Summary
Este protocolo describe la colección de válvulas aórticas humanas extraídas durante procedimientos quirúrgicos de reemplazo de válvula aórtica o de tejido cadavérico, y el posterior aislamiento, expansión y caracterización de células endoteliales e intersticiales de válvula primaria específicas del paciente. Se incluyen detalles importantes sobre los procesos necesarios para garantizar la viabilidad celular y la especificidad del fenotipo.
Abstract
La valvulopatía aórtica calcificante (CAVD) está presente en casi un tercio de la población de edad avanzada. El engrosamiento, endurecimiento y calcificación de la válvula aórtica causa estenosis aórtica y contribuye a la insuficiencia cardíaca y al accidente cerebrovascular. La patogénesis de la enfermedad es multifactorial, y tensiones como la inflamación, la remodelación de la matriz extracelular, el flujo turbulento y el estrés mecánico y la tensión contribuyen a la diferenciación osteogénica de las células endoteliales valvulares e intersticiales valvulares. Sin embargo, los factores iniciadores precisos que impulsan la transición osteogénica de una célula sana a una célula calcificante no están completamente definidos. Además, la única terapia actual para la estenosis aórtica inducida por CAVD es el reemplazo de la válvula aórtica, mediante el cual se extrae la válvula nativa (reemplazo quirúrgico de la válvula aórtica, SAVR) o se inserta una válvula de reemplazo totalmente plegable a través de un catéter (reemplazo de la válvula aórtica transcatéter, TAVR). Estos procedimientos quirúrgicos tienen un alto costo y con graves riesgos; Por lo tanto, es imperativo identificar nuevos objetivos terapéuticos para el descubrimiento de fármacos. Con ese fin, el presente estudio desarrolla un flujo de trabajo en el que los tejidos extirpados quirúrgicamente de pacientes y tejidos de cadáveres de donantes se utilizan para crear líneas primarias específicas del paciente de células valvulares para el modelado de enfermedades in vitro. Este protocolo introduce la utilización de una solución de almacenamiento en frío, comúnmente utilizada en el trasplante de órganos, para reducir el daño causado por el tiempo de obtención a menudo largo entre la escisión de tejidos y el procesamiento de laboratorio con el beneficio de estabilizar en gran medida las células del tejido extirpado. Los resultados del presente estudio demuestran que las células valvulares aisladas conservan su capacidad proliferativa y los fenotipos endoteliales e intersticiales en cultivo más de varios días después de la extracción de la válvula del donante. El uso de estos materiales permite la recolección de células de control y CAVD, a partir de las cuales se establecen líneas celulares de control y enfermedad.
Introduction
La valvulopatía aórtica calcificada (CAVD) es una patología crónica caracterizada por inflamación, fibrosis y macrocalcificación de las valvas valvulares aórticas. La remodelación progresiva y la calcificación de las valvas (denominada esclerosis aórtica) pueden conducir a la obstrucción del flujo sanguíneo (estenosis aórtica) que contribuye al accidente cerebrovascular y conduce a la insuficiencia cardíaca. Actualmente, el único tratamiento para la CAVD es el reemplazo quirúrgico o transcatéter de la válvula aórtica (SAVR y TAVR, respectivamente). No existe una opción no quirúrgica para detener o revertir la progresión de la CAVD, y sin reemplazo valvular, las tasas de mortalidad se acercan al 50% en 2-3 años 1,2,3. La definición de los mecanismos subyacentes que impulsan esta patología identificará posibles enfoques terapéuticos novedosos.
En un adulto sano, las valvas valvulares aórticas tienen aproximadamente un milímetro de grosor, y su función principal es mantener el flujo unidireccional de sangre fuera del ventrículo izquierdo4. Cada uno de los tres foliolos se compone de una capa de células endoteliales valvulares (VEC) que recubre la superficie externa de la valva y funciona como una barrera. Los VEC mantienen la homeostasis valvular regulando la permeabilidad, la adhesión celular inflamatoria y la señalización paracrina 5,6,7. Las células intersticiales valvulares (CIV) comprenden la mayoría de las células dentro de la valvavalvular 8. Los CIV están dispuestos en tres capas distintivas en el folleto. Estas capas se conocen como ventricular, espongiosa y fibrosa9. El ventrículo se enfrenta al ventrículo izquierdo y contiene fibras de colágeno y elastina. La capa media, la espongiosa, contiene un alto contenido de proteoglicanos que proporciona flexibilidad de cizallamiento durante el ciclo cardíaco. La capa externa de fibrosa se encuentra cerca de la superficie de salida en el lado aórtico y es rica en colágeno fibrilar tipo I y tipo III que proporciona fuerza para mantener la coaptación durante la diástole10,11,12. Las CIC residen en un estado quiescente, sin embargo, factores como la inflamación, la remodelación de la matriz extracelular (MEC) y el estrés mecánico pueden alterar la homeostasis de la CIV 8,9,13,14,15,16. Con la pérdida de la homeostasis, los CIC activan y adquieren un fenotipo similar a los miofibroblastos capaz de proliferar, contraer y secar proteínas que remodelan el milieu extracelular17. Los CIC activados pueden convertirse en células calcificantes, lo que recuerda la diferenciación de una célula madre mesenquimal (MSC) en un osteoblasto 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
La calcificación parece iniciarse en la capa fibrosa rica en colágeno a partir de las contribuciones de los VEC y los CIV, pero se expande e invade las otras capas del folioto8. Por lo tanto, está claro que tanto los VEC como los CIC responden a estímulos para regular al alza la expresión de genes osteogénicos, sin embargo, los eventos precisos que impulsan la activación de genes osteogénicos, así como la compleja interacción entre las células y la matriz extracelular de la valva, permanecen mal definidos. Los modelos murinos no son una fuente ideal para estudiar los impulsores no genéticos de la patogénesis de la CAVD, ya que los ratones no desarrollan CAVD de novo26,27, por lo que es necesario el uso de tejidos humanos primarios y las líneas celulares primarias aisladas de estos tejidos. En particular, es imperativo obtener estas células en grandes cantidades y de buena calidad, ya que el campo de los cultivos celulares 3D y el modelado de organoides se está expandiendo y es probable que se convierta en una alternativa ex vivo basada en humanos a los modelos murinos.
