Experimentell design inom ämnet med hjälp av en objektplatsuppgift hos råttor

Summary

Det här protokollet innehåller detaljerade steg för en objekt plats uppgift med fyra upprepningar med samma kohort av råttor. Svag och stark kodning kan ge kort- och långtidsminnen. Protokollets flexibilitet med upprepning kan vara fördelaktigt för studier som involverar kirurgiska operationer genom att spara tid och arbete.

Abstract

Objekt plats erkännande är en framträdande metod som används för att undersöka rumsligt minne hos gnagare. Det här objektets igenkänningsminne ligger till grund för objektplatsaktiviteten. Detta dokument ger ett omfattande protokoll för att vägleda upprättandet av en objektplatsuppgift med möjlighet till upp till fyra repetitioner med samma kohort av råttor. Både svaga och starka kodningsprotokoll kan användas för att studera rumsliga minnen på kort och lång sikt av varierande styrka och för att möjliggöra implementering av relevanta minneshämmande eller -förbättrande manipuleringar. Dessutom tillåter upprepning av testet med den motvikt som presenteras här kombinationen av resultat från två eller flera tester för jämförelse inom försökspersoner för att minska variationen mellan råttor. Denna metod hjälper till att öka statistisk kraft och rekommenderas starkt, särskilt när du kör experiment som ger hög variation i individuellt beteende. Detta förfinar direkt studien genom att öka de data som erhålls från varje djur och minska det totala antalet djur som behövs. Slutligen ökar genomförandet av den upprepade objektlokaliseringsuppgiften effektiviteten i studier som involverar kirurgiska ingrepp genom att spara tid och arbete.

Introduction

Spontana erkännande uppgifter(t.ex. objekt erkännande, objekt plats erkännande) har använts i stor utsträckning i undersökningen av minne hos gnagare. Dessa tester är till skillnad från de olika tester som används för att bedöma minne som baseras på antingen rädsla konditionering eller belöning motivation, genom att spontana erkännande uppgifter baseras enbart på spontana undersökande beteende mot nya stimuli. Detta beteende, som kallas "neotisk preferens"¹, är inneboende hos gnagare såväl som hos andra däggdjursarter och vissa icke-däggdjursdjur som fåglar och fisk². Objektplatsigenkänning, som beror på rumsligt minne, kan observeras med hjälp av objektplatsuppgiften (kallas även spatial objektigenkänningsuppgift)³. Lesion studier har visat att objekt plats erkännande kräver en intakt hippocampus^4,5. På grund av det relativt enkla träningsprotokollet och frånvaron av någon förstärkning är denna uppgift att föredra i många studier. Frånvaron av både positiv och negativ förstärkning minimerar de ytterligare parametrar och hjärnregioner som kan driva beteendet. Därför är beteendet här neutralt och bygger på nyfikenhet och rumsligt minne, vilket möjliggör undersökning av mekanismer som är involverade i kodning, konsolidering och hämtning av det rumsliga minnet.

Protokollet för objektplatsuppgift består vanligtvis av tillvänjningssessioner följt av en enda session med kodnings- och testförsök, åtskilda av en fördröjningsperiod, som varierar från flera minuter till timmar. Det rekommenderas starkt att råttor hanteras i förväg för att minimera djurens stressnivå, och därmed beteende som kan påverka erkännandeminnet, såsom motvilja mot nyhet. På samma sätt spelar ett väl utformat habituation-protokoll en viktig roll för att förhindra stress som kan hindra råttans naturliga beteende under uppgiften. Omfattningen av hantering och tillvänjning varierar dock till stor del mellan laboratorier och experimenterare, vilket kan bidra till låg replicability^6,7,8. I kodningsförsöket ges råttan tid att utforska en arena med två identiska föremål belägna i två utsedda hörn. I testförsöket, som försenas av en period, ges råttan tid att utforska arenan med samma par föremål, men den här gången har en av dem flyttats till en ny plats. Den spontana preferensen som råttorna uppvisar och den resulterande ökningen av tiden som spenderas på att utforska objektet på den nya platsen är vägledande för rumslig igenkänning och minnet av objektplatserna³. Ändring av kodningsstudien (varaktighet och antal upprepningar) påverkar minnets styrka.

Beroende på studiens syfte kan längden på förseningen mellan kodning och testförsök ändras för att modellera proteinsyntesoberoende korttidsminne eller proteinsyntesberoende långtidsminne. Därför kan objekt plats uppgiften användas för en mängd olika studier genom att anpassa protokollet efter behov. Vidare är implementering av experimentella manipuleringar, såsom farmakologiska och optogenetiska interventioner, också möjliga mellan dessa prövningar, liksom in vivo-avbildning. Det finns flera studier^9,10 som rapporterar upprepade iterationer av objektplatsuppgiften inom samma råttkohort. Detta kontrasterar den traditionella användningen där ett djur har en session utan upprepningar. Dessa paradigms effektivitet har dock inte undersökts grundligt, och det finns inte heller några metoddokument som beskriver dessa. Så gott vi vet är detta den första rapporterade beskrivningen av ett protokoll som i detalj beskriver en objektplatsuppgift med upp till fyra repetitioner med samma råttkohort, som också systematiskt jämför resultaten från varje upprepning. Upprepningar kan användas för att balansera experimentella tillstånd för att möjliggöra jämförelse inom försökspersoner med minskad variabilitet mellan testerna. Den tillförlitliga upprepningen av uppgiften gör det möjligt att samla in data, vilket innebär att tillräckligt stor mängd data kan genereras med hjälp av ett relativt litet antal råttor. Slutligen kan upprepningar med samma råtta vara fördelaktiga i experiment som involverar kirurgiska operationer och implantationer genom att minska antalet råttor som krävs som följaktligen sparar tid och arbetskraftskostnader.

