Summary
Vi beskriver metoden för kvantitativ analys av fördelningen av Aspergillus fumigatus conidia (3 μm i storlek) i luftvägarna hos möss. Metoden kan också användas för analys av mikropartiklar och nanopartikel agglomeratfördelning i luftvägarna i olika patologiska tillståndsmodeller.
Abstract
Aspergillus fumigatus conidia är luftburna patogener som kan tränga in i mänskliga luftvägar. Immunkompetenta personer utan allergier uppvisar resistens och immunologisk tolerans, medan konidia hos immunkomprometterade patienter kan kolonisera luftvägarna och orsaka allvarliga invasiva andningsstörningar. Olika celler i olika luftvägsfack är involverade i immunsvaret som förhindrar svampinvasion; Spatio-temporala aspekter av patogen eliminering är dock fortfarande inte helt förstådda. Tredimensionell (3D) avbildning av optiskt rensade helmonterade organ, särskilt lungorna hos experimentella möss, tillåter påvisande av fluorescerande märkta patogener i luftvägarna vid olika tidpunkter efter infektion. I den aktuella studien beskriver vi en experimentell installation för att utföra en kvantitativ analys av A. fumigatus conidia distribution i luftvägarna. Med hjälp av fluorescerande konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM), spårade vi platsen för fluorescerande märkt konidia i bronkial grenar och alveolar fack 6 timmar efter oropharyngeal ansökan till möss. Metoden som beskrivs här användes tidigare för att upptäcka den exakta patogen plats och identifiering av patogen-interagerande celler i olika faser av immunsvaret. Den experimentella inställningen kan användas för att uppskatta kinetiken för patogeneliminering under olika patologiska förhållanden.
Introduction
Dagligen andas människor in luftburna patogener, inklusive sporer av opportunistiska svampar Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) som kan tränga in i andningsorganen1. Luftvägarna hos däggdjur är ett system av luftvägar i olika generationer som kännetecknas av de olika strukturerna i luftvägarna väggar2,3,4. Tracheobronchial väggar består av flera celltyper bland vilka är ciliated celler som ger mucociliary clearance5. I alveolerna finns inga cilierade celler och de genomträngande alveolära rymdpatogenerna kan inte elimineras genom mucociliary clearance6. Dessutom är varje luftvägsgenerering en nisch för flera immuncellpopulationer och delmängder av dessa populationer är unika för vissa luftvägsfack. Således finns alveolära makrofager i de alveolära facken, medan både luftstrupen och ledande luftvägar är fodrade med de intraepitheliala dendritiskacellerna 7,8.
Den ungefärliga storleken på A. fumigatus conidia är 2-3,5 μm9. Eftersom diametern på små luftvägar hos människor och även hos möss överstiger 3,5 μm, föreslogs det att konidia kan tränga in i det alveolära utrymmet2,10,11. I själva verket visade histologisk undersökning svamp tillväxt i alveol av de patienter som lider av aspergillos12. Conidia upptäcktes också i alveol av infekterade möss med levande avbildning av de tjocka lungskivorna13. Samtidigt upptäcktes conidia i den luminala sidan av bronkial epitel av möss14.
Tredimensionell (3D) avbildning av de optiskt rensade helmonterade mus lungorna tillåter morfometrisk analys av luftvägarna15. Särskilt den kvantitativa analysen av visceral pleura nerv distribution utfördes med hjälp av optiskt rensade mus lung exemplar15. Nyligen undersökte Amich et al.16 svamptillväxten efter intranasal applicering av conidia på immunkomprometterade möss med hjälp av en ljus-ark fluorescensmikroskopi av optiskt rensade mus lungprover. Den exakta platsen för vila conidia i luftvägarna vid olika tidpunkter efter infektionen är viktigt för att identifiera cellpopulationerna som kan ge tillräckligt svampdödande försvar i vissa faser av inflammation. Men på grund av den relativt lilla storleken är spatio-temporala aspekter av A. fumigatus conidia distribution i luftvägarna dåligt karakteriserade.
