Summary
我们提出了一个协议，测量微到毫秒的动态13C/15N标签和未标记RNA与1H R1+放松分散核磁共振（NMR）光谱。此协议的重点在于高纯度样品制备和 NMR 实验的设置。
Abstract
RNA是一种高度灵活的生物分子，其中结构的变化在RNA分子作为细胞信使和调节器执行的功能中起着至关重要的作用。虽然这些动态状态仍然隐藏在大多数结构方法中， 但R1+ 放松分散（RD）光谱学允许在原子分辨率下研究微到毫秒系统中的构造动力学。使用 1H作为观测到的原子核进一步扩大了所覆盖的时间制度，并直接获得氢键和碱基配对。
这种研究中具有挑战性的步骤是高纯度和高产量样品制备，可能 为13个C-和 15个N标签，以及设置实验和安装数据来提取以前看不见的状态的人口、汇率和二级结构。该协议在样品准备方面提供了关键的动手步骤，以确保准备合适的RNA样本，并设置 1H R1+ 实验，同时使用同位素标记和无标签RNA样品。
Introduction
RNA在细胞中执行多种调节1、催化2和结构3功能，其中许多功能与灵活的分子结构和这些结构的复杂变化有关，4、5、6、7。低人口状态对于大多数结构确定方法仍然不可见，或者不允许以高原子分辨率研究这些隐藏状态。溶液态核磁共振（NMR）光谱学结合了两个方面，提供了对单个原子核的访问，以及提供一个大型的实验工具箱，通过所有时间系统8的动态目标。RD NMR实验提供了在中间时间尺度上进行构造交换的机会，其中基础配对模式和局部结构重新排列的变化可以预期为5、9、10、11、12、13、14。RD 实验以卡尔-珀塞尔-梅布姆-吉尔脉冲列车15或旋转框架中的放松测量（称为 R1+RD实验16）的形式执行长R2测量。
虽然两者都可以用来提取人口和汇率和化学转移差异到次要状态，R1 +RD实验也给出了兴奋状态的化学转移差异的迹象。这允许对二级结构进行推断，这与RNA结构17的化学转移密切相关。化学转移是核基上的芳香质子和碳、伊米诺质子的碱基配对伙伴以及C4'和C1'原子18、19上的糖皱褶的一个很好的螺旋度指标。需要注意的是，最近，一项使用更高自旋锁 （SL） 功率的化学交换饱和转移 （CEST） 实验，从而将 CEST 实验的适用性转移到更快的交换时间尺度上，作为一个兴奋状态系统的 R1 +RD实验的替代方案发表。
虽然13C和15N同位素经常被用来访问结构交换，最近从这个实验室的工作使用芳香和伊米诺质子作为探测器的构象交换9，10。使用1H作为观测到的原子核带来了几个优点，例如，在更快、更慢的时间尺度上进行交换，提高灵敏度和缩短测量时间。SELective 优化质子实验 （SELOPE） 方法进一步促进了这一点，通过使用同核鳞片耦合（而不是异核磁化转移）对一维 （1D） 频谱进行排斥，并消除对同位素标签20的需求，从而提供芳香质子的获取。本协议涉及统一13C/15 N 标记和未标记样品的1H R1+ RD实验中的测量结果。因此，本文提出了一种样品制备方法，该方法被认为是不同样品制备需要最通用的21种，并在本文的最后一节（图1）中讨论了替代方案。
此时，读者应注意，1H R1 +RD实验可以采用其他样品制备技术，并且可以通过与所呈现技术合成的样品进行其他结构和功能分析方法。1H R1 +RD实验要求高RNA浓度（理想情况下为>1 mM）以及高均匀性，包括RNA长度和结构构造，以确保分子动力学的可靠特征。体外转录（IVT）是许多研究人员产生13个C/15N标签RNA样本的首选方法，因为有标记的核苷三磷酸盐（NTP）和酶反应22的便利结合。然而，广泛使用的T7RNA聚合酶（T7RNAP）23，24，25遭受低5'同质性的情况下，某些启动序列26，27，往往也3'同质性在转录径流28。由于需要大量 ±200 nmol，目标RNA物种的净化变得更加昂贵和费力。这里使用的方法以前曾被提出过，其中主要讨论了优势21。简言之，它通过转录一个更大的串联成绩单来解决描述的问题，然后由Escherichia大肠杆菌RNase H，由幻想寡核苷酸29，30引导（见图2的细节）。
在串联成绩单的 5' 和 3' 末端结合一个间隔序列，可以分别使用高产启动序列和去除靠近质粒模板线性站点的终端悬垂（图 2B）。该方法被证明可以显著提高产量，同时降低成本和劳动力，同时需要更复杂的模板合成和需要额外的酶和寡核苷酸。由于缺乏大小相近的 RNA 物种， RNase H 的高特异性有助于净化。本协议使用离子交换高性能液相色谱 （HPLC） 步骤，该实验室最近于 31日发布了该步骤，但其他方法可能是替代方法。1H R1 +RD可以， 一般来说，在标有或未标记的样本上获得两个各自的脉冲序列，即"标记"1H R1 +异核单量子相关性（HSQC）基实验，具有13C间接维度10和"未标记"1H R1+SELOPE基于1H间接维度20的实验。
这些二维（2D）实验可以作为第一次检查，无论样本中是否存在 R 1+时间尺度上的动态。可以获取光谱中所有已解决峰值的 RD 概述，并确定更彻底的 RD 分析感兴趣的峰值。这意味着，即使是未贴标签的样品，也可以在决定生产更昂贵的标签样品之前进行检查。一旦选择具有构象交换贡献的峰值进行更深入的研究，最好切换到上述实验的 1D 版本（如果峰值仍能解决），以进行所谓的异声实验。对于标记版本，HSQC 转移到13C 被选择性异核交叉极化 （HCP） 步骤所取代，该步骤用于13C R1 +实验32、33、34、35，而在 SELOPE 实验中， 实验只是以 1D 方式运行，这对位于 2D 对角线上的 H8 和 H2 信号特别有用。如果两者都有标记的样本和未标记的样本，那么使用哪个序列的一个标准是，在两个实验中，兴趣的峰值是如何隔离的。
