Summary
Descrevemos o método de análise quantitativa da distribuição de Aspergillus fumigatus conidia (3 μm de tamanho) nas vias aéreas dos camundongos. O método também pode ser utilizado para a análise de micropartículas e distribuição de nanopartículas nas vias aéreas em vários modelos de condições patológicas.
Abstract
Aspergillus fumigatus conidia são patógenos aéreos que podem penetrar nas vias aéreas humanas. Pessoas imunocompetntes sem alergias apresentam resistência e tolerância imunológica, enquanto em pacientes imunocomprometidos, a conidia pode colonizar as vias aéreas e causar distúrbios respiratórios graves. Várias células em diferentes compartimentos das vias aéreas estão envolvidas na resposta imune que previne a invasão fúngica; no entanto, os aspectos espátulais-temporais da eliminação do patógeno ainda não são completamente compreendidos. Imagens tridimensionais (3D) de órgãos de montagem total eliminados opticamente, particularmente os pulmões de camundongos experimentais, permitem a detecção de patógenos fluorescentes rotulados nas vias aéreas em diferentes pontos de tempo após a infecção. No presente estudo, descrevemos uma configuração experimental para realizar uma análise quantitativa da distribuição de A. fumigatus conidia nas vias aéreas. Usando microscopia de varredura a laser confocal fluorescente (CLSM), rastreamos a localização de conidia fluorescente rotulada nos ramos brônquicos e no compartimento alveolar 6 horas após a aplicação do orofaringe aos ratos. A abordagem aqui descrita foi previamente utilizada para detecção da localização precisa do patógeno e identificação das células que interagem com patógenos em diferentes fases da resposta imune. A configuração experimental pode ser usada para estimar a cinética da eliminação do patógeno em diferentes condições patológicas.
Introduction
Diariamente, as pessoas inalam patógenos transmitidos pelo ar, incluindo esporos de fungos oportunistas Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) que podem penetrar no trato respiratório1. O trato respiratório dos mamíferos é um sistema de vias aéreas de diferentes gerações que se caracterizam pelas diferentes estruturas das paredes das vias aéreas2,3,4. As paredes traqueobronquiais consistem em vários tipos de células entre as quais estão células ciliadas que fornecem o desembaraço mucociliar5. Nos alvéolos, não há células ciliadas e os patógenos espaciais alveolares penetrantes não podem ser eliminados pelo desembaraço mucociliary6. Além disso, cada geração de vias aéreas é um nicho para múltiplas populações de células imunes e subconjuntos dessas populações são únicos para certos compartimentos das vias aéreas. Assim, os macrófagos alveolares residem nos compartimentos alveolares, enquanto tanto a traqueia quanto as vias aéreas condutoras são forradas com as células dendríticas intraepitheliais7,8.
O tamanho aproximado de A. fumigatus conidia é de 2-3,5 μm9. Uma vez que o diâmetro das pequenas vias aéreas em humanos e até mesmo em camundongos excede 3,5 μm, foi sugerido que a conidia pode penetrar no espaço alveolar2,10,11. De fato, o exame histológico mostrou o crescimento fúngico nos alvéolos dos pacientes que sofrem de aspergillose12. Conidia também foi detectada nos alvéolos de camundongos infectados usando imagens vivas das fatias de pulmão espessas13. Simultaneamente, conidia foi detectada no lado luminal do epitélio brônquico dos camundongos14.
A imagem tridimensional (3D) dos pulmões do rato de montagem total eliminados opticamente permite a análise morfométrica das vias aéreas15. Particularmente, a análise quantitativa da distribuição visceral do nervo pleural foi realizada utilizando amostras de pulmão de camundongos adequadamente limpas15. Recentemente, Amich et al.16 investigaram o crescimento fúngico após a aplicação intranasal de conídio aos camundongos imunocomprometidos usando uma microscopia de fluorescência de folhas leves de amostras pulmonares de camundongos eliminados opticamente. A localização precisa da conidia de repouso nas vias aéreas em diferentes pontos de tempo após a infecção é importante para identificar as populações celulares que podem fornecer defesa antifúngica suficiente em determinadas fases de inflamação. No entanto, devido ao tamanho relativamente pequeno, os aspectos espástico-temporais da distribuição de A. fumigatus conidia nas vias aéreas são mal caracterizados.
