Summary
该协议描述了在外科主动脉瓣置换手术期间或从尸体组织中提取的人主动脉瓣的收集，以及随后对患者特异性原发性瓣膜内皮和间质细胞的分离、扩增和表征。其中包括有关确保细胞活力和表型特异性所需过程的重要细节。
Abstract
钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）存在于近三分之一的老年人口中。主动脉瓣增厚、变硬和钙化会导致主动脉瓣狭窄，并导致心力衰竭和卒中。疾病发病机制是多因素的，炎症、细胞外基质重塑、湍流、机械应力和应变等应激有助于瓣膜内皮细胞和瓣膜间质细胞的成骨分化。然而，驱动健康细胞向钙化细胞成骨转变的精确起始因素尚未完全确定。此外，CAVD诱导的主动脉瓣狭窄目前唯一的治疗方法是主动脉瓣置换术，即切除自体瓣膜（外科主动脉瓣置换术，SAVR）或通过导管插入完全可塌陷的置换瓣膜（经导管主动脉瓣置换术，TAVR）。这些外科手术成本高，风险严重;因此，确定药物发现的新治疗靶点势在必行。为此，本研究开发了一种工作流程，其中手术从患者和供体尸体组织中取出的组织用于创建患者特异性的瓣膜细胞原系，用于体外疾病建模。该协议引入了通常用于器官移植的冷藏解决方案的利用，以减少组织切除和实验室处理之间通常很长的获取时间造成的损害，从而大大稳定了切除组织的细胞。本研究的结果表明，分离的瓣膜细胞在从供体中取出瓣膜后数天以上在培养物中保留其增殖能力以及内皮和间质表型。使用这些材料可以收集对照细胞和CAVD细胞，从中建立对照细胞系和疾病细胞系。
Introduction
钙化性主动脉瓣疾病 （CAVD） 是一种以炎症、纤维化和主动脉瓣叶大钙化为特征的慢性病理学。小叶的进行性重塑和钙化（称为主动脉硬化症）可导致血流受阻（主动脉瓣狭窄），从而导致中风并导致心力衰竭。目前CAVD的唯一治疗方法是手术或经导管主动脉瓣置换术（分别为SAVR和TAVR）。没有非手术选择来阻止或逆转CAVD进展，如果不进行瓣膜置换，死亡率在2-3年内接近50%1，2，3。定义驱动这种病理学的潜在机制将确定潜在的新型治疗方法。
在健康的成人中，主动脉瓣叶的厚度约为1毫米，其主要功能是维持血液单向流出左心室4。三个小叶中的每一个都由一层瓣膜内皮细胞（VEC）组成，该细胞排列在小叶的外表面并起到屏障的作用。VEC通过调节通透性、炎症细胞粘附和旁分泌信号来维持瓣膜稳态5，6，7。瓣膜间质细胞（VIC）包括瓣叶8内的大部分细胞。VIC在传单中排列成三个不同的层次。这些层被称为脑室、海绵和纤维9。脑室面向左心室，含有胶原和弹性蛋白纤维。中间层，海绵状体，含有高蛋白多糖含量，可在心动周期内提供剪切灵活性。外纤维层位于主动脉侧靠近流出面的位置，富含I型和III型原纤维胶原蛋白，可提供在舒张10，11，12期间维持凝结的强度。VIC处于静止状态，然而，炎症，细胞外基质（ECM）重塑和机械应力等因素可能会破坏VIC稳态8，9，13，14，15，16。随着体内平衡的丧失，VIC激活并获得肌成纤维细胞样表型，能够增殖，收缩和分泌重塑细胞外millieu17的蛋白质。活化的VIC可以转变为钙化细胞，这让人联想到间充质干细胞（MSC）分化为成骨细胞15，17，18，19，20，21，22，23，24，25。
钙化似乎在富含胶原蛋白的纤维层中从VEC和VIC的贡献开始，但扩张并侵入小叶的其他层8。因此，很明显，VEC和VICs都对刺激做出反应以上调成骨基因的表达，然而，驱动成骨基因激活的精确事件，以及细胞和小叶细胞外基质之间的复杂相互作用，仍然不清楚。小鼠模型不是研究CAVD发病机制的非遗传驱动因素的理想来源，因为小鼠不会从头发展CAVD26，27，因此使用原代人体组织和从这些组织中分离的原代细胞系是必要的。特别是，随着3D细胞培养和类器官建模领域正在扩大，并且很可能成为鼠模型的离体人类替代品，因此获得大量和高质量的这些细胞势在必行。
