm ein. Legen Sie die Scangeschwindigkeit auf 6 fest. Schalten Sie die Autosave-Funktion ein. Aktivieren Sie die Option Separate Kacheln speichern. Benennen Sie die Datei. Drücken Sie die Taste Experiment starten.
- Stellen Sie sicher, dass der Versuch die am Mikroskop zugewiesene Zeit nicht überschreitet. Wenn ja, passen Sie die Geschwindigkeit an.
HINWEIS: Die ungefähre Dateigröße beträgt mehr als 10 GB; Stellen Sie sicher, dass genügend Speicherplatz auf der Festplatte vorhanden ist.
5. Spektrales Entmischen und Nähen
- Nutzen Sie die Software für die erste Bildverarbeitung. Wählen Sie für die spektrale Entmischung die Option Mischen aufheben aus. Wählen Sie zwei Bereiche aus, die dem Streptavidin/den Atemwegen und den Konidien entsprechen, um die Spektren aus dem Bild zu erfassen. Klicken Sie auf Entmischung starten.
HINWEIS: Alternativ können Sie die vorhandenen Spektren für 488- und 594-nm-Fluorochrome verwenden. - Öffnen Sie die Datei für die Bildverarbeitung und wählen Sie die Registerkarte Verarbeitung. Wählen Sie im Abschnitt Methoden die Option Geometrisch und Stitching aus. Wählen Sie im Abschnitt Parameter die Option Neue Ausgabe aus und markieren Sie die Option Kacheln verschmelzen. Verwenden Sie den Referenzmodus mit dem ausgewählten Kanal, der der Atemwegsfluoreszenz entspricht. Wenden Sie die Stitching an, indem Sie auf Übernehmenklicken.
6. Bildverarbeitung: Oberflächenrendering
- Öffnen Sie das Bild als Surpass 3D-Ansicht. Erstellen Sie eine Atemwegsoberfläche mit der Option Fläche für den Kanal, der für die Atemwegsvisualisierung verwendet wurde. Wählen Sie den Glättungsparameter von 10 μm.
HINWEIS: Wählen Sie auch den automatischen Schwellenwert aus. - Untersuchen Sie die Oberfläche visuell. Wählen Sie die Schwellenwerte aus, um das ausgehende Signal zu reduzieren. Entfernen Sie die Oberflächen von Pleura und Gefäßen.
- Erstellen Sie eine Maske für die Atemwegsoberfläche mit den Optionen Bearbeiten und Alle maskieren. Wählen Sie den Atemwegskanal und setzen Sie Voxel außerhalb der Oberfläche auf 0,001.
- Speichern Sie die Datei mit der Atemwegsmaske als TIFF-Serie im Ordner. Speichern Sie die Datei mit dem conidia-Kanal als TIFF-Serie im separaten Ordner.
7. Bildbearbeitung: Maskenkorrektur
- Öffnen Sie die Datei mit der Atemwegsmaske in einer Open-Source-Plattform für die biologische Bildanalyse17 als 8-Bit-Bild. Erstellen Sie das Bild binär, indem Sie auf | Binäre | Machen Sie Binär.
HINWEIS: Korrigieren Sie bei Bedarf die Maske: Entfernen Sie die übermäßigen Flächen mithilfe der Polygonauswahl und der Registerkarte Löschen. Alternativ können Sie das Flood Fill Toolverwenden. - Zeichnen Sie die fehlenden Flächen mehrmals mit Dilate (3D):Klicken Sie auf Plugins | Prozess | Erweitern (3D). Füllen Sie die Löcher, indem Sie auf | Binäre | Löcher füllen. Verwenden Sie selektions- und ROI-Manager-Interpolation, um die Restlöcher in der Maske manuell zu füllen. Wenden Sie mehrere Erode-Optionen (3D) an (Plugins | Prozess | Erode (3D)), um die Maskendicke neu zu berechnen.
HINWEIS: Erstellen von Makros mithilfe von Plugins | Makrooptionen für mehrere Dilate (3D) und Erode (3D) Wiederholungen.
Stellen Sie sicher, dass die Anzahl der Erode (3D) der Anzahl der Dilate (3D)-Anwendungen entspricht. - Speichern Sie die Maske in einem neuen Ordner als TIFF-Serie.