Aqui, apresentamos uma configuração experimental para a análise quantitativa da distribuição de A. fumigatus conidia nas vias aéreas de camundongos infectados. Usando microscopia de varredura a laser confocal fluorescente (CLSM) de pulmões opticamente limpos de camundongos que receberam uma aplicação orofaríngea da A. fumigatus conidia fluorescente, obtemos imagens 3D e realizamos o processamento da imagem. Usando imagens 3D do lobo pulmonar de todo o monte, já mostramos anteriormente a distribuição de A. fumigatus conidia nas vias aéreas condutoras de camundongos 72 horas após a aplicação conidia8.
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Protocol
Todos os métodos relativos aos animais de laboratório descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) no Instituto Shemyakin e Ovchinnikov de Química Bioorgânica, Academia Russa de Ciências (protocolo número 226/2017).
1. A. aplicação de conidia fumigatus
- Para obter fluorescentemente rotulado A. fumigatus conidia, fixe 5 × 108 conidia adicionando 1 mL de 3% de paraformaldeído à pelota conidia. Incubar em um tubo de ensaio de 50 mL por 2 h em um shaker à temperatura ambiente.
- Lave conidia com 20 mL de soro fisco tampão de fosfato (PBS): centrífuga a 1.000 x g por 15 min, remova suavemente o sobrenante e adicione PBS fresco em um volume de 20 mL. Repetir.
- Dissolva a conidia em 900 μL de 0,1 M NaHCO3.
- Dissolva o éster succinimidil do corante fluorescente de 594 nm em 100 μL de sulfoxida de dimetila e adicione à conidia.
- Incubar a conidia com o corante por 1h em um shaker a 150 rpm em temperatura ambiente.
- Lave a conidia duas vezes com 20 mL de PBS na centrífuga a 1.000 x g por 15 min.
- Diluir a conidia a uma concentração de 1 × 108 conidia/mL na PBS e armazenar a 4 °C.
- Anestesiar o rato com vapor isoflurane de 0,5-3%. Coloque o mouse no suporte, conserte a língua com fórceps lisos e segure as nares. Pegue uma pipeta de canal único e aplique 50 μL de suspensão conidia à faringe do mouse. Espere até a suspensão ser inalada.
2. Preparação de espécimes
- Prepare o tubo de ensaio de 50 mL e preencha-o com 15 mL de paraformaldeído fresco de 2%. Coloque os instrumentos médicos (fórceps de dissecação de 15 cm, fórceps de ponta fina de 8 cm e tesoura de 10 cm com extremidades cegas) em solução de 70% de etanol.
- Eutanize o mouse de acordo com o protocolo IACUC. Em seguida, coloque o rato na posição dorsal e fixe as patas do rato com agulhas.
NOTA: Se usar luxação cervical para eutanásia, certifique-se da integridade da traqueia.- Trate o mouse com 70% de etanol usando um pulverizador.
- Faça um corte longitudinal mediano na pele ventral das patas traseiras para as patas dianteiras e o queixo.
- Separe a pele do tecido subcutâneo usando fórceps dentados e tesouras fechadas. Conserte as extremidades superiores da pele com agulhas.
- Faça uma incisão na parede abdominal e separe o fígado do diafragma. Escolha cuidadosamente o diafragma com uma tesoura fechada e corte o diafragma.
- Faça um corte medial dos tecidos conjuntivos do tórax e pescoço até que a traqueia seja visível.
- Passe um fio de seda sob a traqueia e faça um nó cirúrgico usando dois fórceps.
NOTA: Alternativamente, use fio dental em vez de fio dental.- Puxe cuidadosamente a rosca e corte os pulmões do tecido conjuntivo com uma tesoura. Segure a tesoura perpendicular à mesa.
- Coloque os pulmões no tubo de ensaio de 50 mL com 2% de paraformaldeído. Deixe as extremidades da rosca fora do tubo, coloque a tampa apertada e vire o tubo para cobrir os pulmões com paraformaldeído. Segure os pulmões durante a noite a 4 °C.