本方法的目的是共享一个工作流程，该工作流程已经建立了有效分离和生长从人类供体的手术切除瓣膜中获得的 VEC 和 VIC 的条件。以前的研究表明，从猪28和鼠瓣29中成功分离了VEC和VIC，据我们所知，这是第一个描述这些细胞在人体组织中的分离。这里描述的方案适用于人切除瓣膜，并通过引入冷存储溶液的使用，极大地规避和改善了组织切除和实验室处理之间通常很长的采购时间造成的损害，冷储存溶液是一种临床用于器官移植的缓冲溶液，极大地稳定了切除组织的细胞。此处描述的方案还展示了如何确定细胞表型并保证细胞存活的高效率，同时最大限度地减少细胞交叉污染。
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Protocol
所有患者样本均来自匹兹堡大学机构审查委员会根据《赫尔辛基宣言》批准的研究的个体。通过器官恢复和教育中心（CORE）获得的尸体组织得到了匹兹堡大学涉及死者的研究和临床培训监督委员会（CORID）的批准。
1. 批准和安全
- 根据《赫尔辛基宣言》，获得机构审查委员会 （IRB） 的批准或对任何患者样本或尸体组织收集的豁免备忘录。
- 参加必要的机构培训以处理人体组织，例如血源性病原体培训，生物医学人类受试者研究，隐私和信息安全以及生物材料的运输和运输。
2. 后勤和准备
- 手术样本
- 确保冰箱可用且位于手术室附近。将装有 40 mL 无菌等分试样冷藏溶液的 50 mL 锥形管预先贴有去识别命名法，供手术人员使用。这些管在4°C下稳定，直到原始包装上的有效期。
- 拔出后，将瓣膜组织放入这些管中。将试管放入密封的二级容器中，例如防漏塑料袋或标有生物危害标签的塑料容器。组织根据运输生物危害的机构协议在冰上拾取和运输。
- 尸体样本
- 将回收的器官浸入冷藏溶液中，放入密封的二级安全壳中，并根据运输生物危害的机构协议在冰上运输。
3. 试剂制备
- 至少在前一天制作涂有胶原蛋白的板。
- 在 50 mL 锥形管中，混合 5 mL 异丙醇、8.7 mL 乙酸和 0.5 μg 胶原蛋白 I 粉。用无菌水加热至 50 mL。混合并通过0.45μm过滤器过滤。
- 在无菌细胞培养罩下，将足够的胶原蛋白溶液添加到 6 孔板和 10 cm 培养皿中，以覆盖整个底部。盖上板，在室温下静置4-6小时。用无菌移液器除去多余的溶液，放入新的无菌50mL锥形管中，并在4°C下保存以制作额外的板。溶液可在4°C下储存数月。
- 将板在37°C培养箱中干燥过夜，随后将它们储存在4°C的可重新密封袋中。 涂有胶原蛋白的盘子和培养皿可以存放几个月。
- 高压灭菌以下物品：组织钳，组织剪刀，棉签和纱布垫。
- VEC生长培养基：根据制造商的方案制备和使用内皮细胞生长培养基。在4°C的黑暗中储存。 在细胞上使用前加热至37°C，不要将培养基留在温浴中超过必要的时间（10-15分钟就足够了）。在准备后的一个月内使用培养基。
- VIC生长培养基：补充DMEM基础培养基（4.5 g/L葡萄糖，L-谷氨酰胺补充剂，110 mg / L丙酮酸钠）30 与10%热灭活FBS和100 I.U./mL青霉素和100 μg/mL链霉素。在4°C的黑暗中储存长达3个月。在细胞上使用前加热至37°C，不要将培养基留在温浴中超过必要的时间（10-15分钟就足够了）。
- 使用前制作无菌冲洗液。用 2.5 μg/mL 杀菌剂、0.05 mg/mL 庆大霉素和 5 μg/mL 杀菌剂补充无菌 PBS。
- 使用前制作无菌胶原酶溶液。将 5 mg 胶原酶 II 加入 5 mL 无菌新鲜 DMEM 基础培养基中。充分混合并通过0.45μm过滤器对溶液进行灭菌。在冰上保持使用。
4. 组织制备和加工
注意：在开始工作之前，必须获得使用人体组织的机构批准。处理纸巾时，必须穿戴以下个人防护装备 （PPE）：一次性液体屏障环绕式防护服，或带有液体屏障包裹围裙和一次性袖子三叶草的专用纽扣前实验室外套;全面罩或带外科口罩的安全眼镜;双层手套;近趾鞋;和遮盖腿的衣服。用于钙化评估（第5节）和细胞分离（第6节和第7节）的组织制备的综合工作流程图分别如图 1A，B 所示。