一般来说，SELOPE实验建议用于多达50个核苷酸的RNA样本。对于较大的RNA，重叠将更大：然而，结构上有趣的核苷酸经常出现在化学转移区域，这些区域的重叠性较小，在更大的RNA中仍然可能获得。另一个论点是，在未标记的样品中，在 1H 和12C 之间不会发生 J 耦合。但是，由于最小自旋锁功率由标记实验中用于脱钩这两个自旋（+1 kHz）的最小功率定义，因此未标记的实验允许使用范围更广的自旋锁 （SL） 强度，因此，可以访问更广泛的交换时间尺度。这些非共振实验为kex提供了额外的信息，如兴奋状态（替代顺从者）、pES的人口，以及以+（地态的化学移位差和兴奋状态）形式非常有价值的化学转移信息。
图1：提交协议的工作流程。准备前的实际大规模样品生产，包括模板制备和确认成功的体外转录和 RNase H 。大规模生产，包括 HPLC 净化、NMR 管填充和 RNA 折叠确认。如果同位素标记合成，应在同一天进行无标签的纯化，以进行梯度优化。NMR 用R1 +实验来描述构象动力学。每个步骤都可以独立执行，例如，1H R1 + RD 分析可以应用于使用其他方法产生的任何合适的RNA样本。缩写：IVT =体外转录;HPLC = 高性能液相色谱;核磁共振 = 核磁共振;RD = 放松分散。请单击此处查看此图的较大版本。
本协议的目的是为研究RNA发夹分子中1H R1 +放松分散的构造动力学提供实际细节和关键参数。在提供了目标RNA的设计、合成和离子交换 HPLC 纯化的详细协议后，描述了使用所有、部分或没有 NTP 作为13C/15N 标记版本执行的目标RNA 的纯化工作流程，并描述了最终确定 NMR 样本并确认与 NMR 光谱仪的构象交换的工作流程。最后，介绍了在布鲁克NMR光谱仪上设置1HR1+RD实验的细节（图1）。该协议给出每个步骤，以设置标记样本的1D版本和额外的注释和一个表来调整设置SELOPE版本（表2）。协议后，将讨论样品制备的关键步骤和替代路线以及1H R1 + RD 设置。
Protocol
图2 ：报告的串联 IVT 协议的原理图表示。（ A ）从带 T7RNAP （左）的线性质粒模板和笔录的 RNAse H 连续的串联转录，以实现目标长度 RNA ，由心绞痛 DNA 指南指导（右）。（B） 串联模板的详细示意图，从病毒 T7RNAP 发起人开始，启动序列。目标序列（深蓝色，示例为 20 nt 长）重复"n"次。重复的两侧分别由最后八个和前四个核苷酸组成的 5+ 和 3+ 间隔序列，以便从第一个和最后一个重复单元中删除启动和限制序列。（C）串联成绩单（红色）和幻想指南（绿色）的混合。Rnase H 将 RNA 切开，与 DNA 5+ 末端相对。2+ - OME RNA 侧翼通过增强指南对目标 RNA 的结合亲和力来增加特异性。这个数字已经从21日修改。缩写： T7RNAP = T7 RNA 聚合酶。请单击此处查看此图的较大版本。
1. 为新的RNA结构做准备
- 普拉斯米德设计和准备
- 在克隆工具中编写模板序列， 例如串行克隆器。
- 以T7促销器序列为例，并添加高收益启动序列（T7：5'-TATACGACTACTTA =GGGAGA-3'）。
注：转录将从带护剂（*）指示的核苷酸开始。启动序列 GGGAGA 是可变的，但强烈依赖序列：因此，建议使用此序列。 - 将目标序列的最后 8 个核苷酸 （nt） 添加为 5' 垫片 （5'S）。
- 添加目标序列 （TS） 的重复。
- 重复后（5'S）将前四个核苷酸添加为 3' 垫片。
- 添加 BamHI 限制站点 （RS） 或类似的唯一限制站点。
注：所示的总序列将在细菌高拷贝质粒（例如pUC19）：5'-T7-5'S-（TS）n-3'S-RS-3' （图 2B）中克隆或随便订购。重复次数应高达基因合成所允许的次数（本协议中最多为 600 nt）。 - 使用商业套件放大 大肠杆菌 中的质粒。
- 使用适当的限制位点，在 20 ng/μL 下对纯化质粒进行线性化。规模限制消化与巴姆希高达1兆升。
- 净化消化的质粒，并确认1%的玫瑰凝胶上成功线性化。将线性质粒存储在 -20 °C 下数月。
- 指南设计（图 2C）
- 在 5'-3' 方向上写下目标 RNA 序列的最后 8 个核苷酸，并在 5'-3'方向的 3' 端添加目标 RNA 序列的前四个核苷酸。
- 生成该序列的反向 DNA 补充
- 通过在核苷酸字母前添加"m"，将第一个和最后四个核苷酸更改为其 2'-OMe 修改。
注：用于合成，MU 用于代替 mT。 - 订购具有标准脱盐净化的寡头。
注：检查生成的寡头是否可以在两个RNA序列连接以外的其他位置绑定。需要在中央四个DNA核苷酸中完全互补，而侧翼区域可能允许不匹配。如有必要，将侧翼扩展到 18 nt，以生成唯一的绑定序列36。
- 小规模IVT
注：对于无 RNase 的工作，请在无菌和无 RNase 条件下准备所有试剂。使用 RNase 净化试剂（参见 材料表）和 95% v/v 乙醇在使用前清洁工作表面和移液器。用95%的乙醇清洗手套，穿无绒长袖衣服。为了尽量减少 RNase 污染，不要在打开的管子上呼吸。- 准备 Tris-Cl （pH 8.0）、 二甲酸酯、MgCl2、 精氨酸和 NTP/GMP （未缓冲） 的库存解决方案。 表1所示混合试剂。在添加酶或核酸之前，提前准备这些试剂的主混合物。
注意：如果使用冷冻试剂，解冻后彻底混合。如果混合在过高浓度下，试剂可能会沉淀，因此强烈建议按照 表 1中的顺序进行。 - 按以下顺序添加：质粒、导引、无机磷酸盐（ IPPase ）、 Rnase H 、 T7RNAP 。由于酶活性可能因内部产生的酶而异，因此在选择最佳酶之前先测试几个浓度。
注：包括反应的负控制， 例如， 没有 RNase H ，将缺失的目标带归因于有缺陷的 RNase H ，而不是不成功的转录。 - 将反应在 37 °C 下孵化 1 小时，并确认对变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE） （图 3A） 的反应。将样品在加载溶液中稀释 10 倍，并将 1 μL 加载到凝胶上。
