यह प्रोटोकॉल डाउनस्ट्रीम माइक्रोस्कोपी अध्ययनों के लिए एस-चरण कोशिकाओं की कुशलतापूर्वक पहचान करने के लिए एक गैर-आक्रामक विधि का वर्णन करता है, जैसे लेजर माइक्रो-विकिरण द्वारा डीएनए मरम्मत प्रोटीन भर्ती को मापना।
डीएनए क्षति की मरम्मत अत्यधिक प्रतिक्रियाशील वातावरण में कोशिकाओं की आनुवंशिक अखंडता को बनाए रखती है। कोशिकाएं मेटाबोलिक गतिविधियों या यूवी विकिरण जैसे अंतर्जात और बहिर्जात स्रोतों दोनों के कारण विभिन्न प्रकार के डीएनए क्षति को जमा कर सकती हैं। डीएनए की मरम्मत के बिना, सेल के आनुवंशिक कोड से समझौता हो जाता है, प्रोटीन की संरचनाओं और कार्यों को कम करता है और संभावित रूप से बीमारी पैदा करता है।
डीएनए क्षति मरम्मत के क्षेत्र में विभिन्न कोशिका चक्र चरणों में विभिन्न डीएनए मरम्मत मार्गों की स्थानिक गतिशीलता को समझना महत्वपूर्ण है। वर्तमान फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी तकनीक डीएनए क्षति प्रेरण के बाद विभिन्न मरम्मत प्रोटीन की भर्ती काइनेटिक्स को मापने के लिए महान उपकरण प्रदान करती है। कोशिका चक्र के एस चरण के दौरान डीएनए संश्लेषण डीएनए की मरम्मत के बारे में सेल भाग्य में एक अजीब बिंदु है। यह गलतियों के लिए पूरे जीनोम स्क्रीन करने के लिए एक अनूठी खिड़की प्रदान करता है । इसके साथ ही डीएनए संश्लेषण त्रुटियां डीएनए अखंडता के लिए भी खतरा पैदा करती हैं जो गैर-विभाजित कोशिकाओं में सामने नहीं आती है । इसलिए, कोशिका चक्र के अन्य चरणों की तुलना में एस चरण में डीएनए मरम्मत प्रक्रियाओं में काफी अंतर है, और उन मतभेदों को खराब समझा जाता है।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल सेल लाइनों की तैयारी और स्थानीय रूप से प्रेरित डीएनए क्षति साइटों पर एस चरण में डीएनए मरम्मत प्रोटीन की गतिशीलता की माप का वर्णन करता है, एक लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एक 405 एनएम लेजर लाइन से लैस है। टैग किए गए पीसीएनए (mPlum के साथ) का उपयोग एस चरण में डीएनए क्षति भर्ती को मापने के लिए एक AcGFP-लेबल मरम्मत प्रोटीन ऑफ इंटरेस्ट (यानी, EXO1b) के साथ संयुक्त सेल चक्र मार्कर के रूप में किया जाता है।
कोशिकाओं में उत्पन्न होने वाले विभिन्न प्रकार के डीएनए घावों को संबोधित करने के लिए कई डीएनए मरम्मत मार्ग विकसित हुए हैं, जिनमें से सभी अंतरिक्ष और समय दोनों में अत्यधिक विनियमित हैं। कोशिका चक्र के सबसे कमजोर समय में से एक एस चरण है, जब डीएनए संश्लेषण होता है। जबकि प्रसार जीवन के लिए मौलिक है, यह भी एक बड़ी चुनौती प्रदान करता है । कोशिकाओं को अपने जीनोम की वफादार प्रतिकृति सुनिश्चित करने के लिए उत्परिवर्तन से बचने के लिए भविष्य की पीढ़ियों के लिए नीचे पारित किया जाना चाहिए । नतीजतन, प्रसार हस्तक्षेप का एक चिकित्सीय बिंदु प्रदान करता है जिसे ऑन्कोलॉजी के क्षेत्र में चिकित्सीय दृष्टिकोणों के विकास के लिए नियोजित किया गया है।
डीएनए घावों पर प्रोटीन भर्ती का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली सभी प्रमुख तकनीकों की अपनी ताकत और सीमाएं हैं। माइक्रो-विकिरण में बेहतर स्थानिक और लौकिक संकल्प1 है जैसे कि आयनीकरण विकिरण-प्रेरित फोसी (आईआरआईएफ), क्रोमेटिन-इम्यूनोप्रिपिपिटेशन (सीआईपी), या जैव रासायनिक अंशों की इम्यूनोफ्लोरोसेंट इमेजिंग जैसे अधिकांश वैकल्पिक तरीकों की तुलना में। हालांकि, माइक्रो-विकिरण उपरोक्त तकनीकों की मजबूती को लाख देता है जो एक ही समय में बड़ी संख्या में कोशिकाओं का नमूना ले सकता है।