- Disseca os lóbulos pulmonares do coração e uns dos outros com um bisturi.
- Coloque os lóbulos pulmonares em uma placa de 24 poços, com cada lóbulo em um poço separado. Lave os lóbulos pulmonares em 1 mL de soro fisiológico tris-tampão (TBS) pH 7.4, 5 vezes por 1 h cada em um shaker a 150 rpm.
- Substitua 1 mL de TBS por 1 mL do tampão de bloqueio (1% Triton X 100, 5% de leite em pó em TBS) e deixe a amostra durante a noite em temperatura ambiente em um shaker.
- Substitua o tampão de bloqueio por 1 mL de streptavidin-488-nm conjugado fluorcromo diluído 1:30 em TBS. Deixe o espécime por pelo menos 72 h em temperatura ambiente em um shaker (150 rpm).
- Lave a amostra 5 vezes por 1 h cada em 1 mL de TBS à temperatura ambiente em um agitador (150 rpm). Transfira a amostra para os novos poços e cubra-a com 2% de paraformaldeído durante a noite a 4 °C para pós-fixação.
3. Limpeza óptica do lobo pulmonar do rato
- Coloque o espécime na garrafa de vidro de 5 mL preenchida com 3 mL de solução de água de metanol de 50% e coloque-o na batedeira de amostra em temperatura ambiente por 1h.
- Substitua 3 mL de 50% de metanol por 3 mL de 100% de metanol e coloque-o no misturador de amostras por 2h. Prepare uma mistura de 1:2 v/v de álcool benzílico e benzoato benzílico (BABB) em um volume total de 1 mL.
- Transfira o espécime para uma placa de 24 poços e cubra com 1 mL de mistura BABB por pelo menos 30 min. Não deixe o espécime no BABB por muito tempo; BABB pode danificar a placa de plástico e tornar o espécime muito rígido.
- Coloque o espécime na câmara de cobertura de imagens celulares. A amostra está pronta para a imagem.
4. Imagem do lobo pulmonar do rato com CLSM
- Ligue o sistema de microscópio. Abra o software do microscópio. Acenda a luz de transmissão na guia Localizar. Selecione o objetivo de 10x.
NOTA: Para uma análise mais detalhada, use o objetivo de 20x, mas aumenta o tempo do experimento e o tamanho do arquivo de imagem. - Coloque a câmara com o espécime no porta-slides. Coloque o suporte no estágio XY sobre o objetivo. Centralizar o espécime usando os controles XY do palco em cima do objetivo. Use a luz de transmissão e a ocular para encontrar manualmente o espécime Z-plane.
- Mude o software para a guia Aquisição. Selecione o modo CLSM λ.. Ligue os lasers de 488 nm e 561 nm. Selecione o espelho dicrómico 488/561 nm. Mude a faixa espectral do detector para 490-695 nm. Ajuste a potência do laser à faixa apropriada (10-50 μW). Ajuste o ganho do detector entre 750-900.
NOTA: As configurações de ganho mais altas são indesejáveis devido ao ruído. - Reduza o pinhole para 1 Unidade arejada clicando no botão 1 AU. Defina a resolução do pixel para 512 × 512 pixels.
- Ligue o modo Z-stack. Iniciar imagens ao vivo. Selecione o plano focal no qual ambos os corantes são visíveis.
NOTA: Se necessário, ajuste a potência do laser para normalizar o brilho dos dois corantes fluorescentes. Use o modo Galeria e Single-channel, para evitar o recorte e para combinar com precisão a intensidade da fluorescência. - Expanda o painel z-stack apareceu. Use a roda de foco e encontre o plano mais baixo da amostra. Use o primeiro botão no painel Z-stack. Mova o plano focal para cima para encontrar o limite superior do espécime e salve a posição usando o botão Último. Verifique a representação da profundidade da amostra no painel de pilha Z.