Denna studie presenterar ett omfattande protokoll som beskriver hur man utför en objektplatsuppgift hos vuxna råttor med hjälp av starka och svaga kodningsförsök följt av testförsök med 1-h och 24-h förseningar. Det starka kodningsprotokollet producerar statistiskt signifikant igenkänningsminne när det testas med 1-h och 24-h förseningar och kan därför användas för att studera både kortsiktiga och långsiktiga minnen vid implementering av manipuleringar för att hämma dessa minnen¹¹. Däremot producerar det svaga kodningsprotokollet endast betydande korttidsminne när det testas med en 1-h-fördröjning. Frånvaron av långtidsminne kan användas för att studera manipuleringar för att förbättra kvarhållningen av minne^11,12. Det här protokollet innehåller också detaljerade hanterings- och tillvänjningssessioner, som syftar till att öka replicerbarheten för objektplatsuppgiften. Detta dokument visar också upprepning av uppgiften i fyra distinkta sammanhang med samma kohort av råttor med hjälp av det svaga kodningsprotokollet, som bekräftas att producera reproducerbara och konsekventa resultat varje gång.

Protocol

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av de danska nationella myndigheterna (Licensnummer: 2018-15-0201-01405) i enlighet med dansk och EU:s djurskyddslagstiftning.

1. Experimentell installation och förberedelse av distinkta sammanhang

1. Objektplatsarena med sammanhang
   OBS: Inställningen nedan visas i en sluten ljudisolerad låda (figur 1B) med ljuskällan placerad längs takets kanter och kameran placerad i mitten av lådans tak. Arenan, 60 cm x 60 cm med väggar som är 100 cm höga (Figur 1B), placeras inuti lådan och är helt isolerad från det omgivande rummet. Alla rumsliga signaler finns inne på arenan. Detta förenklar processen för att skapa distinkta sammanhang. En liknande isoleringsnivå från det omgivande rummet kan uppnås genom att omsluta en vanlig öppen arena med en enhetlig gardin runt väggarna.
   1. Få en fyrkantig arena av ogenomskinlig, icke-porös hårdplast med minst 60 cm bredd och minst 50 cm höjd. Välj en färg för golvet som kontrasterar mot råttans färg för framgångsrik registrering av råttrörelser av den automatiserade programvaran (om tillämpligt). Placera arenan antingen i en låda (figur 1B) eller på en plattform som omges av en gardin.
   2. För att skapa ett sammanhang, få ett andra lager av infogbara väggar(t.ex. väggbeläggning av samma material som arenan, eller plasttapeter som enkelt kan rengöras) i olika färger och / eller mönster(t.ex. svart, vitt, ränder eller prickar). Sätt in det andra lagret av väggar i arenan så att de skiljer sig från varandra.
   3. Få tredimensionella (3D) rumsliga signaler (1-2 per sammanhang) med dimensioner som varierar mellan 10 cm x 10 cm x 5 cm och 20 cm x 15 cm x 15 cm (bredd x längd x höjd) och har (i) distinkta geometriska former och (ii) färger som kontrasterar väggfärgen. Häng dem på väggarna tillräckligt högt så att råttor inte kan nå dessa signaler.
   4. Få olika par objekt (så många som kontextnumret) som inte är porösa, icke-tuggbara och lätta att rengöra. Sträva efter att ha distinkta geometriska former och texturer för varje nytt objekt. Välj objekt som är mellan 5 och 15 cm breda och höjd (undvik högre objekt). Se figur 1D för exempel på fyra distinkta objekt (koner, fotbollar, rektangulära prismor och triangulära prismor).
      OBS: Varje objekt bör vara av liknande intresse som råttor, så att de totala utforskningstiderna för alla objekt är jämförbara.
   5. Hitta den bästa lösningen för att fästa föremålen på golvet i arenan (t.ex. med hjälp av klibbiga mattor, dubbelsidig tejp, fästa en metallplatta under objektet och en parningsmagnet under arenan etc.).
   6. När du skapar ett annat sammanhang återskapar du väggarna så att de kontrasterar fördelningen av färg och mönster på väggarna från föregående sammanhang. Använd nya rumsliga 3D-signaler som skiljer sig från och kontrasterar mot alla tidigare ledtrådar. Se figur 1C för exempel på fyra olika sammanhang.
   7. Få en ljuskälla som säkerställer en diffus och lika belysning inom arenan och som har ett dimmeralternativ. Justera ljusintensiteten till cirka 100-120 lux i hörnen av arenan efter att ha skapat varje sammanhang. Skaffa en kamera och placera den i mitten av lådans tak.
      OBS: Ljusintensiteten kan justeras till en lägre nivå om automatiserad poängsättningsprogramvara inte används.
2. Objektpyts
   1. Få en hink (>50 cm i diameter). Välj inte en fyrkantig form för att undvika likheter med den experimentella arenan. Fyll den med sängkläder.
   2. Få 5-10 objekt av olika former och storlekar (som skiljer sig från de objekt som ska användas i experimentet) och placera dem slumpmässigt i skopan(figur 1A).

Figur 1: Den experimentella installationen, inklusive fyra olika sammanhang och objekt. (A) Objekthinken för objekttillvänjning. B)Experimentapparaten (till vänster), som omsluter objektets platsarena, kameran och ljuskällan. Den experimentella boxen och arenan före kontextupplägg (mitten) och arena med kontextuppsättning (höger). (C) Fyra sammanhang (1-4) med distinkta väggfärger och mönster, samt tredimensionella rumsliga signaler. (D)Fyra objekt som används i sammanhangen 1-4. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

3. Programvara för kamera och spårning (tillval)
   1. Skaffa programvara som kan användas för att fjärrstyra kamerainspelaren och som kan spåra råtta näsor. Gör programvarujusteringarna för varje specifikt sammanhang och råttstam före varje experiment.
4. Motvikt av objektplatser och experimentella grupper
   1. Förbered möjliga kombinationer av objektplatser för kodnings- och testförsök och namnge dessa som räknare. Skapa kombinationerna så att de täcker alla hörn som objektplatser och objektrörelser från angränsande till diagonala hörn och vice versa ( Figur2A).
   2. Förbered ett schema för det specifika experimentet och matcha varje råtta i en experimentell grupp med en räknare. Använd varje par av de två parade räknarna (figur 2A) inom en grupp, om det finns tillräckligt med råttor. Använd samma uppsättning räknare för båda försöksgrupperna i en enda kodnings-/testsession (figur 2B). Tilldela om räknare för följande sessioner (dvs. varje ny kontext).
      OBS: Kör råttorna i blandad ordning under kodnings-/testsessioner(t.ex.kör inte alla råttor i den ena buren efter den andra; rotera istället burar för att säkerställa en lugn miljö i en bur av mer än en råtta).
   3. När du använder två eller flera sammanhang för att balansera de experimentella grupperna (t.ex. 1-h-minne jämfört med 24-h minnesgrupper), tilldela råttor till varje grupp och ändra grupperna i följande sammanhang (figur 2B).