注： 凝胶混合物： 8 M 尿素， 20% 丙烯酰胺 （19：1 丙烯酰胺： 二丙烯酰胺） 在 1x TBE.装载溶液：5m乙烯胺四乙酸（EDTA），300微米溴酚蓝色形式胺。由于不断产生新的 RNA ，不能指望在 1 小时后完成 RH 酶 H 反应。此时，请留意一个清晰的目标波段和缺乏具有类似分子量的物种（例如，±3核苷酸（nt）产品）。
- 准备 Tris-Cl （pH 8.0）、 二甲酸酯、MgCl2、 精氨酸和 NTP/GMP （未缓冲） 的库存解决方案。 表1所示混合试剂。在添加酶或核酸之前，提前准备这些试剂的主混合物。
| 试剂 | 库存集中度 | 小规模（μL） |
| H2O | - | 24 |
| 特里斯 | 1 M | 5 |
| MgCl2 | 1 M | 0.5 |
| DTT | 1 M | 0.5 |
| 精子 | 250mM | 5 |
| GMP | 100mM | 2.5 |
| ATP | 100mM | 1.5 |
| GTP | 100mM | 1.5 |
| 乌特普 | 100mM | 1.5 |
| CTP | 100mM | 1.5 |
| 质粒 | 20 ng/μL | 5 |
| 指南 | 100 μM | 10 |
| 伊帕塞 | 10毫克/毫升 | 0.5 |
| 纳斯 H | 10 微克/兆升 | 2 |
| T7 RNA 聚合酶 | 5毫克/毫升 | 2 |
表 1 ：串联 IVT 和同时 Rnase H 的试剂表。 库存浓度可以适应用户的便利性。如果 Rnase H 必须在 T7 IVT 后执行，则在 T7RNAP 热灭活后添加导引和 Rnase H 。使用与反应量表线性比例的量表。缩写： T7RNAP = T7 RNA 聚合酶;IVT = 体外 转录。
2. NMR 样品制备
- 放大对所需体积（通常为 10 mL）的反应，并在一夜之间运行反应。第二天用变性PAGE凝胶（图3A）测试反应完成情况。
注：不完整的反应由高于目标带的更高分子量物种显示。- 如果不成功或不完整，通过在 450 W 的 15 s 传统微波炉中加热溶液，在反应容器中采用再年 RNA 和导引。
- 将溶液缓慢冷却至 37 °C，40 分钟。使用加热块的体积低于 1 mL。注意新沉淀物的形成。
- 添加更多 IPPase 和 Rnase H，并在 37 °C 下再孵育 1-3 小时。 确认完成反应与变性页面。
- 当 RNase H 裂口反应完成后，通过将 EDTA 添加到 50 mM 最终浓度和涡流来彻底解析反应。
注：潜在的热磷酸盐沉淀会溶解，新的蛋白质沉淀形成。 - 通过 0.2 μm 注射器过滤器过滤溶液，并根据注射回路大小将溶液集中到可注入 HPLC 系统的体积中。
注：协议可以通过在 -20 °C 下冻结样品在此处暂停。
- 大规模 HPLC 净化
- 在使用后一周内准备离子交换缓冲器 A 和 B。过滤和除气缓冲器。
注：缓冲器A：20mM醋酸钠：20mM 高氯酸钠，pH 6.5。缓冲器B：20mM醋酸钠：600mM 高氯酸钠，pH 6.5。 - 在 75 °C 下，用 100% 缓冲 B 对列进行等价，然后用 100% 缓冲 A 对至少 2 列卷进行等价。
- 以5.5mL/min 的流量准备 HPLC 序列 （图 3B） 。使用以下序列对大小在 20 到 30 nt 之间的 RNA 进行净化：0-7 分钟：0% B：7-16分钟：梯度0-20%B：16 - 46 分钟：，通常梯度为 20 - 30% B （根据需要进行优化）：46-62分钟：100%B：62-73 分钟： 0% B.
注：流量从 5.5 到 8 mL/min 的变化不会影响此协议中的分离。 - 通过一次注射相当于 1 mL 的转录反应（未标记），优化脱毛梯度。
注：有关进一步的细节和讨论，请参阅卡尔松等人31和费勒等人21。 - 在变性页面上测试收集的分数。如果主峰值被很好地隔离并包含纯目标 RNA ，则将净化范围扩大至相当于 10 mL 的转录反应。
- 收集利息的分数，集中注意力，并与 NMR 缓冲器交换缓冲。对于超过 50 mL 的体积，请使用超中心滤芯单元（参见 材料表）。
注：NMR缓冲：15mM磷酸钠：25mM 氯化钠;0.1 m EDTA， pH 6.5.为了尽量减少粘附在塑料管壁上的所有收集管的损失，用 1 mL 的水、涡流和离心机清洗所有收集管，以收集所有液体。 - 通过紫外线光谱确定浓度。根据费勒等人21计算反应产量。
注：用于RD实验的NMR样品浓度不应低于130微米，使用NMR管（材料表）的样本量为250微升，对应于500微米。
- 在使用后一周内准备离子交换缓冲器 A 和 B。过滤和除气缓冲器。
- RNA 样本的折叠
- 将体积为 ±10 mL 的样品稀释并加入到每管 1 mL 中。
- 将RNA引力加热到95°C5分钟。
- 将样品放在冰上或水冰盐混合物中，孵育30分钟，从而冷却样品。
- 在 2 mL 离心滤芯单元中池取样品并浓缩至 ±250 μL。
- 填充 NMR 管
- 通过冲洗充足的水、RNase 净化试剂、水、95% 乙醇 （EtOH） 和水来清洁 NMR 管中的 NMR 管。离开干燥。
- 使用水冲洗和使用 RNase 净化试剂擦拭柱塞，使用无绒毛擦拭 95% EtOH 清洁柱塞。离开干燥。
- 在 NMR 示例中添加 10% D2O 的 V/v。
- 使用大型移液器尖端将RNA样本填充到 NMR 管中。让液体沿着管壁的一侧流动。
- 插入柱塞，通过快速扭曲运动将柱塞向下推移以消除气泡。
- 将柱塞缓慢向上，而不会产生新的气泡，然后用石蜡薄膜固定。
