Summary
Vi beskriver metoden for kvantitativ analyse av fordelingen av Aspergillus fumigatus conidia (3 μm i størrelse) i musenes luftveier. Metoden kan også brukes til analyse av mikropartikler og nanopartikkelagglomeratfordeling i luftveiene i ulike patologiske tilstandsmodeller.
Abstract
Aspergillus fumigatus conidia er luftbårne patogener som kan trenge inn i menneskelige luftveier. Immunotokmpente mennesker uten allergier viser motstand og immunologisk toleranse, mens hos immunkompromitterte pasienter kan conidia kolonisere luftveiene og forårsake alvorlige invasive luftveissykdommer. Ulike celler i forskjellige luftveisrom er involvert i immunresponsen som forhindrer soppinvasjon; Imidlertid er de romlige-temporale aspektene ved patogen eliminering fortsatt ikke helt forstått. Tredimensjonal (3D) avbildning av optisk ryddede helmonterte organer, spesielt lungene til eksperimentelle mus, tillater påvisning av fluorescerende merkede patogener i luftveiene på forskjellige tidspunkter etter infeksjon. I den nåværende studien beskriver vi et eksperimentelt oppsett for å utføre en kvantitativ analyse av A. fumigatus conidia distribusjon i luftveiene. Ved hjelp av fluorescerende konfikal laserskanningsmikroskopi (CLSM) sporet vi plasseringen av fluorescerende merket conidia i bronkialgrenene og alveolarrommet 6 timer etter orofaryngeal anvendelse på mus. Tilnærmingen beskrevet her ble tidligere brukt til påvisning av nøyaktig patogenplassering og identifisering av patogeninteragerende celler i forskjellige faser av immunresponsen. Det eksperimentelle oppsettet kan brukes til å estimere kinetikken til patogen eliminering under forskjellige patologiske forhold.
Introduction
På daglig basis inhalerer folk luftbårne patogener, inkludert sporer av opportunistiske sopp Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) som kan trenge inn i luftveiene1. Luftveiene til pattedyr er et system av luftveier av forskjellige generasjoner som er preget av de forskjellige strukturene i luftveisveggene2,3,4. Trakeobronkiale vegger består av flere celletyper blant annet ciliated celler som gir mucociliary clearance5. I alveolene er det ingen cilierte celler, og de gjennomtrengende alveolarrompatogenene kan ikke elimineres ved mucociliary clearance6. Videre er hver luftveisgenerasjon en nisje for flere immuncellepopulasjoner, og undergrupper av disse populasjonene er unike for visse luftveisrom. Dermed ligger alveolar makrofager i alveolarrommene, mens både luftrøret og ledende luftveier er foret med de intraepitheliale dendritiske cellene7,8.
Den omtrentlige størrelsen på A. fumigatus conidia er 2-3,5 μm9. Siden diameteren av små luftveier hos mennesker og til og med hos mus overstiger 3,5 μm, ble det foreslått at conidia kan trenge inn i alveolarrommet2,10,11. Faktisk viste histologisk undersøkelse soppveksten i alveolene til pasientene som lider av aspergillose12. Conidia ble også påvist i alveolene av infiserte mus ved hjelp av levende avbildning av de tykke lungeskivene13. Samtidig ble conidia oppdaget i lysende side av bronkial epitel av mus14.
Tredimensjonal (3D) avbildning av de optisk ryddede helmonterte muse lungene tillater morfometrisk analyse av luftveiene15. Spesielt ble den kvantitative analysen av den viscerale pleurale nervefordelingen utført ved hjelp av optisk klarerte muse lungeprøver15. Nylig undersøkte Amich et al.16 soppveksten etter intranasal påføring av conidia til immunkompromitterte mus ved hjelp av en lysark fluorescensmikroskopi av optisk ryddede muse lungeprøver. Den nøyaktige plasseringen av hvile conidia i luftveiene på forskjellige tidspunkter etter infeksjonen er viktig for å identifisere cellepopulasjonene som kan gi tilstrekkelig antifungalt forsvar i visse faser av betennelse. På grunn av den relativt små størrelsen er imidlertid de romlige-temporale aspektene ved A. fumigatus conidia-distribusjon i luftveiene dårlig preget.