Figur 2: Representativa motviktsmetoder. (A) Möjliga orienteringar av föremål på arenan vid kodnings- och testförsök namnges som räknare. Objekt 1 är alltid det rörliga objektet. Varannan räknare balanseras så att platsen för det rörliga objektet ändras. Varje hörn är upptaget två gånger och objekt 1 flyttas från diagonal till intilliggande och vice versa under lika många gånger. (B) Exempel på kodnings-/testschema för två motviktssessioner(t.ex. sammanhang 1 och 2). Råttor tilldelas experimentella tillstånd i sammanhang 1 (session X, vänster). En uppsättning räknarpar(dvs. 1-2, 3-4, 5-6 och 7-8) väljs och tilldelas varje råtta i en experimentell grupp. Samma uppsättning räknare tilldelas råttor i båda experimentgrupperna. I följande session i sammanhang 2 (session X+1; höger) ändras råttorna i försöksgrupperna för motvikt och en ny uppsättning räknarpar tilldelas. Tidpunkten i början av kodnings- och testförsöken bör noteras. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

OBS: Alla hanterings-, tillvänjnings- och kodnings-/testsessioner i detta protokoll optimerades under ljusfasen av en 12-h ljus/ mörk cykel, och därför rekommenderas att experiment utförs under ljusfasen.

2. Hantering och tillvänjning

1. Börja hantera råttor som börjar antingen från avvänjning (om råttorna är uppfödda i hemanläggningen) eller 2-3 veckor före början av experiment (om råttorna beställs från en extern anläggning, efter att ha tillåtit dem att acklimatisera sig i en vecka efter ankomsten).
2. Tillbringa minst 10-15 min på varje bur med 4 råttor i 2 eller 3 dagar i veckan tills råttorna är bekväma att röras och plockas upp av experimenteraren. Justera den tilldelade tiden per bur beroende på antalet råttor i en bur.
   OBS: Det är viktigt att alla experimenterare som förväntar sig att arbeta med råttorna är närvarande under hanteringen.
3. I de fall där hanteringen börjar vid avlning, minska hanteringen till ett minimum (valfritt) när denna nivå har uppnåtts. Om du börjar 2-3 veckor före experimenten, fortsätt hanteringen till början av habituation sessioner.
4. Ta råttorna i sina burar till experimentrummet för att vana råttorna till transporten såväl som till experimentrummet. Låt råttor sitta i minst 30 minuter för att ge dem tid att lugna ner sig och vana. Efter denna tid, returnera råttorna / burarna till bostadsrummet.
   OBS: Steg 2.4 kan kombineras med hantering och upprepas så många gånger som behövs. Ytterligare tillvänjning kan genomföras i detta steg om protokollet innehåller ytterligare manipuleringar(t.ex. hantering för injektionsproceduren etc.).
5. Utför objektvana för att vana råttor att interagera med föremål och för att minska allmänna stressnivåer som härrör från upplevelsen av nya miljöer.
   1. För session 1, ta alla hemburar till experimentrummet och låt råttorna vana vid rummet och bosätta sig i minst 30 minuter. Sätt råttor (2-4 råttor) från samma bur tillsammans i hinken i 20 min. Rengör hinken genom att ta bort avföring mellan varje grupp råttor. Upprepa proceduren för alla burar. Lägg alla råttor i sina hemburar och återvänd till bostadsrummet.
   2. För session 2, på en separat dag ta alla burar till experimentrummet och lämna i minst 30 minuter. Lägg varje råtta individuellt i hinken i 10 min. Placera råttan tillbaka i hemburen och rengör hinken efter varje råtta. Lämna tillbaka alla burar till bostadsrummet.
   3. Upprepa steg 2.5.2 en separat dag för session 3.
6. Om den experimentella apparaten är en sluten låda (figur 1B), välj att utföra tom låda vana att vana råttorna till den nya experimentella apparaten. I session 4, ta alla burar till experimentrummet och lämna i minst 30 minuter. Placera råttor från samma bur tillsammans (2-4 råttor) i den tomma arenan utan sammanhang eller rumsliga signaler (Figur 1B,mitten) i 20 min. Placera alla råttor tillbaka i hemmaburen och torka arenan med 70% etanol efter varje grupp råttor.
   OBS: Steg 2.5 och 2.6 ska utföras under en enda vecka, före kontextveckan (steg 2.7; se figur 3). En paus i ett par dagar under dessa steg är acceptabelt. Efter start steg 2.7 ska dock varje steg utföras på på varandra följande dagar enligt specifik, fram till slutet av testförsöket (steg 2.9).
7. Utför sammanhangsvana för att vana råttor till sammanhanget och 3D-signaler, för att minska allmänna stressnivåer och för att stödja det rumsliga lärandet i miljön.
   1. Ändra den tomma arenan för att skapa den första kontexten enligt beskrivningen i avsnitt 1.1, men placera inte föremålen i arenan. Förbered inspelningsutrustningen.
   2. För session 1, ta alla burar till experimentrummet och lämna i minst 30 minuter. Starta inspelaren om du gör detta manuellt. Placera den första råttan i mitten av arenan och låt råttan utforska arenan i 10 minuter. Stoppa sedan inspelaren (om manuell) och placera råttan tillbaka i hemburen. Torka av arenan noggrant med 70% etanol efter varje råtta och returnera alla burar till bostadsrummet när det är klart.
   3. För sessioner 2 och 3, upprepa steg 2.7.2 för varje råtta under två på varandra följande dagar så att det finns totalt 3 sessioner av kontext tillvänjning per råtta.
      OBS: Överväg att blanda i vilken ordning råttor går in i arenan, särskilt när det handlar om en stor grupp. Detta undviker att köra specifika råttor upprepade gånger vid samma tid på dagen.