8. Conidia quantitative Analyse
- Öffnen Sie die App in der Programmier- und numerischen Rechenplattform: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/84525-conidia_counter.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Dateien hinzufügen. Wählen Sie den Luftwegsmaskenordner und den Conidia-Ordner aus.
- Legen Sie einen benutzerdefinierten Schwellenwert zwischen 0 und 1 fest. Drücken Sie die Taste OK.
- Speichern Sie die Ausgabetabelle in der benutzerdefinierten .xls Datei.
- Analysieren Sie die Daten mit Software für statistische Analysen.
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Representative Results
Nach dem obigen Protokoll wurde das 3D-Bild erhalten, das die Atemwege und A. fumigatus conidia im Lungenlappen einer Maus zeigt (Abbildung 1A). Streptavidin (das zur Visualisierung der Atemwege verwendet wurde) markierte Bronchien und Bronchiolen15. Zusätzlich werden die großen Gefäße, die durch ihre Morphologie leicht von den Atemwegen zu unterscheiden sind, und die Pleura im Atemwegskanal visualisiert (Abbildung 1A-C). Die Schaffung der Atemwegsoberfläche und der Maske ermöglichte die Entfernung des Gefäßes und der Pleuravorsprünge im Atemwegskanal; Die Integrität der Atemwegsoberfläche wird jedoch durch das schwache Signal von Streptavidin in mehreren Bronchialästen zerstört (Abbildung 1B-C). Die Weiterverarbeitung der Atemwegsmaske ermöglicht die Reparatur der fehlenden Fragmente (Bild 1D).
Die Verteilung von A. fumigatus conidia in der Lunge von Mäusen wurde mit den linken oder rechten oberen Lungenlappen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Anwendung von Conidien geschätzt. Für den rechten oberen Lungenlappen besteht das Bild aus etwa 30 Kacheln und etwa 250 Z-Stapeln. Nach dem Stitchen hatte das Bild, das mit der Auflösung 512 × 512 aufgenommen wurde, eine Bildgröße von 2360 × 2815 Pixel und die Größe eines Pixels beträgt 2,77 μm × 2,77 μm, was mit der Größe von A. fumigatus conidia von 2-3,5 μm9vergleichbar ist.
Das vergrößerte Bild der distalen Atemwegsregion zeigt, dass die Detektion der genauen Lage von Konidien (innerhalb oder außerhalb der Bronchialäste) aufgrund der Komplexität des Bildes und der geringen Größe der Konidien im Verhältnis zur Größe der Atemwege ziemlich schwierig ist (Abbildung 2A). Eine genaue Untersuchung ergab, dass sich Konidien sowohl innerhalb als auch außerhalb der Bronchialäste befanden (Abbildung 2B-C).
Die Schwellenwerteinstellungen des Konidienkanals beeinflussen die resultierende Anzahl der Konidien stark (Abbildung 2B-C). Um die unvoreingenommene quantitative Analyse durchzuführen, haben wir eine App in der Programmier- und numerischen Computerplattform entwickelt, mit der die Anzahl der Konidien innerhalb und außerhalb der Atemwegsmaske geschätzt werden kann, wobei die manuelle Schwellenwerteinstellung vermieden wird. Die App handelt basierend auf dem folgenden Algorithmus. Zunächst wird der Konidienkanal mit einem optimalen Schwellenwert in einen binären 3D-Bildstapel segmentiert. Wie oben beschrieben, erlaubt die gewählte Abbildungsauflösung die Identifizierung eines Konidiums als ein Pixel. Die Verwendung von Streptavidin zur Markierung der Atemwege ermöglicht die Visualisierung von Bronchien, aber nicht von Alveolen15. Daher werden Konidien, die sich in Bronchien befinden, als Konidienpixel innerhalb der Atemwegsmaske definiert, während Konidien, die sich in Alveolen befinden, als Konidienpixel außerhalb der Atemwegsmaske definiert sind. In Anbetracht dessen wird im nächsten Schritt des Algorithmus eine binäre UND-Operation für das Atemwegsmaskenbild und das Konidienbild durchgeführt, um Pixel von Konidien zu extrahieren, die sich in Bronchien befinden. In ähnlicher Weise werden die verbleibenden Konidienpixel extrahiert, um die Anzahl der Konidien in den Alveolen zu erhalten. Der resultierende Prozentsatz der Konidien in Bronchien und Alveolen im Verhältnis zur Gesamtmenge an Konidien in der Lunge wird im Balkendiagramm und in der Ausgabetabelle der App-Benutzeroberfläche dargestellt.