Här presenterar vi en experimentell inställning för kvantitativ analys av A. fumigatus conidia distribution i luftvägarna hos infekterade möss. Med hjälp av fluorescerande konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM) av optiskt rensade lungor av möss som fick en oropharyngeal tillämpning av fluorescerande märktA A. fumigatus conidia, får vi 3D-bilder och utför bildbehandlingen. Med hjälp av 3D-avbildning av hela berget lunglob har vi tidigare visat fördelningen av A. fumigatus conidia i den ledande luftvägarna hos möss 72 timmar efter conidiaansökan 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder för försöksdjur som beskrivs här har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences (protokollnummer 226/2017).
1. A. fumigatus conidia ansökan
- För att erhålla fluorescerande märkt A. fumigatus conidia, fixera 5 × 108 conidia genom att tillsätta 1 ml 3% paraformaldehyd till konidialkulleten. Inkubera i ett 50 ml provrör i 2 timmar på en skakapparat vid rumstemperatur.
- Tvätta conidia med 20 ml fosfatbuffert saltlösning (PBS): centrifugera vid 1 000 x g i 15 min, ta försiktigt bort supernatanten och tillsätt färsk PBS i en volym av 20 ml. Upprepa.
- Lös upp conidian i 900 μL på 0,1 M NaHCO3.
- Lös upp succinimidylestern i 594 nm fluorescerande färgämne i 100 μL dimetylsulfoxid och tillsätt conidia.
- Inkubera konidian med färgämnet i 1 timme på en skakapparat vid 150 varv/min vid rumstemperatur.
- Tvätta conidian två gånger med 20 ml PBS i centrifugen vid 1 000 x g i 15 min.
- Späd conidia till en koncentration av 1 × 108 conidia/ml i PBS och förvara vid 4 °C.
- Söv musen med 0,5-3% isofluranånga. Sätt musen på hållaren, fixa tungan med släta tång och håll naresna. Ta en enda kanalpipett och applicera 50 μL conidia suspension på musspennxen. Vänta tills suspensionen har inandats.
2. Provberedning
- Förbered provröret på 50 ml och fyll det med 15 ml färsk 2% paraformaldehyd. Placera de medicinska instrumenten (15 cm tandade dissekeringstångar, 8 cm finspetsade tångar och 10 cm sax med trubbiga ändar) i 70% etanollösning.
- Avliva musen i enlighet med IACUC-protokollet. Placera sedan musen i dorsala position och fixa mustassarna med nålar.
OBS: Om du använder livmoderhalsförskjutning för dödshjälp, se till att luftstrupen är integritet.- Behandla musen med 70% etanol med en spruta.
- Gör ett median längsgående snitt i ventrala huden från bakpotterna till förepawsna och hakan.
- Separera huden från den subkutana vävnaden med tandade tångar och sluten sax. Fixera hudens övre ändar med nålar.
- Gör ett snitt i bukväggen och separera levern från membranet. Välj försiktigt membranet med sluten sax och skär sedan membranet.
- Gör en medial skärning av bröstkorgen och hals bindväv tills luftstrupen är synlig.
- Kör en silkestråd under luftstrupen och gör en kirurgisk knut med två tång.
OBS: Alternativt kan du använda tandtråd istället för silkestråd.- Dra försiktigt tråden och skär av lungorna från bindväven med sax. Håll saxen vinkelrät mot bordet.
- Sätt lungorna i 50 ml provrör med 2% paraformaldehyd. Lämna gängändarna utanför röret, sätt locket tätt och vänd röret för att täcka lungorna med paraformaldehyd. Håll lungorna över natten vid 4 °C.
- Dissekera lungloberna från hjärtat och varandra med en skalpell.
- Sätt lungloberna i en 24 brunnsplatta, med varje lob i en separat brunn. Tvätta lungloberna i 1 ml trisbuffrad saltlösning (TBS) pH 7,4, 5 gånger i 1 timme vardera på en skakapparat vid 150 varv/min.
- Ersätt 1 ml TBS med 1 ml blockeringsbuffert (1% Triton X 100, 5% mjölkpulver i TBS) och lämna provet över natten vid rumstemperatur på en skakapparat.
- Byt ut blockeringsbufferten mot 1 ml streptavidin-488- nm fluorkrom konjugat utspädd 1:30 i TBS. Lämna provet i minst 72 timmar vid rumstemperatur på en skakapparat (150 varv/min).
- Tvätta provet 5 gånger i 1 timme vardera i 1 ml TBS vid rumstemperatur på en skakapparat (150 varv/min). Överför provet till de nya brunnarna och täck det med 2% paraformaldehyd över natten vid 4 °C för efterfixering.