Bild 3: Utformningen av beteendeexperimentet, inklusive hanterings-, habituation- och objektplatsuppgiftsprotokoll. Råttor bör hanteras regelbundet från och med några veckor före tillvänjningsveckan. I vecka 0 utförs objekt- och experimentboxvanor över 4 sessioner med minst 24-timmars intervall däremellan. I vecka 1 utförs kontextvana under 3 på varandra följande sessioner med 24-timmars intervall däremellan, följt av kodning och testförsök. Det bör finnas minst 48 timmar och upp till 1 veckas intervall innan du fortsätter med följande session(t.ex. börja vana vid nästa sammanhang i vecka 2 eller 3). Förkortning: Hab., habituation. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

8. Kodningsprövning (session 4)
   OBS: Vid farmakologiska manipuleringar kan en rimlig tid för administrering av ett medel vara antingen före eller omedelbart efter kodningsprövningen och/eller före teststudien beroende på det farmakologiska medlets art.
   1. Ta alla burar till experimentrummet och lämna i minst 30 minuter. Använd det schema som förberetts i förväg (figur 2B), placera det första identiska paret objekt på de angivna platserna (i 2 hörn och ett avstånd av >10 cm från respektive vägg; en L-formad bit kartong kan användas för att hålla samma avstånd varje gång) genom att använda klibbiga mattor eller dubbelsidig tejp.
   2. Starta inspelaren (om den är manuell). Placera den första råttan i arenan vänd mot en vägg eller ett hörn som inte upptas av något objekt (lika avstånd till varje objekt).
      OBS: Följ stegen nedan för antingen svag eller stark kodning.
   3. För svag kodning (1 försök), låt råttan utforska arenan och föremål i 20 minuter. Stoppa sedan inspelaren (om den är manuell) och placera råttan tillbaka i hemburen. Ta bort föremålen och torka av både föremålen och arenan noggrant med 70% etanol.
   4. Upprepa steg 2.8.3 för alla råttor så att varje råtta får 1 kodningsförsök på 20 min.
   5. För stark kodning (3 försök), låt råttan utforska arenan och föremål i 5 minuter. Stoppa sedan inspelaren (om den är manuell) och placera råttan tillbaka i hemburen. Ta inte bort objekten. Torka av arenan och föremålen med 70% etanol.
   6. Upprepa steg 2.8.5 ytterligare två gånger med samma råtta så att det finns totalt 3 försök. Placera råttan tillbaka i hemburen när tiden är slut. Ta bort föremålen för noggrann rengöring och torka av föremålen och arenan med 70% etanol.
      OBS: Inter-trial intervall för en råtta bör vara ca 1-2 min.
   7. Upprepa steg 2.8.5-2.8.6 för varje råtta.
   8. Om fördröjningstiden är kortare än 24 timmar, håll burarna i experimentrummet tills testförsöket. Om inte, returnera alla burar till bostadsrummet när de är klara.
9. Testversion (session 4)
   OBS: Fördröjningsperioden ska räknas från början av kodningsprövningen.
   1. Vid en fördröjning på 24 timmar (eller någon försening som kräver att testförsöket utförs följande dag), ta alla burar till experimentrummet och lämna tillräckligt med tid före det första testet så att råttorna kan lämnas i minst 30 minuter. Enligt schemat placerar du objekten på de angivna platserna (ett av objekten på en ny plats).
   2. När det är dags startar du inspelaren (om den är manuell). Placera den första råttan i arenan vänd mot en vägg eller ett hörn som inte upptas av något objekt (lika avstånd till varje objekt).
   3. Låt råttan utforska arenan och föremålen i 5 minuter. Stoppa sedan inspelaren (om den är manuell). Placera råttan i hemburen igen. Ta bort föremålen och torka av både föremålen och arenan noggrant med 70% etanol.
   4. Upprepa stegen 2.9.2-2.9.3 för varje råtta. Lämna tillbaka alla burar till bostadsrummet.
      OBS: Starta habituationprotokollet från steg 2.7 (kontextvana) efter ett intervall på minst 48 timmar och upp till 1 vecka i varje efterföljande kodnings-/testsession.

3. Dataanalys

1. För varje råtta, poäng utforskningstiden för varje objekt i både kodnings- och testförsöken med hjälp av programvara som utformats för detta ändamål eller med hjälp av en manuell installation. Poängkodningsförsök under hela varaktigheten. Poängtestförsök i 2 minuter för bästa diskrimineringsprestanda³. Om du använder automatisk poängsättning av programvara online exporterar du poängdata från programvaran.
2. Räkna prospekteringstiden när råttan är i kontakt med objektet, sniffa objektet eller vända mot objektet på ett avstånd mindre än 2 cm. Inkludera klättring och sittande på objektet som utforskning om inte råttans uppmärksamhet verkar vara någon annanstans än objektet(t.ex. titta bort från objektet).
3. Beräkna den totala prospekteringstiden för båda objekten för varje råtta. Överväg att utesluta alla råttor som har en total prospekteringstid på mindre än 10 s i teststudien (för 2 minuters poängsättning) från detta test, eftersom det kan återspegla otillförlitlig utforskning.
4. Beräkna procentandelen utforskning för varje objekt (ekvation 1) eller diskrimineringsindex (DI) för varje råtta (ekvation 2) och beräkna medelvärden för grupperna.
   (1)
   
   OBS: Om % prospektering är 50% eller DI är 0, betyder det att prestandan är på chansnivå, och råttan har ingen preferens för något av objekten. Den genomsnittliga procentuella utforskningen och DI under kodningsförsök bör vara ~ 50% respektive 0. Alla råttor som visar en preferens som är högre än [medelvärdet ± (2 × SD)] för något av objekten i kodningsförsöket bör uteslutas från analysen av respektive test. Detta möjliggör tillförlitlig tolkning av preferensen i testförsöket som minne för den stabila objektplatsen. Det här värdet kan beräknas för ett enskilt test eller för kombinerade kodningsdata från flera tester.
5. Analysera data med den metod som bäst passar den experimentella installationen. Använd ett t-test medett exempel för att upptäcka en signifikant preferens över chansnivån.
6. När du använder mer än ett sammanhang med motvikt kombinerar du resultaten av samma experimentella tillstånd i olika sammanhang.
   OBS: Detta kommer att resultera i grupper som består av samma råttor, vilket möjliggör jämförelse inom försökspersonen med hjälp av ett parat t-testför två grupper och med hjälp av upprepade måttanalys av varians (ANOVA) för mer än två grupper.