एस चरण में डीएनए मरम्मत की जांच करने के लिए, एक अतुलकृणाक कोशिका संस्कृति आबादी में एस चरण कोशिकाओं को अलग करने में सक्षम होना चाहिए । इसे संबोधित करने के लिए कई प्रसिद्ध तरीके हैं, जिनमें कोशिकाओं का सिंक्रोनाइजेशन, या विभिन्न कोशिका चक्र चरणों का दृश्य शामिल है। हालांकि, दोनों दृष्टिकोण महत्वपूर्ण चुनौतियों और संभावित कलाकृतियों का परिचय देते हैं। प्रारंभिक एस चरण (उदाहरण के लिए, डबल थाइमिडीन ब्लॉक, एफिडिकोलिन और हाइड्रोक्सीयूरिया उपचार) में कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले रासायनिक सिंक्रोनाइजेशन तरीके प्रतिकृति तनाव के प्रेरण के माध्यम से सिंक्रोनाइजेशन प्राप्त करते हैं और अंततः डीएनए स्वयं को नुकसान पहुंचाते हैं। यह एस चरण2में डीएनए मरम्मत प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इन तरीकों के उपयोग को सीमित करता है । सीरम भुखमरी और रिलीज के माध्यम से सिंक्रोनाइजेशन केवल सीमित संख्या में सेल लाइनों पर लागू होता है, मोटे तौर पर कैंसर सेल लाइनों को छोड़कर जो गैर-परिवर्तित सेल लाइनों की तुलना में सेल-चक्र प्रगति के लिए विकास कारकों पर कम भरोसा करते हैं। फ्लोरेसेंस सर्वास्थितिन सेल चक्र संकेतक (FUCCI) प्रणाली सेल चक्र का अध्ययन करने के लिए एक विशेष रूप से उपयोगी उपकरण है, लेकिन एस औरजी-2सेल-चक्र चरणों 3 के बीच अंतर करते समय इसकी एक मौलिक सीमा होती है।
यहां यह दिखाया गया है कि फ्लोरोसेंटी टैग पीसीएनए को एस चरण के लिए गैर-इनवेसिव मार्कर के रूप में टैग किया गया है, जो एफसीआईसीआई सिस्टम की तुलना में अधिक विशिष्टता और लचीलेपन की अनुमति देते हुए रासायनिक सेल-चक्र सिंक्रोनाइजेशन विधियों की कमियों को सीमित करता है। एक मार्कर के रूप में, न केवल पीसीएनए एक अतुल्यकालिक आबादी में एस-चरण कोशिकाओं को उजागर कर सकता है, बल्कि यह एस चरण (यानी, प्रारंभिक, मध्य, या देर से एस-चरण)4के भीतर कोशिकाओं की सटीक प्रगति भी दिखा सकता है। बहिर्जात, टैग किए गए पीसीएनए का कम अभिव्यक्ति स्तर सेल चक्र प्रगति और डीएनए मरम्मत प्रक्रियाओं दोनों के साथ न्यूनतम हस्तक्षेप सुनिश्चित करता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि पीसीएनए उचित डीएनए क्षति प्रेरण के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में भी कार्य करता है क्योंकि यह कई डीएनए घावों की मरम्मत में शामिल है और इसे स्थानीय रूप से प्रेरित डीएनए क्षति स्थलों1,4 में भर्ती कियाजाताहै।
यहां प्रस्तुत किए गए प्रयोगों से यह प्रदर्शित होता है कि एस चरण में EXO1b की भर्ती गतिशीलता को कैसे मापना है और यह अच्छी तरह से स्थापित PARP अवरोधक, ओलापरिब से कैसे प्रभावित होता है। EXO1b नाभिक गतिविधि बेमेल मरम्मत (एमएमआर), न्यूक्लियोटाइड एक्ससेशन रिपेयर (एनईआर), और डबल-फंसे ब्रेक (डीएसबी) मरम्मत सहित डीएनए मरम्मत मार्गों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए प्रासंगिक है। एस चरण में, EXO1b डीएनए रिसेक्शन5के दौरान 3 ‘ एसएसडीएनए ओवरहैंग के गठन के माध्यम से मुताबिक़ पुनर्संयोजन (एचआर) में एक प्रमुख भूमिका निभाता है । EXO1b को डीएनए प्रतिकृति में और फंसाया गया है, जिसमें चेकपॉइंट एक्टिवेशन में भूमिकाओं के साथ रुकी हुई डीएनए कांटे को फिर से शुरू करने के साथ ही प्राइमर हटाने और ओकाजाकी टुकड़ा परिपक्वता को प्रतिकृति 5 में स्ट्रैंड विस्थापन केदौरानपिछड़ने वाले स्ट्रैंड पर फिर से शुरू किया गया है । क्षतिग्रस्त डीएनए साइटों के लिए EXO1b भर्ती पाली (एडीपी-रिबोस) (PAR)6,7के साथ सीधी बातचीत से विनियमित है । EXO1b के कई सेल-चक्र विशिष्ट प्रभावों के कारण, यह पीसीएनए का उपयोग करके एस-चरण विशिष्ट भर्ती अध्ययनों के लिए एक उत्कृष्ट विकल्प है।