- 收到尸体器官标本后，切除主动脉根部并浸没在 50 mL 锥形管无菌冲洗溶液中。收到手术标本后，从运输容器中取出并浸没在无菌冲洗溶液的 50 mL 锥形管中。将装有组织的管放在摇杆上的冰桶中，并在室温（RT）下混合10分钟。
注意：尽可能接近提取时间处理组织将产生最佳的细胞回收率，但是可以在切除后61小时以上收集活细胞，并且数据显示随着时间的增加，VICs比VECs更健壮。如果组织不能立即处理，在可能的情况下，取出组织，执行步骤4.1，然后将组织放回新鲜的无菌冷藏溶液中并保持在4°C直至准备继续。在夜间或周末手术期间收集的瓣膜可以储存在4°C的40mL冷储存溶液中，并且在提取后2天以上仍然能够产生活细胞。 - 用70%乙醇喷洒试管并移至无菌罩。取出组织并切除两个瓣叶（图2A）。将一张小叶放入低温小瓶中（如果需要几个较小的小块用于将来的分析，则为2-3个小瓶），并通过滴入液氮快速冷冻，然后储存在-80°C。
- 如果瓣膜是二叶式的，则仅切除一个小叶。用剪刀将小叶从结节到铰链切成两半。使用传单的一半进行快速冷冻，另一半用于步骤4.3。
- 处理用于石蜡包埋的第二份小叶，通过将结节到铰链切成两半来评估钙化含量。将两块都放入浸没在4%多聚甲醛（PFA）中的盒中，然后在室温下放在摇杆上至少2小时，但不超过4小时。
注意：较长的固定时间会产生更多的免疫荧光染色背景。执行步骤 4.2 和 4.3 后，立即转到第 6 节，并在步骤 6.12 之后返回步骤 4.4。 - 固定后，通过将浸入新鲜PBS中3-4次1小时来洗涤组织。这些洗涤后，如果需要，样品可以在4°C的PBS中停留数月。在嵌入之前继续执行下一步。
- 逐渐从PBS改为70%乙醇。每一步用1：4 70%乙醇：PBS洗涤30-60分钟;1：1 70% 乙醇：PBS， 4：1 70% 乙醇：PBS;70%乙醇。
- 根据既定的协议31嵌入组织，使切片将揭示传单的三层（图1A）。或者，如果可用，将组织带到病理学核心进行包埋和切割。
- 处理纸巾后，酌情丢弃或存放个人防护用品并立即洗手。用漂白剂或洗涤剂消毒剂 1：10 稀释度对所有设备、表面以及固体和液体废物进行净化。等待 20 分钟进行净化，然后用 70% 乙醇冲洗。根据制造商的说明用支原体喷雾剂处理细胞培养罩。
5. 冯·科萨染色钙含量
注意：这可以在细胞分离和细胞系建立后很好地完成，但一定要将组织的钙化水平与与建立的原代细胞系有关的文件联系起来。
- 将5或10μm厚的石蜡切片切到载玻片上，并在65°C下烘烤载玻片1小时，然后冷却至室温。
- 使用新鲜溶液，通过浸没如下方式对载玻片进行脱蜡：100%二甲苯30分钟，2x;100%乙醇3分钟，2x;90%乙醇3分钟;80%乙醇3分钟;70%乙醇3分钟;50%乙醇3分钟;超纯水3分钟;保存在超纯水中，直到下一步。
注意：以上时间是最短时间，每一步可能会更长。 - 根据制造商的方案进行冯·科萨染色。
- 显微镜下评估整个瓣膜面积，并分配对照组织（无钙化迹象）或CAVD（任何钙化证据， 图2B）。
6. 瓣膜内皮细胞 （VEC） 分离、扩增和确认
- 在无菌细胞培养罩中，打开包含剩余瓣叶的锥形管，并将小叶放入装有冰冷PBS的新50 mL锥形管中。盖上管子，在室温下轻轻倒置或放在摇杆上2分钟。
- 将组织转移到装有 5-7 mL 冷胶原酶溶液的 60 mm 培养皿中。使用镊子将小叶的两侧浸入溶液中3-4次。将组织在37°C的细胞培养箱中孵育5-10分钟，每2分钟轻轻摇动组织3-4次。
- 从培养皿中取出 2 mL 溶液，放入无菌 15 mL 锥形管中。将镊子放在结节上，然后使用干燥的无菌棉签从镊子滑动到铰链，旋转拭子，同时沿着小叶移动拭子。在每次滑动之间，在 15 mL 锥形管中的溶液中漱拭拭拭子以去除细胞。重复以完全擦拭组织表面，然后翻转并在另一侧重复。