- 按 NMR 确认折叠。
注意：此时，必须至少执行部分共振任务，以确认RNA样本的二级结构，并确定对构造动力学研究感兴趣的区域。详尽描述RNA共振分配将超过这个协议，因此我们指的是成熟的文献在这一点上19，37，38。电泳移动性移位检测 （EMSA） 可以成为 RNA 折叠的有用指标，并作为 NMR 实验的补充数据。- 比较以下样本的光谱，其中1H R1 +RD实验进行与适当折叠的参考样本（图4）：1H 1D，特别是伊米诺区域10 +15ppm;芳香1H，13C-HSQC;1H，1H -塞洛佩 （可选） 。
注：芳香指纹也是必要的，即使在伊米诺信号之间达成协议的情况下，因为较暗的形成通常显示相同或类似的伊米诺信号作为RNA发夹。SELOPE 实验可以取代1H、13C-HSQC 进行芳香指纹识别，因为对未标记样品的异核实验非常耗时。 - 使用 UUCG 循环作为指纹参考（如果存在）。
- 每次在记录 1H R1 + RD 实验之前进行此比较。
- 比较以下样本的光谱，其中1H R1 +RD实验进行与适当折叠的参考样本（图4）：1H 1D，特别是伊米诺区域10 +15ppm;芳香1H，13C-HSQC;1H，1H -塞洛佩 （可选） 。
3. 1H R1 + 放松分散-共振（标记为1D版本）
注：下面的步骤描述了使用基于 HSQC 的 RD 脉冲序列的 1D 版本为标记样本设置 RD 实验。对于未标记的样品，请遵循基于 SELOPE 的 1D 序列的相同步骤。表2显示两种情况的参数名称和设置概述。关注1D版本是因为它们在不共振测量方面更为实用，施拉格尼特等人和施泰纳等人分别详细讨论了基于SELOPE和HSQC的实验的2D版本的设置。
- 确定硬90°脉冲（P1）的 1 H 功率。
- 选项 A： 使用布鲁克 脉冲 命令。
- 选项 B：在zg实验中，通过测量水峰质子硬脉冲功率水平的营养曲线确定 360° 脉冲。
注：90°脉冲长度是观测到零信号的持续时间的四分（如果测量了完整的计算曲线，则它是第二个零;但在实践中，只有360° 预期值周围的区域被采样）。
- 使用第3.1步确定的脉冲长度运行 1 H1D频谱zgesgp.f2f3dec，以在每次 R 1+ 测量之前确认 RNA 折叠。
注：如果首次运行 1H SL 实验，请检查计算的 SL 功率是否与通过校准每个所需带宽的 SL 功率提供给样本的功率相对应。施泰纳等人介绍了详细的校准步骤。 - 为标记数据集创建1H R1+，并设置关键参数。
- 创建新数据集;理想情况下，基于1H-13C 芳香 HSQC 数据集，用于全标记 RNA 样本进行 RNA 分配。
注：这将确保已经设置了 13C 以及 15N 电源和脱钩电源。 - 根据 表 2的第一部分设置一般参数。
- 根据 表 2的第二部分设置 RD 特定参数。
- 将 1H SL 功率设置为最低值（1.2 kHz）用于测试。
- 生成一个只有一个条目的测试 vd 列表，0 ms，（以优化 vd 列表，如步骤 3.4 中所述），将TDF1设置为 1，并更新D30。
- 使用这些设置运行测试频谱。
- 创建新数据集;理想情况下，基于1H-13C 芳香 HSQC 数据集，用于全标记 RNA 样本进行 RNA 分配。
- 优化 vd 列表（要使用的 SL 长度列表）。
- 使用 测试 vd 列表运行实验（例如，六个条目：0 米、5 米、10 米、20 米、30 米、40 米;争用这些值以避免因加热而出现系统错误）。
- 相应地更新 D30 和 TDF1（在此示例中，D30 = 42m 和 TDF1 = 6）。
- 峰值 与 SL 长度的绘图强度。确定原始峰值强度降低到 1/3 的 SL 长度。
- 创建用于实验的最终 vd 列表，并考虑以下因素：确定前一步中描述的最长 SL 长度：避免使用具有递减或提升顺序的列表;并添加一些重复的统计研究。请记住，每次 vd 列表有任何更改时，都要更新 D30 和 TDF1。
注：该实验以伪 2D 方式以 vd 列表中给出的不同 SL 长度运行。 - 选择扫描次数，以便列表中最弱的峰值的信号与噪声比 （SINO） 至少为 10。
注：虽然 vd 列表针对低 SL 功率（1.2 kHz）进行了优化，但此 vd 列表还应在要使用的最高 SL 功率（例如15 kHz）进行测试。这是因为在具有显著 KEX 贡献的峰值的高 SL 功率下，衰变速度会慢得多。因此，在高 SL 功率下也应验证足够的衰变。
| 参数描述 | 脉冲序列中的参数名称 | |
| 标记为 1D | 1D 塞洛普 | |
| 脉冲程序用于共振 1D | 1HR1rho_HCP_onres1D.es | 1HR1r_HH_onres1D.js |
| 1H 载波频率（ppm） | O1P = ppm 中的水共振 | O1P = 兴趣峰值的化学转移 （ppm） |
| CNST28 = 兴趣峰值的化学转移 （ppm） | CNST29 = ppm 中的水共振 | |
| 1H 硬 90o 脉冲 | P1 = PL1（以 3.1.1 校准） | P1 = PL1（以 3.1.1 校准） |
| 水抑制的形状脉冲和动力 | P25 = 1000 我们 @ sp3 | P12 = 2000 我们 @ sp1 |
| （水门事件） | （激发雕刻） | |
| 13C 载波频率，与 13C 化学转移的兴趣峰值的共振 | O2P | – |
| 15N 载波频率，平均 15N 化学移位以脱钩（如芳香 HSQC 所用） | O3P | – |
| 13C/15N 脱钩（设置为 HSQC） | pcpd2， cpd2 | – |
| pcpd3， cpd3 | ||
| HCP 转移（例如，p=1/J = 100 Hz） | – | |
| 脉冲 和 脉冲 2 命令可用于确定硬脉冲的电量 | ||
