Summary
Vi beskriver metoden til kvantitativ analyse af fordelingen af Aspergillus fumigatus conidia (3 μm i størrelse) i musens luftveje. Metoden kan også anvendes til analyse af mikropartikler og nanopartikel agglomeratfordeling i luftvejene i forskellige patologiske tilstandsmodeller.
Abstract
Aspergillus fumigatus conidia er luftbårne patogener, der kan trænge ind i menneskelige luftveje. Immunkompetente mennesker uden allergi udviser resistens og immunologisk tolerance, mens conidia hos immunkompromitterede patienter kan kolonisere luftvejene og forårsage alvorlige invasive luftvejssygdomme. Forskellige celler i forskellige luftveje rum er involveret i immunrespons, der forhindrer svampeinvasion; de spatio-tidsmæssige aspekter af fjernelse af patogener er dog stadig ikke helt forstået. Tredimensionel (3D) billeddannelse af optisk rensede hele monteringsorganer, især lungerne fra eksperimentelle mus, gør det muligt at detektere fluorescerende mærkede patogener i luftvejene på forskellige tidspunkter efter infektion. I denne undersøgelse beskriver vi et eksperimentelt setup til at udføre en kvantitativ analyse af A. fumigatus conidia distribution i luftvejene. Ved hjælp af fluorescerende konfokal laserscanning mikroskopi (CLSM), spores vi placeringen af fluorescerende mærket conidia i bronchiale grene og alveolar rum 6 timer efter oropharyngeal anvendelse på mus. Den her beskrevne fremgangsmåde blev tidligere anvendt til påvisning af den nøjagtige patogenplacering og identifikation af de patogen-interagerende celler i forskellige faser af immunresponset. Den eksperimentelle opsætning kan bruges til at estimere kinetik af patogenet eliminering under forskellige patologiske forhold.
Introduction
På daglig basis indånder folk luftbårne patogener, herunder sporer af opportunistiske svampe Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia), der kan trænge ind i luftvejene1. Luftvejene af pattedyr er et system af luftveje af forskellige generationer, der er kendetegnet ved de forskellige strukturer i luftvejene2,3,4. Tracheobronchial vægge består af flere celletyper, blandt hvilke er ciliated celler, der giver slimhinde clearance5. I alveolerne er der ingen sammenklædede celler, og de gennemtrængende alveolarrumpatogener kan ikke elimineres ved den mucociliary clearance6. Desuden er hver luftvejsgenerering en niche for flere immuncellepopulationer, og delmængder af disse populationer er unikke for visse luftvejsrum. Således alveolar makrofager opholde sig i alveolar rum, mens både luftrør og ledende luftveje er foret med intraepithelial dendritiske celler7,8.
Den omtrentlige størrelse af A. fumigatus conidia er 2-3,5 μm9. Da diameteren af små luftveje hos mennesker og endda hos mus overstiger 3,5 μm, blev det foreslået, at conidia kan trænge ind i alveolarrummet2,10,11. Faktisk viste histologiske undersøgelser svampevæksten hos alveolerne hos de patienter, der lider af aspergillosis12. Conidia blev også påvist i alveolerne af inficerede mus ved hjælp af levende billeddannelse af de tykke lungeskiver13. Samtidig blev conidia påvist i den lysende side af bronchiale epitel af mus14.
Tredimensionel (3D) billeddannelse af de optisk ryddede helmonteringsmuse lunger tillader morfometrisk analyse af luftvejene15. Især blev den kvantitative analyse af den viscerale pleural nervefordeling udført ved hjælp af optisk ryddede muse lungeprøver15. For nylig undersøgte Amich et al.16 svampevæksten efter intranasal anvendelse af conidia på de immunkompromitterede mus ved hjælp af en lysarkfluorescensmikroskopi af optisk clearede muse lunger. Den nøjagtige placering af hvilekonidia i luftvejene på forskellige tidspunkter efter infektionen er vigtig for at identificere cellepopulationerne, der kan give tilstrækkeligt svampedræbende forsvar i visse faser af inflammation. På grund af den relativt lille størrelse er spatio-tidsmæssige aspekter af A. fumigatus conidia distribution i luftvejene imidlertid dårligt karakteriseret.