NOTA: Uma representação da profundidade da amostra aparecerá no painel de pilha de Z após a primeira e as últimas posições serem escolhidas. - Posicione o objetivo usando a roda de foco perto da parte inferior do espécime, olhando para o painel z-stack. Isto é aproximadamente 20 μm do fundo do espécime.
- Desligue o modo Z-stack e ligue o modo de varredura de ladrilhos. Adquira a imagem com um número adequado de telhas para o tamanho do espécime. 5 × 5 telhas são um bom ponto de partida.
- Ajuste o número de telhas e a posição XY da amostra até que todo o pulmão se encaixe dentro da imagem de ladrilho. Verifique novamente a correção das posições de pilha Z com a posição XY recém-obtida no centro da amostra.
- Ligue os modos Z-stack e Tile Scan. Definir passo Z (em painel z-stack) a 5 μm. Defina a velocidade de varredura para 6. Ligue a função Autosave. Ligue a opção Salvar telhas separadas. Diga o arquivo. Pressione o botão Iniciar experimento.
- Verificar se o experimento não excede o tempo alocado no microscópio; se assim for - ajuste a velocidade.
NOTA: O tamanho aproximado do arquivo é superior a 10 Gb; certifique-se de que há espaço suficiente no disco rígido.
5. Descompra e costura espectral
- Use o software para o processamento inicial da imagem. Para descompração espectral, selecione a opção Descompração. Selecione duas regiões correspondentes ao streptavidin/airways e conidia para adquirir o espectro da imagem. Clique em Iniciar Desmixing.
NOTA: Alternativamente, utilize os espectros existentes para fluorocromes de 488 e 594 nm. - Abra o arquivo para o processamento da imagem e selecione a guia Processamento. Na seção Métodos, selecione Geométrico e Costura . Na seção Parâmetro, selecione a nova saída e marque a opção Azulejos de Fusíveis. Use o modo de referência com o canal selecionado correspondente à fluorescência das vias aéreas. Aplique a Costura clicando em Aplicar.
6. Processamento de imagem: renderização de superfície
- Abra a imagem como uma exibição 3D de superação. Crie uma superfície das vias aéreas usando a opção Superfície para o canal que foi usado para a visualização das vias aéreas. Escolha o parâmetro Desválico de 10 μm.
NOTA: Escolha também o valor do limiar automático. - Inspecione visualmente a superfície. Escolha os limiares para reduzir o sinal de saída. Remova as superfícies da pleura e vasos.
- Crie uma máscara para a superfície das vias aéreas usando as opções Editar e Mascarar Tudo. Selecione o canal das vias aéreas e defina Voxels fora da superfície para 0,001.
- Salve o arquivo com a máscara das vias aéreas como uma série TIFF para a pasta. Salve o arquivo com o canal conidia como uma série TIFF para a pasta separada.
7. Processamento de imagem: correção da máscara
- Abra o arquivo com a máscara das vias aéreas em uma plataforma de código aberto para análise de imagens biológicas17 como uma imagem de 8 bits. Torne a imagem binária clicando em Process | | binário Faça binário.
NOTA: Se necessário, corrija a máscara: remova as superfícies excessivas usando a seleção do Polígono e exclua a guia Excluir. Alternativamente, utilize a Ferramenta de Enchimento de Inundação. - Desenhe as superfícies ausentes usando várias vezes Dilate (3D): clique em Plugins | | processos Dilatação (3D). Preencha os orifícios clicando em Process | | binário Preencher furos. Use a interpolação do gerenciador de seleção e roi para preencher os orifícios residuais na máscara manualmente. Aplique várias opções de Erode (3D) (Plugins | | processos Erosão (3D)) para reemplar a espessura da máscara.
NOTA: Crie macros usando plugins | As opções de macros para várias repetições de Dilate (3D) e Erode (3D).
Certifique-se de que o número de erode (3D) seja igual ao número de aplicações dilatados (3D). - Salve a máscara em uma nova pasta como uma série TIFF.
8. Análise quantitativa conidia
- Abra o aplicativo na plataforma de programação e computação numérica: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/84525-conidia_counter.
- Pressione o botão Adicionar arquivos. Selecione a pasta da máscara das vias aéreas e a pasta conidia.