Representative Results

Här visas de representativa resultaten för både de starka och svaga kodningsprotokollen som beskrivs med hjälp av hantyneshydroxilas (Th)-Cre transgena råttor¹³ med Long-Evans stam backcrossed fyra gånger till Lister Hooded stam och vild typ Lister Hooded råttor. Th-Cre transgena råttor användes eftersom denna råttlinje kommer att användas i framtida studier som involverar optogenetik. Med varje protokoll testades minnet med förseningar på 1 och 24 timmar. Tester vid 1 h visar korttidsminne, medan 24-h tester visar långtidsminne. Uteslutningsvärdet för kodningsinställningar beräknades enligt beskrivningen i protokollet med hjälp av kombinerade data från fem tester (starka och svaga kodningsprotokoll) som [50,8 % ± (2×10,8 %)]. Råttor som hade en kodningspreferens över och under dessa värden uteslöts från analyserna av respektive test.

För starka kodningsförsök användes 16 råttor, och för svaga kodningsexperiment användes 19 råttor. Under de starka kodningsförsöken (3 × 5 min kodning; Figur 4A), det fanns ingen signifikant preferens för något av objekten (52,0 ± 1,9%, n = 16, t₁₅ = 1, 1, 1, p = 0,29; ett prov t-test kontra chansnivå). Detta starka kodningsprotokoll ledde till preferens för objektet på den nya platsen, som visas i termer av genomsnittlig procentuell utforskning, som var betydligt högre än chansnivån (50%) i tester med både 1-h och 24-h förseningar (1-h minne, 77,9 ± 2,4%, n = 8, t₇ = 11,8, p < 0,001; 24-h minne, 65,2 ± 5,3%, n = 8, t₇ = 2,8, p = 0,025; ett prov t-test kontra chansnivå). Det fanns ingen signifikant skillnad mellan 1-h och 24-h minne (p = 0,056; unpaired Welchst-test).

Under de svaga kodningsförsöken (20 min kodning; resultat poolade från fyra sammanhang; Figur 4B), det fanns ingen signifikant preferens för något av objekten (51,1 ± 1,0%, n = 66, t₆₅ = 1,2, p = 0,24; ett prov t-test kontra chansnivå). Detta svaga kodningsprotokoll gav en betydande ökning av preferensen för objektet på den nya platsen jämfört med slumpnivån i tester med en 1-h-fördröjning, men inte 24-h fördröjning (kombinerade data från alla fyra sammanhangen; 1-h minne, 66,7 ± 2,0%, n = 32, t₃₁ = 8,2, p < 0,001; 24-h minne, 49,6 ± 2,6%, n = 34, t₃₃ = 0,16, p = 0,87; ett prov t-test kontra chansnivå). Det fanns en signifikant skillnad mellan prestandan i tester med 1-h och 24-h förseningar (1-h minne: n = 32, 24-h minne: n = 34, t_61,5 = 5,2, p < 0,001; unpaired Welchs t-test).

Minne på gruppnivå observerades inte i 24-h fördröjning testet som indexeras av chans-nivå prestanda, men visade individuella variationer. Denna högre variation för svaga till minnesfria förhållanden (t.ex.24-h-test) observerades ofta på grund av mer slumpmässig utforskning av objekten. Därför är det viktigt att inte tolka råttornas prestanda individuellt. I stället kan distribution av enskilda datapunkter användas tillsammans med gruppgenomsnittet som det tillförlitliga resultatet av testet. Ju starkare kodningen är, desto mer enhetlig blir råttornas beteende, och ju färre råttor som behövs för att nå statistisk signifikans, vilket kan observeras i figur 4A för det starka kodningsprotokollet. Däremot behövs större grupper för att uppnå tillförlitliga resultat för svaga förhållanden (figur 4B).

Figur 4: Minnesprestanda efter stark och svag kodning. (A) Den starka kodningsstudien (3 × 5 min kodning) följt av antingen 1-h eller 24-h testförsök. Det fanns ingen signifikant preferens för något av objekten under kodningsförsök (n = 16). Den starka kodningen gav betydligt ökad preferens för objektet på den nya platsen i testerna med både 1-h och 24-h förseningar jämfört med chansnivå (1-h och 24-h minne: n = 8 i varje grupp). Det fanns ingen signifikant skillnad mellan grupperna. B)Den svaga kodningsstudien (20 minuters kodning) följt av antingen 1-h eller 24-h testförsök. Det fanns ingen signifikant preferens för något av objekten som grupp under kodningsförsök (n = 66). Den svaga kodningen gav betydligt ökad preferens för objektet på den nya platsen i testet med en 1-h, men inte 24-h fördröjning, jämfört med chansnivå (1-h minne: n = 32; 24-h minne: n = 34). Det fanns en betydande skillnad mellan prestandan i tester med 1-h och 24-h förseningar. Resultaten samlades från fyra sammanhang. Enskilda datapunkter presenteras som punkter. Alla staplar visar procentandelen utforskning av objektet på ny plats som medelvärde ± SEM. *p < 0,05, ***p < 0,001; t-test med ettprov jämfört med chansnivå (50 %, streckad linje). ^###p < 0.001; ns, inte betydande; Opared Welchs t-test. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

En betydande fördel med detta etablerade protokoll är att det kan utföras fyra gånger med hjälp av fyra distinkta sammanhang (figur 1C) med samma kohort av råttor. Resultaten i figur 5 visar ett möjligt sätt att använda motvikt med två experimentella grupper (1-h och 24-h minnesgrupper). De två grupperna uppvägdes i två sammanhang (sammanhangen 1 och 2), och detta upprepades i ytterligare två sammanhang (sammanhangen 3 och 4. Figur 5A). Resultaten från de fyra sammanhangen presenteras individuellt i figur 5BD ,därminnet för varje försöksgrupp bedömdes genom att jämföra preferensen med chansnivån i varje sammanhang (1-h minne: Sammanhang 1, 69,9 ± 3,6%, n = 9, t₈ = 5,5, s. < 0,001; Sammanhang 2, 65,6 ± 3,9%, n = 9, t₈ = 4,0, p = 0,004; Sammanhang 3, 65,2 ± 3,8%, n = 7, t₆ = 4,0, p = 0,007; Sammanhang 4, 65,3 ± 5,6%, n = 7, t₆ = 2,7, p = 0,035; 24-h minne: Kontext 1, 45,1 ± 6,4%, n = 9, t₈ = 0,77, p = 0,46; Sammanhang 2, 49,1 ± 4,9%, n = 9, t₈ = 0,18, p = 0,86; Sammanhang 3, 57,2 ± 4,1%, n = 8, t₇ = 1,7, p = 0,12; Sammanhang 4, 47,6 ± 4,7%, n = 8, t₇ = 0,52, p = 0,62; ett prov t-test kontra chansnivå).