Her præsenterer vi et eksperimentelt setup til kvantitativ analyse af A. fumigatus conidia distribution i luftvejene af inficerede mus. Ved hjælp af fluorescerende konfokal laserscanning mikroskopi (CLSM) af optisk ryddet lunger af mus, der har modtaget en oropharyngeal anvendelse af fluorescerende mærket A. fumigatus conidia, vi får 3D-billeder og udføre billedbehandling. Ved hjælp af 3D-billeddannelse af hele monterings lungeflappen har vi tidligere vist fordelingen af A. fumigatus conidia i de ledende luftveje af mus 72 timer efter conidia-applikation8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder vedrørende forsøgsdyr, der er beskrevet her, er godkendt af Den Institutionelle Komité for Dyrepleje og Brug (IACUC) ved Shemyakin og Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences (protokolnummer 226/2017).
1. A. fumigatus conidia ansøgning
- For at opnå fluorescerende mærket A. fumigatus conidia, fix 5 × 108 conidia ved at tilsætte 1 mL af 3% paraformaldehyd til conidia pellet. Inkuber i et 50 mL reagensglas i 2 timer på en shaker ved stuetemperatur.
- Vask conidia med 20 mL fosfatbuffers saltvand (PBS): centrifuge ved 1.000 x g i 15 minutter, fjern forsigtigt supernatanten, og tilsæt frisk PBS i et volumen på 20 mL. Gentage.
- Conidia opløses i 900 μL på 0,1 M NaHCO3.
- Succinimidylesteren på 594 nm fluorescerende farvestof opløses i 100 μL dimethylsulfoxid og tilsættes conidia.
- Inkuber conidia med farvestoffet i 1 time på en shaker ved 150 omdrejninger ved stuetemperatur.
- Der vaskes conidia to gange med 20 mL PBS i centrifuge ved 1.000 x g i 15 min.
- Conidia fortyndes til en koncentration på 1 × 108 conidia/mL i PBS og opbevares ved 4 °C.
- Bedøve musen med 0,5-3% isoflurane damp. Sæt musen på holderen, fastgør tungen med glatte pincet, og hold narerne. Tag en enkelt kanalpipette og påfør 50 μL conidia suspension på muse-svælget. Vent, indtil suspensionen er inhaleret.
2. Prøveforberedelse
- Forbered 50 mL reagensglas og fyld det med 15 mL frisk 2% paraformaldehyd. Placer de medicinske instrumenter (15 cm tandede dissekerende pincet, 8 cm finspidsede pincet og 10 cm saks med stumpe ender) i 70% ethanolopløsning.
- Aflive musen i overensstemmelse med IACUC protokollen. Placer derefter musen i dorsal position og fastgør musepoterne med nåle.
BEMÆRK: Hvis du bruger cervikal dislokation til aktiv dødshjælp, skal du sikre luftrørets integritet.- Behandl musen med 70% ethanol ved hjælp af en sprøjte.
- Lav et median langsgående snit i ventralhuden fra bagpoterne til forepaws og hagen.
- Adskil huden fra det subkutane væv ved hjælp af tandede pincet og lukket saks. Fastgør de øvre ender af huden med nåle.
- Lav et snit i bugvæggen og adskille leveren fra mellemgulvet. Vælg forsigtigt mellemgulvet med lukket saks og skær derefter mellemgulvet.
- Lav et mediale snit af brystkassen og nakkeforbindelsesvævet, indtil luftrøret er synligt.
- Kør en silketråd under luftrøret og lav en kirurgisk knude ved hjælp af to pincet.
BEMÆRK: Alternativt kan du bruge tandtråd i stedet for silketråd.- Træk forsigtigt tråden og afskær lungerne fra bindevævet med en saks. Hold saksen vinkelret på bordet.