- 一只手拿着镊子握住瓣膜小叶，另一只手拿着1 mL移液管，用培养皿中的溶液冲洗小叶的表面。冲洗后，将培养皿中含有VEC的所有溶液与拭子中的细胞转移到相同的15 mL锥形管中，然后继续步骤6.5。将剩余的瓣膜组织放入装有7 mL无菌胶原酶溶液的新15 mL锥形管中，然后继续步骤7.1。
- 将含有 VEC 的管以 180 x g 离心 5 分钟以沉淀分离的 VEC。吸出上清液并重悬于 3 mL VEC 生长培养基中。再次离心一次并除去上清液。将细胞重悬于1 mL生长培养基中，并使用血细胞计数器和台盼蓝确定细胞数量。
- 将 VEC 沉淀重悬于 2 mL VEC 生长培养基中，并将细胞接种在 6 孔板的胶原蛋白预包被孔中，浓度约为 5 x 105 细胞/cm2。让细胞生长至少3-4天，然后取出培养基并补充新鲜培养基。每 4 天重复更换一次介质。VEC将在鹅卵石形状的斑块中生长（图3B，左图）。
- 当VEC贴片覆盖板的>80%时，根据细胞生长的速度以约1.3 x 104个细胞/ cm 2分裂细胞（如果它们在不到1周的时间内达到80%，细胞数略低/ cm2）。
- 分裂时，用 2 mL DPBS 洗涤细胞两次，然后加入足够的解离试剂以覆盖细胞表面。在37°C孵育2-3分钟，检查以确保细胞没有过度孵育。通过向 15 mL 管中加入等体积的 VEC 生长培养基和转移液体来停止消化。以 180 x g 离心 5 分钟，除去上清液，并根据所需的孔/板数重悬于适当体积的培养基中。
注意：一旦扩增成 10 厘米板，VEC 有时可能会在增殖时失去其形态并改变表型。当VEC在细胞系的建立和扩增过程中以低汇合度接种时，往往会发生这种情况。 - 为了保证纯培养，请考虑在每次分裂时使用CD31+超顺磁珠。
- 对于 1 x 108 个或更少的细胞（一个 10 cm 或更少的培养皿），根据制造商的方案通过洗涤制备 25 μL 超顺磁性磁珠。
注意：建议在VEC胰蛋白酶消化之前执行步骤6.10。 - 按照步骤 6.8 分离细胞，但重悬于 500 μL PBS 中，0.1% BSA，pH 7.4，并置于 2 mL 离心管中。将 500 μL 洗涤和重悬的珠子加入 2 mL 细胞管中，并在 4 °C 下在旋转器上孵育 20 分钟。
- 将管子放在磁铁上2分钟。当管仍在磁铁中时，小心地除去上清液。从磁铁上取下试管，加入 1 mL 新鲜 PBS 和 0.1% BSA，轻轻移液 2-3 次，然后放回磁铁上 2 分钟。再重复 2 次。最终去除缓冲液后，将细胞重悬于重新铺板所需的体积生长培养基中。
注意：细胞仍然有珠子，但这些珠子不会影响生长，并将在随后的传代中去除。 - 细胞扩增后，除形态外，还可通过免疫荧光标志物（如血管性血友病因子 （vWF）、钙粘蛋白 5 （CDH5） 或 PECAM-1/CD31）的阳性染色以及 VIC 标志物（如钙钙蛋白 1 （CNN） 或 α-2 平滑肌肌动蛋白）的阴性染色来确认 VEC 表型（αSMA，图 4，左 图）。
7. 瓣膜间质细胞 （VIC） 隔离、扩增和储存
- 如步骤6.4所述，从瓣膜组织中去除VECS后，将小叶置于具有7mL胶原酶溶液的15mL锥形管中。在细胞培养箱中孵育12小时，盖子略微打开以允许气体交换。在胶原酶溶液中长达18小时仍可成功分离VIC。
- 孵育后，在无菌细胞培养罩中，用血清移液管轻轻混合组织，以确保VIC从小叶组织中释放。
- 去除细胞悬液并通过 0.70 μm 过滤器进入 50 mL 锥形管。
- 将 7 mL VIC 生长培养基加入 50 mL 管中，并以 180 x g 离心 5 分钟。吸出上清液并将细胞沉淀重悬于1mL VIC生长培养基中并确定细胞数。将VIC接种在60 mm组织培养处理的培养皿中，浓度为1.3 x 104 细胞/ cm2。
- 在更换培养基之前让细胞生长至少 1-2 天。取出培养基并洗涤两次DPBS以去除残留的碎屑并更换为新鲜的生长培养基。每 2-3 天补充一次培养基。VIC将以成纤维细胞形状生长（图3B，右图）。