El propósito del presente método es compartir un flujo de trabajo que ha establecido las condiciones para aislar y cultivar eficientemente VEC y CIC obtenidos de válvulas extirpadas quirúrgicamente de donantes humanos. Estudios previos han demostrado el aislamiento exitoso de VEC y VICs de válvulas porcinas28 y murinas29, hasta donde sabemos, este es el primero en describir el aislamiento de estas células en tejidos humanos. El protocolo descrito aquí es aplicable a las válvulas extirpadas humanas y evita y mejora en gran medida el daño causado por el tiempo de obtención a menudo largo entre la escisión de tejidos y el procesamiento de laboratorio mediante la introducción de la utilización de una solución de almacenamiento en frío, una solución tamponada utilizada clínicamente en trasplantes de órganos que estabiliza en gran medida las células del tejido extirpado. El protocolo descrito aquí también muestra cómo determinar el fenotipo celular y garantizar una alta eficiencia de la supervivencia celular con una contaminación cruzada celular mínima.
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Protocol
Todas las muestras de pacientes se recogen de individuos inscritos en estudios aprobados por la junta de revisión institucional de la Universidad de Pittsburgh de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Los tejidos cadavéricos obtenidos a través del Centro para la Recuperación y Educación de Órganos (CORE) fueron aprobados por el Comité de Supervisión de Investigación y Capacitación Clínica con Difuntos (CORID) de la Universidad de Pittsburgh.
1. Homologación y seguridad
- Obtener la aprobación de la Junta de Revisión Institucional (IRB) o un memorando exento para cualquier recolección de muestras de pacientes o tejidos cadavéricos de acuerdo con la Declaración de Helsinki.
- Tome la capacitación institucional requerida para trabajar con tejidos humanos, como capacitación en patógenos transmitidos por la sangre, investigación biomédica con sujetos humanos, privacidad y seguridad de la información, y transporte y envío de materiales biológicos.
2. Logística y preparación
- Muestras quirúrgicas
- Asegúrese de que haya un refrigerador disponible y ubicado cerca de la sala de operaciones. Mantenga en este refrigerador los tubos cónicos de 50 ml preetiquetados con una nomenclatura no identificable que contenga 40 ml de alícuotas estériles de solución de almacenamiento en frío para uso del personal quirúrgico. Estos tubos son estables a 4 °C hasta la fecha de caducidad en el envase original.
- Tras la extracción, coloque tejido valvular en estos tubos. Coloque los tubos en un recipiente secundario sellado, como una bolsa de plástico a prueba de fugas o un recipiente de plástico que esté etiquetado con una etiqueta de riesgo biológico. Los tejidos se recogen y transportan en hielo de acuerdo con los protocolos institucionales para el transporte de riesgos biológicos.
- Muestras cadavéricas
- Sumergir los órganos recuperados en una solución de almacenamiento en frío, colocarlos en un recipiente de contención secundario sellado y transportarlos en hielo de acuerdo con los protocolos institucionales para el transporte de riesgos biológicos.
3. Preparación de reactivos
- Haga placas recubiertas de colágeno al menos el día anterior.
- En un tubo cónico de 50 ml, mezcle 5 ml de alcohol isopropílico, 8,7 ml de ácido acético y 0,5 μg de colágeno I en polvo. Llevar hasta 50 mL con agua estéril. Mezclar y filtrar a través de un filtro de 0,45 μm.
- Bajo una campana de cultivo celular estéril, agregue suficiente solución de colágeno a 6 platos de pocillos y platos de 10 cm para cubrir todo el fondo. Cubra el plato y deje reposar durante 4-6 h a temperatura ambiente. Retirar el exceso de solución con una pipeta estéril, colocar en un nuevo tubo cónico estéril de 50 ml y guardar a 4 °C para hacer placas adicionales. La solución puede conservarse a 4 °C durante varios meses.
- Secar las placas en una incubadora a 37 °C durante la noche y, posteriormente, almacenarlas en una bolsa resellable a 4 °C. Los platos y platos recubiertos de colágeno se pueden almacenar durante varios meses.
- Autoclave los siguientes elementos: pinzas de tejido, tijeras de tejido, hisopos de algodón y gasas.
- Medios de crecimiento VEC: Prepare y use el medio de crecimiento de células endoteliales de acuerdo con los protocolos del fabricante. Conservar en la oscuridad a 4 °C. Calentar a 37 °C justo antes de usar en las células, no dejar los medios en el baño caliente más tiempo del necesario (10-15 min es suficiente). Use los medios dentro de un mes de la preparación.
- Medios de crecimiento VIC: Suplemento DMEM base medio (4,5 g/L de glucosa, suplemento de L-glutamina, 110 mg/L de piruvato de sodio)30 con 10% de FBS inactivado por calor y 100 UI/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina. Conservar en la oscuridad a 4 °C durante un máximo de 3 meses. Calentar a 37 °C justo antes de usar en las células, no dejar los medios en el baño caliente más tiempo del necesario (10-15 min es suficiente).