Mit diesem Ansatz wurde die quantitative Analyse der Konidienverteilung in den Atemwegen von Mäusen für den Zeitpunkt von 6 Stunden nach der Anwendung von Conidia durchgeführt (Abbildung 2D). Die Daten deuten darauf hin, dass bei oropharyngealer Anwendung die Mehrheit der Konidien in den Alveolarraum eindringt und sich dort zu Beginn der entzündlichen Immunantwort befindet.
Abbildung 1. Das Prinzip der Atemwegsbildverarbeitung. (A) 3D-Aufnahme des rechten oberen Lungenlappens einer Maus, 24 Stunden nach der Anwendung der Konidien, die biotinreiche Strukturen (Streptavidin, weiß) und A. fumigatus conidia (Magenta) zeigen. Steptavidin-positive große Gefäße sind mit feinen Pfeilen gekennzeichnet. (B,C) Die Oberfläche (grün) und die Maske (orange) für die Atemwege. Die fehlenden Atemwegsfragmente in der Oberfläche und der Maske sind mit Pfeilen gekennzeichnet; die übermäßigen Strukturen mit Pfeilspitzen. Der Maßstabsbalken beträgt 1000 μm. (D) Die Atemwegsmaske nach den Korrekturen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Conidia Bildverarbeitung und quantitative Analyse. (A) Vergrößertes Bild der distalen Atemwege (Streptavidin, Grautöne) und A. fumigatus conidia (Magenta), die in Abbildung 1Adargestellt sind. Der Maßstabsbalken beträgt 300 μm B, C. Vergrößertes Bild beliebig boxed auf (A) wird als Z-Slice mit einem hohen Schwellenwert (B) und einem niedrigen Schwellenwert (C) dargestellt. Konidien innerhalb der Atemwege sind mit Pfeilen und außen mit Pfeilspitzen gekennzeichnet. Der Maßstabsbalken beträgt 150 μm. (D) Quantitative Analyse von Konidien in den Bronchialästen und im Alveolarraum. Die Daten werden als Median- und Interquartilsbereich für 4 Mäuse gezeigt, 6 h nach Der Einnahme von A. fumigatus conidia. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die 3D-Bildgebung von Ganzen Organen ermöglicht die Gewinnung der Daten ohne Sezierung der Probe, was für die Untersuchung der räumlichen Aspekte der anatomischen Verteilung des Erregers im Organismus von großer Bedeutung ist. Es gibt verschiedene Techniken und Modifikationen der gewebeoptischen Reinigung, die helfen, die Laserlichtstreuung zu überwinden und die Bildgebung ganzer Organe zu ermöglichen15,16,18,19. Einer der kundenspezifischen Gewebereinigungsansätze besteht aus methanolbasierter Gewebedehydrierung und -entpidalung, gefolgt von optischer Klärung mit BABB. Der Ansatz wurde vor mehr als 100 Jahren entwickelt und hat mehrere Modifikationen. In unserer Arbeit verwenden wir die einfachste Modifikation, die von Scott et al. beschrieben wurde. 15 Ein solcher Ansatz ist optimal für den Einsatz mit fluoreszierend markierten Krankheitserregern. Darüber hinaus sind die Fluorochrome mit hoher Photostabilität für eine längere Bildgebung vorzuziehen. Leider ist die Visualisierung von transgenen TdTomato A. fumigatus conidia mit dieser Methode aufgrund der hohen Empfindlichkeit von TdTomato gegenüber BABB nicht möglich (Daten nicht gezeigt). So erlaubt der hier beschriebene Ansatz den erfolgreichen Nachweis von ruhenden oder fixierten Krankheitserregern, kann aber nicht zur Bildgebung von wachsenden A. fumigatus conidia oder Hyphen verwendet werden. Zusätzlich ist die immunhistochemische Färbung der Probe mit den hochaffinen Bindungssubstanzen vorzuziehen. Daher hatten wir auch Schwierigkeiten, die fluoreszierend markierten Antikörper anzuwenden, um Gefäße und Lymphgefäße in ganz montierten Lungenlappenproben zu visualisieren. Scott et al. 15 visualisierte Nervenfasern mittels zweistufiger Färbung mit Antikörpern gegen PGP 9.5. Dies deutet darauf hin, dass einige Antikörper zur Färbung mit der folgenden optischen Klärung mit BABB verwendet werden können. Wir verloren auch das fluoreszierende Signal der 0,1 μm fluoreszierenden Latexpartikel nach der BABB-Klärung, während die Verwendung der Clearing-enhanced 3D (Ce3D) Clearing-Lösung18 das fluoreszierende Signal der Partikel nicht beeinflusste.