Her presenterer vi et eksperimentelt oppsett for kvantitativ analyse av A. fumigatus conidia distribusjon i luftveiene til infiserte mus. Ved hjelp av fluorescerende konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM) av optisk klarerte lunger av mus som fikk en orofaryngeal anvendelse av den fluorescerende merket A. fumigatus conidia, får vi 3D-bilder og utfører bildebehandlingen. Ved hjelp av 3D-avbildning av hele lungeloben har vi tidligere vist fordelingen av A. fumigatus conidia i gjennomføring av luftveier av mus 72 timer etter conidia-påføring8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder angående laboratoriedyr beskrevet her er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Shemyakin og Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences (protokollnummer 226/2017).
1. A. fumigatus conidia søknad
- For å oppnå fluorescerende merket A. fumigatus conidia, fikse 5 × 108 conidia ved å legge 1 ml 3% paraformaldehyd til conidia pellet. Inkuber i et 50 ml reagensrør i 2 timer på en shaker ved romtemperatur.
- Vask conidia med 20 ml fosfatbuffer saltvann (PBS): sentrifuge ved 1000 x g i 15 min, fjern forsiktig supernatanten og tilsett fersk PBS i et volum på 20 ml. Gjenta.
- Løs opp conidia i 900 μL på 0,1 M NaHCO3.
- Løs opp den succinimidylstereren av 594 nm fluorescerende fargestoff i 100 μL dimetylsulfoksid og legg til conidia.
- Inkuber conidia med fargestoffet i 1 time på en shaker ved 150 rpm ved romtemperatur.
- Vask conidia to ganger med 20 ml PBS i sentrifugen ved 1000 x g i 15 minutter.
- Fortynn conidia til en konsentrasjon på 1 × 108 conidia/ml i PBS og oppbevar ved 4 °C.
- Bedøv musen med 0,5-3% isoflurandamp. Sett musen på holderen, fest tungen med glatte tang og hold nares. Ta en enkeltkanals pipette og påfør 50 μL conidia suspensjon til musen pharynx. Vent til suspensjonen er inhalert.
2. Prøveforberedelse
- Forbered 50 ml reagensglass og fyll det med 15 ml frisk 2% paraformaldehyd. Plasser de medisinske instrumentene (15 cm tannede dissekerings tang, 8 cm finspissede tang og 10 cm saks med stumpe ender) i 70% etanoloppløsning.
- Euthanize musen i samsvar med IACUC protokollen. Plasser deretter musen i dorsal posisjon og fest musepotene med nåler.
MERK: Ved bruk av cervical dislokasjon for eutanasi, sørg for integriteten til luftrøret.- Behandle musen med 70% etanol ved hjelp av en sprøyter.
- Lag et median langsgående kutt i ventralhuden fra bakpotene til forpaws og haken.
- Skill huden fra det subkutane vevet ved hjelp av tann tang og lukket saks. Fest de øvre endene av huden med nåler.
- Lag et snitt i bukveggen og skille leveren fra membranen. Velg forsiktig membranen med lukket saks og kutt deretter membranen.
- Lag et medialt kutt av thorax og nakke bindevev til luftrøret er synlig.
- Kjør en silketråd under luftrøret og lag en kirurgisk knute ved hjelp av to tang.
MERK: Alternativt kan du bruke tanntråd i stedet for silketråd.- Trekk forsiktig tråden og kutt av lungene fra bindevevet med saks. Hold saksen vinkelrett på bordet.