- Haga una solución de enjuague estéril justo antes de usar. Suplementar PBS estéril con fungicida de 2,5 μg/ml, 0,05 mg/ml de gentamicina y 5 μg/ml bactericida.
- Haga una solución estéril de colagenasa justo antes de usar. Añadir 5 mg de colagenasa II a 5 ml de medio base DMEM fresco estéril. Mezclar bien y esterilizar la solución pasando por un filtro de 0,45 μm. Mantener en hielo hasta su uso.
4. Preparación y procesamiento de tejidos
NOTA: La aprobación institucional para el uso de tejidos humanos debe obtenerse antes de comenzar a trabajar. Al manipular pañuelos desechables, se debe usar el siguiente equipo de protección personal (EPP): una bata envolvente desechable de barrera líquida o una bata de laboratorio frontal de botón dedicada con una envoltura de barrera líquida alrededor del delantal y tréboles desechables para mangas; un protector facial completo o gafas de seguridad con una máscara quirúrgica; guantes dobles; zapatos cerrados; y ropa para cubrir las piernas. Los diagramas completos de flujo de trabajo de la preparación tisular para la evaluación de calcificación (Sección 5) y el aislamiento celular (Secciones 6 y 7) se ilustran en la Figura 1A, B, respectivamente.
- Al recibir la muestra de órgano cadavérico, extirpar la raíz aórtica y sumergirla en un tubo cónico de 50 ml de solución de enjuague estéril. Al recibir la muestra quirúrgica, retirar de los recipientes de transporte y sumergir en un tubo cónico de 50 ml de solución de enjuague estéril. Coloque el tubo que contiene el pañuelo en un cubo de hielo en un balancín y mezcle durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT).
NOTA: El procesamiento de los tejidos lo más cerca posible del momento de la extracción producirá la mejor recuperación celular, sin embargo, las células viables se pueden recolectar más de 61 h después de la escisión, y los datos muestran que los CIV son más robustos que los VEC a medida que aumenta el tiempo. Si el tejido no puede procesarse inmediatamente, cuando sea posible, extraer el tejido, realizar el paso 4.1 y, a continuación, volver a colocar el tejido en una solución fresca estéril de almacenamiento en frío y conservar a 4 °C hasta que esté listo para continuar. Las válvulas recolectadas durante cirugías nocturnas o de fin de semana se pueden almacenar en una solución de almacenamiento en frío de 40 ml a 4 ° C y aún pueden producir células viables más de 2 días después de la extracción. - Rocíe los tubos con etanol al 70% y muévalos a una campana estéril. Extraer el tejido y extirpar dos valvas valvulares (Figura 2A). Coloque un prospecto en un vial criogénico (o 2-3 viales si se necesitan varias piezas más pequeñas para futuros análisis) y congele rápidamente introduciendo nitrógeno líquido y luego guárdelo a -80 °C.
- Si la válvula es bicúspide, extirpe solo una valva. Con unas tijeras, corte la valva por la mitad desde el nódulo hasta la bisagra. Utilice una mitad del prospecto para la congelación rápida y la otra mitad para el paso 4.3.
- Procese el segundo prospecto para la incrustación de parafina para evaluar el contenido de calcificación cortándolo por la mitad desde el nódulo hasta la bisagra. Coloque ambas piezas en un casete que esté sumergido en paraformaldehído al 4% (PFA), luego colóquelas en un balancín a RT durante un mínimo de 2 h pero no más de 4 h.
NOTA: Los tiempos de fijación más largos crean más fondo con la tinción inmunofluorescente. Una vez realizados los pasos 4.2 y 4.3, vaya inmediatamente a la Sección 6 y vuelva al paso 4.4 después del paso 6.12. - Después de la fijación, lavar los pañuelos sumergiéndolos en PBS fresco durante 1 h 3-4 veces. Después de estos lavados, las muestras pueden permanecer en PBS a 4 °C durante varios meses si es necesario. Continúe con el siguiente paso justo antes de incrustar.
- Cambie gradualmente de PBS a etanol al 70%. Lavar 30-60 min cada paso con 1:4 70% etanol:PBS; 1:1 70% etanol:PBS, 4:1 70% etanol:PBS; 70% etanol.
- Incrustar el tejido de tal manera que las secciones revelen las tres capas del foliolo (Figura 1A) de acuerdo con los protocolos establecidos31. Alternativamente, y si está disponible, lleve el tejido a un núcleo de patología para incrustarlo y cortarlo.
- Después de manipular pañuelos desechables, deseche o guarde el EPP según corresponda y lávese las manos inmediatamente. Descontamine todos los equipos, superficies y desechos sólidos y líquidos con una dilución 1:10 de cloro o desinfectante detergente. Deje 20 minutos para la descontaminación, luego siga con un enjuague con etanol al 70%. Trate la campana de cultivo celular con spray de micoplasma de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
5. Tinción de Von Kossa para el contenido de calcio
NOTA: Esto se puede hacer bien después del aislamiento celular y el establecimiento de la línea, pero asegúrese de vincular el nivel de calcificación del tejido con los documentos relacionados con la línea celular primaria establecida.
- Cortar rodajas de parafina de 5 o 10 μm de espesor en portaobjetos de vidrio y hornear portaobjetos a 65 °C durante 1 h, luego enfriar a RT.