3. Mus lunglob optisk clearing
- Placera provet i 5 ml glasflaska fylld med 3 ml 50% metanolvattenlösning och sätt på det på provblandaren vid rumstemperatur i 1 timme.
- Byt ut 3 ml 50% metanol mot 3 ml 100% metanol och sätt på den på provblandaren i 2 timmar. Förbered en 1:2 v/v blandning av bensylalkohol och bensylbensoat (BABB) i en total volym av 1 ml.
- Överför provet till en 24 brunnsplatta och täck med 1 ml BABB-blandning i minst 30 minuter. Lämna inte provet i BABB under en längre tid; BABB kan skada plastplattan och göra provet för styvt.
- Lägg provet i cellavbildningslockglaset i bottenkammaren. Provet är klart för avbildning.
4. Mus lunglob imaging med CLSM
- Sätt på mikroskopsystemet. Öppna mikroskopprogramvaran. Tänd överföringslampan på fliken Leta reda på. Välj 10x-målet.
OBS: För mer detaljerad analys, använd 20x-målet, men det ökar tiden för experimentet och bildfilens storlek. - Sätt kammaren med provexemplaret i omslagsreglaget. Sätt hållaren på XY-scenen över målet. Centrera provet med XY-kontrollerna på scenen ovanpå målet. Använd transmissionslampan och okularet för att manuellt hitta provexemplaret Z-plan.
- Byt ut programvaran till fliken Förvärv. Välj CLSM λ-läge. Sätt på lasern på 488 nm och 561 nm. Välj den 488/561 nm dichroiska spegeln. Ändra detektorns spektralområde till 490-695 nm. Justera lasereffekten till lämpligt område (10-50 μW). Justera detektorförstr hur stor 750-900-räckvidden är.
OBS: Högre förstärkningsinställningar är oönskade på grund av buller. - Begränsa pinhole till 1 Airy-enhet genom att klicka på 1 AU-knapp. Ställ in pixelupplösningen på 512 × 512 pixlar.
- Slå på Z-stack-läget. Starta Live Imaging. Välj det brännfokusplan där båda färgämnena är synliga.
OBS: Vid behov, justera lasereffekten för att normalisera ljusstyrkan hos de två fluorescerande färgämnena. Använd galleri- och enkanalsläge för att undvika urklipp och för att exakt matcha fluorescensintensiteten. - Expandera det visade Z-stackfönstret. Använd fokuseringshjulet och hitta provet lägsta plan. Använd knappen Första i fönstret Z-stack. Flytta brännplanet uppåt för att hitta provexemplarets övre gräns och spara positionen med hjälp av knappen Sista. Kontrollera representationen av exempeldjupet i Z-stackfönstret.
Obs: En representation av provdjupet visas i Z-stackfönstret efter att de första och sista positionerna har valts. - Placera målet med hjälp av fokuseringshjulet nära provets botten genom att titta på Z-stackrutan. Detta är cirka 20 μm från provets botten.
- Stäng av Z-stack-läget och aktivera läget Tile Scan. Hämta bilden med ett lämpligt antal brickor för provexemplarets storlek. 5 × 5 plattor är en bra utgångspunkt.
- Justera antalet plattor och provexemplaret XY-läge tills hela lungan passar inuti den kaklade bilden. Kontrollera om Z-stackpositionerna är korrekta med den nyligen erhållna XY-positionen i mitten av provet.
- Aktivera lägena både Z-stack och Tile Scan. Ställ in Z-steg (i Z-stackfönstret) på 5 μm. Ställ in skanningshastigheten på 6. Aktivera funktionen Spara automatiskt. Aktivera alternativet Spara separata paneler. Namnge filen. Tryck på knappen Starta experiment.
- Kontrollera att experimentet inte överskrider den tilldelade tiden på mikroskopet. om så är möjligt - justera hastigheten.
OBS: Den ungefärliga filstorleken är mer än 10 Gb; se till att det finns tillräckligt med utrymme på hårddisken.
5. Spektral unmixing och sömmar
- Använd programvaran för den första bildbehandlingen. För spektral unmixing väljer du alternativet Blanda. Välj två regioner som motsvarar streptavidin/airways och conidia för att hämta spektra från bilden. Klicka på Starta avblandning.