महत्वपूर्ण कदम और संभावित प्रोटोकॉल समस्या निवारण/संशोधन
सूक्ष्म विकिरण के लिए उचित ऊतक संस्कृति पोत सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। अधिकांश उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग सिस्टम 0.17 मिमी कवर ग्लास मोटाई के लिए अनुकूलित हैं। उच्च या कम मोटाई इमेजिंग कक्षों या प्लास्टिक पॉलिमर से बने लोगों का उपयोग करना (405 एनएम इमेजिंग के लिए अनुकूलित नहीं), छवि की गुणवत्ता को काफी कम कर सकता है। कांच की सतहों का उपयोग करते समय, सुनिश्चित करें कि वे ऊतक-संस्कृति सेल आसंजन को बढ़ाने के लिए इलाज कर रहे हैं। यदि वे ऊतक-संस्कृति का इलाज नहीं कर रहे हैं, इन कक्षों को लेपित करने की आवश्यकता होगी, उदाहरण के लिए, कोशिकाओं को बोने से पहले पॉली-डी-lysine के साथ । जब कक्षित कवरग्लास में कोशिकाओं चढ़ाना, आदर्श कोशिका घनत्व कोशिका चक्र अनियमितताओं और कोशिकाओं के लिए अतिरिक्त तनाव से बचने के लिए सर्वोपरि है । एक स्थिर तापमान बनाए रखने के लिए प्रयोग से पहले माइक्रोस्कोप घटकों का उचित थर्मल संतुलन समय चूक इमेजिंग भर में ध्यान बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है और समय और नमूनों में एक सजातीय डीडीआर सुनिश्चित करने के लिए भी आवश्यक है।
यह महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को एक स्वस्थ हालत में है माइक्रो विकिरण से पहले आर्टिफैक्युअल डेटा को कम करने के लिए । यदि कोशिकाओं में संक्रमण के बाद अनियमित आकृति विज्ञान है/चयन, कोशिकाओं को कई मार्ग के माध्यम से प्रगति करने की अनुमति जब तक आकृति विज्ञान सामांय करने के लिए रिटर्न । हमेशा सुनिश्चित करें कि उपयोग की जाने वाली कोशिकाएं माइकोप्लाज्मा संदूषण से मुक्त हैं। माइकोप्लाज्मा संक्रमण के कई प्रतिकूल प्रभावों में, यह मेजबान कोशिकाओं को डीएनए क्षति भी पहुंचाता है और उनके डीडीआर रास्तों को प्रभावित कर सकता है14,15। सेल संस्कृति में माइकोप्लाज्मा का पता लगाने का सबसे संवेदनशील तरीका पीसीआर (बनाम डीएपीआई या होचस्ट के साथ पता लगाना) के माध्यम से है।
ब्याज की मरम्मत प्रोटीन का इष्टतम अतिव्यवसंन अंतर्जात स्तरों के बराबर होना चाहिए, हालांकि, पता लगाने के लिए पर्याप्त उच्च। वायरल वैक्टर पर उपयोग किए जाने वाले प्रमोटर, संक्रमण के दौरान वायरल टिटर, और संक्रमण के समय की लंबाई सभी को आदर्श अभिव्यक्ति के स्तर के लिए समायोजित किया जा सकता है। लगातार परिणामों के लिए, सजातीय अभिव्यक्ति के स्तर और सामान्य सेल आकृति विज्ञान सुनिश्चित करने के लिए व्यक्तिगत सेल क्लोन को अलग करें। वेक्टर निर्माणों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है जो उचित सेल-चक्र और डीएनए मरम्मत मार्कर फ़ंक्शन के लिए अंतर्जात स्तर से अधिक टैग पीसीएनए को अधिक नहीं करते हैं। यहां तक कि पीसीएनए ओवरएक्सप्रेशन का निम्न स्तर एस-चरण कोशिकाओं को भेदभाव करने के लिए पर्याप्त है। इस उद्देश्य के लिए रेट्रोवायरल पीबीएई वैक्टर का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है (Addgene #1764, #1765, #1766, #1767)। पीसीएनए को किसी भी मोनोमेरिक रेड(जैसे, एमपलम, मचेरी, एमरूबी, आदि) या मोनोमेरिक ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, एमईजीएफपी, एसीजीएफपी, एमवाबी, एमईओएनग्रीन, एमईमेरल्ड आदि) के साथ टैग किया जा सकता है, जिसे तब बारी-बारी से टैग किया जा सकता है। फ्लोरोसेंटली टैग किए गए पीओआई की कुछ सीमाएं और विचार हैं। फ्लोरोसेंट टैग सामान्य प्रोटीन फ़ंक्शन और स्थानीयकरण को बाधित कर सकता है। इस प्रकार, टैग (एन या सी-टर्मिनल) के स्थान पर विचार किया जाना चाहिए। हमेशा मोनोमेरिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग करें, क्योंकि गैर-मोनोमेरिक वेरिएंट का ओलिगोमेराइजेशन पीओआई के कार्य को प्रभावित कर सकता है।