- Usando soluciones frescas, desparafinar los portaobjetos sumergiéndolos de la siguiente manera: 100% xileno durante 30 min, 2x; 100% etanol durante 3 min, 2x; 90% etanol durante 3 min; 80% etanol durante 3 min; 70% etanol durante 3 min; 50% etanol durante 3 min; agua ultrapura durante 3 min; Mantener en agua ultrapura hasta los próximos pasos.
NOTA: Los tiempos anteriores son mínimos, cada paso puede durar más. - Proceda con la tinción de Von Kossa de acuerdo con los protocolos del fabricante.
- Evaluar microscópicamente el área completa de la válvula y asignar un tejido de control (sin signos de calcificación) o CAVD (cualquier evidencia de calcificación, Figura 2B).
6. Aislamiento, expansión y confirmación de células endoteliales valvulares (VEC)
- En una campana de cultivo celular estéril, abra el tubo cónico que contiene la valva de válvula restante y coloque la valva en un nuevo tubo cónico de 50 ml lleno de PBS helado. Tapa el tubo e invierte suavemente o colócalo en un balancín durante 2 minutos en RT.
- Retire el tejido a un plato de 60 mm lleno de 5-7 ml de solución fría de colagenasa. Usando fórceps, sumerja ambos lados de la valva en la solución 3-4 veces. Incubar el tejido durante 5-10 min en la incubadora de cultivo celular a 37 °C, meciendo el tejido suavemente cada 2 min 3-4 veces.
- Retire 2 ml de la solución del plato y colóquela en un tubo cónico estéril de 15 ml. Coloque fórceps en el nódulo y use un hisopo de algodón estéril seco para deslizar desde los fórceps hasta la bisagra, girando el hisopo mientras lo mueve a lo largo de la valva. Entre cada deslizamiento, haga buches con el hisopo en la solución en el tubo cónico de 15 ml para eliminar las células. Repita para frotar completamente la superficie del tejido, luego voltee y repita en el otro lado.
- Sosteniendo la valva de la válvula con pinzas en una mano y una pipeta de 1 ml en la otra, enjuague las superficies de la valva con la solución en el plato. Una vez enjuagado, transfiera toda la solución que contiene los VEC en el plato al mismo tubo cónico de 15 ml con las células del hisopo y continúe con el paso 6.5. Coloque el tejido valvular restante en un nuevo tubo cónico de 15 ml con 7 ml de solución estéril de colagenasa y continúe con el paso 7.1.
- Centrifugar el tubo que contiene los VEC a 180 x g durante 5 min para granular los VEC aislados. Aspirar el sobrenadante y resuspender en 3 mL de medios de crecimiento VEC. Centrifugar una vez más y retirar el sobrenadante. Resuspender las células en 1 ml de medios de crecimiento y determinar el número de células usando un hemocitómetro y azul de tripano.
- Resuspender el pellet de VEC en 2 ml de medios de crecimiento VEC y placar las células en un pocillo pre-recubierto de colágeno de una placa de 6 pocillos a aproximadamente 5 x 105 células/cm2. Deje que las células crezcan al menos 3-4 días, luego retire los medios y reponga con medios nuevos. Repita el cambio de medios cada 4 días. Los VEC crecerán en parches en forma de adoquines (Figura 3B, paneles izquierdos).
- Cuando los parches VEC cubren el >80% de la placa, divida las células en aproximadamente 1.3 x 104 células/cm2 dependiendo de qué tan rápido crezcan (si alcanzan el 80% en menos de 1 semana divididas a un número ligeramente menor de células/cm2).
- Para dividir, lave las células dos veces con 2 ml de DPBS y luego agregue suficiente reactivo de disociación para cubrir la superficie de las células. Incubar durante 2-3 min a 37 °C, comprobando que las células no estén sobreincubadas. Detenga la digestión agregando el mismo volumen de medios de crecimiento VEC y transfiera líquido a un tubo de 15 ml. Centrifugar a 180 x g durante 5 min, eliminar el sobrenadante y volver a suspender en el volumen apropiado de medios para el número de pocillos/placas necesarios.
NOTA: Una vez expandidos en una placa de 10 cm, los VEC a veces pueden perder su morfología y cambiar de fenotipo a medida que proliferan. Esto tiende a ocurrir cuando los VEC se siembran en una confluencia baja durante el establecimiento y la expansión de la línea celular. - Para garantizar un cultivo puro, considere utilizar perlas superparamagnéticas CD31 + con cada división.
- Para 1 x 108 o menos células (un plato de 10 cm o menos), preparar 25 μL de perlas superparamagnéticas lavándolas de acuerdo con los protocolos del fabricante.
NOTA: Se recomienda realizar el paso 6.10 antes de la tripsinización de los VEC. - Separar las células como en el paso 6.8 pero resuspender en 500 μL de PBS con BSA al 0,1%, pH 7,4, y colocarlas en un tubo de centrífuga de 2 ml. Añadir 500 μL de perlas lavadas y resuspendidas al tubo de células de 2 ml e incubar en un rotador durante 20 min a 4 °C.
- Coloque los tubos en el imán durante 2 minutos. Mientras el tubo todavía está en el imán, retire con cuidado el sobrenadante. Retire el tubo del imán, agregue 1 ml de PBS fresco con BSA al 0,1%, pipete suavemente 2-3 veces, luego vuelva a colocar el imán durante 2 minutos. Repita 2 veces más. Después de la eliminación final del tampón, resuspenda las células en los medios de crecimiento en el volumen necesario para el rechapado.