- Sett lungene i 50 ml reagensglasset med 2% paraformaldehyd. La trådendene ligge utenfor røret, sett dekselet stramt og snu røret for å dekke lungene med paraformaldehyd. Hold lungene over natten ved 4 °C.
- Disseker lungelobene fra hjertet og hverandre med en skalpell.
- Sett lungelobene i en 24 brønnplate, med hver lobe i en separat brønn. Vask lungelobene i 1 ml Tris-bufret saltvann (TBS) pH 7,4, 5 ganger i 1 time hver på en shaker ved 150 o/min.
- Bytt ut 1 ml TBS med 1 ml blokkeringsbuffer (1% Triton X 100, 5% pulverisert melk i TBS) og la prøven stå over natten ved romtemperatur på en shaker.
- Bytt ut blokkeringsbufferen med 1 ml streptavidin-488- nm fluorkromekonjugat fortynnet 1:30 i TBS. La prøven stå i minst 72 timer ved romtemperatur på en shaker (150 o/min).
- Vask prøven 5 ganger i 1 time hver i 1 ml TBS ved romtemperatur på en shaker (150 rpm). Overfør prøven til de nye brønnene og dekk den med 2% paraformaldehyd over natten ved 4 °C for etterfiksering.
3. Mus lunge lobe optisk rydding
- Plasser prøven i 5 ml glassflaske fylt med 3 ml 50% metanolvannløsning og sett den på prøveblanderen ved romtemperatur i 1 time.
- Bytt ut 3 ml 50% metanol med 3 ml 100% metanol og sett den på prøveblanderen i 2 timer. Forbered en 1:2 v/v blanding av benzylalkohol og benzylbenzoat (BABB) i et totalt volum på 1 ml.
- Overfør prøven til en 24 brønnplate og dekk med 1 ml BABB-blanding i minst 30 min. Ikke la prøven stå i BABB i lang tid; BABB kan skade plastplaten og gjøre prøven for stiv.
- Sett prøven i celleavbildningsdekselets bunnkammer. Eksemplet er klart for avbildning.
4. Mus lunge lobe bildebehandling med CLSM
- Slå på mikroskopsystemet. Åpne mikroskopprogramvaren. Slå på overføringslyset i finn-fanen. Velg 10x-målsettingen.
MERK: For mer detaljert analyse, bruk 20x-målet, men det øker tiden for eksperimentet og bildefilstørrelsen. - Sett kammeret med prøven i dekselsklieholderen. Sett holderen på XY-scenen over målet. Midtstill prøven ved hjelp av XY-kontrollene på scenen på toppen av målet. Bruk transmisjonslyset og okularet til å finne prøven Z-plan manuelt.
- Bytt programvaren til kategorien Anskaffelse. Velg CLSM λ-modus. Slå på 488 nm og 561 nm lasere. Velg det 488/561 nm dikroiske speilet. Endre spektralområdet til detektoren til 490-695 nm. Juster lasereffekten til riktig område (10-50 μW). Juster detektorforsterkningen mellom 750-900.
MERK: Høyere forsterkningsinnstillinger er uønskede på grunn av støy. - Begrens hullhullet til 1 Luftig enhet ved å klikke på 1 AU-knapp. Sett pikseloppløsningen til 512 × 512 piksler.
- Slå på Z-stakkmodus. Start Live Imaging. Velg fokusplanet der begge fargestoffene er synlige.
MERK: Juster om nødvendig laserkraften for å normalisere lysstyrken til de to fluorescerende fargestoffene. Bruk galleri- og enkanalsmodus for å unngå klipping og for å nøyaktig matche fluorescensintensiteten. - Utvid den viste Z-stakkruten. Bruk fokuseringshjulet og finn det laveste planet i prøven. Bruk Første-knappen i Z-stakkruten. Flytt fokusplanet oppover for å finne den øverste grensen til prøven og lagre posisjonen ved hjelp av Siste-knappen. Kontroller representasjonen av prøvedybden i Z-stakkruten.