| 持续时间（设置为 1/J（1H-13C） 的利息峰值） | P11 | |
| 电源 1H 和电源 13C | SP1， SP12 | |
| 塞洛普转移 （d = 1/4J （H5-H6）） | – | D5 |
| 塞洛普的选择性脉冲（例如芳香区域）（4000我们，Eburp） | – | P13 = SP4 |
| SL / RD 特定参数： | ||
| 1H SL 功率，从校准的硬脉冲（例如，使用脉冲命令）获得。 | Pl25 = CNST12 （1.2 = 15 kHz） | Pl24 （50 Hz 或 15 kHz） |
| SL 持续时间的可变延迟列表（最初 1 条目，0，3.1.3 下描述的优化） | vdlist （+ 0 = 40 ms） | vdlist （+ 0 = 150 ms 由于未标记样品中的低 R2） |
| vd 列表中的 TDF1 条目数（最初 1） | TDF1 | TDF1 |
| 热补偿： | ||
| D30 = vd 列表中的最大值 = 2ms | D30 | D30 |
| 非常广泛的 Sls 的额外热补偿 | PL25 | |
| 失谐具体参数： | ||
| 脉冲程序用于失谐振 1Ds | 1HR1rho_HCP_offres1D.es | 1HR1r_HH_offres1D.js |
| 偏移用于异振实验 | CNST30 | CNST30 |
表2：建立基于1D HCP和基于1D-SELOPE的1H R1+实验的参数概述。缩写：1D = 一维;HCP = 异核交叉极化;塞洛普 – 分离优化质子实验;ppm = 百万分之一;HSQC® 异核自旋量子相关性;SL = 旋转锁;RD = 放松分散
- 设置和获取共振 1H R1 + 实验
- 将实验从第3.4节复制到 托普斯平的新文件夹中。
- 在此文件夹中，设置不同 SL 强度的实验，每次更改 PL25 和 CNST12。使用 脉冲 命令确定每个 SL 强度的正确功率级别。使用 1.2 到 15 kHz 的 SL 强度，对较低的 SL 强度进行更密集的采样（请参阅 图 5G 以示选定的 SL 强度）。添加一些实验的副本，以复制某些 SL 强度。
- 运行这些实验。
- 共振分析 1H R1+ 实验
- 在 TopSpin 中，使用相同的处理参数（例如， 线宽、相）使用命令 xf2处理每个伪 2D 数据集的每个切片，然后使用 Bruker AU 程序 分拆 2D将数据集拆分为 1D。
- 获取每个 1D 切片的信号强度和音量。
注：在实践中，最好将光谱解压，以消除潜在重叠峰值的贡献，并允许使用 Bruker AU 程序 的多重扩展， 该程序在文本文件 decall 中的一个实验中方便地总结了所有切片的强度或区域.txt 然后，它可以很容易地与其他程序一起读出（Python 脚本写在内部在这里使用，施泰纳等人描述）在步骤 3.6.3 和 3.6.4。 - 适合每个 SL 强度的单指数衰变，以获得 R1 + （或共振 、R2+REX）值。
- 绘制这些 R2+REX 值 （y） 与。SL 强度 （x） （图 5F，G）。
注：如果低 SL 强度的值显著较高，并且随着 SL 功率的增加而降低（如图 5G所示），则所调查的峰值显示分散，并且进行额外的（非共振）实验以获取有关兴奋状态 与兴奋状态的人口和化学转移差异的信息可能很有趣。地面状态。
4. 1H R1 + 放松分散 -失谐（标记为 1D 版本）
- 设置和获取异声 1H R1+ 实验
- 在一个新的顶针文件夹中，设置实验在一定的SL强度（通常首先在最低的SL强度作为R EX贡献最高有，见图5G代表选择的异振SL），但与不同的偏移，每次改变CNST30。
- 使用偏移高达±（3或4）*SL强度，与密集的采样约0偏移，如图5H，I.
- 运行这些实验。
- 异振1H R 1 +实验分析
- 使用相同的处理策略（如 3.6.1+3.6.3）来确定每个偏移的 R1+ 值。
- 绘制这些值与偏移（图5G）。
注：此曲线中的不对称已经表明可以获取兴奋状态的化学转移信息。必须使用 Bloch-McConnell 或拉盖尔方程进行彻底的拟合和分析，以获取有关kEX、p ES以及+10、20（图 5G）的信息。 在 Petzold 实验室 Github 存储库（https://github.com/PetzoldLab）上可以找到两个 1D 实验的示例数据集、脉冲程序和宏。表2提供了参数概述。
Representative Results
RNA 生产协议通过生成高纯度成绩单促进净化。 图 3A 显示了串联成绩单的几个反应的结果，提供了成功和不成功的反应。Lane 1 显示了完全裂开的脚本的最佳情况，只有微弱的副产品痕迹。Lane 2a 显示不完整的，可以通过重新修复和添加更多 RNase H （ Lane 2b ，步骤 2 . 1 . 2 ）来解决。1、2a 和 2b 车道的 RNA 构造相同。3 号车道上的样本显示不成功。排除这种反应的故障将涉及检查导引序列、 DNA 模板的纯度和退火温度。可能， RNase H 将不得不在 T7 IVT 后执行，如示例 2 所示。
4 巷中的样品显示了大量侧产品，这些产品很难通过离子交换 HPLC 去除。排除此类样本的故障可能涉及（ a ）降低温度、 RNase H 量或反应时间，（ b ）降低梯度和注射量，并试图将目标分数与侧产品分开。卡尔松等人已经讨论了如何提高离子交换HPLC纯化分辨率的进一步信息。HPLC 将目标RNA与更长或更短的核酸、蛋白质或小分子污染物分离。 图 3B 显示了离子交换 HPLC 净化的最佳结果。应选择梯度，以便目标 RNA 物种在下一个较小的物种之后至少放小一个列体积（在此示例中为： 35 mL ），在下一个较大物种之前放小一列体积。