- Estabeleça um limite personalizado entre 0 e 1. Pressione o botão OK.
- Salve a tabela de saída para o arquivo .xls personalizado.
- Analise os dados com software para análise estatística.
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Representative Results
Seguindo o protocolo acima, obteve-se a imagem 3D mostrando as vias aéreas e A. fumigatus conidia no lobo pulmonar de um rato (Figura 1A). Streptavidin (que foi usado para visualização de vias aéreas) rotulou brônquios e brônquios15. Além disso, os vasos de grande porte, que são facilmente distinguíveis das vias aéreas por sua morfologia, e pleura são visualizados no canal das vias aéreas(Figura 1A-C). A criação da superfície das vias aéreas e da máscara permitiram a remoção da embarcação e as projeções de pleura no canal das vias aéreas; no entanto, a integridade da superfície das vias aéreas é destruída devido ao fraco sinal de streptavidina em vários ramos brônquicos(Figura 1B-C). O processamento posterior da máscara das vias aéreas permite o reparo dos fragmentos faltantes(Figura 1D).
A distribuição de A. fumigatus conidia nos pulmões dos camundongos foi estimada usando os lobos pulmonares superiores esquerdo ou direito em diferentes pontos de tempo após a aplicação da conidia. Para o lobo pulmonar superior direito, a imagem consiste em aproximadamente 30 telhas e cerca de 250 Z-stacks. Após a costura, a imagem adquirida com a resolução 512 × 512 tinha um tamanho de imagem de 2360 × 2815 pixels e o tamanho de um pixel é de 2,77 μm × 2,77 μm, o que é comparável com o tamanho de A. fumigatus conidia que é de 2-3,5 μm9.
A imagem ampliada da região das vias aéreas distal demonstra que a detecção da localização precisa da conídio (dentro ou fora dos ramos brônquicos) é bastante difícil devido à complexidade da imagem e ao pequeno tamanho da conidia em relação ao tamanho das vias aéreas(Figura 2A). Exame preciso revelou que conidia estava localizada dentro e fora dos ramos brônquicos(Figura 2B-C).
As configurações limiares do canal conidia influenciam muito o número resultante de conidia (Figura 2B-C). Para fazer a análise quantitativa imparcial desenvolvemos um aplicativo na plataforma de programação e computação numérica que permite estimar o número de conidia dentro e fora da máscara das vias aéreas, evitando a configuração do limiar manual. O aplicativo atua com base no algoritmo a seguir. Primeiro, o canal conidia é segmentado em uma pilha binária de imagens 3D usando um valor de limiar ideal. Como foi descrito acima, a resolução de imagem selecionada permite a identificação de um conidium como um pixel. O uso de streptavidin para rotulagem de vias aéreas permite a visualização de brônquios, mas nãoalvéolos 15. Portanto, conidia residente em brônquios são definidos como pixels conidia dentro da máscara das vias aéreas, enquanto conidia residente em alvéolos são definidos como pixels conidia fora da máscara das vias aéreas. Considerando isso, na próxima etapa do algoritmo, é realizada uma operação binária e e para a imagem da máscara das vias aéreas e a imagem conidia para extrair pixels de conidia que residem em brônquios. Da mesma forma, os pixels conidia restantes são extraídos para obter o número de conidia em alvéolos. A porcentagem resultante de conidia em brônquios e alvéolos em relação à quantidade global de conídio no pulmão é apresentada no gráfico de barras e na tabela de saída da interface do usuário do aplicativo.
Por meio dessa abordagem, foi realizada a análise quantitativa da distribuição de conidia nas vias aéreas dos camundongos para o ponto de tempo de 6 horas após a aplicação da conidia(Figura 2D). Os dados sugerem que, após a aplicação orofaríngea, a maioria das conidias penetram no espaço alveolar e se localizam lá no início da resposta imune inflamatória.