MERK: En representasjon av prøvedybden vises i Z-stakkruten etter at første og siste posisjon er valgt. - Plasser målet ved hjelp av fokuseringshjulet nær bunnen av prøven, ved å se på Z-stakkruten. Dette er ca. 20 μm fra bunnen av prøven.
- Slå av Z-stakkmodus og slå på flisskanningsmodus. Skaff bildet med et passende antall fliser for størrelsen på prøven. 5 × 5 fliser er et godt utgangspunkt.
- Juster antall fliser og prøve XY-posisjonen til hele lungen passer inne i flislagt bilde. Kontroller riktigheten av Z-stack-posisjonene på nytt med den nylig oppnådde XY-posisjonen til midten av prøven.
- Slå på både Z-stack- og Tile Scan-modus. Sett Z-trinn (i Z-stakkruten) til 5 μm. Sett skannehastigheten til 6. Slå på funksjonen For automatisk lagring. Aktiver alternativet Lagre separate fliser. Gi filen et navn. Trykk starteksperimentknappen.
- Kontroller at eksperimentet ikke overskrider den tildelte tiden på mikroskopet. i så fall - juster hastigheten.
MERK: Den omtrentlige filstørrelsen er mer enn 10 Gb; kontroller at det er nok plass på harddisken.
5. Spektral unmixing og søm
- Bruk programvaren for den første bildebehandlingen. Velg alternativet Unmixing for spektral unmixing. Velg to områder som tilsvarer streptavidin/airways og conidia for å hente spektra fra bildet. Klikk Start unmixing.
MERK: Alternativt kan du bruke det eksisterende spektraet i 488 og 594 nm fluorokrom. - Åpne filen for bildebehandling, og velg kategorien Behandler . Velg Geometrisk og Sømunder Metoder . I Parameter-delen velger du Ny utgang og merker av for Sikringsfliser. Bruk referansemodusen med den valgte kanalen som tilsvarer luftveisfluorescensen. Bruk sømmen ved å klikke Bruk.
6. Bildebehandling: overflategjengivelse
- Åpne bildet som en overgår 3D-visning. Opprett en luftveisoverflate ved hjelp av alternativet Overflate for kanalen som ble brukt til luftveisvisualiseringen. Velg utjevningsparameteren på 10 μm.
MERK: Velg også den automatiske terskelverdien. - Kontroller overflaten visuelt. Velg terskler for å redusere outlying signalet. Fjern overflatene på pleura og kar.
- Opprett en maske for luftveisoverflaten ved hjelp av alternativene Rediger og masker alle. Velg luftveiskanalen og sett Voxels utenfor overflaten til 0,001.
- Lagre filen med luftveismasken som en TIFF-serie i mappen. Lagre filen med conidia-kanalen som en TIFF-serie i den separate mappen.
7. Bildebehandling: maskekorrigering
- Åpne filen med luftveismasken i en åpen kildekode-plattform for biologisk bildeanalyse17 som et 8-biters bilde. Gjør bildet binært ved å klikke Behandle | Binær | Lag Binær.
MERK: Korriger om nødvendig masken: Fjern de overdrevne overflatene ved hjelp av Polygon-markeringen og Slett-fanen. Du kan også bruke flomfyllverktøyet. - Tegn de manglende overflatene ved hjelp av flere ganger Dilate (3D): klikk Plugins | Behandle | Dilate (3D). Fyll hullene ved å klikke behandle | Binær | Fyll hull. Bruk markering og ROI manager interpolering for å fylle resthullene i masken manuelt. Bruke flere eroder (3D) alternativer (Plugins | Behandle | Erode (3D)) for å ta nytt utsnitt av masketykkelsen.
MERK: Opprett makroer ved hjelp av Plugins | Makroalternativer for flere 3D- (Dilate) og Erode (3D) gjentas.