- 当VIC达到>90%的汇合度时，用DPBS洗涤两次以去除多余的培养基，并通过添加适当体积的预热解离试剂覆盖板（即每10厘米培养皿2-3mL）来分离细胞。将培养皿在37°C培养箱中孵育。孵育2-3分钟后，VIC将从培养皿中分离。加入 4-6 mL 预热培养基。
注意：如果细胞需要超过3分钟才能从板上取出，则解离试剂可能已失去效力。如果需要，可以使用细胞刮刀轻轻提起细胞。 - 将细胞悬液转移到管中，并以180× g 轻轻离心5分钟。除去上清液后，将细胞沉淀轻轻重悬于预热的VIC生长培养基中，并使用血细胞计数器和台盼蓝确定活细胞的数量。以原始培养皿的 1：2 密度接种活细胞（即，每 10 cm 培养皿 ~ 1 × 10 个6 个细胞或 1.3 x 104 个细胞/cm2）。
- 通过免疫荧光标志物（如 αSMA、CNN 或 SM22α）的阳性染色和 VEC 标志物（如 CD31、CDH5 或 vWF）的阴性染色来评估 VIC 表型（图 4，右图）。
注意：此处介绍的方案工作流程无偏地选择一份传单用于 VEC 和 VIC 分离，而其余传单用于 Von Kossa 染色（第 5 节）和快速冷冻。
8. 长期电池储存
- 一旦扩增，冷冻细胞以进行长期储存。用 2-5 mL DPBS 洗涤细胞两次，然后加入足够的解离试剂以分离细胞，如步骤 6.8 和 7.6 所示。通过加入等体积的 VEC 或 VIC 生长培养基并将细胞悬液转移到 15 mL 管中来停止消化。
- 使用血细胞计数器和台盼蓝确定活细胞的数量。
- 以180× g 离心5分钟。
- 将细胞重悬于冷藏的条件生长培养基中，细胞密度为~3×106 细胞/mL。
- 轻轻旋转，加入等体积的冷冻 2x 冷冻保存培养基。这将使细胞浓度达到 ~ 1.5 × 106 个细胞/mL。
- 将 1 mL 等分到冷冻保存瓶中。将小瓶放入细胞冷冻容器中，关闭并倒置 5-6 次以确保细胞保持悬浮状态。将容器置于-80°C下6-72小时或根据冷冻容器方案。从-80°C取出小瓶并转移到液氮中长期储存。
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Representative Results
上述协议概述了处理人类瓣膜组织以及从这些组织中分离和建立活细胞系所需的步骤。主动脉瓣的小叶被处理用于石蜡包埋，快速冷冻以长期储存以进行生化或遗传分析，并消化以分离VEC和VIC（图1）。虽然手术标本可能具有主动脉瓣狭窄的临床诊断，并且可能表现出肉眼可见的重度钙化结节，但主动脉瓣钙化存在于大量老年人（>65岁）中32，并且由于这种患病率，所有组织 - 手术和尸体 - 都接受Von Kossa染色或类似程序以评估是否存在钙化（图2）。
结果发现，使用冷藏溶液极大地稳定了切除瓣膜组织的细胞。冷藏溶液用于活体器官移植。在从供体中取出之前或之后，它通过器官冲洗，并在冰上运输期间留在该器官的脉管系统中。据观察，与手术组织相比，VEC系更容易从供体标本中建立，并且供体系更有可能保留其内皮细胞形态以进行更多传代。这是令人困惑的，因为供体组织通常在死后12-24小时内无法到达实验室，而手术组织在2到4小时之间获得。在用冷藏溶液而不是PBS包装手术标本管时，细胞回收率大大提高。如图 3 所示，活的 VEC 和 VIC 都可以在瓣膜拔出后 61 小时以上获得。虽然在瓣膜切除后一天内分离细胞时，获得的活 VIC 百分比略高于 VEC，但细胞在切除后 48 小时后仍可存活。高达40%的总回收细胞对应于活细胞，我们已经观察到生物学重复之间的一致数字。此外，形态学检查还可以确认细胞身份;虽然VECs表现为堆积，鹅卵石样和生长接触抑制的细胞，但VIC形态类似于具有纺锤形的肌成纤维细胞。标本的免疫染色证实，91.8%±1.8（n = 3）的扩增VEC对内皮标志物vWF呈阳性，而92.0%±5.0（n = 3）的扩增VIC对间质细胞标志物αSMA呈阳性（图4）。这些数字与之前报告的结果一致33.