I sammanhangen 1, 2 och 4 visade jämförelsen mellan grupperna signifikanta skillnader mellan 1-h och 24-h minne (1-h minne kontra 24-h minne: Sammanhang 1, t_12,7 = 3, 4, p = 0, 005; Sammanhang 2, t_15,2 = 2,6, p = 0,019; Sammanhang 3, t_13,0 = 1,4, p = 0,17; Sammanhang 4, t_12.2 = 2.4, p = 0.032; unpaired Welchs t-test). För en bättre representation och jämförelse inom ämnet av uppgifterna kombinerades resultaten från två motviktssammanhang (figur 5C,E). De kombinerade experimentella grupperna jämfördes med slumpnivån individuellt igen (sammanhang 1 och 2 kombinerade: 1-h minne, 67,8 ± 2,6%, n = 18, t₁₇ = 6,7, p < 0,001; 24-h minne, 47,1 ± 3,9%, n = 18, t₁₇ = 0,74, p = 0,47; Sammanhangen 3 och 4 kombinerade: 1-h minne, 65,3 ± 3,3%, n = 14, t₁₃ = 4,7, p < 0,001; 24-h minne, 52,4 ± 3,2%, n = 16, t₁₅ = 0,73, p = 0,48; ett prov t-test kontra chansnivå). Sedan jämfördes de experimentella grupperna med varandra.

I båda sammanhangsparen fanns det betydande skillnader mellan grupper som avslöjades av jämförelser inom ämnet (1-h minne kontra 24-h minne: Sammanhang 1 och 2 kombinerade, t₁₆ = 3,5, p = 0, 003; Sammanhangen 3 och 4 kombinerade, t₁₃ = 2,4, p = 0,032; parat t-test). Jämförbara resultat erhölls också med lister hooded-råttor av vildtyp i det svaga kodningsprotokollet med hjälp av sammanhangen 1 och 4 för de två motviktssessionerna (data visas inte). Resultatensplicerbarhet och tillförlitlighet validerades genom att jämföra varje datamängd med enkelvägs-ANOVA. Ingen signifikant skillnad upptäcktes mellan de fyra sammanhangen (1-h minne: F_3,28 = 0,31, p = 0, 81; 24-h minne: F_3,30 = 0,99, p = 0,41). Därför kan objektplatstestet upprepas tillförlitligt med minsta möjliga påverkan av upprepningar, med tanke på att instruktionerna i detta protokoll följs.

Figur 5: Olika sätt att presentera och analysera resultaten av det svaga kodningsprotokollet med två experimentella grupper som balanseras över två sessioner. (A) Den experimentella designen för motvikt med två experimentella grupper (1-h och 24-h minnesgrupper) över två sessioner (sammanhang 1 och 2). Motvikten upprepades i ytterligare två sessioner (sammanhangen 3 och 4). Boch D) Resultaten från varje sammanhang och de experimentella grupperna jämfördes individuellt med slumpnivå och med varandra. I alla fyra sammanhangen höjdes preferensen för objektet på den nya platsen i tester med en 1-h-fördröjning avsevärt jämfört med chansnivån [Sammanhang 1 och 2: n = 9 per grupp (B); Sammanhang 3 och 4: n = 7 per grupp (D)]. I 24-h fördröjningstester skilde sig inte preferensen för objektet på den nya platsen från slumpen (sammanhang 1 och 2: n = 9 per grupp; Sammanhang 3 och 4: n = 8 per grupp). Det fanns en betydande skillnad mellan försöksgruppernas preferenser i sammanhangen 1, 2 och 4, men inte sammanhang 3, vilket framgår av jämförelsen mellan försökspersonerna. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; t-test med ettprov jämfört med chansnivå (50 %, streckad linje). ^#p < 0,05; ^##p < 0,01; ns, inte betydande; Opared Welchs t-test. C och E. Resultaten presenteras efter att ha kombinerat de experimentella grupperna från de två motviktssammanhang [sammanhangen 1 och 2 tillsammans, n = 17 per grupp (C). Sammanhangen 3 och 4 tillsammans, n = 14 per grupp (E)]. Preferensen för objektet på den nya platsen ökade betydligt jämfört med chansnivån i tester med en 1-h, men inte 24-h fördröjning, i båda sammanhangsparen. Jämförelsen mellan försöksgrupperna inom försöksgrupperna visade betydande skillnader mellan preferenserna för objektet på den nya platsen i tester med 1-h och 24-h förseningar i båda sammanhangsparen. p < 0,001, t-test med ettprov jämfört med chansnivå (50 %, streckad linje). ^#p < 0,05, ^#p < 0,01; parat t-test. Enskilda datapunkter presenteras som punkter. Alla staplar visar procentandelen utforskning av objektet på den nya platsen som ± SEM. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Discussion

Objektplatsuppgiften kan användas i en mängd olika studier för att undersöka rumsligt minne enligt beskrivningen tidigare. Flexibiliteten i installationen möjliggör modellering av korttids- och långtidsminne av olika styrkor, och det kan enkelt implementeras till en låg kostnad. Men eftersom det finns många parametrar i protokollet som kan påverka resultaten, och olika studier varierar något i dessa parametrar⁶, kan man möta svårigheter att framgångsrikt genomföra uppgiften för första gången. Ovanstående protokoll är avsett att vägleda läsarna genom denna process smidigt. Ytterligare avgörande åtgärder som kan vara betydande för ett framgångsrikt genomförande av uppgiften med hög replicability kommer att diskuteras nedan.