Kontroller at antallet eroder (3D) er lik antall 3D-applikasjoner (Dilate). - Lagre masken i en ny mappe som en TIFF-serie.
8. Conidia kvantitativ analyse
- Åpne appen i programmerings- og numerisk databehandlingsplattform: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/84525-conidia_counter.
- Trykk Legg til filer. Velg luftveismaskemappen og conidia-mappen.
- Angi en egendefinert terskel mellom 0 og 1. Trykk på OK-knappen.
- Lagre utdatatabellen i den egendefinerte .xls filen.
- Analyser dataene med programvare for statistisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter protokollen ovenfor ble 3D-bildet som viser luftveiene og A. fumigatus-conidia i lungeloben til en mus oppnådd (Figur 1A). Streptavidin (som ble brukt til luftveisvisualisering) merket bronkier og bronkioler15. I tillegg visualiseres de store fartøyene, som lett kan skilles fra luftveiene ved deres morfologi, og pleura i luftveiskanalen (Figur 1A-C). Opprettelsen av luftveisoverflaten og masken tillot fjerning av fartøyet og pleuraprojeksjonene i luftveiskanalen; Imidlertid blir integriteten til luftveisoverflaten ødelagt på grunn av det svake signalet om streptavidin i flere bronkialgrener (Figur 1B-C). Videre behandling av luftveismasken tillater reparasjon av de manglende fragmentene (Figur 1D).
Fordelingen av A. fumigatus conidia i musenes lunger ble estimert ved hjelp av venstre eller høyre overlegne lungelober på forskjellige tidspunkter etter conidia-påføring. For høyre overlegen lungelobe består bildet av ca. 30 fliser og rundt 250 Z-stabler. Etter søm hadde bildet som ble anskaffet med oppløsningen 512 × 512 en bildestørrelse på 2360 × 2815 piksler, og størrelsen på en piksel er 2,77 μm × 2,77 μm, som er sammenlignbar med størrelsen på A. fumigatus conidia som er 2-3,5μm μm.
Det forstørrede bildet av den distale luftveisregionen viser at deteksjon av den nøyaktige plasseringen av conidia (inne eller utenfor bronkialgrenene) er ganske vanskelig på grunn av bildets kompleksitet og den lille størrelsen på conidia i forhold til størrelsen på luftveiene (Figur 2A). Presis undersøkelse viste at conidia var plassert både i og utenfor bronkialgrenene (Figur 2B-C).
Terskelinnstillingene til conidiakanalen påvirker i stor grad det resulterende antall conidia (Figur 2B-C). For å gjøre den objektive kvantitative analysen utviklet vi en app i programmerings- og numerisk databehandlingsplattform som gjør det mulig å estimere antall conidia i og utenfor luftveismasken, og unngå den manuelle terskelinnstillingen. Appen fungerer basert på følgende algoritme. For det første segmenteres conidia-kanalen i en binær 3D-stabel med bilder ved hjelp av en optimal terskelverdi. Som beskrevet ovenfor tillater den valgte bildeoppløsningen identifisering av ett conidium som en piksel. Bruken av streptavidin for luftveismerking tillater visualisering av bronkier, men ikke alveoli15. Derfor er conidia bosatt i bronkier definert som conidia piksler inne i luftveiene maske, mens conidia bosatt i alveoli er definert som conidia piksler utenfor luftveismasken. Tatt i betraktning dette, i neste trinn av algoritmen, utføres en binær OG operasjon for luftveismaskebildet og conidia-bildet for å trekke ut piksler av conidia som ligger i bronkiene. På samme måte ekstraheres de resterende konidiapikslene for å oppnå antall conidia i alveoler. Den resulterende prosentandelen av conidia i bronkier og alveoler i forhold til den totale mengden conidia i lungen presenteres i stolpediagrammet og utdatatabellen til appbrukergrensesnittet.