लेजर सेटिंग्स प्रत्येक इमेजिंग प्रणाली के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए के रूप में ऑप्टिकल पथ के कई घटकों वास्तविक कोशिकाओं में दिया शक्ति को प्रभावित करेगा । लेजर माइक्रो-विकिरण उत्तेजन तरंगदैर्ध्य, एफईआरपी लेजर के बिजली उत्पादन और यदि किसी पूर्व-संवेदीकरण एजेंटों (ब्रोमोडेऑक्सीयूरिडीन या होचस्ट की तरह) का उपयोग किया जाता है, तो कई प्रकार के डीएनए घावों का कारण बन सकता है। 405 एनएम लेजर ऑक्सीडेटिव डीएनए क्षति, एकल और डबल फंसे ब्रेक16,17का कारण बन सकते हैं। उच्च लेजर आउटपुट सेटिंग्स का उपयोग करके, डीएसबी की मात्रा बढ़ जाती है। इस प्रोटोकॉल में पूर्व संवेदीकरण विधियों का उपयोग नहीं किया गया था, लेकिन इन तकनीकों को साहित्य में बहुत शामिल किया गया है और नीचे चर्चा में फिर से छाया हुआ है। हमारी राय में, सबसे अच्छा तरीका है परीक्षण करने के लिए अगर वांछित घाव उत्पन्न होता है ज्ञात डीएनए क्षति मार्ग विशिष्ट जीन की भर्ती के लिए परीक्षण से है । बीईएलआर पाथवे के घटकों एनटीएचएल 1 या ओजीजी 1 की भर्ती से पता चलता है कि ऑक्सीकृत डीएनए बेस10,11,17, 18,19को शामिल किया गया है, जबकि FBXL10 या XRCC5 डीएसबी8,20, 21की उपस्थिति का संकेत देता है। एक्सआरसीसी1 की भर्ती ऑक्सीडाइज्ड डीएनए बेस और सिंगल फंसे ब्रेक (एसएसबी)22, 23की उपस्थिति दोनों को इंगित कर सकती है । एक्सपीसी (यानी, RAD4) एनईआर का एक अच्छा संकेतक है जो पराबैंगनी प्रकाश (यूवी)17,24द्वारा उत्पन्न भारी डीएनए एडक्ट्स को हटा देता है। क्योंकि एक्सोजेनस प्रोटीन की भर्ती से कुछ अनियमितताएं शुरू हो सकती हैं, अंतर्जात डीएनए मरम्मत प्रोटीन या मार्कर (जैसे डबल फंसे ब्रेक के लिए γH2A.X) की इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला विशिष्ट डीएनए घावों की उपस्थिति की पुष्टि कर सकता है। वैकल्पिक रूप से, डीएनए घावों के विशिष्ट प्रकार के खिलाफ उठाए गए एंटीबॉडी का भी उपयोग किया जा सकता है। दिया लेजर शक्ति को समायोजित करने के लिए, दोनों निवास समय और लेजर शक्ति बदला जा सकता है।
गणितीय मॉडलिंग की मदद से, एक विस्तृत गतिज विश्लेषण किया जा सकता है जो पीओआई के भर्ती गुणों में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है (उदाहरण के लिए, कई डीएनए बाध्यकारी डोमेन का योगदान, विभिन्न सिग्नलिंग घटनाओं के प्रति संवेदनशीलता, आदि)। 1,25मजबूत वर्कफ्लो बनाने के लिए स्वचालित भर्ती मूल्यांकन और सेल ट्रैकिंग को जोड़ा जा सकता है ।
डीएनए पूर्व संवेदीकरण के फायदे और सीमाएं
माइक्रो-विकिरण से पहले डीएनए का पूर्व-संवेदीकरण डीएनए मरम्मत प्रोटीन भर्ती16, 17के लिए आमतौर पर उपयोग कियाजानेवाला उपकरण है। माइक्रो-विकिरण से पहले डीएनए को संवेदनशील बनाने से यह डीएसबी के लिए अतिसंवेदनशील होता है। डीएनए पूर्व संवेदीकरण के लिए दो सबसे आम तरीके या तो ब्रोमोडेऑक्सीयूडिडीन (BrdU) या Hoechst डाई के साथ कोशिकाओं के पूर्व उपचार कर रहे हैं । उच्च लेजर शक्तियों पर सूक्ष्म विकिरण में सक्षम नहीं प्रणालियों के लिए, इन तरीकों DSBs की तरह डीएनए घावों को प्रेरित करने के लिए आवश्यक हो सकता है । इसके अतिरिक्त, एक संचारित प्रकाश