Även om kodnings-/testsessionen ofta är i fokus när du kör objektplatsexperiment, har hanterings- och habituationprotokoll en djupgående effekt på resultatet av denna typ av beteendetester där resultatet beror på ostört naturligt råttbeteende^14,15. Som sådan bör stegen före kodnings-/testsessionen utformas med försiktighet, eftersom de kan påverka råttas beteende och minne och följaktligen påverka slutresultatet. En bra nivå av hantering och tillvänjning så att råttor blir bekanta med experimenteraren och uppgiften kommer att minimera effekten av stressfaktorer samtidigt som sannolikheten för att uppvisa naturligt beteende^{ökar 8}. Som nämnts i protokollet kan hanteringen börja så tidigt som avröjning av valpar om råttstammen bibehålls i hemanläggningen. Baserat på tidigare erfarenheter (data som inte visats) och från flera tidigare studier^16,17, resulterar denna tidiga hantering i låg ångest och ökad nyfikenhet under månaderna som följer.

Eftersom objektplatsuppgiften enbart beror på råttornas inneboende undersökande drivkraft, kan förväntat beteende lätt hindras om råttor inte är ivriga att utforska eller ovilliga att närma sig nyhet, som kallas "neofobiskt beteende"¹. Som sådan rekommenderas det starkt att inkludera ett grundligt hanterings- och habituationprotokoll enligt studiens specifika behov. Detta protokoll kan användas som en minimikravsguide, och ytterligare steg kan genomföras (t.ex.om studien ska inkludera injektioner i ett senare skede krävs tillvänjning till injektionsförfaranden och specifik hållposition). Stammen och åldern på de experimentella råttorna är två andra inflytelserika faktorer och bör övervägas innan man planerar ett experiment för att undvika suboptimala resultat. Olika råttstammar kan ha olika beteenden och baslinje^{ångestnivåer 18,19,20} och därför kan specifik justering av protokollet krävas beroende på den belastning som används.

Detta protokoll bekräftas fungera bra med Th-Cre transgena råttor med Long-Evans stam backcrossed fyra gånger till Lister Hooded stam och vild typ Lister Hooded råttor. En logiskt idealisk startålder för råttor i beteendeexperiment är cirka 12^{veckor 20}, men variabilitet mellan stammar och de specifika kraven för uppgiften bör beaktas. Det kan också vara möjligt att använda utvecklande råttor om det är av intresse för studien, även om justeringar av protokollet kan krävas och inte omfattas här. Det är dock viktigt att överväga om råttan vid en viss ålder har utvecklat de kognitiva funktioner som krävs för att framgångsrikt utföra denna uppgift. En studie^{21 som} undersöker detta har rapporterat att endast de tonåriga råttorna vid postnatal dag 38 och inte tidigare, visade allocentric rumsligt minne återspeglas i preferens för objekt på den nya platsen, som observerats hos vuxna råttor. Protokollet som presenteras här var framgångsrikt med råttor som var 15-16 veckor gamla i början av den första kodning / testsessionen. Tidigare producerade samma starka kodningsprotokoll suboptimala till negativa resultat när man använde 23 veckor gamla råttor som inte hade nått den optimala nivån av tillvänjning på grund av brist på hantering och tillvänjning i en ung ålder. Dessa råttor misslyckades antingen med att prestera annorlunda än chansnivå eller i själva verket uppvisade aversion mot nyhet som observerats i termer av preferens för de stabila objekten istället för de förskjutna objekten (data visas inte). Dessa resultat ger bevis för att åldern och tidpunkten för hanteringsvana kan ha en inverkan på effektiviteten av tillvänjning och som ett resultat bidra till observation av oroligt och neofobiskt beteende i testerna.

Här beskrivs två olika protokoll som säkerställer stark eller svag kodning i objekt plats aktiviteten. Under upprättandet av dessa protokoll observerades att intresset för föremålen minskade efter 5-10 minuters utforskning under enstaka långa prövningar(t.ex. 20 minuters kodning) och råttor slutade så småningom utforska. Detta resulterar i svagare minne av objektplatserna. Ett kodningsprotokoll som sammanflätar kodningsförsök med korta viloperioder(t.ex. 3 x 5 minuters kodning) övervinner detta och leder till hög utforskning under hela försöken. Således påverkar den aktiva utforskningstiden och den olika layouten för dessa två kodningsprotokoll minnets styrka, som är starkare efter 3 x 5 min kodning än efter 20-minuters kodningsprotokoll. Liknande resultat kan också uppnås med något olika varaktigheter med enstaka försök kontra interfolierade prövningsprotokoll, och justeringar kan göras för att passa studiens och råttstammens behov.

I motsats till protokoll som använder ett vanligt vitt öppet fält med endast externa ledtrådar i rummet, använder protokollet som presenteras här en arena med distinkta sammanhang och intra-maze-signaler som sannolikt kräver mer tid att lära sig. Därför rekommenderas tillägg av ett kontext tillvänjningssteg i protokollet före kodningsstudien. Detta gör det möjligt för råttor att bilda en rumslig karta över varje sammanhang under tillvänjning och minska varaktigheten för följande kodningsstudie, eftersom råttorna bara behöver koda objektens platser i förhållande till denna karta. Dessutom kommer kontextvana att göra det möjligt för råttor att vana vid alla möjliga distraktorer i varje sammanhang, till exempel 3D-rumsliga signaler, vilket minimerar beteenden annat än objektutforskning i kodnings-/testsessionen att följa. Med implementeringen av en grundlig motviktsmetodsom består av flera nivåer (dvs. ett brett utbud av objektplatskombinationer (räknare) och riktning på objektförskjutningen minimeras oönskade preferenser som kan stiga på grund av variationer i ljusintensitet och väggfärger /mönster i hörnen av arenan.