Ved hjelp av denne tilnærmingen ble den kvantitative analysen av conidia-fordelingen i musenes luftveier utført for tidspunktet 6 timer etter conidia-påføring (Figur 2D). Dataene antyder at ved orofaryngeal applikasjon trenger flertallet av conidia inn i alveolarrommet og finner der i begynnelsen av den inflammatoriske immunresponsen.
Figur 1. Prinsippet om luftveisbildebehandling. (A) 3D-bilde av høyre overlegen lunge lobe av en mus, 24 timer etter conidia søknad som viser biotin-rike strukturer (streptavidin, hvit) og A. fumigatus conidia (magenta). Steptavidin-positive store fartøy er indikert med fine piler. (B,C) Overflaten (grønn) og masken (oransje) for luftveiene. De manglende luftveisfragmentene i overflaten og masken er indikert med piler; de overdrevne strukturene med pilspisser. Skalastangen er 1000 μm. (D) Luftveismasken etter korreksjonene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Conidia bildebehandling og kvantitativ analyse. (A) Forstørret bilde av de distale luftveiene (Streptavidin, grå nyanser) og A. fumigatus conidia (magenta) som presenteres i figur 1A. Skalalinjen er 300 μm B, C. Forstørret bilde vilkårlig bokset på (A) representeres som et Z-stykke med høy terskelverdi (B) og en lav terskelverdi (C). Conidia inne i luftveiene er indikert med piler, og utenfor med pilspisser. Skalalinjen er 150 μm. (D) Kvantitativ analyse av conidia i bronkialgrenene og alveolarrommet. Dataene vises som median og interkvartilt område for 4 mus, 6 timer etter å ha mottatt A. fumigatus conidia. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heldekkende 3D-avbildning tillater innhenting av dataene uten disseksjon av prøven, noe som er av stor betydning for å undersøke de romlige aspektene ved den anatomiske fordelingen av patogenet i organismen. Det finnes flere teknikker og modifikasjoner av vev optisk clearing som bidrar til å overvinne laserlysspredningen og tillate heldekkende bildebehandling15,16,18,19. En av de tilpassede vevsryddingsmetodene består av metanolbasert vevsdehydrering og delipidasjon etterfulgt av optisk rydding med BABB. Tilnærmingen ble utviklet for mer enn 100 år siden og har flere modifikasjoner. I vårt arbeid bruker vi den enkleste modifikasjonen som ble beskrevet av Scott et al. 15 En slik tilnærming er optimal for bruk med fluorescerende merkede patogener. Videre er fluorokromene med høy fotostabilitet å foretrekke for langvarig avbildning. Dessverre er visualisering av transgen TdTomato A. fumigatus conidia ikke mulig ved hjelp av denne metoden, på grunn av den høye følsomheten til TdTomato til BABB (data ikke vist). Dermed tillater tilnærmingen som vi beskriver her vellykket påvisning av hvile eller faste patogener, men kan ikke brukes til avbildning av voksende A. fumigatus conidia eller hyphae. I tillegg er immunhiistokjemisk farging av prøven med høy affinitetsbindende stoffer å foretrekke. Dermed fikk vi også problemer med å prøve å bruke de fluorescerende merkede antistoffene for å visualisere kar og lymfatikk i helmonterte lungelobeprøver. Men Scott et al. 15 visualiserte nervefibre ved hjelp av totrinnsfarging med antistoffer mot PGP 9,5. Dette indikerer at noen antistoffer kan brukes til farging med følgende optiske rydding ved hjelp av BABB. Vi mistet også fluorescerende signalet fra de 0,1 μm fluorescerende latekspartiklene etter BABB-rydding, mens bruken av clearingforbedret 3D (Ce3D) ryddeløsning18 ikke påvirket partiklenes fluorescerende signal.