- Sæt lungerne i 50 mL reagensglas med 2% paraformaldehyd. Efterlad trådender uden for røret, sæt dækslet stramt, og vend røret for at dække lungerne med paraformaldehyd. Hold lungerne natten over ved 4 °C.
- Dissekere lungeflipperne fra hjertet og hinanden med en skalpel.
- Sæt lungeflipperne i en 24 brøndplade, med hver lap i en separat brønd. Vask lungeflipperne i 1 mL Tris-buffered saltvand (TBS) pH 7,4, 5 gange i 1 time hver på en shaker ved 150 omdrejninger i minuttet.
- 1 mL TBS erstattes med 1 mL af blokeringsbufferen (1% Triton X 100, 5% mælkepulver i TBS) og prøven efterlades natten over ved stuetemperatur på en shaker.
- Stødpuden udskiftes med 1 mL streptavidin-488- nm fluorkromkonjugat fortyndet 1:30 i TBS. Lad prøveemnet stå i mindst 72 timer ved stuetemperatur på en ryster (150 omdrejninger).
- Prøveemnet vaskes 5 gange i 1 time hver i 1 mL TBS ved stuetemperatur på en shaker (150 omdrejninger i minuttet). Prøveemnet overføres til de nye brønde, og det dækkes med 2 % paraformaldehyd natten over ved 4 °C til efterfiksering.
3. Mus lunge lap optisk clearing
- Prøveemnet anbringes i 5 ml glasflasken fyldt med 3 ml 50% methanolvandsopløsning, og prøveblanderen anbringes ved stuetemperatur i 1 time.
- 3 mL methanol på 3 mL erstattes med 3 mL 100% methanol, og den anbringes på prøveblanderen i 2 timer. Der fremstilles en blanding på 1:2 v/v af benzylalkohol og benzylbenoat (BABB) i et samlet volumen på 1 mL.
- Prøveemnet overføres til en 24-brøndsplade, og der dækkes med 1 mL BABB-blanding i mindst 30 min. Prøveemnet må ikke efterlades i BABB i lang tid. BABB kan beskadige plastpladen og gøre prøven for stiv.
- Sæt prøven i cellen billedbehandling coverglass-bund kammer. Prøven er klar til billedbehandling.
4. Mus lunge lap billeddannelse med CLSM
- Tænd mikroskopsystemet. Åbn mikroskopsoftwaren. Tænd for transmissionslampen under fanen Find. Vælg 10x-målsætningen.
BEMÆRK: For mere detaljeret analyse skal du bruge 20x-målet, men det øger tidspunktet for eksperimentet og billedfilstørrelsen. - Sæt kammeret med prøven i dækslets glideholder. Sæt indehaveren på XY-scenen over målet. Centrer prøven ved hjælp af XY-kontrollerne på scenen oven på målet. Brug transmissionslyset og okularet til manuelt at finde prøven Z-plan.
- Skift softwaren til fanen Anskaffelse. Vælg CLSM λ-mode. Tænd for lasere på 488 nm og 561 nm. Vælg 488/561 nm dichroic spejl. Detektorens spektralområde ændres til 490-695 nm. Lasereffekten justeres til det relevante område (10-50 μW). Juster detektorgevinsten mellem 750-900 rækkevidde.
BEMÆRK: Højere forstærkningsindstillinger er uønskede på grund af støj. - Indsnævr pinhole til 1 Luftig enhed ved at klikke på 1 AU-knap. Angiv pixelopløsningen til 512 × 512 pixel.
- Tænd for Z-staktilstanden. Start Live Imaging. Vælg det brændplan, hvor begge farvestoffer er synlige.