डिटेक्टर या एक फ्लोरोसेंट संकेत के अभाव में सेल नाभिक पर प्रकाश डाला (उदाहरण के लिए, जब अतप्त अंतहीन डीएनए मरम्मत प्रोटीन की भर्ती का अध्ययन), Hoechst दोनों एक पूर्व उपकरण और एक फ्लोरोसेंट दाग के रूप में कार्य करता है हालांकि, डीएनए पूर्व संवेदीकरण महत्वपूर्ण जटिलताओं को पेश कर सकता है। BrdU (10 μM की अंतिम एकाग्रता में इस्तेमाल किया) कोशिकाओं में जोड़ा जाना चाहिए 24 घंटे (या सेल लाइन में एक पूर्ण कोशिका चक्र के बराबर समय) ठीक से डीएनए में शामिल करने के लिए और सेल चक्र हस्तक्षेप26पैदा कर सकता है । Hoechst 33342 (1 μg/mL की अंतिम एकाग्रता में उपयोग किया जाता है) लंबे समय इनक्यूबेशन अवधि के बाद साइटोटॉक्सिक होता है लेकिन डाई के साथ नाभिक को संतृप्त करने के लिए पर्याप्त समय की आवश्यकता होती है। इसलिए, इसे केवल माइक्रो-विकिरण से 15-20 मिनट पहले लागू किया जाना चाहिए; अन्यथा, भर्ती के आंकड़े सुसंगत नहीं होंगे । इस तरह से दागदार कोशिकाओं को27 , 28को कुछ घंटों से अधिक समय तक संस्कृति में नहीं रखा जा सकता . सुनिश्चित करें कि Hoechst 33358 का उपयोग न करें, जो होचस्ट 33342 डाई के रूप में पारम करने योग्य सेल के रूप में नहीं है। पूर्व संवेदीकरण भी प्रयोगों के बीच अनावश्यक विचरण शुरू कर सकते है और प्रयोग और भी अधिक सेल घनत्व में मतभेदों के प्रति संवेदनशील बनाता है (के रूप में यह शामिल डाई/सेल की मात्रा को प्रभावित करेगा) ।
कंफोकल माइक्रोस्कोपी के फायदे और सीमाएं
वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी की तुलना में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की इमेजिंग गति सीमित हो सकती है। हालांकि, एक गूंजता स्कैनर से लैस एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप कताई-डिस्क माइक्रोस्कोपी की गति के करीब आने वाली इमेजिंग गति (संकल्प की कीमत पर) में काफी सुधार कर सकता है। तीन विशेषताएं A1R HD25 कॉन्फोकल सिस्टम को यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के लिए एक उत्कृष्ट विकल्प बनाती हैं। सबसे पहले, सिस्टम के 25 मिमी एफओवी एक स्कैन किए गए क्षेत्र (नियमित सेटअप में 5-10 कोशिकाओं बनाम) में 15-20 कोशिकाओं के बीच छवि करना संभव बनाता है, सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए आवश्यक अधिग्रहण की संख्या को सीमित करता है। दूसरा, एफईआरपी मॉड्यूल और दो स्कैनहेड कोशिकाओं को एक साथ छवि और माइक्रो-विकिरणित करना संभव बनाते हैं, न कि केवल क्रमिक रूप से। अंत में, दोनों सुनाई देती है और galvano स्कैनर होने का लचीलापन आसानी से असाधारण गति के साथ उच्च लौकिक संकल्प इमेजिंग के बीच स्विच करने की क्षमता प्रदान करता है जो फ्लोरोफोरेस की शमन को कम करता है, और उच्च स्थानिक संकल्प इमेजिंग जो शोर अनुपात के लिए एक उच्च संकेत के साथ छवियों का उत्पादन करने के लिए धीमी स्कैनिंग गति का उपयोग करता है । जबकि उपरोक्त लचीलेपन के लिए उपयोग की गई प्रणाली, अधिक व्यापक रूप से उपलब्ध कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप विन्यास के समान होती है, केवल गैलवानो स्कैनर का उपयोग प्रस्तुत प्रयोगों (माइक्रो-विकिरण और बाद में इमेजिंग दोनों के लिए) में किया जाता था।
सूक्ष्म विकिरण के फायदे और सीमाएं