OBS: Alternativt kan du använda det befintliga spektrat för 488 och 594 nm fluorokromer. - Öppna filen för bildbehandlingen och välj fliken Bearbetning. I avsnittet Metoder väljer du Geometrisk och Sömmar. I avsnittet Parameter väljer du alternativet Ny utgång och markerar alternativet Säkringspaneler. Använd referensläget med den valda kanalen som motsvarar luftvägarna fluorescens. Använd sömmen genom att klicka på Använd.
6. Bildbehandling: ytrendering
- Öppna bilden som en 3D-vy för överträffa . Skapa en luftvägsyta med alternativet Surface för kanalen som användes för visualiseringen av luftvägarna. Välj utjämningsparametern 10 μm.
OBS: Välj också det automatiska tröskelvärdet. - Inspektera ytan visuellt. Välj tröskelvärden för att minska avlysningssignalen. Ta bort pleura och kärlens ytor.
- Skapa en mask för luftvägarna med alternativen Redigera och Maskera alla. Välj luftvägskanalen och ställ voxels utanför ytan till 0,001.
- Spara filen med luftvägsmasken som en TIFF-serie i mappen. Spara filen med conidia-kanalen som en TIFF-serie i den separata mappen.
7. Bildbehandling: maskkorrigering
- Öppna filen med luftvägsmasken i en plattform med öppen källkod för biologisk bildanalys17 som en 8-bitars bild. Gör bilden binär genom att klicka på | Binär | Gör binär.
OBS: Vid behov, korrigera masken: ta bort de överdrivna ytorna med polygonvalet och fliken Ta bort. Alternativt kan du använda verktyget För översvämningsfyllning. - Rita de saknade ytorna med flera gånger Dilate (3D): klicka på Plugins | Bearbeta | Vidga (3D). Fyll hålen genom att klicka på | Binär | Fyll hål. Använd markering och ROI-chefsinterpolering för att fylla kvarvarande hål i masken manuellt. Använd flera Erode-alternativ (3D) (Plugins | Bearbeta | Erodera (3D)) för att återförstälja masktjockleken.
Skapa makron med plugins | Makroalternativ för flera dilaterade (3D) och Erode (3D) upprepas.
Se till att antalet Erode (3D) är lika med antalet Dilate (3D) applikationer. - Spara masken i en ny mapp som en TIFF-serie.
8. Kvantitativ analys av Conidia
- Öppna appen i programmerings- och numerisk beräkningsplattform: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/84525-conidia_counter.
- Tryck på knappen Lägg till filer. Välj mappen airway mask och conidia-mappen.
- Ange ett anpassat tröskelvärde mellan 0 och 1. Tryck på OK-knappen.
- Spara utdatatabellen i den anpassade .xls filen.
- Analysera data med programvara för statistisk analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enligt protokollet ovan erhölls 3D-bilden som visar luftvägarna och A. fumigatus conidia i en muss lunglob (figur 1A). Streptavidin (som användes för luftvägsvisualisering) märkt bronkial och bronkioler15. Dessutom visualiseras de stora fartygen, som lätt kan särskiljas från luftvägarna genom sin morfologi, och lungsäcken i luftvägskanalen (figur 1A-C). Skapandet av luftvägsytan och masken tillät avlägsnande av fartyget och pleuraprojektionerna i luftvägskanalen. Luftvägsytans integritet förstörs dock på grund av streptavidins svaga signal i flera bronkialgrenar (figur 1B-C). Den fortsatta bearbetningen av luftvägsmasken gör det möjligt att reparera de fragment som saknas (figur 1D).
Fördelningen av A. fumigatus conidia i mössens lungor uppskattades med hjälp av vänster eller höger överlägsen lunglob vid olika tidpunkter efter conidia ansökan. För rätt överlägsen lunglob består bilden av cirka 30 plattor och cirka 250 Z-staplar. Efter sömnad hade bilden som förvärvades med upplösningen 512 × 512 en bildstorlek på 2360 × 2815 pixlar och storleken på en pixel är 2,77 μm × 2,77 μm, vilket kan jämföras med storleken på A. fumigatus conidia som är 2-3,5 μm9.
Den förstorade bilden av den distala luftvägsregionen visar att detektion av den exakta platsen för conidia (inuti eller utanför bronkialgrenarna) är ganska svårt på grund av bildens komplexitet och den lilla storleken på conidia i förhållande till luftvägarna (figur 2A). Exakt undersökning visade att conidia fanns både inuti och utanför luftrörsgrenarna (figur 2B-C).