Flera faktorer bör beaktas när du upprepar uppgiften för att öka replicability mellan kodning / testsessioner och minimera påverkan av upprepning. För det första måste distinkta sammanhang (så många som antalet upprepningar av kodnings-/testsessioner) utformas för att undvika ackumulering av rumsligt minne som kan orsakas av att de upprepade sessionerna utförs med samma kontext. För att uppnå detta användes en apparat med utbytbara väggar av olika färger och mönster (Figur 1B, C). De distinkta väggarna och 3D-objekten (t.ex. leksaker eller små vardagliga föremål med distinkta färger och former, se protokoll och figur 1C)som hänger på väggarna är de rumsliga signaler och landmärken som råttorna potentiellt använder för att lära sig objektplatser i förhållande till sina sammanhang. Om ett test inte ger företräde för det flyttade objektet kan du överväga att ändra dessa parametrar för kontexten (väggdesign och rumsliga signaler). Alternativt kan en rektangulär eller cirkelformad arena användas för objektplatsuppgifter i stället för en fyrkantig arena som i detta protokoll. Cirkulära arenor rapporteras eliminera^{hörnpreferenser 22} som ofta observeras på arenor med hörn, och därför kan det vara fördelaktigt när man hanterar en särskilt hög ångest råtta eller musstam. Även om kraven på att skapa fyra distinkta sammanhang i detta protokoll fungerar optimalt med en kvadratisk form, kan en cirkulär arena också göras funktionell efter vissa justeringar.

För det andra bör intervallen mellan varje kodnings-/testsession fastställas så att råttorna behåller samma intressenivå varje gång, samtidigt som risken för kumulativt lärande som följer av ett tätt repetitionsschema undviks. Vanligtvis är ett intervall på minst dubbelt så lång tid som fördröjningstiden mellan kodning och testförsök tillräckligt, med längre intervaller som är mer gynnsamma för mer än två repetitioner. Detta innebär att även om minst 48-timmarsintervall efter ett 24-timmarstest är tillräckligt för en eller två repetitioner, rekommenderas med hjälp av ett 1-veckorsintervall för fyra repetitioner. Som resultaten i figur 5 och jämförelsen med ANOVA visar kan uppgiften upprepas fyra gånger. Baserat på detta kan det etablerade protokollet användas för att balansera upp till fyra experimentella tillstånd. Antalet experimentella grupper avgör antalet upprepningar av kodnings-/utvärderingssessioner i olika sammanhang. Resultaten i figur 5 representerar ett möjligt sätt att använda protokollet med två experimentella grupper. Grupperna balanserades upp i två sessioner och samma villkor upprepades i ytterligare två sessioner (för valideringsändamål). Den andra uppsättningen motviktssessioner kan också användas för att balansera nya villkor. På samma sätt kan tre eller fyra experimentella tillstånd jämföras med tre eller fyra motviktssessioner.

I dessa fall bör sammanhangen utformas så att de passar kontrasterande egenskaper som beskrivs i protokollet. Det är anmärkningsvärt att den motviktskonstruktionen kanske inte är lämplig för experiment där ytterligare manipuleringar, såsom ett farmakologiskt ingrepp som kan lämna en långvarig effekt eller skada, ska användas. För att bibehålla testernas effektivitet och replicability bör försöket utformas i enlighet därmed. Data från upprepade tester kan presenteras och analyseras på flera sätt, vilket visas i figur 5. För en första analys kan försöksgrupperna i varje sammanhang jämföras individuellt med slumpnivå med hjälp av ett urval t-test för att fastställa någon signifikant preferens(figur 5B,D). Detta kan vara till hjälp för att få en snabb förståelse för data, men det säkerställer bara en indirekt jämförelse av grupperna. Så för att jämföra två eller flera grupper bör data analyseras med två-prov t-tester (parat eller oparat) respektive ANOVA. Detta kan ske i form av jämförelse mellan grupperna mellan försökspersonerna inom en enda kodnings-/testsession(figur 4A och figur 5B,D)eller jämförelse inom ämnet av grupperna från två (eller flera) motviktssammanhang (figur 5C,E). Den senare metoden rekommenderas starkt, särskilt när man hanterar svaga minnesförhållanden, vilket, som förklarats tidigare, resulterar i hög varians på grund av slumpmässighet i beteendet.

Att kombinera de motbalanserade kontexterna leder till större grupper som krävs för att på ett tillförlitligt sätt visualisera gruppens beteende med minimal variation. Med hjälp av ett protokoll med upprepningar i motviktssessioner kan man förvänta sig en minskning av antalet råttor till cirka en tredjedel av det antal som skulle krävas med hjälp av ett enda test med samma statistiska effekt. Vanligtvis är provstorlekar i ett intervall av 7 till 15 råttor (totalt) för motviktssessioner och i ett intervall av 20 till 50 råttor (10 till 25 per grupp) för en enda session med en effektstorlek och effekt som båda är större än 0,8 tillräckliga. Minskningen av antalet djur som behövs och ökningen av den information vi får från varje djur som använder detta protokoll förfinar både studien och tjänar 3R-principerna om etisk användning av djur i forskning. Det är viktigt i detta steg att komma ihåg att slumpmässigt råttbeteende, som inte åtföljs av ett starkt minne, kan resultera i individuella starka preferenser både under och över chansen, men gruppgenomsnittet bör ge en preferens som inte skiljer sig väsentligt från slumpen. Enskilda uppgifter bör tolkas noggrant. Fördelningen av enskilda datapunkter inom en grupp kan också vara informativ för tolkning av resultat. Som ses i figur 4 och figur 5ändras fördelningen beroende på minnets styrka. Sammantaget kan protokollet som presenteras här enkelt följas för att implementera objektplatsuppgiften med upprepningar för att modellera kortvarig och/eller långsiktig rumsligt minne. Det enkla och flexibla utbildningsprotokollet och möjligheten att genomföra ytterligare manipuleringar gör denna uppgift till ett populärt val. Dessa ändringar av protokollet möjliggör undersökning av särskilda steg som minneshämtning, konsolidering och återkallande.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Open-field/experimental box	O'Hara & Co (Japan)	OF-3001	Open-field box for the object location task
Object 1: cones	O'Hara & Co (Japan)	ORO-RR
Object 2: footballs	O'Hara & Co (Japan)	ORO-RB
Object 3: rectangular blocks	O'Hara & Co (Japan)	ORO-RC	Rectangular blocks were modified after purchase
Object location task apparatus	O'Hara & Co (Japan)	SPP-4501	Sound attenuating box that contains the open-field box for the object location task
Tracking software	O'Hara & Co (Japan)	TimeSSI	For movement tracking and automated camera functions
Wild-type Lister Hooded rats	Charles River	603