BEMÆRK: Juster om nødvendigt lasereffekten for at normalisere lysstyrken på de to fluorescerende farvestoffer. Brug Galleri- og Single-Channel-tilstand for at undgå klipning og for præcist at matche fluorescensintensiteten. - Udvid den viste Z-stakrude. Brug fokushjulet og find prøvens laveste plan. Brug knappen Første i ruden Z-stak. Flyt brændplanet opad for at finde prøveemnets øverste grænse, og gem positionen ved hjælp af knappen Sidste. Kontroller repræsentationen af prøvedybden i ruden Z-stak.
BEMÆRK: Der vises en repræsentation af prøvedybden i ruden Z-stak, når første og sidste position er valgt. - Placer målet ved hjælp af fokushjulet nær bunden af prøven ved at se på Z-stakruden. Dette er ca. 20 μm fra bunden af prøven.
- Slå Z-staktilstanden fra, og slå tilstanden Feltscanning til. Anskaf billedet med et passende antal fliser til prøvens størrelse. 5 × 5 fliser er et godt udgangspunkt.
- Juster antallet af fliser og prøven XY position, indtil hele lungen passer ind i flisebelagt billede. Kontroller korrektheden af Z-stakpositionerne igen med den nyopskaffede XY-position i midten af prøven.
- Slå både Z-stack- og Flisescanningstilstand til. Angiv Z-trin (i Z-stakruderuden) til 5 μm. Indstil scanningshastigheden til 6. Slå funktionen Automatisk lagring til. Slå indstillingen Gem separate felter til. Navngiv filen. Tryk på knappen Start eksperiment.
- Kontroller, at forsøget ikke overstiger den tildelte tid på mikroskopet. hvis ja - justere hastigheden.
BEMÆRK: Den omtrentlige filstørrelse er mere end 10 Gb. sørg for, at der er tilstrækkelig plads på harddisken.
5. Spektral ublandede og syning
- Brug softwaren til den første billedbehandling. Vælg indstillingen Ubixning for spektral ubixning. Vælg to regioner, der svarer til streptavidin/airways og conidia for at erhverve spektre fra billedet. Klik på Start udpakning.
BEMÆRK: Alternativt kan du bruge de eksisterende spektre til 488 og 594 nm fluorochrom. - Åbn filen til billedbehandlingen, og vælg fanen Behandling. Vælg Geometrisk og Synkron isektionen Metoder . Vælg det nye output i sektionen Parameter, og marker indstillingen Sikringsfelter. Brug referencetilstanden sammen med den valgte kanal, der svarer til luftvejenescens. Anvend syningen ved at klikke på Anvend.
6. Billedbehandling: overfladegengivelse
- Åbn billedet som en Overgå 3D-visning. Opret en luftvejsoverflade ved hjælp af indstillingen Surface til den kanal, der blev brugt til luftvejsvisualisering. Vælg udjævningsparameteren på 10 μm.
BEMÆRK: Vælg også den automatiske tærskelværdi. - Visuelt inspicere overfladen. Vælg tærsklerne for at reducere det fjerntliggende signal. Fjern overfladerne af pleura og fartøjer.
- Opret en maske til luftvejene ved hjælp af indstillingerne Rediger og maske alle. Vælg luftvejene kanal og sæt Voxels uden for overfladen til 0,001.
- Gem filen med luftvejsmasken som en TIFF-serie i mappen. Gem filen sammen med conidia-kanalen som en TIFF-serie i den separate mappe.
7. Billedbehandling: maskekorrektion
- Åbn filen med luftvejsmasken i en open source-platform til biologisk billedanalyse17 som et 8-bit billede. Gør billedet binært ved at klikke på Proces | Binær | Gør binær.
BEMÆRK: Ret om nødvendigt masken: Fjern de overdrevne overflader ved hjælp af polygonmarkeringen og fanen Slet. Du kan også bruge værktøjet Til udfyldning af oversvømmelser. - Tegn de manglende overflader ved hjælp af flere gange Dilate (3D): Klik på Plugins | Udfør | Dilate (3D). Fyld hullerne ved at klikke på Proces | Binær | Fyld huller. Brug markering og ROI manager interpolation til at udfylde de resterende huller i masken manuelt. Anvend flere eroder (3D) indstillinger(Plugins | Udfør | Eroder (3D)) for at gensample masketykkelsen.