I den nåværende tilnærmingen bruker vi streptavidin for å merke luftveier. Streptavidin binder endogene biotin som anses å være uttrykt i Clara celler (og alveolar type II epitelceller i mindre grad)20. Som Clara celler (også kjent som Club celler) i fravær av betennelse ligger i bronkiene og bronkioler, men ikke i alveolar rommet, streptavidin farging visualiserer bare bronkial grener. Derfor, i den nåværende tilnærmingen, ble alle conidia utenfor de streptavidin-merkede luftveiene bestemt som plassert i alveolarrommet. For mer presis deteksjon av conidia-plasseringen, bør noen andre luftveismarkører, for eksempel SOX9, brukes3. I tilfelle, når antistoffbruk er nødvendig Ce3D eller tredimensjonal avbildning av løsemiddel-klarerte organer (3DISCO)19 teknikker er mer hensiktsmessig enn BAAB-basert optisk clearing. Babb optisk rydding er imidlertid den mest enkle og tidkrevende tilnærmingen, og er derfor den mest fordelaktige for på forhånd fluorescerende merket conidia deteksjon i merket med streptavidin luftveier.
3D-avbildning av muse lungene kan også utføres ved hjelp av optisk projeksjon tomografi integrert mikroskopi3. På grunn av begrensningen i oppløsningen av tomografi er CLSM imidlertid mer egnet for samtidig avbildning av luftveiene og 3 μm conidia. I vårt tilfelle blir et enkelt conidium sett på som en piksel. Behandlingen av slike bilder tillot kvantifisering av conidia i og utenfor bronkialgrenene. Metoden kan også brukes til å sammenligne anatomisk conidia-distribusjon hos immunokogene og immunkompromitterte mus. Tilnærmingen kan også brukes til å estimere kinetikken til conidia eliminering fra luftveiene til mus. Videre er kombinasjonen av tilnærmingen til hele luftveiene morfometri som ble utviklet av Scott et al. 15 med algoritmen for objektiv konidia kvantitativ analyse kan være nyttig i den nøyaktige plasseringen av A. fumigatus conidia og andre partikler av sammenlignbar størrelse i forskjellige generasjoner av bronkial treet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne rapporterer ingen interessekonflikter i dette arbeidet.
Acknowledgments
Forfatterne takker professor Sven Krappmann (Universitetssykehuset Erlangen og FUA Erlangen-Nürnberg, Tyskland) for å ha gitt Aspergillus fumigatus conidia-stammen AfS150. Forfatterne takker MIPT Press Office. V.B. anerkjenner Departementet for vitenskap og høyere utdanning i Russland (#075-00337-20-03, prosjekt FSMG-2020-0003). Arbeidet med A. fumigatus conidia imaging and kvantification ble støttet av RSF No 19-75-00082. Arbeidet med luftveisavbildning ble støttet av RFBR No 20-04-60311.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 NHS Ester | ThermoFisher | A20004 | |
| Aspergillus fumigatus conidia | ATCC | 46645 | The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative |
| Benzyl alcohol | Panreac | 141081.1611 | 98.0-100 % |
| Benzyl benzoate | Acros | AC10586-0010 | 99+% |
| C57Bl/6 mice | Pushchino Animal Breeding Centre (Russia) | Male. 12 - 30 week old. | |
| Catheter | Venisystems | G715-A01 | 18G |
| Cell imaging coverglass-bottom chamber | Eppendorf | 30742028 | 4 or 8 well chamber with coverglass bottom |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Any centrifuge provided 1000 g can be used |
| Confocal laser scanning microscope | ZEISS | ZEISS LSM780 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | ≥99.9% |
| FIJI image processing package | FIJI | Free software | |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD557R | Toothed |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD321R | Fine-tipped |
| Forcep | Bochem | 1727 | Smooth |
| Glass bottle | DURAN | 242101304 | With ground-in lid |
| Graphic Editor Photoshop | Adobe Inc | Adobe Photoshop CS | |
| GraphPad Software | GraphPad | Prism 8 | |
| Imaris Microscopy Imaging Software | Oxford Instruments | Free trial is available https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial | |
| Isoflurane | Karizoo | ||
| NaHCO3 | Panreac | 141638 | |
| Objective | ZEISS | 420640-9800-000 | Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS | Paneco | P060Π | |
| Pipette | ProLine | 722020 | 5 to 50 μL |
| Powdered milk | Roth | T145.2 | |
| Sample mixer | Dynal | MXIC1 | |
| Scissors | B. Braun | BC257R | Blunt |
| Shaker | Apexlab | GS-20 | 50-300 rpm |
| Skalpel | Bochem | 12646 | |
| Silk thread | B. Braun | 3 USP | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Test tube | SPL Lifesciences | 50050 | 50 mL |
| Tris (hydroxymethyl aminomethane) | Helicon | H-1702-0.5 | Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1 |
| Triton X-100 | Amresco | Am-O694-0.1 | |
| ZEN microscope software | ZEISS | ZEN2012 SP5 | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html |
References
- O'Gorman, C. M. Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis. Fungal Biology Reviews. 25 (3), 151-157 (2011).