图 1：瓣膜组织处理和与人工控制和 CAVD 瓣膜的细胞隔离。 （A）用于评估瓣膜钙化水平的组织处理示意图。（B）从对照组和CAVD组织中分离和表征人瓣膜内皮细胞（VECs）和瓣膜间质细胞（VIC）的时间过程和步骤的示意图。请点击此处查看此图的大图。
图2：钙化的评估 。 （A）来自人类供体的对照（顶部）和钙化（底部）瓣膜组织的代表性图像。请注意，CAVD组织的钙化结节会严重改变形态和干净切除小叶的能力。（B）代表性的Von Kossa染色后对对照（左）和CAVD（右）瓣膜组织进行染色，并进一步处理人体瓣膜组织。注意钙化是通过小叶组织中存在深色沉淀来揭示的。Valve图像是用实验室相机捕获的。冯·科萨染色的阀门用10倍物镜，比例尺200 μm捕获。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：细胞 存活 （A） VEC 和 VIC 存活曲线的评估。从五个阀门标本中获得三份传单。从每个瓣膜的第一个小叶立即处理（提取后3-12小时），第二个小叶在大约24小时后（22-35小时）处理，第三个小叶在获得组织后约48小时处理（45-61小时）。将阀门传单保存在4°C的冷藏溶液中，直到它们被处理。y 轴表示活细胞的百分比。（B）VECs（左图）和VIC（右图）健康培养物的形态。图表显示了从n = 5个瓣膜组织中分离±SD活细胞的平均比例。使用4倍和10倍物镜分别使用比例尺200 μm和100 μm捕获图像。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：VEC 和 VIC 上的代表性免疫荧光染色。 VEC对内皮标志物血管性血友病因子（vWF，左图）呈阳性，而VIC对间质标志物αSMA呈阳性。请注意，我们的隔离协议保证了高隔离效率;未检测到 VE 和 VIC 之间的交叉污染。使用10倍物镜，比例尺100μm捕获图像。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
从人类获得对照和疾病组织对于体外和离体疾病建模至关重要;然而，虽然人们经常谈到弥合长凳到床边之间的差距的挑战，但相反的顺序 - 从手术室到长凳 - 往往同样令人生畏。对于基础科学家获得原始人体组织标本至关重要的是与投资的外科医生科学家合作，该科学家拥有一支由护士、外科技术人员、医师助理、医学生和住院医师以及临床协议经理组成的团队，他们可以招募和同意患者，参与并协助正确处理切除组织，并协调组织采集所需的后勤工作。如果没有所有相关人员尽最大努力减少从切除到细胞分离的时间，重要的细胞物质及其所含信息将被不可挽回地改变或丢失。
保持组织标本活力的关键是使用冷藏溶液。这与 UPMC 和其他移植医疗中心的器官移植团队使用的解决方案相同。与从手术室快速获得但保存在冷PBS中的组织相比，从提前数小时从供体中切除的尸体组织获得更好的细胞产量。这一偶然发现对于从人体组织中获取细胞至关重要。从组织切除到实验室交付的采购时间范围为手术组织的1-5小时和尸体组织的24小时以上。相比之下，动物组织的采购和处理通常可以在安乐死后几分钟内完成，这是细胞活力的理想选择。在没有冷藏溶液的情况下，适合培养细胞的培养基也可能比PBS表现更好，但是由于冷储存溶液在活体器官移植中的成功以及在该溶液中接收尸体组织，因此本文未对该培养基进行测试。该解决方案具有货架稳定性，非常适合在手术室中储存，并且已知腺苷等特定成分可促进对缺血/缺氧等细胞应激的有益反应21，34。
获得活细胞的另一个重要步骤是用杀菌剂、庆大霉素和杀菌剂清洗组织。这种短暂的冲洗有助于确保细胞不受细菌和真菌的污染。同样重要的是从瓣膜组织中消化VEC的步骤，在短短几分钟内，VEC被分离，然后从瓣膜小叶的表面擦拭。随后对驻留在小叶致密细胞外基质上的VIC的消化在持续时间和强度方面具有更大的回旋余地。本协议中描述的无偏组织处理允许分离瓣叶中存在的主要两个细胞群，VEC和VIC。尽管最近的单细胞转录组分析显示，至少十四种不同的细胞亚型共存于人类瓣膜中，包括CAVD组织中的6种非瓣膜衍生基质细胞35，但这种多样性可能代表由于加工和消化这些硬化组织的影响而引起的变化，或者可能是由于小叶细胞暴露于的不同微环境： VEC暴露于两种不同的血流中，而VIC嵌入三种不同的细胞外基质层8，9中。本文描述的大规模分离方案和分析确保超过90%的VEC和VIC对应于其主要表型。虽然可能会发现一定程度的异质性，但它并不影响VEC和VIC稳态8，9，13，14，15，16研究的一般结果。
同样重要的是要注意，患者及其瓣膜组织，以及从他们那里获得的细胞系，并不相同。遗传学、合并症、手术和加工过程中的处理以及消化溶液成分的新鲜度可能会影响生长速度，甚至可能影响分离细胞的行为或表型。虽然本研究表明通过该程序产生足够数量的活细胞的能力，但这些细胞系可能存在先天或诱导的差异，这可能会影响下游实验。通常很难准确知道从患者或供体身上取出组织的时间，特别是在后者的情况下，循环停止的时间。此外，组织之间在获得的活瓣膜细胞数量、细胞的增殖能力和细胞表型保留方面存在固有的变异性。细胞系可能携带基因突变 - 先天性或体细胞性 - 这是医生和研究团队不知道的，组织的重塑和随后的处理也可能改变细胞表型甚至表观遗传学。因此，对于使用这些原代人类细胞的所有实验，使用生物复制 - 即从不同患者获得的细胞系 - 是绝对必要的，尽管它们会产生大量的时间和成本。这有助于确保任何结果不是由于组织采购和处理的混杂效应引起的。不同细胞系的可变增殖速率可以通过在不同时间收集实验中的细胞或接种不同密度的实验细胞来调节;没有一个答案是最适合所有实验设计的。虽然并发症并非微不足道，但使用原代人类对照和CAVD组织来源的细胞系进行体外和离体实验模型对于确定驱动CAVD发病机制的起始因子和繁殖过程至关重要。
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Disclosures
IS获得Atricure和Medtronic的机构研究支持，并担任Medtronic Vascular的顾问。这些冲突都与这项工作无关。所有其他作者均无可披露的内容。
Acknowledgments
我们要感谢杰森·多宾斯（Jason Dobbins）对这份手稿的深刻讨论和批判性阅读。我们要感谢器官恢复和教育中心的帮助和支持，并感谢组织捐赠者及其家人使这项研究成为可能。所有患者样本均来自匹兹堡大学机构审查委员会根据《赫尔辛基宣言》批准的研究的个体。通过器官恢复和教育中心（CORE）获得的尸体组织得到了匹兹堡大学涉及死者的研究和临床培训监督委员会（CORID）的批准。
一些用 Biorender.com 创建的图形。