BEMÆRK: Opret makroer ved hjælp af plug-ins | Makroindstillinger for flere 3D- og erodere-gentagelser (Dilate).
Kontroller, at antallet af Erode-programmer (3D) er lig med antallet af Dilate-programmer (3D). - Gem masken i en ny mappe som en TIFF-serie.
8. Konidia kvantitativ analyse
- Åbn appen i programmeringsplatformen og den numeriske computerplatform: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/84525-conidia_counter.
- Tryk på knappen Tilføj filer. Vælg luftvejsmaskemappen og mappen conidia.
- Angiv en brugerdefineret tærskel mellem 0 og 1. Tryk på knappen OK.
- Gem outputtabellen i den brugerdefinerede .xls fil.
- Analyser dataene med software til statistisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter ovenstående protokol blev 3D-billedet, der viser luftvejene og A. fumigatus conidia i en muss lungelap, opnået (Figur 1A). Streptavidin (der blev brugt til luftvejsvisualisering) mærket bronchi og bronchioles15. Derudover visualiseres de store fartøjer, som let kan skelnes fra luftvejene ved deres morfologi, og pleura i luftvejene (Figur 1A-C). Oprettelsen af luftvejene og masken gjorde det muligt at fjerne fartøjet og lungeudskrivningerne i luftvejene. luftvejenes integritet ødelægges imidlertid på grund af det svage signal om streptavidin i flere bronchiale grene (Figur 1B-C). Den videre behandling af luftvejsmasken gør det muligt at reparere de manglende fragmenter (Figur 1D).
Fordelingen af A. fumigatus conidia i musens lunger blev anslået ved hjælp af venstre eller højre overlegne lungeflipper på forskellige tidspunkter efter conidia-påføring. For den rigtige overlegne lunge lap, består billedet af ca 30 fliser og omkring 250 Z-stakke. Efter syning havde det billede, der blev erhvervet med opløsningen 512 × 512, en billedstørrelse på 2360 × 2815 pixel, og størrelsen på en pixel er 2,77 μm × 2,77 μm, hvilket kan sammenlignes med størrelsen af A. fumigatus conidia, der er 2-3,5 μm9.
Det forstørrede billede af det distale luftvejsområde viser, at det er ret vanskeligt at detektering af conidias nøjagtige placering (inden for eller uden for bronkialgrenene) på grund af billedets kompleksitet og den lille størrelse conidia i forhold til luftvejenes størrelse (Figur 2A). En præcis undersøgelse viste, at conidia var placeret både inden for og uden for bronkialgrenene(figur 2B-C).
Tærskelindstillingerne for conidiakanalen har stor indflydelse på det resulterende antal conidia (figur 2B-C). For at gøre den upartiske kvantitative analyse udviklede vi en app i programmerings- og numerisk computerplatform, der gør det muligt at estimere antallet af conidia i og uden for luftvejsmasken og undgå den manuelle tærskelindstilling. Appen fungerer baseret på følgende algoritme. For det første segmenteres conidia-kanalen i en binær 3D-stak billeder ved hjælp af en optimal tærskelværdi. Som beskrevet ovenfor tillader den valgte billedopløsning identifikation af et konidium som en pixel. Brugen af streptavidin til luftvejsmærkning tillader visualisering af bronchi, men ikke alveoler15. Derfor defineres conidia bosiddende i bronchi som conidia pixels inde i luftvejsmasken, mens conidia bosiddende i alveoler defineres som conidia pixels uden for luftvejsmasken. I betragtning af dette udføres der i det næste trin af algoritmen en binær AND-operation for luftvejsmaskebilledet og conidia-billedet for at udtrække pixels af conidia, der er bosiddende i bronchi. På samme måde ekstraheres de resterende conidiapixel for at opnå antallet af conidia i alveoler. Den resulterende procentdel af conidia i bronchi og alveoli i forhold til den samlede mængde konidia i lungerne er præsenteret i søjlediagrammet og outputtabellen for appbrugergrænsefladen.