- Hyde, D. M., et al. Asthma: A comparison of animal models using stereological methods. European Respiratory Review. 15 (101), 122-135 (2006).
- Alanis, D. M., Chang, D. R., Akiyama, H., Krasnow, M. A., Chen, J. Two nested developmental waves demarcate a compartment boundary in the mouse lung. Nature Communications. 5, (2014).
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Donohue, J. F. Targeted drug-aerosol delivery in the human respiratory system. Annual Review of Biomedical Engineering. 10, (2008).
- Bustamante-Marin, X. M., Ostrowski, L. E.
- Fröhlich, E., Salar-Behzadi, S. Toxicological assessment of inhaled nanoparticles: Role of in vivo, ex vivo, in vitro, and in Silico Studies. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4795-4822 (2014).
- Patel, V. I., Metcalf, J. P. Airway macrophage and dendritic cell subsets in the resting human lung. Critical Reviews in Immunology. 38 (4), 303-331 (2018).
- Bogorodskiy, A. O., et al. Murine intraepithelial dendritic cells interact with phagocytic cells during Aspergillus fumigatus-Induced Inflammation. Frontiers in Immunology. 11, (2020).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous fuman fungal pathogen. PLoS Pathogens. 9 (12), 1-4 (2013).
- Overton, N., Gago, S., Bowyer, P. Immunogenetics of chronic and allergic aspergillosis. Immunogenetics of Fungal Diseases. , 153-171 (2017).
- Thiesse, J., et al. Lung structure phenotype variation in inbred mouse strains revealed through in vivo micro-CT imaging. Journal of Applied Physiology. 109 (6), 1960-1968 (2010).
- Tochigi, N., et al. Histopathological implications of Aspergillus infection in lung. Mediators of Inflammation. 2013, (2013).
- Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin rodA. PLoS Pathogens. 6 (4), 1-18 (2010).
- Shevchenko, M. A., et al. Aspergillus fumigatus infection-induced neutrophil recruitment and location in the conducting airway of immunocompetent, neutropenic, and immunosuppressed mice. Journal of Immunology Research. 2018, 5379085 (2018).
- Scott, G. D., Blum, E. D., Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Tissue optical clearing, three-dimensional imaging, and computer morphometry in whole mouse lungs and human airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 1 (51), 43-55 (2014).
- Amich, J., et al. Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-aspergillus fumigatus interactions. mBio. 11 (1), (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. High-dimensional cell-level analysis of tissues with Ce3D multiplex volume imaging. Nat Protoc. 14 (6), 1708-1733 (2019).
- Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J Vis Exp. (89), e51382 (2014).
- Kuhn, C. Biotin stores in rodent lungs: Localization to Clara and type II alveolar cells. Experimental Lung Research. 14 (4), 527-536 (1988).