Tröskelinställningarna för conidiakanalen påverkar i hög grad det resulterande antalet conidia (figur 2B-C). För att göra den opartiska kvantitativa analysen utvecklade vi en app i programmerings- och numerisk beräkningsplattform som gör det möjligt att uppskatta antalet conidia inuti och utanför luftvägsmasken och undvika den manuella tröskelinställningen. Appen fungerar baserat på följande algoritm. Först segmenteras conidia-kanalen i en binär 3D-stack med bilder med ett optimalt tröskelvärde. Som beskrivits ovan tillåter den valda bildupplösningen identifiering av en konidium som en pixel. Användningen av streptavidin för luftvägsmärkning tillåter visualisering av bronkier men inte alveoli15. Därför definieras conidia som bor i bronkier som konidiapixlar inuti luftvägsmasken, medan conidia som bor i alveoli definieras som konidiapixlar utanför luftvägsmasken. Med tanke på detta utförs i nästa steg i algoritmen en binär OCH-operation för luftvägsmaskbilden och conidia-bilden för att extrahera pixlar av conidia som bor i bronkier. På samma sätt extraheras de återstående conidia pixlarna för att erhålla antalet konidia i alveoli. Den resulterande procentandelen konidia i bronkier och alveoli i förhållande till den totala mängden konidia i lungan presenteras i stapeldiagrammet och utdatatabellen för appens användargränssnitt.
Med hjälp av detta tillvägagångssätt utfördes den kvantitativa analysen av conidiafördelningen i mössens luftvägar under 6 timmar efter conidia-appliceringen (figur 2D). Data tyder på att vid oropharyngeal ansökan, majoriteten av conidia penetrera alveolar utrymmet och lokalisera där i början av det inflammatoriska immunsvaret.
Figur 1. Principen om luftvägsbildbehandling. (A) 3D-bild av den högra överlägsna lungloben hos en mus, 24 timmar efter conidia-applikation som visar biotinrika strukturer (streptavidin, vit) och A. fumigatus conidia (magenta). Steptavidin-positiva stora fartyg indikeras med fina pilar. B,C) Ytan (grön) och masken (orange) för luftvägarna. De saknade luftvägsfragmenten i ytan och masken indikeras med pilar; de överdrivna strukturerna med pilspetsar. Skalstången är 1000 μm. (D) Luftvägsmasken efter korrigeringarna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2. Conidia bildbehandling och kvantitativ analys. (A) Förstorad bild av de distala luftvägarna (Streptavidin, grå nyanser) och A. fumigatus conidia (magenta) som presenteras i figur 1A. Skalstången är 300 μm B, C. Förstorad bild godtyckligt boxad på (A) representeras som en Z-sektor med högt tröskelvärde (B) och ett lågt tröskelvärde (C). Conidia inuti luftvägarna indikeras med pilar och utvändigt med pilspetsar. Skalstången är 150 μm. (D) Kvantitativ analys av konidia i bronkialgrenarna och det alveolära utrymmet. Uppgifterna visas som median- och interkvartilområdet för 4 möss, 6 timmar efter att ha fått A. fumigatus conidia. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Helorgan 3D-avbildning tillåter erhållande av data utan dissekering av provet, vilket är av stor betydelse för att undersöka de rumsliga aspekterna av patogenens anatomiska fördelning i organismen. Det finns flera tekniker och modifieringar av vävnad optisk clearing som hjälper till att övervinna laserljusspridning och tillåta helorgansavbildning15,16,18,19. En av de anpassade vävnadsrensningsmetoderna består av metanolbaserad vävnadsuttorkning och delipidation följt av optisk clearing med BABB. Tillvägagångssättet utvecklades för mer än 100 år sedan och har flera modifieringar. I vårt arbete använder vi den enklaste modifieringen som beskrevs av Scott et al. 15 Ett sådant tillvägagångssätt är optimalt för användning med fluorescerande märkta patogener. Dessutom är fluorokromer med hög fotostabilitet att föredra för långvarig avbildning. Tyvärr är visualisering av transgen tdtomato A. fumigatus conidia inte möjligt med denna metod, på grund av TdTomatos höga känslighet för BABB (data visas inte). Således tillåter metoden som vi beskriver här framgångsrik upptäckt av vila eller fasta patogener, men kan inte användas för avbildning av växande A. fumigatus conidia eller hyphae. Dessutom är immunohistochemical färgning av provet med hög affinitet bindande ämnen att föredra. Således stod vi också inför problem med att försöka applicera fluorescerande märkta antikroppar för att visualisera kärl och lymfatisk i helmonterade lunglobprover. Men Scott et al. 15 visualiserade nervfibrer med tvåstegsfärgning med antikroppar mot PGP 9.5. Detta indikerar att vissa antikroppar kan användas för färgning med följande optiska clearing med BABB. Vi förlorade också fluorescerande signalen från 0,1 μm fluorescerande latexpartiklar efter BABB-röjning, medan användningen av clearingförbättrad 3D-clearinglösning 18 inte påverkade partiklarnas fluorescerande signal.