जबकि माइक्रो-विकिरण बेजोड़ स्थानिक और लौकिक संकल्प प्रदान करता है, यह सीमाओं के बिना नहीं है। लेजर माइक्रो विकिरण द्वारा डीएनए क्षति स्वाभाविक रूप से होने वाली हानिकारक एजेंटों की तुलना में नाभिक के विशिष्ट भागों के लिए अत्यधिक संकुल है । इस प्रकार, सूक्ष्म विकिरण के कारण क्रोमेटिन प्रतिक्रिया सजातीय रूप से वितरित क्षति की तुलना में भिन्न हो सकती है। इसके अतिरिक्त, माइक्रो-विकिरण समय लेने वाला है और केवल कुछ दर्जन कोशिकाओं पर आयोजित किया जा सकता है, जबकि बड़ी जनसंख्या आधारित जैव रासायनिक विधियां (क्रोमेटिन आंशिकता, इम्यूनोप्रिपेशन, सीआईपी) एक समय में हजारों कोशिकाओं का अध्ययन करके बढ़ी हुई मजबूती प्रदान कर सकती हैं। पारंपरिक जैव रासायनिक तकनीकों के साथ माइक्रो-विकिरण द्वारा की गई टिप्पणियों की पुष्टि करना विश्वसनीय निष्कर्षों के लिए एक प्रभावी रणनीति है। हालांकि एक निश्चित FOV में कई कोशिकाओं के एक साथ माइक्रो विकिरण संभव है, इमेजिंग प्रणाली को कार्य करने के लिए और अधिक समय की आवश्यकता होगी । इसलिए, प्रोटीन की गतिशीलता को मापने कि डीएनए घावों के लिए बहुत तेजी से भर्ती माइक्रो विकिरण के लिए संभव आरओआई की संख्या एक साथ इस्तेमाल सीमा । इस प्रोटोकॉल के लिए उपयोग की जाने वाली इमेजिंग प्रणाली पर, एकल 1024 पिक्सेल लंबे आरओआई का माइक्रो-विकिरण 1000 माइक्रोन निवास समय का उपयोग करके 1032 एमएस लेता है और 3000 माइक्रोन का उपयोग करके 3088 एमएस पूरा करने के लिए समय रहता है। आरओआई की कई लाइनों का उपयोग करने से माइक्रो-विकिरण को खत्म करने के लिए आवश्यक समय में काफी वृद्धि होगी (उदाहरण के लिए, 7 x 1024 पिक्सेल लंबा आरओआई 14402 एमएस का उपयोग करके 1000 μs निवास समय और 21598 एमएस का उपयोग करके 3000 माइक्रोन निवास समय लेता है)। यह समय छवि अधिग्रहण से खो गया है और इस पर विचार किया जाना चाहिए । जब तेजी से भर्ती की घटनाओं इमेजिंग, सबसे कम आरओआई संभव है और एक समय में केवल माइक्रो विकिरण एक सेल का उपयोग करें ।
सिंक्रोनाइजेशन विधियों पर फायदे और सीमाएं
सेल चक्र विशिष्ट अध्ययनों के लिए, मौजूदा तरीकों में कोशिकाओं को विशिष्ट कोशिका चक्र चरणों में सिंक्रोनाइजेशन या कोशिका के विशिष्ट कोशिका चक्र चरण की पहचान करने के लिए फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स का उपयोग करना शामिल है। हालांकि, इन तरीकों में से प्रत्येक अपनी चुनौतियों और सीमाओं प्रदान करता है ।
FUCCI प्रणाली3 (फ्लोरोसेंट प्रोटीन पर निर्भर सीडीटी 1 और Geminin के कटा हुआ रूपों टैग) सेल चक्र अध्ययन के लिए एक विशेष रूप से उपयोगी उपकरण है, लेकिन सीमाएं है जब यह सेल चक्र के एस और G2 चरणों के बीच अंतर करने के लिए आता है । मिथुन का स्तर पहले से ही मध्य एस चरण से अधिक है और एम चरण तक उच्च रहते हैं, जिससे इन चरणों को अलग करना मुश्किल हो जाता है। FUCCI प्रणाली का उपयोग भी मतलब है कि माइक्रोस्कोप के दो ऑप्टिकल चैनलों POI इमेजिंग के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है ।
गैर कैंसर सेल लाइनों सीरम (सीरम भुखमरी) में पाया विकास कारकों को हटाने के द्वारा G0 में सिंक्रोनाइज्ड किया जा सकता है कोशिकाओं को कम या कोई डीएनए क्षति के कारण । हालांकि, अधिकांश कैंसर सेल लाइनें आंशिक रूप से अपने मीडिया में सीरम की पर्याप्त मात्रा के बिना भी सेल चक्र के माध्यम से प्रगति जारी रखेगी। इसके अतिरिक्त, कोशिकाएं आंशिक रूप से देर से G1, प्रारंभिक एस चरण तक सिंक्रोनाइजेशन खोना शुरू कर देती हैं। सीरम भुखमरी के अलावा, सेल चक्र सिंक्रोनाइजेशन को प्राप्त करने के लिए कई रासायनिक तरीके हैं। हाइड्रोक्सीयूरिया, एफिडिकोलिन और थायरिडीन ब्लॉक कोशिकाओं को प्रारंभिक एस चरण में सिंक्रोनाइज़ करने के लिए डीएनए प्रतिकृति को रोकने के तरीके हैं। जबकि इन तरीकों सस्ते और सरल हैं, वे प्रतिकृति तनाव है जो डीएनए क्षति में परिणाम परिचय । इन डीएनए प्रतिकृति अवरोधकों को H2A के फॉस्फोरिलेशन को प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है । एक्स, डीएसबी2, 29का एक प्रसिद्ध मार्कर । एस-चरण कोशिकाओं के लिए एक मार्कर के रूप में टैग-पीसीएनए का उपयोग करने की विधि रासायनिक सिंक्रोनाइजेशन के कारण कलाकृतियों के लिए क्षमता को कम करती है और सीरम भुखमरी की तुलना में सेल लाइनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है ।