CSH得到了美国国家心肺血液研究所K22 HL117917和R01 HL142932，美国心脏协会20IPA35260111的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm filter | Thermo Scientific | 7211345 | Preparing plate with collagen coating |
| 10 cm cell culture plate | Greiner Bio-One | 664160 | Cell culture/cell line expansion |
| 10 mL serological pipet | Fisher | 14955234 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 1000 μL filter tips | VWR | 76322-154 | Cell culture/cell line expansion |
| 10XL filter tips | VWR | 76322-132 | Cell culture/cell line expansion |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339650 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 16% paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710S | Tissue and cell fixative |
| 190 proof ethanol | Decon | 2801 | Disinfection |
| 1x DPBS: no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | Saline solution. VIC/VEC isolation |
| 1x PBS | Fisher | BP2944100 | Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| 20 μL filter tips | VWR | 76322-134 | Cell culture/cell line expansion |
| 200 proof ethanol | Decon | 2701 | Deparaffinizing tissue samples |
| 2-propanol | Fisher | A416P 4 | Making collagen coated plates |
| 5 mL serological pipet | Fisher | 14955233 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 60 mm dish | GenClone | 25-260 | VEC isolation |
| 6-well cell culture plate | Corning | 3516 | Cell culture/cell line expansion |
| Acetic acid, glacial | Fisher | BP2401 500 | Making collagen coated plates |
| AlexaFluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | Fluorescent f-actin counterstain |
| Belzer UW Cold Storage Transplant Solution | Bridge to Life | BUW0011L | Tissue storage solution |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V - Fatty Acid Free 25g | Bioworld | 220700233 | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| Calponin 1 antibody | Abcam | ab46794 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| CD31 (PECAM-1) (89C2) | Cell Signaling | 3528 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| CD31+ Dynabeads | Invitrogen | 11155D | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| CDH5 | Cell Signaling | 2500 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Cell strainer with 0.70 μm pores | Corning | 431751 | VIC isolation |
| Collagen 1, rat tail protein | Gibco | A1048301 | Making collagen coated plates |
| Collagenase II | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray | Decon | 4101 | Disinfection |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | A27977 | Automated cell counter |
| Countess II reusable slide coverslips | Invitrogen | 2026h | Automated cell counter required slide cover |
| Coverslips | Fisher | 125485E | Mounting valve samples |
| Cryogenic vials | Olympus Plastics | 24-202 | Freezing cells/tissue samples |
| Disinfecting Bleach with CLOROMAX - Concentrated Formula | Clorox | N/A | Disinfection |