Ved hjælp af denne fremgangsmåde blev den kvantitative analyse af conidia-fordelingen i musens luftveje udført i et tidsrum på 6 timer efter conidia-applikationen (Figur 2D). Dataene tyder på, at ved oropharyngeal anvendelse trænger størstedelen af conidia ind i alveolarrummet og lokaliserer der i begyndelsen af det inflammatoriske immunrespons.
Figur 1. Princippet om luftveje billedbehandling. (A) 3D-billede af højre overlegne lunge lap af en mus, 24 timer efter conidia ansøgning viser biotin-rige strukturer (streptavidin, hvid) og A. fumigatus conidia (magenta). Steptavidin-positive store fartøjer er angivet med fine pile. (B,C) Overfladen (grøn) og masken (orange) for luftvejene. De manglende luftvejsfragmenter i overfladen og masken er angivet med pile; de overdrevne strukturer med pilespidser. Skalastangen er 1000 μm. (D) Luftvejsmasken efter korrektionerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Conidia billedbehandling og kvantitativ analyse. (A)Forstørret billede af de distale luftveje (Streptavidin, grå nuancer) og A. fumigatus conidia (magenta), som er vist i figur 1A. Skalalinjen er 300 μm B, C. Forstørret billede vilkårligt bokset på (A) repræsenteres som en Z-skive med en høj tærskel (B) og en lav tærskelværdi (C). Conidia inde i luftvejene er angivet med pile og udenfor med pilespidser. Skalabjælken er 150 μm. (D) Kvantitativ analyse af conidia i bronchiale grene og alveolarrummet. Dataene vises som median- og interkvartilområdet for 4 mus, 6 timer efter at have modtaget A. fumigatus conidia. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Helorgan 3D-billeddannelse gør det muligt at opnå dataene uden dissektion af prøven, hvilket er af stor betydning for at undersøge de rumlige aspekter af patogenets anatomiske fordeling i organismen. Der er flere teknikker og modifikationer af væv optisk clearing, der hjælper med at overvinde laserlys spredning og tillade hele organ billeddannelse15,16,18,19. En af de brugerdefinerede væv clearing tilgange består af methanol-baserede væv dehydrering og delipidation efterfulgt af optisk clearing med BABB. Tilgangen blev udviklet for mere end 100 år siden og har flere ændringer. I vores arbejde bruger vi den enkleste ændring, der blev beskrevet af Scott et al. 15 En sådan fremgangsmåde er optimal til brug med fluorescerende mærkede patogener. Desuden er fluorochromes med høj fotostability at foretrække for langvarig billeddannelse. Desværre er visualisering af transgen TdTomato A. fumigatus conidia ikke mulig ved hjælp af denne metode på grund af TdTomatos høje følsomhed over for BABB (data vises ikke). Den tilgang, vi beskriver her, muliggør således vellykket påvisning af hvile eller faste patogener, men kan ikke bruges til billeddannelse af voksende A. fumigatus conidia eller hyphae. Derudover er den immunokemiske farvning af prøven med de høj-affinitetsbindingsstoffer at foretrække. Således stod vi også over for problemer med at forsøge at anvende de fluorescerende mærkede antistoffer til at visualisere kar og lymfe i hele monterede lungelappeprøver. Men Scott et al. 15 visualiserede nervefibre ved hjælp af to-trins farvning med antistoffer mod PGP 9,5. Dette indikerer, at nogle antistoffer kan bruges til farvning med følgende optiske clearing ved hjælp af BABB. Vi mistede også lysstofrøret fra 0,1 μm fluorescerende latexpartikler efter BABB-rydning, mens brugen af clearingforstærket 3D-clearingopløsning (Ce3D)18 ikke påvirkede partiklernes lysstofrør.