Figura 1. O princípio do processamento de imagens das vias aéreas. (A) imagem 3D do lobo pulmonar superior direito de um rato, 24 horas após a aplicação conidia mostrando estruturas ricas em biotina (streptavidin, branco) e A. fumigatus conidia (magenta). As naves grandes e positivas steptavidin são indicadas com setas finas. (B,C) A superfície (verde) e a máscara (laranja) para as vias aéreas. Os fragmentos das vias aéreas que faltam na superfície e a máscara são indicados com setas; as estruturas excessivas com pontas de flecha. Barra de escala é de 1000 μm. (D) A máscara das vias aéreas após as correções. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Processamento de imagem conidia e análise quantitativa. (A) Imagem ampliada das vias aéreas distais (Streptavidin, tons cinzentos) e A. fumigatus conidia (magenta) que são apresentadas na Figura 1A. Barra de escala é de 300 μm B, C. A imagem arbitr arbitrária ampliada em caixas (A) é representada como uma fatia Z com um limiar alto (B) e um baixo valor de limiar(C). Conidia dentro das vias aéreas são indicadas com flechas, e fora com pontas de flecha. Barra de escala é de 150 μm. (D) Análise quantitativa da conídia nos ramos brônquicos e no espaço alveolar. Os dados são mostrados como a faixa mediana e interquartil para 4 camundongos, 6 h depois de receber A. fumigatus conidia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A imagem 3D de órgãos inteiros permite a obtenção dos dados sem dissecção da amostra, o que é de grande importância para investigar os aspectos espaciais da distribuição anatômica do patógeno no organismo. Existem várias técnicas e modificações de limpeza óptica tecidual que ajudam a superar a dispersão da luz laser e permitem imagens de órgãos inteiros15,16,18,19. Uma das abordagens personalizadas de limpeza de tecidos consiste em desidratação e delipidação de tecidos à base de metanol, seguida de limpeza óptica com BABB. A abordagem foi desenvolvida há mais de 100 anos e tem várias modificações. Em nosso trabalho, usamos a modificação mais simples que foi descrita por Scott et al. 15 Tal abordagem é ideal para o uso com patógenos rotulados fluorescentemente. Além disso, os fluorochromes com alta fotoestabilidade são preferíveis para imagens prolongadas. Infelizmente, a visualização do TdTomato A. transgênico não é possível usar esse método, devido à alta sensibilidade do TdTomato ao BABB (dados não mostrados). Assim, a abordagem que descrevemos aqui permite a detecção bem sucedida de patógenos de repouso ou fixos, mas não pode ser usada para imagens de crescimento de A. fumigatus conidia ou hifa. Além disso, é preferível a coloração imunohistoquímica do espécime com as substâncias de ligação de alta afinidade. Assim, também enfrentamos problemas para tentar aplicar os anticorpos fluorescentes rotulados para visualizar vasos e linfáticos em amostras de lobo pulmonar de montagem inteira. No entanto, Scott et al. 15 fibras nervosas visualizadas utilizando coloração em duas etapas com anticorpos contra PGP 9.5. Isso indica que alguns anticorpos podem ser usados para coloração com a seguinte clareira óptica usando BABB. Também perdemos o sinal fluorescente das partículas de látex fluorescentes de 0,1 μm após a limpeza do BABB, enquanto o uso da solução de limpeza 3D (Ce3D)aprimorada não afetou o sinal fluorescente das partículas.
Na abordagem atual, usamos streptavidin para rotular as vias aéreas. Streptavidin liga biotina endógena que é considerada expressa em células claras (e as células epiteliais tipo Alveolar II em menor grau)20. Como as células Clara (também conhecidas como células do Clube) na ausência de inflamação residem nos brônquios e brônquios, mas não no compartimento alveolar, a coloração de streptavidin visualiza apenas ramos brônquicos. Portanto, na abordagem atual, todas as conidia fora das vias aéreas com etiqueta streptavidin foram determinadas como sendo localizadas no espaço alveolar. Para a detecção mais precisa da localização da conidia, alguns outros marcadores das vias aéreas, como sox9, devem ser usados3. No caso, quando o uso de anticorpos for necessário, as imagens ce3D ou tridimensionais de órgãos desmatados com solventes (3DISCO)19 são mais apropriadas do que a compensação óptica baseada em BAAB. No entanto, a limpeza óptica babb é a abordagem mais simples e demorada, e, portanto, é a mais vantajosa para a detecção de conidia fluorescente com antecedência no marcado com as vias aéreas streptavidin.