NOTA: Las células seguirán teniendo cuentas, pero éstas no afectarán el crecimiento y se eliminarán en pasajes posteriores. - Una vez que las células se han expandido, además de la morfología, confirmar el fenotipo VEC mediante tinción positiva para marcadores inmunofluorescentes como el factor von Willebrand (vWF), cadherina 5 (CDH5) o PECAM-1 / CD31, y tinción negativa para marcadores VIC como calponina 1 (CNN) o actina de músculo liso alfa-2 (αSMA, Figura 4, paneles izquierdos).
7. Aislamiento, expansión y almacenamiento de la celda intersticial de la válvula (VIC)
- Como se indica en el paso 6.4, después de eliminar los VEC del tejido de la válvula, la valva se coloca en un tubo cónico de 15 ml con 7 ml de solución de colagenasa. Incubar durante 12 h en la incubadora de cultivo celular con la tapa ligeramente abierta para permitir el intercambio de gases. El aislamiento exitoso de los CIV todavía puede ocurrir con hasta 18 h en solución de colagenasa.
- Después de la incubación, en una campana de cultivo celular estéril, mezclar el tejido suavemente pipeteando con una pipeta serológica para asegurar la liberación de CIV del tejido de la valva.
- Retire la suspensión celular y pase a través de un filtro de 0,70 μm a un tubo cónico de 50 ml.
- Añadir 7 ml de medio de crecimiento VIC al tubo de 50 ml y centrifugar a 180 x g durante 5 min. Aspirar sobrenadante y resuspender el pellet celular en 1 mL de medio de crecimiento VIC y determinar el número celular. Colocar en placa los CIV en una placa tratada con cultivo de tejidos de 60 mm a 1,3 x 104 células/cm2.
- Deje que las células crezcan al menos 1-2 días antes de reemplazar los medios. Retire los medios y lave dos veces los DPBS para eliminar los residuos residuales y reemplazarlos con un medio de crecimiento fresco. Reponga el medio cada 2-3 días. Los CIC crecerán en forma de fibroblastos (Figura 3B, paneles derechos).
- Cuando los CIC alcancen una confluencia del >90%, lávese dos veces con DPBS para eliminar el exceso de medios y desprenda las células agregando el volumen apropiado de reactivo de disociación precalentado para cubrir la placa (es decir, 2-3 ml por plato de 10 cm). Incubar el plato en una incubadora a 37 °C. Los CIC se desprenderán del plato después de 2-3 minutos de incubación. Agregue 4-6 ml de medios precalentados.
NOTA: Si las células tardan más de 3 minutos en levantarse de la placa, el reactivo de disociación puede haber perdido potencia. Si es necesario, se puede usar un raspador de células para levantar suavemente las células. - Transfiera la suspensión celular a un tubo y centrifugar suavemente a 180 x g durante 5 min. Después de retirar el sobrenadante, resuspenda suavemente el pellet celular en medios de crecimiento VIC precalentados y determine el número de células viables utilizando un hemocitómetro y azul de tripano. Siembre las células viables a una densidad de 1:2 del plato original (es decir, ~ 1 × 106 células por plato de 10 cm o 1.3 x 104 células/cm2).
- Evalúe el fenotipo VIC mediante tinción positiva para marcadores inmunofluorescentes como αSMA, CNN o SM22α y tinción negativa para marcadores VEC como CD31, CDH5 o vWF (Figura 4, paneles derechos).
NOTA: El flujo de trabajo del protocolo presentado aquí selecciona imparcialmente un folleto para el aislamiento de VEC y VIC, mientras que los folletos restantes se utilizan para la tinción de Von Kossa (Sección 5) y la congelación rápida.
8. Almacenamiento celular a largo plazo
- Una vez expandidas, congele las células para su almacenamiento a largo plazo. Lave las células dos veces con 2-5 ml de DPBS y luego agregue suficiente reactivo de disociación para separar las células como en los pasos 6.8 y 7.6. Detenga la digestión agregando el mismo volumen de medios de crecimiento VEC o VIC y transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml.
- Determine el número de células viables mediante el uso de un hemocitómetro y azul de tripano.
- Centrifugar a 180 x g durante 5 min.
- Resuspender las células en medios de crecimiento acondicionados refrigerados a una densidad celular de ~ 3 × 106 células/ml.
- Suavemente con remolinos, agregue un volumen igual de medio de criopreservación 2x refrigerado. Esto llevará la concentración celular a ~ 1.5 × 106 células / ml.
- Alícuota 1 ml en viales de criopreservación. Coloque los viales en un recipiente de congelación celular, ciérrelos e invierta 5-6 veces para asegurarse de que las celdas permanezcan suspendidas. Coloque el envase a -80 °C durante 6-72 h o según el protocolo del envase de congelación. Retirar los viales a -80 °C y transferirlos a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
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Representative Results
El protocolo anterior describe los pasos necesarios para el manejo de tejidos valvulares humanos y el aislamiento y establecimiento de líneas celulares viables a partir de estos tejidos. Las valvas de la válvula aórtica se procesan para la incrustación de parafina, se congelan a presión para su almacenamiento a largo plazo para análisis bioquímicos o genéticos y se digieren para el aislamiento de VEC y CIV (Figura 1). Mientras que las muestras quirúrgicas probablemente tendrán un diagnóstico clínico de estenosis aórtica y pueden exhibir nódulos pesados de calcificación que pueden ser visibles a simple vista, la calcificación de la válvula aórtica está presente en un número significativo de ancianos (>65 años)32, y debido a esta prevalencia todos los tejidos - quirúrgicos y cadavéricos - son sometidos a tinción de Von Kossa o procedimiento similar para evaluar si la calcificación está presente (Figura 2).