I den nuværende tilgang bruger vi streptavidin til at mærke luftveje. Streptavidin binder endogen biotin, der anses for at være udtrykt i Clara celler (og alveolar type II epitelceller i mindre grad)20. Som Clara celler (også kendt som Club celler) i mangel af betændelse opholde sig i bronchi og bronchioles, men ikke i alveolar rum, streptavidin farvning visualiserer kun bronchiale grene. Derfor blev alle conidia uden for de streptavidin-mærkede luftveje i den nuværende metode bestemt som værende placeret i alveolarrummet. For at opnå en mere præcis påvisning af conidia-placeringen bør deranvendesnogle andre luftvejsmarkører, f.eks. Hvis det er nødvendigt at bruge antistoffer Ce3D eller tredimensionel billeddannelse af opløsningsmiddelbehandlede organer (3DISCO) 19 teknikker, er19 teknikker mere hensigtsmæssige end BAAB-baseret optisk clearing. Babb optisk clearing er imidlertid den mest enkle og tidskrævende tilgang og er derfor den mest fordelagtige for den på forhånd fluorescerende mærkede conidia-detektion i mærket med streptavidin luftveje.
3D-billeddannelse af musens lunger kan også udføres ved hjælp af optisk projektionstomografi integreret mikroskopi3. På grund af begrænsningen i tomografiopløsningen er CLSM imidlertid mere egnet til samtidig billeddannelse af luftvejene og 3 μm conidia. I vores tilfælde ses et enkelt konidium som en pixel. Behandlingen af sådanne billeder gjorde det muligt at kvantificere conidia i og uden for bronkialgrenene. Metoden kan også anvendes til at sammenligne anatomisk conidia-fordeling i de immunkompetente og immunkompromitterede mus. Tilgangen kan også bruges til at estimere conidia-elimineringens kinetik fra musenes luftveje. Desuden kombinationen af tilgangen af hele luftvejene morfetometri, der blev udviklet af Scott et al. 15 med algoritmen til upartisk conidia kvantitative analyse kan være nyttige i den nøjagtige placering af A. fumigatus conidia og andre partikler af tilsvarende størrelse i forskellige generationer af bronkial træ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne rapporterer ingen interessekonflikter i dette arbejde.
Acknowledgments
Forfatterne takker professor Sven Krappmann (Universitetshospitalet Erlangen og FUA Erlangen-Nürnberg, Tyskland) for at have leveret Aspergillus fumigatus conidia-stammen AfS150. Forfatterne takker MIPT Press Office. V.B. anerkender Den Russiske Føderations ministerium for videnskab og videregående uddannelse (#075-00337-20-03, projekt FSMG-2020-0003). Arbejdet vedrørende A. fumigatus conidia imaging og kvantificering blev støttet af RSF nr. Arbejdet med luftvejes billeddannelse blev understøttet af RFBR nr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 NHS Ester | ThermoFisher | A20004 | |
| Aspergillus fumigatus conidia | ATCC | 46645 | The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative |
| Benzyl alcohol | Panreac | 141081.1611 | 98.0-100 % |
| Benzyl benzoate | Acros | AC10586-0010 | 99+% |
| C57Bl/6 mice | Pushchino Animal Breeding Centre (Russia) | Male. 12 - 30 week old. | |
| Catheter | Venisystems | G715-A01 | 18G |
| Cell imaging coverglass-bottom chamber | Eppendorf | 30742028 | 4 or 8 well chamber with coverglass bottom |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Any centrifuge provided 1000 g can be used |
| Confocal laser scanning microscope | ZEISS | ZEISS LSM780 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | ≥99.9% |
| FIJI image processing package | FIJI | Free software | |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD557R | Toothed |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD321R | Fine-tipped |
| Forcep | Bochem | 1727 | Smooth |
| Glass bottle | DURAN | 242101304 | With ground-in lid |
| Graphic Editor Photoshop | Adobe Inc | Adobe Photoshop CS | |
| GraphPad Software | GraphPad | Prism 8 | |
| Imaris Microscopy Imaging Software | Oxford Instruments | Free trial is available https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial | |
| Isoflurane | Karizoo | ||
| NaHCO3 | Panreac | 141638 | |
| Objective | ZEISS | 420640-9800-000 | Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS | Paneco | P060Π | |
| Pipette | ProLine | 722020 | 5 to 50 μL |
| Powdered milk | Roth | T145.2 | |
| Sample mixer | Dynal | MXIC1 | |
| Scissors | B. Braun | BC257R | Blunt |
| Shaker | Apexlab | GS-20 | 50-300 rpm |
| Skalpel | Bochem | 12646 | |
| Silk thread | B. Braun | 3 USP | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Test tube | SPL Lifesciences | 50050 | 50 mL |
| Tris (hydroxymethyl aminomethane) | Helicon | H-1702-0.5 | Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1 |
| Triton X-100 | Amresco | Am-O694-0.1 | |
| ZEN microscope software | ZEISS | ZEN2012 SP5 | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html |
References
- O'Gorman, C. M. Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis. Fungal Biology Reviews. 25 (3), 151-157 (2011).