这种方法中较小的物种包括单核苷酸、流产产品（ 8 - 12 nt ）、 3 ' 和 5 ' 间隔序列（ 5 - 14 nt ）和导引（ 12 nt 幻想核酸），而较长的序列可能是不洁的串联重复和质粒。当达到分离良好的脱液峰值时，纯化可以放大到每次注射相当于 +20 mL 的 IVT 反应。RNA 样本的正确折叠对于 RD 实验至关重要，并且必须在每次测量之前得到确认。 图 4 显示了在应用步骤 2.4（蓝色）中的折叠协议之前的 A 标记 22-mer RNA，以及实现正确折叠后的相同示例（红色）。Mc-Fold 二级结构预测 （图 4C）提出了具有 4 个碱基对的发夹结构，从而产生 5 个 imino 信号。
图4A中的两个光谱都证实了这些预测信号，尽管相对强度略有不同，这表明一些折叠结构错误（这里，一毛钱）可能只有1H 1D光谱来评估是有问题的。然而，芳香1H，13C-HSQC频谱（图4B），在折叠协议（蓝色）之前只显示样品的芳香信号3个，但根据步骤2.4（红色）折叠的样品的所有4个信号。以蓝色显示的样本可能形成同质体（图4D中建议的结构），其产生的伊米诺信号与发夹相同。A13H2的信号似乎被交换了。这些结果有助于强调折叠确认的重要性与伊米诺和芳香指纹实验之前，每个RD实验。本协议中描述的1H R1+脉冲序列允许检测中间交换系统中的动态。最初记录了共振曲线，如果存在特定残留物的动态，则在获得的R2+REX值内可见分散，而此曲线对于无交换的残留物是平的。
图5显示了合成RNA发夹（图5A）中两个不同的H8原子获得的代表性共振曲线，其中G6H8体验交换（图5C），而A4H8则没有（图5B）。由于此示例中的交换速度相对较慢（kEX = 292 ± 40 Hz），因此利用 SELOPE 实验的优势来实现低 SL 强度，并且使用脉冲序列的 1D 版本记录了两个共振曲线。然后，使用相同的脉冲序列获取在共振配置文件中显示分散的残留物的失谐数据。图5D显示获得的R 1+值与偏移值，其中曲线的轻微不对称已经表示[é]的标志。
这变得更加明显，在R 2+REX情节中，R1的贡献被删除（图5E）。同一数字的右列显示在稍有不同的合成RNA发夹中为两个不同的H8原子获得的具有代表性的共振曲线，交换速度更快，其中G6H8体验交换（图5G），而A4H8则不（图5F）。更快的汇率（kEX = 43，502 ± 38，478 Hz） 允许使用 SELOPE 2D 版本同时对所有芳香质子进行 RD 记录，以获取谐振数据（图 5H、I中显示的 G6H8 数据）。
正面和负面结果的通用标识符
串联 IVT 和 RNase H 中的阳性结果可识别为： 1 ）目标带是变性 PAGE 凝胶中最强的波段。2） 主波段周围没有或只有弱频段。3） 没有或只有弱的更高分子量物种。4） HPLC 色谱图显示目标 RNA 的分离度高。5） 当主峰值被采样时，只有一个波段出现在变性的 PAGE 凝胶上。
串联 IVT 和 RNase H 中的负结果如下： 1 ）在变性 PAGE 凝胶上可以看到不或只是弱主带。2） 从RNA串联重复的高分子量物种模式是可见的。3） 虽然主波段存在，但强度相似的波段在 3 nt ±或低于主波段。
折叠良好的样品可识别如下：1） 观测到的伊米诺质子数量与二次结构模拟所期望的伊米诺质子数量相匹配（例如，Mc-Fold39，图4A）。2） UUCG 环中的 syn G-U 摆动基对（如果存在）在 +9.5 ppm 下可见，有时只能在较低的温度下可见。Fürtig和同事40日描述了UUCG环路的进一步指纹识别。3） 芳香指纹与先前分配的样本一致，该样本已被确认可以正确折叠（图4C）。
误折或降级的样本可识别如下：1） 伊米诺信号比二级结构模拟预测的要多（注：减少 imino 信号并不一定意味着误折叠，因为关闭基对通常不可见，构象交换拓宽了线条）。2） 缺少伊米诺信号。3） 芳香区高强度的狭窄信号，表示单核苷酸降解产物。4） 伊米诺或芳香信号与已确认折叠的参考样本（图 4C）之间的差异。
在可检测的时间尺度中显示无交换的原子可以识别为：1） 来自平面 RD 配置文件（由于缺少的REX贡献随应用 SL 功率而变化）（图 5B和图 5F）。2） 当kEX和 +具有相同数量级时，必须小心处理慢中间交换的情况。在这种情况下，共振贡献可能非常小，如图 5C中所见（在此例中，安装参数为kEX = 292 ± 40 Hz 和+112 ± 4 Hz）。如有疑问，可以记录低 SL 离谐振曲线以进行验证。
在共振RD实验（图5B 和 图5F）中，可以从非平面放松分散剖面中识别出中间时间尺度上显示交换的原子：2） HSQC 或 SELOPE 实验中更广泛的线宽也可以作为交换指标。
选好的反共振曲线的 SL 功率值（图5E，F）： 1） 在共振曲线中有相当大的kEX贡献（图5C 和图 5G 中表示选定的 SL 功率值）。2） 由于对至少 3 个 SL 功率值进行离共振曲线测量，所选 SL 功率值应分布在具有kEX贡献的谐振曲线区域。3） 导致拉盖尔适合后的非平面R2+REX曲线 （例如，图 5D： SL 强度 25、 50 和 75 Hz;图5E）。
对于异振曲线（图 5E，F）选择不当的 SL 功率值会导致拉盖尔适合后的平面R2+REX曲线。图5E中显示了一个例子，其中100赫兹的离共振曲线非常平坦，因此没有提供关于+的重要信息。
旋转框架核过豪瑟效应 （ROE） 人工制品的指示： 1） 从离共振曲线获得的+与空间附近质子 /质子的化学变化相匹配，该变换显示与核过豪瑟效应光谱 （NOESY） 光谱的兴趣峰值相交的峰值。（例如，图5I显示快速中间交换的预期广泛的离共振曲线，但曲线也有更清晰的特征，例如，在-3000赫兹和+1500赫兹。这些很可能是由于 ROE 人工制品，而不是化学转移，这种 H8 在不同的符合者）。2） Laguerre 适合确实有效，但对于共振和至少 3 个离共振曲线，效果不好（给出高错误或物理上不可能的值），即使指数是从高 SINO（>20）（例如 kEX = 43，502 ± 38，478 Hz）的实验中获得的） 。通常每个 SL 都适合单独，但将它们放在一起会产生更高的错误：相反的行为是期望一个真正的兴奋状态。