| DMEM | Gibco | 10569044 | Growth media. VIC expansion |
| EBM - Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500 | Lonza Walkersville | CC3129 | Growth media. VEC expansion |
| EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 - 1 kit SingleQuot Kit | Lonza Walkersville | CC4176 | Growth media supplement. VEC expansion |
| EVOS FL Microscope | Life Technologies | Model Number: AME3300 | Fluorescent imaging |
| EVOS XL Microscope | Life Technologies | AMEX1000 | Visualizing cells during cell line expansion |
| Fetal Bovine Serum - Premium Select | R&D Systems | S11550 | VIC expansion |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Fisherbrand Cell Scrapers | Fisher | 08-100-241 | VIC expansion |
| Fungizone | Gibco | 15290-026 | Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Glass slides | Globe Scientific Inc | 1358L | mounting valve samples |
| Goat anti-Mouse 488 | Invitrogen | A11001 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Mouse 594 | Invitrogen | A11005 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 594 | Invitrogen | A11012 | Fluorescent secondary Antibody |
| Invitrogen Countess II FL Reusable Slide | Invitrogen | A25750 | Automated cell counter required slide |
| Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Invitrogen | R37606 | Fluorescent nucleus counterstain |
| LM-HyCryo-STEM - 2X Cryopreservation media for stem cells | HyClone Laboratories, Inc. | SR30002 | Frozen cell storage |
| Mounting Medium | Fisher Chemical Permount | SP15-100 | Mounting valve samples |
| Mr. Frosty freezing container | Nalgene | 51000001 | Container for controlled sample freezing |
| Mycoplasma-ExS Spray | PromoCell | PK-CC91-5051 | Disinfection |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | Antibiotic. VIC expansion |
| Plasmocin | Invivogen | ANTMPT | Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion |
| SM22a antibody | Abcam | ab14106 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| Sstandard pattern scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Sterile cotton swab | Puritan | 25806 10WC | VEC isolation |
| Swingsette human tissue cassette | Simport Scientific | M515-2 | Tissue embedding container |
| Taylor Forceps (17cm) | Fine Science Tools | 11016-17 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | cell counting solution |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | Splitting VIC/VECs |
| Von Kossa kit | Polysciences | 246331 | Staining paraffin sections of tissues for calcification |
| von Willebrand factor antibody | Abcam | ab68545 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Xylenes | Fisher Chemical | X3S-4 | Deparaffinizing tissue samples |
| αSMA antibody | Abcam | ab7817 | Primary antibody (VIC positive stain) |
References
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