- Hyde, D. M., et al. Asthma: A comparison of animal models using stereological methods. European Respiratory Review. 15 (101), 122-135 (2006).
- Alanis, D. M., Chang, D. R., Akiyama, H., Krasnow, M. A., Chen, J. Two nested developmental waves demarcate a compartment boundary in the mouse lung. Nature Communications. 5, (2014).
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Donohue, J. F. Targeted drug-aerosol delivery in the human respiratory system. Annual Review of Biomedical Engineering. 10, (2008).
- Bustamante-Marin, X. M., Ostrowski, L. E.
- Fröhlich, E., Salar-Behzadi, S. Toxicological assessment of inhaled nanoparticles: Role of in vivo, ex vivo, in vitro, and in Silico Studies. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4795-4822 (2014).
- Patel, V. I., Metcalf, J. P. Airway macrophage and dendritic cell subsets in the resting human lung. Critical Reviews in Immunology. 38 (4), 303-331 (2018).
- Bogorodskiy, A. O., et al. Murine intraepithelial dendritic cells interact with phagocytic cells during Aspergillus fumigatus-Induced Inflammation. Frontiers in Immunology. 11, (2020).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous fuman fungal pathogen. PLoS Pathogens. 9 (12), 1-4 (2013).
- Overton, N., Gago, S., Bowyer, P. Immunogenetics of chronic and allergic aspergillosis. Immunogenetics of Fungal Diseases. , 153-171 (2017).
- Thiesse, J., et al. Lung structure phenotype variation in inbred mouse strains revealed through in vivo micro-CT imaging. Journal of Applied Physiology. 109 (6), 1960-1968 (2010).
- Tochigi, N., et al. Histopathological implications of Aspergillus infection in lung. Mediators of Inflammation. 2013, (2013).
- Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin rodA. PLoS Pathogens. 6 (4), 1-18 (2010).
- Shevchenko, M. A., et al. Aspergillus fumigatus infection-induced neutrophil recruitment and location in the conducting airway of immunocompetent, neutropenic, and immunosuppressed mice. Journal of Immunology Research. 2018, 5379085 (2018).
- Scott, G. D., Blum, E. D., Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Tissue optical clearing, three-dimensional imaging, and computer morphometry in whole mouse lungs and human airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 1 (51), 43-55 (2014).
- Amich, J., et al. Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-aspergillus fumigatus interactions. mBio. 11 (1), (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. High-dimensional cell-level analysis of tissues with Ce3D multiplex volume imaging. Nat Protoc. 14 (6), 1708-1733 (2019).
- Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J Vis Exp. (89), e51382 (2014).
- Kuhn, C. Biotin stores in rodent lungs: Localization to Clara and type II alveolar cells. Experimental Lung Research. 14 (4), 527-536 (1988).