Im vorliegenden Ansatz verwenden wir Streptavidin zur Kennzeichnung der Atemwege. Streptavidin bindet endogenes Biotin, das in Clara-Zellen (und in geringerem Maße in den alveolären Typ-II-Epithelzellen) exprimiert wird20. Da sich Clara-Zellen (auch Clubzellen genannt) in Abwesenheit von Entzündungen in den Bronchien und Bronchiolen befinden, aber nicht im Alveolarkompartiment, visualisiert die Streptavidin-Färbung nur Bronchialäste. Daher wurden im vorliegenden Ansatz alle Konidien außerhalb der Streptavidin-markierten Atemwege als im Alveolarraum gelegen bestimmt. Für die genauere Detektion der Konidienposition sollten einige andere Atemwegsmarker, wie SOX9, verwendet werden3. Für den Fall, dass die Verwendung von Antikörpern erforderlich ist, sind Ce3D oder dreidimensionale Bildgebung von lösungsmittelgeräumten Organen (3DISCO)19 Techniken besser geeignet als BAAB-basierte optische Clearing. Die optische Reinigung von BABB ist jedoch der einfachste und zeitaufwendigste Ansatz und daher der vorteilhafteste für die vorab fluoreszierend markierte Konidiendetektion in den mit Streptavidin markierten Atemwegen.
Die 3D-Bildgebung der Mauslunge kann auch mit optischer Projektionstomographie durchgeführt werden integrierteMikroskopie 3. Aufgrund der begrenzten Auflösung der Tomographie eignet sich CLSM jedoch besser für die gleichzeitige Abbildung der Atemwege und 3 μm Konidien. In unserem Fall wird ein einzelnes Konidium als ein Pixel angesehen. Die Verarbeitung solcher Bilder ermöglichte die Quantifizierung von Konidien innerhalb und außerhalb der Bronchialäste. Die Methode kann auch angewendet werden, um die anatomische Konidienverteilung bei immunkompetenten und immungeschwächten Mäusen zu vergleichen. Der Ansatz kann auch verwendet werden, um die Kinetik der Konidienelimination aus den Atemwegen von Mäusen abzuschätzen. Darüber hinaus ist die Kombination des Ansatzes der gesamten Atemwegsmorphometrie, der von Scott et al. entwickelt wurde. 15 mit dem Algorithmus für unvoreingenommene Konidien kann die quantitative Analyse bei der genauen Lokalisierung von A. fumigatus conidia und anderen Partikeln vergleichbarer Größe in verschiedenen Generationen des Bronchialbaums hilfreich sein.
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Disclosures
Die Autoren berichten von keinen Interessenkonflikten in dieser Arbeit.
Acknowledgments
Die Autoren danken Prof. Sven Krappmann (Universitätsklinikum Erlangen und FUA Erlangen-Nürnberg) für die Bereitstellung des Aspergillus fumigatus conidia Stamms AfS150. Die Autoren danken miPT Press Office. V.B. erkennt das Ministerium für Wissenschaft und Hochschulbildung der Russischen Föderation an (#075-00337-20-03, Projekt FSMG-2020-0003). Die Arbeiten zur Bildgebung und Quantifizierung von A. fumigatus conidia wurden durch RSF Nr. 19-75-00082 unterstützt. Die Arbeiten zur Bildgebung der Atemwege wurden durch RFBR Nr. 20-04-60311 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 NHS Ester | ThermoFisher | A20004 | |
| Aspergillus fumigatus conidia | ATCC | 46645 | The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative |
| Benzyl alcohol | Panreac | 141081.1611 | 98.0-100 % |
| Benzyl benzoate | Acros | AC10586-0010 | 99+% |
| C57Bl/6 mice | Pushchino Animal Breeding Centre (Russia) | Male. 12 - 30 week old. | |
| Catheter | Venisystems | G715-A01 | 18G |
| Cell imaging coverglass-bottom chamber | Eppendorf | 30742028 | 4 or 8 well chamber with coverglass bottom |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Any centrifuge provided 1000 g can be used |
| Confocal laser scanning microscope | ZEISS | ZEISS LSM780 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | ≥99.9% |
| FIJI image processing package | FIJI | Free software | |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD557R | Toothed |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD321R | Fine-tipped |
| Forcep | Bochem | 1727 | Smooth |
| Glass bottle | DURAN | 242101304 | With ground-in lid |