从非共振曲线获得的"真实"交换指示与空间附近/质子中质子的化学变化不匹配，后者显示与NOESY光谱兴趣峰值的交叉峰值（例如图5E）。2） 拉盖尔适合给低错误的共振和至少 3 个失谐曲线 （例如，图 5E vs.图5I，请参阅标题以获得合适的结果）。
图3 ： T7 串联 IVT 和 RNase H 反应的样本生产。 （ A）串联 IVT 和 RNase H 的正负结果的变性页。梯子高度指 RNA 参考， 12* 指幻想指南。巷 1： 成功生成 20 nt 目标 RNA。很少有更短和更长的产品存在。巷 2a ：串联成绩单的不完整。虽然 HPLC 的净化是可能的，但会浪费大量材料。巷 2b ： 2 巷的持续 Rnase H 产生一个干净的样品，准备 HPLC 注射（与巷 1 相同）。巷 4 ： RNase H 基本上没有成功，也没有产生目标带。全长串联成绩单仍然可见于 600 nt。巷5：产生了目标带，但存在一个强大的-1波段。虽然可以执行 HPLC，但需要小心地删除侧产品。（B） 成功注射 HPLC 的示例。38分钟的峰值包含目标长度的纯RNA，而更长和更短的产品与目标RNA有很好的分离。小组B已由 21日起修改。缩写：IVT = 体外 转录;HPLC = 高性能液相色谱;nt = 核苷酸;AU = 任意单位。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：在（蓝色）和（红色）后的RNA发夹示例，在NMR.（A）的折叠步骤2.4（参见协议）的1个H-1D光谱的A标记22-merRNA的Imino区域。伊米诺信号基础对标识的预期区域以灰色表示。（B） 1H，13C-HSQC 光谱的RNA的芳香共振从面板A.折叠后的样本（红色）显示 4 个信号，而折叠前的样本（蓝色）仅显示 3 个信号。（C） 麦克折叠预测 22 mer RNA 作为发夹。从这个二级结构中可以预期到五个伊米诺信号，这可以在A.（D）面板中发现由22-merRNA形成的同质体的拟议结构中的两个样本，从而产生与发夹结构相同的5个碱基对。缩写：核磁共振： 核磁共振;1D = 一维;HSQC = 异核单量子相关性;ppm = 百万分之一。请单击此处查看此图的较大版本。
图5：1H R1 +RD代表基于RNA发夹的两种不同构造的结果。（A） 左列显示在 RNA 上获得的结果，在凸起的 U 上方有 C-G 基对，而右列显示在基对切换到 G-C 的样本上获得的结果。（B） 和（F） 显示两个构造的 A4H8 获得的平面分散配置文件，表示没有构造交换。（C-E） 显示在 （G-C） 结构中为 G6 获得的谐振、失谐和安装数据。Laguerre 适合导致以下结果： R1 = 2.87 ± 0.01 Hz， R2 = 7.76 ± 0.03 Hz， kEX =292 ± 40 Hz， pES = 0.31 ± 0.03%， = 112 ± 4 Hz.（G=I）显示共振、失谐和在 （G-C） 结构中为 G6 获得的安装数据。拉盖尔适合导致以下结果： R1 =1.93 ± 0.02 Hz， R2 = 6.71 ± 0.86 Hz， k EX = 43，502 ± 38，478 Hz， p ES = 27 ± 16%， + 203 ± 166 Hz.这个数字从20个修改。缩写：SL = 旋转锁。请单击此处查看此图的较大版本。
Discussion
本文提出的协议是以前以研究文章10、20、21、31的形式发表的若干协议的综合。因此，可以应用协议的片段，而其他部分可以交换给读者的偏好。例如，R 1 +测量可以在使用任何方法生产的 RNA 样本上进行，因为可以假定长度的折叠和均匀性。此外，该协议不包含关于RNA序列共振分配的信息，这是RD实验所需的步骤，因为这在以前的文献19、37、38中已被广泛报道。部分、细分或特定地点的标签方案 36、41、42、43、44 是促进共振分配或减少对 RD 实验感兴趣的共振重叠的方法，并在文献中详细描述。这种方法允许使用任何核苷酸标识的统一标记，这已经可以大大简化共振分配。
这里介绍的IVT方法克服了序列和标签的已知问题，与其他方法相比，提高了产量，降低了成本和工作时间。病毒启动序列的使用减少了反应优化的需要，这是该领域的一个已知问题，执行起来可能非常耗时，在非 G 启动的情况下，成绩单的副本很少。串联成绩单的 T7 IVT 和 Rnase H 裂口可以在同一容器中同时执行。反应过程中，在变性的 PAGE 凝胶上可以看到多重串联重复的模式，该凝胶在完成 RNase H 反应（图 3A、车道 1和 2b）后凝聚到目标 RNA 上的单个波段。使用此方法的典型产量范围为每 1 mL IVT 30 至 70 nmol RNA。然而，基于 RNase H 串联重复的方法并非没有自身的某些问题。RNase H 反应通常不会在与 T7 转录同时运行时完成（图 3A ，车道 2a ）。
串联单元的分离可以通过将指南退到成绩单上并添加更多 RNase H （图 3A 、车道 2b 、步骤 2 . 1 . 2 ）来最终确定。由于体积大的加热速度缓慢，导致 Mg2+催化 RNA 的水解，因此使用了传统的微波炉，将样品加热到 10-15 s 中的 95 °C >。迄今尚未观察到对所生产样品的不利影响。有些构造显示一个小的第二波段，无法通过优化反应条件（图3A，车道4）消除。通常，如果使用优化良好的脱位梯度，这些作为 HPLC 色谱中的肩部可以相当清晰地可见，并且可以删除（步骤 2.2.5）。以下讨论旨在突出协议中的关键步骤，特别是关于获得能够解释构象动力学的高质量数据。