I det nuvarande tillvägagångssättet använder vi streptavidin för att märka luftvägarna. Streptavidin binder endogent biotin som anses uttryckas i Clara-celler (och de alveolära epitelcellerna av typ II i mindre utsträckning)20. Som Clara celler (även känd som Club celler) i avsaknad av inflammation bor i bronkier och bronkioler, men inte i alveolar fack, ströptavidin färgning visualiserar endast bronkial grenar. Därför fastställdes alla konidia utanför de streptavidin-märkta luftvägarna i det alveolära utrymmet i detta tillvägagångssätt. För den mer exakta detektion av conidia-platsen bör vissa andra luftvägsmarkörer, till exempel SOX9, användas3. Om antikroppsanvändning är nödvändig är Ce3D- eller tredimensionell avbildning av lösningsmedelsrensade organ (3DISCO)19-tekniker lämpligare än BAAB-baserad optisk clearing. Babb optisk clearing är dock den enklaste och mest tidskrävande metoden, och därför är den mest fördelaktiga för i förväg fluorescerande märkt conidia detektering i markerade med streptavidin luftvägar.
3D-avbildning av mus lungorna kan också utföras med hjälp av optisk projektion tomografi integrerad mikroskopi3. På grund av begränsningen i upplösningen av datortomografi är CLSM dock mer lämplig för samtidig avbildning av luftvägarna och 3 μm conidia. I vårt fall ses ett enda konidium som en pixel. Bearbetningen av sådana bilder tillät kvantifiering av conidia inuti och utanför bronkialgrenarna. Metoden kan också tillämpas för att jämföra anatomisk konidiafördelning hos immunkompetenta och immunkomprometterade möss. Tillvägagångssättet kan också användas för att uppskatta kinetiken i conidia eliminering från mössens luftvägar. Dessutom kombinationen av tillvägagångssättet för hela luftvägarna morfmetri som utvecklades av Scott et al. 15 med algoritmen för opartisk konidia kvantitativ analys kan vara till hjälp i den exakta platsen för A. fumigatus conidia och andra partiklar av jämförbar storlek i olika generationer av bronkialträdet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna rapporterar inga intressekonflikter i detta arbete.
Acknowledgments
Författarna tackar professor Sven Krappmann (Universitetssjukhuset Erlangen och FUA Erlangen-Nürnberg, Tyskland) för att de förser Aspergillus fumigatus conidia-stammen AfS150. Författarna tackar MIPT Press Office. V.B. erkänner Ryska federationens ministerium för vetenskap och högre utbildning (#075-00337-20-03, projekt FSMG-2020-0003). Arbetet med A. fumigatus conidia imaging och quantification stöddes av RSF nr 19-75-00082. Arbetet med luftvägsavbildning stöddes av RFBR nr 20-04-60311.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 NHS Ester | ThermoFisher | A20004 | |
| Aspergillus fumigatus conidia | ATCC | 46645 | The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative |
| Benzyl alcohol | Panreac | 141081.1611 | 98.0-100 % |
| Benzyl benzoate | Acros | AC10586-0010 | 99+% |
| C57Bl/6 mice | Pushchino Animal Breeding Centre (Russia) | Male. 12 - 30 week old. | |
| Catheter | Venisystems | G715-A01 | 18G |
| Cell imaging coverglass-bottom chamber | Eppendorf | 30742028 | 4 or 8 well chamber with coverglass bottom |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Any centrifuge provided 1000 g can be used |
| Confocal laser scanning microscope | ZEISS | ZEISS LSM780 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | ≥99.9% |
| FIJI image processing package | FIJI | Free software | |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD557R | Toothed |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD321R | Fine-tipped |
| Forcep | Bochem | 1727 | Smooth |
| Glass bottle | DURAN | 242101304 | With ground-in lid |
| Graphic Editor Photoshop | Adobe Inc | Adobe Photoshop CS | |
| GraphPad Software | GraphPad | Prism 8 | |