| Graphic Editor Photoshop | Adobe Inc | Adobe Photoshop CS | |
| GraphPad Software | GraphPad | Prism 8 | |
| Imaris Microscopy Imaging Software | Oxford Instruments | Free trial is available https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial | |
| Isoflurane | Karizoo | ||
| NaHCO3 | Panreac | 141638 | |
| Objective | ZEISS | 420640-9800-000 | Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS | Paneco | P060Π | |
| Pipette | ProLine | 722020 | 5 to 50 μL |
| Powdered milk | Roth | T145.2 | |
| Sample mixer | Dynal | MXIC1 | |
| Scissors | B. Braun | BC257R | Blunt |
| Shaker | Apexlab | GS-20 | 50-300 rpm |
| Skalpel | Bochem | 12646 | |
| Silk thread | B. Braun | 3 USP | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Test tube | SPL Lifesciences | 50050 | 50 mL |
| Tris (hydroxymethyl aminomethane) | Helicon | H-1702-0.5 | Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1 |
| Triton X-100 | Amresco | Am-O694-0.1 | |
| ZEN microscope software | ZEISS | ZEN2012 SP5 | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html |
References
- O'Gorman, C. M. Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis. Fungal Biology Reviews. 25 (3), 151-157 (2011).
- Hyde, D. M., et al. Asthma: A comparison of animal models using stereological methods. European Respiratory Review. 15 (101), 122-135 (2006).
- Alanis, D. M., Chang, D. R., Akiyama, H., Krasnow, M. A., Chen, J. Two nested developmental waves demarcate a compartment boundary in the mouse lung. Nature Communications. 5, (2014).
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Donohue, J. F. Targeted drug-aerosol delivery in the human respiratory system. Annual Review of Biomedical Engineering. 10, (2008).
- Bustamante-Marin, X. M., Ostrowski, L. E.
- Fröhlich, E., Salar-Behzadi, S. Toxicological assessment of inhaled nanoparticles: Role of in vivo, ex vivo, in vitro, and in Silico Studies. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4795-4822 (2014).
- Patel, V. I., Metcalf, J. P. Airway macrophage and dendritic cell subsets in the resting human lung. Critical Reviews in Immunology. 38 (4), 303-331 (2018).
- Bogorodskiy, A. O., et al. Murine intraepithelial dendritic cells interact with phagocytic cells during Aspergillus fumigatus-Induced Inflammation. Frontiers in Immunology. 11, (2020).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous fuman fungal pathogen. PLoS Pathogens. 9 (12), 1-4 (2013).
- Overton, N., Gago, S., Bowyer, P. Immunogenetics of chronic and allergic aspergillosis. Immunogenetics of Fungal Diseases. , 153-171 (2017).
- Thiesse, J., et al. Lung structure phenotype variation in inbred mouse strains revealed through in vivo micro-CT imaging. Journal of Applied Physiology. 109 (6), 1960-1968 (2010).
- Tochigi, N., et al. Histopathological implications of Aspergillus infection in lung. Mediators of Inflammation. 2013, (2013).
- Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin rodA. PLoS Pathogens. 6 (4), 1-18 (2010).
- Shevchenko, M. A., et al. Aspergillus fumigatus infection-induced neutrophil recruitment and location in the conducting airway of immunocompetent, neutropenic, and immunosuppressed mice. Journal of Immunology Research. 2018, 5379085 (2018).
- Scott, G. D., Blum, E. D., Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Tissue optical clearing, three-dimensional imaging, and computer morphometry in whole mouse lungs and human airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 1 (51), 43-55 (2014).
- Amich, J., et al. Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-aspergillus fumigatus interactions. mBio. 11 (1), (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. High-dimensional cell-level analysis of tissues with Ce3D multiplex volume imaging. Nat Protoc. 14 (6), 1708-1733 (2019).
- Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J Vis Exp. (89), e51382 (2014).
- Kuhn, C. Biotin stores in rodent lungs: Localization to Clara and type II alveolar cells. Experimental Lung Research. 14 (4), 527-536 (1988).