Se encontró que el uso de solución de almacenamiento en frío estabilizó en gran medida las células del tejido de la válvula extirpada. La solución de almacenamiento en frío se utiliza en trasplantes de órganos vivos. Se lava a través de los órganos antes o después de la extracción del donante y se deja en la vasculatura de ese órgano durante el transporte en hielo. Se observó que las líneas VEC se establecieron más fácilmente a partir de muestras de donantes que de tejidos quirúrgicos, y las líneas de donantes tenían más probabilidades de retener su morfología de células endoteliales durante más pasajes. Esto fue desconcertante, ya que los tejidos de los donantes a menudo no llegaban al laboratorio durante 12-24 horas postmortem, mientras que el tejido quirúrgico se obtenía entre 2 y 4 horas. Al empacar los tubos de la muestra quirúrgica con una solución de almacenamiento en frío en lugar de PBS, la recuperación celular aumentó considerablemente. Como se ve en la Figura 3, tanto los VEC viables como los VICs se pueden obtener más de 61 horas después de la extracción de la válvula. Si bien se obtiene un porcentaje ligeramente mayor de CIC vivos que de CEV cuando las células se aíslan hasta un día después de la escisión valvular, las células permanecen viables después de 48 horas después de la escisión. Hasta el 40% del total de células recuperadas corresponden a células vivas y hemos observado cifras consistentes entre réplicas biológicas. Además, la inspección morfológica también confirma la identidad celular; mientras que los VEC aparecen como células empaquetadas, similares a adoquines e inhibidas por contacto de crecimiento, la morfología del VIC es similar a los miofibroblastos con forma de huso. La inmunotinción de las muestras confirmó que el 91,8% ± 1,8 (n = 3) de los VEC expandidos fueron positivos para el marcador endotelial vWF, mientras que el 92,0% ± 5,0 (n = 3) de los CIC expandidos fueron positivos para el marcador celular intersticial αSMA (Figura 4). Estas cifras están en línea con los resultados reportados anteriormente33.
Figura 1: Procesamiento de tejido valvular y aislamiento celular de válvulas de control humano y CAVD . (A) Representación esquemática del procesamiento tisular para la evaluación de los niveles de calcificación de las válvulas. (B) Representación esquemática del curso temporal y los pasos para el aislamiento y caracterización de células endoteliales valvulares humanas (VEC) y células intersticiales valvulares (CIV) a partir de tejidos control y CAVD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Evaluación de la calcificación . (A) Imagen representativa de tejidos valvulares control (arriba) y calcificados (abajo) de donantes humanos. Tenga en cuenta que los nódulos de calcificación del tejido CAVD pueden alterar gravemente la morfología y la capacidad de extirpar limpiamente los valvas. (B) Tinción representativa de Von Kossa del tejido valvular de control (izquierda) y CAVD (derecha) después de la fijación y procesamiento posterior del tejido valvular humano. Tenga en cuenta que la calcificación se revela por la presencia de precipitación oscura en el tejido de la valva. Las imágenes de Valve fueron capturadas con una cámara de laboratorio. Las válvulas teñidas de Von Kossa se capturaron con un objetivo de 10x, barra de escala de 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Evaluación de las curvas de supervivencia de VECs y VICs de supervivencia celular (A) VECs y CIV. Se obtuvieron tres foliolos de cinco muestras de válvulas. El primer folioto de cada válvula se procesó inmediatamente (3-12 h después de la extracción), el segundo foliolo se procesó aproximadamente 24 h después (22-35 h) y el tercer foliolo se procesó aproximadamente 48 h después de obtener el tejido (45-61 h). Las valvas de las válvulas se mantuvieron en solución de almacenamiento en frío a 4 °C hasta que se procesaron. El eje y representa el porcentaje de células vivas. (B) Morfología de cultivos sanos de VEC (paneles izquierdos) y CIC (paneles derechos). Los gráficos muestran la proporción media ± de células vivas SD aisladas de n = 5 tejidos valvulares. Las imágenes fueron capturadas con un objetivo 4x y 10x, barras de escala 200 μm y 100 μm, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Tinción inmunofluorescente representativa en VECs y CIV. Los VEC son positivos para el marcador endotelial von Willebrand Factor (vWF, paneles izquierdos), mientras que los VIC son positivos para el marcador intersticial αSMA. Tenga en cuenta que nuestro protocolo de aislamiento garantiza una alta eficiencia de aislamiento; no se detecta contaminación cruzada entre los CEV y los CIV. Las imágenes fueron capturadas con un objetivo 10x, barra de escala 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La obtención de tejidos de control y enfermedades de los seres humanos es fundamental para el modelado de enfermedades in vitro y ex vivo; Sin embargo, mientras que a menudo se habla de los desafíos de cerrar la brecha entre el banco y la cabecera, el orden inverso, pasar de la sala quirúrgica al banco, a menudo es una brecha igual de desalentadora. Esencial para que un científico básico obtenga muestras primarias de tejido humano es una colaboración con un científico cirujano invertido que tenga un equipo de enfermeras, técnicos quirúrgicos, asistentes médicos, estudiantes y residentes de medicina, y gerentes de protocolos clínicos que puedan inscribir y dar su consentimiento a los pacientes, participar y ayudar en el manejo adecuado de los tejidos extirpados y coordinar la logística requerida para la recolección de tejidos. Sin el máximo esfuerzo de todos los involucrados para reducir el tiempo desde la escisión hasta el aislamiento celular, el material celular vital y la información que contiene se alterarán o perderán irreparablemente.