| Imaris Microscopy Imaging Software | Oxford Instruments | Free trial is available https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial | |
| Isoflurane | Karizoo | ||
| NaHCO3 | Panreac | 141638 | |
| Objective | ZEISS | 420640-9800-000 | Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS | Paneco | P060Π | |
| Pipette | ProLine | 722020 | 5 to 50 μL |
| Powdered milk | Roth | T145.2 | |
| Sample mixer | Dynal | MXIC1 | |
| Scissors | B. Braun | BC257R | Blunt |
| Shaker | Apexlab | GS-20 | 50-300 rpm |
| Skalpel | Bochem | 12646 | |
| Silk thread | B. Braun | 3 USP | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Test tube | SPL Lifesciences | 50050 | 50 mL |
| Tris (hydroxymethyl aminomethane) | Helicon | H-1702-0.5 | Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1 |
| Triton X-100 | Amresco | Am-O694-0.1 | |
| ZEN microscope software | ZEISS | ZEN2012 SP5 | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html |
References
- O'Gorman, C. M. Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis. Fungal Biology Reviews. 25 (3), 151-157 (2011).
- Hyde, D. M., et al. Asthma: A comparison of animal models using stereological methods. European Respiratory Review. 15 (101), 122-135 (2006).
- Alanis, D. M., Chang, D. R., Akiyama, H., Krasnow, M. A., Chen, J. Two nested developmental waves demarcate a compartment boundary in the mouse lung. Nature Communications. 5, (2014).
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Donohue, J. F. Targeted drug-aerosol delivery in the human respiratory system. Annual Review of Biomedical Engineering. 10, (2008).
- Bustamante-Marin, X. M., Ostrowski, L. E.
- Fröhlich, E., Salar-Behzadi, S. Toxicological assessment of inhaled nanoparticles: Role of in vivo, ex vivo, in vitro, and in Silico Studies. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4795-4822 (2014).
- Patel, V. I., Metcalf, J. P. Airway macrophage and dendritic cell subsets in the resting human lung. Critical Reviews in Immunology. 38 (4), 303-331 (2018).
- Bogorodskiy, A. O., et al. Murine intraepithelial dendritic cells interact with phagocytic cells during Aspergillus fumigatus-Induced Inflammation. Frontiers in Immunology. 11, (2020).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous fuman fungal pathogen. PLoS Pathogens. 9 (12), 1-4 (2013).
- Overton, N., Gago, S., Bowyer, P. Immunogenetics of chronic and allergic aspergillosis. Immunogenetics of Fungal Diseases. , 153-171 (2017).
- Thiesse, J., et al. Lung structure phenotype variation in inbred mouse strains revealed through in vivo micro-CT imaging. Journal of Applied Physiology. 109 (6), 1960-1968 (2010).
- Tochigi, N., et al. Histopathological implications of Aspergillus infection in lung. Mediators of Inflammation. 2013, (2013).
- Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin rodA. PLoS Pathogens. 6 (4), 1-18 (2010).
- Shevchenko, M. A., et al. Aspergillus fumigatus infection-induced neutrophil recruitment and location in the conducting airway of immunocompetent, neutropenic, and immunosuppressed mice. Journal of Immunology Research. 2018, 5379085 (2018).
- Scott, G. D., Blum, E. D., Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Tissue optical clearing, three-dimensional imaging, and computer morphometry in whole mouse lungs and human airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 1 (51), 43-55 (2014).
- Amich, J., et al. Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-aspergillus fumigatus interactions. mBio. 11 (1), (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. High-dimensional cell-level analysis of tissues with Ce3D multiplex volume imaging. Nat Protoc. 14 (6), 1708-1733 (2019).
- Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J Vis Exp. (89), e51382 (2014).
- Kuhn, C. Biotin stores in rodent lungs: Localization to Clara and type II alveolar cells. Experimental Lung Research. 14 (4), 527-536 (1988).