A imagem 3D dos pulmões do camundongo também pode ser realizada usando a microscopia integrada de projeção óptica3. No entanto, devido à limitação na resolução da tomografia, o CLSM é mais adequado para a imagem simultânea das vias aéreas e conidia de 3 μm. No nosso caso, um único conidium é visto como um pixel. O processamento dessas imagens permitiu quantificação de conidia dentro e fora dos ramos brônquicos. O método também pode ser aplicado para comparar a distribuição de cíddia anatômica nos camundongos imunocompetuntes e imunocomprometidos. A abordagem também pode ser utilizada para estimar a cinética da eliminação da conidia das vias aéreas dos camundongos. Além disso, a combinação da abordagem de toda a morfometria das vias aéreas que foi desenvolvida por Scott et al. 15 com o algoritmo para análise quantitativa conidia imparcial pode ser útil na localização precisa de A. fumigatus conidia e outras partículas de tamanho comparável em diferentes gerações da árvore brônquica.
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Disclosures
Os autores não relatam conflitos de interesse neste trabalho.
Acknowledgments
Os autores agradecem ao Prof. Sven Krappmann (Hospital Universitário Erlangen e FUA Erlangen-Nürnberg, Alemanha) por fornecer a cepa Aspergillus fumigatus conidia AfS150. Os autores agradecem a Assessoria de Imprensa do MIPT. V.B. reconhece o Ministério da Ciência e Educação Superior da Federação Russa (#075-00337-20-03, projeto FSMG-2020-0003). O trabalho relativo à A. fumigatus conidia e quantificação foi apoiado pela RSF nº 19-75-00082. O trabalho de imagem das vias aéreas foi apoiado pela RFBR nº 20-04-60311.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 NHS Ester | ThermoFisher | A20004 | |
| Aspergillus fumigatus conidia | ATCC | 46645 | The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative |
| Benzyl alcohol | Panreac | 141081.1611 | 98.0-100 % |
| Benzyl benzoate | Acros | AC10586-0010 | 99+% |
| C57Bl/6 mice | Pushchino Animal Breeding Centre (Russia) | Male. 12 - 30 week old. | |
| Catheter | Venisystems | G715-A01 | 18G |
| Cell imaging coverglass-bottom chamber | Eppendorf | 30742028 | 4 or 8 well chamber with coverglass bottom |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Any centrifuge provided 1000 g can be used |
| Confocal laser scanning microscope | ZEISS | ZEISS LSM780 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | ≥99.9% |
| FIJI image processing package | FIJI | Free software | |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD557R | Toothed |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD321R | Fine-tipped |
| Forcep | Bochem | 1727 | Smooth |
| Glass bottle | DURAN | 242101304 | With ground-in lid |
| Graphic Editor Photoshop | Adobe Inc | Adobe Photoshop CS | |
| GraphPad Software | GraphPad | Prism 8 | |
| Imaris Microscopy Imaging Software | Oxford Instruments | Free trial is available https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial | |
| Isoflurane | Karizoo | ||
| NaHCO3 | Panreac | 141638 | |
| Objective | ZEISS | 420640-9800-000 | Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS | Paneco | P060Π | |
| Pipette | ProLine | 722020 | 5 to 50 μL |
| Powdered milk | Roth | T145.2 | |
| Sample mixer | Dynal | MXIC1 | |
| Scissors | B. Braun | BC257R | Blunt |
| Shaker | Apexlab | GS-20 | 50-300 rpm |
| Skalpel | Bochem | 12646 | |
| Silk thread | B. Braun | 3 USP | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Test tube | SPL Lifesciences | 50050 | 50 mL |
| Tris (hydroxymethyl aminomethane) | Helicon | H-1702-0.5 | Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1 |
| Triton X-100 | Amresco | Am-O694-0.1 | |
| ZEN microscope software | ZEISS | ZEN2012 SP5 | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html |
References
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