Fundamental para mantener la viabilidad de las muestras de tejido es el uso de una solución de almacenamiento en frío. Esta es la misma solución utilizada por los equipos de trasplante de órganos en UPMC y otros centros médicos de trasplante. Se obtuvo un mejor rendimiento celular de los tejidos cadavéricos que habían sido extirpados del donante muchas horas antes que de los tejidos obtenidos más rápidamente en el quirófano pero mantenidos en PBS frío. Este descubrimiento accidental ha sido esencial para la obtención de células a partir de tejidos humanos. El tiempo de obtención desde la escisión del tejido hasta la entrega en el laboratorio varía de 1 a 5 horas para el tejido quirúrgico y más de 24 horas para el tejido cadavérico. En comparación, la obtención y el procesamiento de tejidos animales a menudo se pueden realizar a los pocos minutos de la eutanasia, lo cual es ideal para la viabilidad celular. En ausencia de solución de almacenamiento en frío, es probable que un medio adecuado para el cultivo de células también pueda funcionar mejor que PBS, sin embargo, este medio no se probó aquí debido al éxito de la solución de almacenamiento en frío en el trasplante de órganos vivos y a la recepción de tejidos cadavéricos en esta solución. La solución es estable en el estante, lo que es ideal para el almacenamiento en quirófanos, y se sabe que ingredientes específicos como la adenosina promueven respuestas beneficiosas al estrés celular como la isquemia / hipoxia21,34.
Otro paso esencial para obtener células viables es lavar los tejidos con fungicida, gentamicina y bactericida. Este breve enjuague ayuda a garantizar que las células permanezcan no contaminadas por bacterias y hongos. Igualmente críticos son los pasos para digerir los VEC fuera del tejido de la válvula, donde en el lapso de unos pocos minutos, los VEC se separan y luego se limpian de la superficie de las valvas de la válvula. La digestión posterior de los CIV que residen en la densa matriz extracelular de la valva tiene mucho más margen de maniobra para la duración y la fuerza. El tratamiento tisular imparcial descrito en este protocolo permite el aislamiento de las dos principales poblaciones celulares presentes en la valva valvular, VECs y VICs. Aunque un reciente análisis del transcriptoma de una sola célula ha demostrado la coexistencia de al menos catorce subtipos celulares diferentes que residen en la válvula humana, incluidas seis células estromales no derivadas de válvulas en el tejido CAVD35, esta diversidad puede representar variaciones debido a los efectos del procesamiento y la digestión de estos tejidos endurecidos, o puede deberse a diferentes microambientes a los que están expuestas las células de la valva: Los VEC están expuestos a dos flujos sanguíneos diferentes, mientras que los CIV están incrustados en tres estratos diferentes de la matriz extracelular 8,9. El protocolo de aislamiento a gran escala y el análisis descritos en este documento aseguran que más del 90% de los VEC y VICs correspondan a su fenotipo principal. Aunque se puede encontrar un grado de heterogenicidad, no afecta los resultados generales del estudio de la homeostasis VEC y VIC 8,9,13,14,15,16.
También es importante tener en cuenta que los pacientes y sus tejidos valvulares, y por lo tanto las líneas celulares obtenidas de ellos, no son idénticos. La genética, las comorbilidades, el manejo durante la cirugía y el procesamiento, y la frescura de los ingredientes de la solución de digestión pueden afectar la tasa de crecimiento e incluso quizás el comportamiento o el fenotipo de las células aisladas. Si bien el presente estudio demuestra la capacidad de producir un número suficiente de células viables con este procedimiento, puede haber diferencias innatas o inducidas en estas líneas celulares que pueden afectar la experimentación posterior. A menudo es difícil saber con precisión el tiempo transcurrido desde que se ha extraído el tejido del paciente o donante, y particularmente en el caso de este último, el tiempo transcurrido desde que se ha detenido la circulación. Además, existe una variabilidad inherente entre los tejidos con respecto al número de células valvulares viables obtenidas, la capacidad proliferativa de las células y la retención del fenotipo celular. Las líneas celulares pueden albergar mutaciones genéticas, ya sean congénitas o somáticas, de las que el médico y el equipo de investigación desconocen, y la remodelación y posterior manipulación de los tejidos también puede modificar el fenotipo celular o incluso la epigenética. Como tal, para todos los experimentos en los que se utilizan estas células humanas primarias, es absolutamente esencial que se utilicen réplicas biológicas, es decir, líneas celulares obtenidas de diferentes pacientes, a pesar del tiempo y el costo sustanciales en los que incurren. Esto ayuda a garantizar que los resultados no se deban a efectos de confusión de la obtención y el procesamiento del tejido. La tasa de proliferación variable de diferentes líneas celulares puede ajustarse recolectando células en experimentos en diferentes momentos o sembrando células para experimentos a diferentes densidades; Ninguna respuesta es la mejor para todos los diseños experimentales. Si bien las complicaciones no son insignificantes, el uso de líneas celulares derivadas de tejido de control humano primario y CAVD para modelos experimentales in vitro y ex vivo es esencial para definir los factores iniciadores y los procesos de propagación que impulsan la patogénesis de la CAVD.