समाप्ति
डीएनए क्षति आनुवंशिक रोगों के लिए एक प्रेरक शक्ति है जहां उत्परिवर्तनीय घावों कोशिकाओं के घातक परिवर्तन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । डीएनए संश्लेषण मशीनरी को लक्षित करना कैंसर जैसी हाइपरप्रोलाइफेरेटिव बीमारियों के उपचार में एक मौलिक चिकित्सीय रणनीति है। इन बीमारियों का इलाज ज्यादा लक्षित तरीके से करने के लिए हमें डीएनए घावों की मरम्मत करने वाले प्रोटीन की बेहतर समझ की जरूरत होती है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल संभावित कलाकृतियों को कम करने और प्रयोगों की प्रजनन क्षमता बढ़ाने के लिए पारंपरिक सिंक्रोनाइजेशन विधियों द्वारा प्रस्तुत चुनौतियों को कम करके एस चरण में सूक्ष्म विकिरण आधारित अध्ययनों में मदद करता है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक एम पगानो को उनके निरंतर समर्थन के साथ-साथ डी सिमोनेची, ए मर्जियो और जी तांग को पांडुलिपि की महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए धन्यवाद देते हैं । बी मिवातानी-मिंटर ने आर मिवातानी और बी मिंटर को उनके निरंतर समर्थन के लिए धन्यवाद दिया । जी रोना धन्यवाद के रोणे जुराज़ और जी रोना ने अपने निरंतर समर्थन के लिए।
Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434-500G | For quenching formaldehyde |
Anti-EXO1 Rabbit Polyclonal Antibody | Proteintech | 16253-1-AP | primary antibody |
Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | primary antibody |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 3117332001 | BSA for blocking |
BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine) | Merck | 19-160 | pre-sensitizing agent |
Citifluor™ Mountant Solution AFR3 | Electron Microscopy Sciences | 17973-10 | antifade containing PBS solution for imaging |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | nucleic acid stain |
DMEM Medium | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | Cell culture medium for HEK293T cells |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Vehichle control and dissolution solvent |
EGFP-FBXL10 | Addgene | #126542 | viral expression vector for EGFP-FBXL10 |
EXO1b-AcGFP (in pRetroQ) | custom cloning | na | EXO1b cDNA was cloned in the NheI, BamHI sites of pRetroQ-AcGFP1-N1 vector. |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140071 | Media supplement |
FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | Phenol red free medium for microscopy |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A32723 | secondary antibody |
HEK293T cells | ATCC | ATCC CRL-3216 | Cell line for viral packaging |
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | Buffering agent to supplement live cell imaging medium |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | pre-sensitizing agent |
Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection reagent |
McCoy’s 5A (Modified) Medium | Life Technologies | 16600-108 | Cell culture medium for U-2 OS cells |
mCherry-PCNA | Addgene | #55117 | non-viral PCNA construct suitable for cell cycle marker |
mPlum-PCNA | Addgene | #55994 | non-viral PCNA construct suitable for cell cycle marker |
mPlum-PCNA (in pBABE) | custom cloning | na | mPlum-PCNA cDNA was cloned from Addgene #55994 in the BamHI, SalI sites of pBABE (puro) |
Nikon A1R-HD25 Confocal Scanhead and Controller | Nikon | na | confocal imaging system |
Nikon LUN4 laser unit | Nikon | na | excitation system |
Nikon LUN-F 50 mW 405 nm FRAP laser unit | Nikon | na | FRAP laser unit |
Nikon NIS Elements Confocal Controller Software | Nikon | na | Confocal controlling software |
Nikon Ti2-E Inverted Microscope | Nikon | na | inverted epifluorescent microscope base |
Nikon Ti2-LAPP Modular Illumination System | Nikon | na | illumination system |
NTHL1-mCherry (in pRetroQ) | custom cloning | na | NTHL1 cDNA was cloned in the NheI, SalI sites of pRetroQ-mCherry-N1 vector. |
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (4 well) | Thermo Fisher Scientific | 155382PK | Live cell microscopy cell culture chamber |
Olaparib | Selleck Chemicals | S1060 | PARP inhibitor |
Opti-MEM reduced serum media | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | Dilution medium for transient transfection |
Paraformaldehyde aqueous solution (32%) | Thermo Fisher Scientific | 50-980-494 | Fixative |
pBABE (hygro) | Addgene | #1765 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
pBABE (neo) | Addgene | #1767 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
pBABE (puro) | Addgene | #1764 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
pBABE (zeo) | Addgene | #1766 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
PCNA Antibody (PC10) | Santa Cruz | sc-56 | primary antibody |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Gibco | 10378016 | Media supplement |
polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003 | Increase viral infection efficiency |
pRetroQ-AcGFP-C1 | Takara | 632506 | retroviral expression vector |
pRetroQ-AcGFP-N1 | Takara | 632505 | retroviral expression vector |
pRetroQ-mCherry-C1 | Takara | 632567 | retroviral expression vector |
pRetroQ-mCherry-N1 | Takara | 632568 | retroviral expression vector |
pUMVC | Addgene | #8449 | Viral packaging vector |
Sodium-pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | Supplement for live cell imaging medium |
Triton X-100 aqueous solution (10%) | Sigma-Aldrich | 11332481001 | Dilute in PBS for cell permeabilization buffer |
Trypsin-EDTA Solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | Dilute in PBS to split cells |
U-2 OS Cells | ATCC | HTB-96 | Optimal cell line for microscopy experiments |
Universal Mycoplasma Detection Kit | ATCC | 30-1012K | PCR based Mycoplasma detection kit |
VSV-G | Addgene | #8454 | Viral protein envelope vector |