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Disclosures
IS recibe apoyo institucional de investigación de Atricure y Medtronic y sirve como consultor para Medtronic Vascular. Ninguno de estos conflictos está relacionado con este trabajo. Todos los demás autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Jason Dobbins por la perspicaz discusión y la lectura crítica de este manuscrito. Nos gustaría reconocer al Centro para la Recuperación y Educación de Órganos por su ayuda y apoyo y agradecer a los donantes de tejidos y sus familias por hacer posible este estudio. Todas las muestras de pacientes se recogen de individuos inscritos en estudios aprobados por la junta de revisión institucional de la Universidad de Pittsburgh de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Los tejidos cadavéricos obtenidos a través del Centro para la Recuperación y Educación de Órganos (CORE) fueron aprobados por el Comité de Supervisión de Investigación y Capacitación Clínica con Difuntos (CORID) de la Universidad de Pittsburgh.
Algunas figuras creadas con Biorender.com.
CSH cuenta con el apoyo del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre K22 HL117917 y R01 HL142932, la Asociación Americana del Corazón 20IPA35260111.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm filter | Thermo Scientific | 7211345 | Preparing plate with collagen coating |
| 10 cm cell culture plate | Greiner Bio-One | 664160 | Cell culture/cell line expansion |
| 10 mL serological pipet | Fisher | 14955234 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 1000 μL filter tips | VWR | 76322-154 | Cell culture/cell line expansion |
| 10XL filter tips | VWR | 76322-132 | Cell culture/cell line expansion |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339650 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 16% paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710S | Tissue and cell fixative |
| 190 proof ethanol | Decon | 2801 | Disinfection |
| 1x DPBS: no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | Saline solution. VIC/VEC isolation |
| 1x PBS | Fisher | BP2944100 | Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| 20 μL filter tips | VWR | 76322-134 | Cell culture/cell line expansion |
| 200 proof ethanol | Decon | 2701 | Deparaffinizing tissue samples |
| 2-propanol | Fisher | A416P 4 | Making collagen coated plates |
| 5 mL serological pipet | Fisher | 14955233 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 60 mm dish | GenClone | 25-260 | VEC isolation |
| 6-well cell culture plate | Corning | 3516 | Cell culture/cell line expansion |
| Acetic acid, glacial | Fisher | BP2401 500 | Making collagen coated plates |
| AlexaFluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | Fluorescent f-actin counterstain |
| Belzer UW Cold Storage Transplant Solution | Bridge to Life | BUW0011L | Tissue storage solution |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V - Fatty Acid Free 25g | Bioworld | 220700233 | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| Calponin 1 antibody | Abcam | ab46794 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| CD31 (PECAM-1) (89C2) | Cell Signaling | 3528 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| CD31+ Dynabeads | Invitrogen | 11155D | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| CDH5 | Cell Signaling | 2500 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Cell strainer with 0.70 μm pores | Corning | 431751 | VIC isolation |
| Collagen 1, rat tail protein | Gibco | A1048301 | Making collagen coated plates |
| Collagenase II | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray | Decon | 4101 | Disinfection |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | A27977 | Automated cell counter |
| Countess II reusable slide coverslips | Invitrogen | 2026h | Automated cell counter required slide cover |
| Coverslips | Fisher | 125485E | Mounting valve samples |
| Cryogenic vials | Olympus Plastics | 24-202 | Freezing cells/tissue samples |
| Disinfecting Bleach with CLOROMAX - Concentrated Formula | Clorox | N/A | Disinfection |
| DMEM | Gibco | 10569044 | Growth media. VIC expansion |
| EBM - Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500 | Lonza Walkersville | CC3129 | Growth media. VEC expansion |
| EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 - 1 kit SingleQuot Kit | Lonza Walkersville | CC4176 | Growth media supplement. VEC expansion |
| EVOS FL Microscope | Life Technologies | Model Number: AME3300 | Fluorescent imaging |
| EVOS XL Microscope | Life Technologies | AMEX1000 | Visualizing cells during cell line expansion |
| Fetal Bovine Serum - Premium Select | R&D Systems | S11550 | VIC expansion |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Fisherbrand Cell Scrapers | Fisher | 08-100-241 | VIC expansion |
| Fungizone | Gibco | 15290-026 | Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Glass slides | Globe Scientific Inc | 1358L | mounting valve samples |
| Goat anti-Mouse 488 | Invitrogen | A11001 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Mouse 594 | Invitrogen | A11005 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 594 | Invitrogen | A11012 | Fluorescent secondary Antibody |
| Invitrogen Countess II FL Reusable Slide | Invitrogen | A25750 | Automated cell counter required slide |
| Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Invitrogen | R37606 | Fluorescent nucleus counterstain |
| LM-HyCryo-STEM - 2X Cryopreservation media for stem cells | HyClone Laboratories, Inc. | SR30002 | Frozen cell storage |
| Mounting Medium | Fisher Chemical Permount | SP15-100 | Mounting valve samples |
| Mr. Frosty freezing container | Nalgene | 51000001 | Container for controlled sample freezing |
| Mycoplasma-ExS Spray | PromoCell | PK-CC91-5051 | Disinfection |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | Antibiotic. VIC expansion |
| Plasmocin | Invivogen | ANTMPT | Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion |
| SM22a antibody | Abcam | ab14106 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| Sstandard pattern scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Sterile cotton swab | Puritan | 25806 10WC | VEC isolation |
| Swingsette human tissue cassette | Simport Scientific | M515-2 | Tissue embedding container |
| Taylor Forceps (17cm) | Fine Science Tools | 11016-17 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | cell counting solution |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | Splitting VIC/VECs |
| Von Kossa kit | Polysciences | 246331 | Staining paraffin sections of tissues for calcification |
| von Willebrand factor antibody | Abcam | ab68545 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Xylenes | Fisher Chemical | X3S-4 | Deparaffinizing tissue samples |
| αSMA antibody | Abcam | ab7817 | Primary antibody (VIC positive stain) |
References
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