RNase 污染
细胞外 Rnases 无处不在，高度稳定，对 NMR 样品的长期稳定性构成最大威胁。因此，在无 RNase 环境中工作并保持所有试剂和塑料器皿无 RNase 至关重要。建议使用滤镜提示，甚至面罩。在 HPLC 净化后，这一点尤其重要。受 RNases 污染的 NMR 样品通常显示由于单核苷酸降解产品，在数天或数周后在 1个 H-1D 光谱中可见的狭窄峰值。这种样品不适合 R1+测量。
NMR 示例
由于RNA具有高电压性质，与大多数蛋白质相比，它可以在没有降水的情况下用于高浓度。Shigemi NMR 管（见 材料表）的使用是有利的，因为它们允许将高度浓缩的样品集中在线圈的中心，同时由于易感性匹配的玻璃底部和柱塞，仍然提供理想的闪烁和锁定条件。这样，B1 的不遗传性就降低了，导致线条变窄。NMR 管中的典型样品体积为 250 μL，典型浓度为 1-2 mM。不建议在 500 μM 以下的样品用于 RD 实验，因为实验需要很长时间，而且非常有光。同样，不建议低于 200 μL 的样品体积，因为需要良好的闪亮和现场稳定性（锁）。插入柱塞时，避免在样品中形成气泡（步骤 2.4.5）至关重要。如果修复不当，柱塞可以滑入样品中，从而减少可检测体积。此外，温度的快速变化可能导致样品中形成新的气泡。因此，在运输样品时以及在 NMR 光谱仪中更改探针温度时应小心谨慎。在较长时间后再次测量时，检查样品是否有气泡。
RNA 折叠
如果不能正确折叠，动态RNA分子可以存在于多个构象中。尽管二级结构的熔化温度只能略高于室温，但建议在测量前进行彻底的加热和捕捉冷却过程。高度浓缩的发夹样品在动能控制下折叠（加热和捕捉冷却）随着时间的推移可以形成同质体，这就需要在每次核磁共患 NMR 测量之前严格控制 RNA 折叠。如果测量的RNA不是发夹结构，而是RNA复式，则应在热力学控制下进行缓慢折叠。
在这种情况下，加热后的冷却过程应在小时范围内，而RNA在 NMR 样品中的最终体积和浓度中使用。预期伊米诺和芳香共振的初始计数可以提供有关样品同质性的见解。如果样品看起来不像预期，则应重新折叠。Mg2+ （添加为氯化盐） 可以帮助折叠RNA结构45.实际上，折叠控制是与至少部分分配 NMR 共振并实验性地解决二级结构的示例的比较。
旋转锁电源和加热考虑
如果将 1H R1 + RD 实验作为 2D 概述实验运行，SL 功率应不低于 1.2 kHz。射频发射频率应放置在感兴趣的峰值 ppm 区域中间（例如芳香质子的 7.5 ppm）。然后，1.2 kHz 的带宽将足够大，可以旋转锁定这些质子，而不会产生任何重大的失谐效应。这种影响可以在 RD 配置文件中识别。如果发生 ，R2+REX 值会随着 SL 功率值的增加而增加而不是减少，尤其是对于低 SL 功率。检查计算的 SL 功率值是否与交付给示例的功率相对应。在实践中，如果在较新的光谱仪上仔细校准 了 1H 90° 硬脉冲，则可以使用计算的 SL 功率;但是，这可以通过校准每个所需带宽的 SL 功率来检查。
SL 功率的范围非常广泛，可用于1H R1 +RD实验，导致样品加热变化（基于 HCP 序列的 HSQC 为 1.2 kHz 至 15 kHz，SELOPE 实验为 50 Hz 至 15 kHz）。在比较低功耗 SLs 获得的 1D与。。。 。时，可以检测到样品加热的不平等是化学移位的轻微变化。大功率 SLs。这种效应通常不在异种核的R1+实验中的热补偿中考虑。由于每个自旋锁功率系列的 vd 列表中指定的旋转锁持续时间不同，这些实验中的热补偿通常是为了纠正不同的加热。特别是对于SELOPE实验，第二次热补偿应该用于所有应用SL强度，如20中描述的。
vd 列表考虑
如前所述，vd 列表应包含足够长的时间点，以获得显著的强度衰减（理想情况下，降低到初始信号的 30%，或者如果不可能在探针规格内达到 70% 的衰变，则尽可能低）。虽然 vd 列表针对低 SL 功率 （1.2 kHz） 进行了优化，但此 vd 列表还应在要使用的最高 SL 功率（例如15 kHz）进行测试。这是由于，对于具有显著 REX 贡献的峰值，在高 SL 功率下衰变速度会慢得多。因此，在高 SL 功率下也应验证足够的衰变。在异振实验中，在高偏移下衰变时也必须考虑这一点。vd 列表的理想最大时间点对于分散实验的不同区域可能有很大的不同。在这种情况下，vd 列表中可以包含更多的点，并且根据它们将导致的低 SINO 进行分析时，可以丢弃用于更高 SL 功率或更高偏移的较长 vd 列表点。一般来说，5-8 vd 列表点应被视为能够发现导致非指数衰变的潜在人工制品，如 J 耦合（见下文）。
1D-HCP 选择性考虑
如果在运行基于 HCP 的 1D 版本时，如果与基于 2D HSQC 的实验的1H 维度的兴趣峰值重叠，则必须特别小心。基于 HCP 的传输非常（但从未 100% 选择性），因此，另一个峰值可能会导致 1D 兴趣峰值的强度和衰变行为。这表明，使用标记实验的1D和 2D 版本获得的共振R1 + 值存在差异。
ROE 考虑因素：
对于具有慢中间交换的原子的离共振曲线，ROE 人工制品可以根据获得的 [与 NOESY 或 ROESY 光谱 的比较 ]进行识别。如果交叉峰值可以识别出与 +对应的化学移位差，那么观察到的兴奋状态实际上可能是 ROE 伪器（例如，在芳香质子之间发现了 ROE，它们都在同一化学移位范围内，因此被那些非共振曲线20所覆盖）。从经验，这总是导致不良适合与大错误，可能是由于ROE没有遵循相同的模式 REX 与增加SL功率。中速交换的情况变得更加困难。虽然共振曲线（从相邻核上获得的 13C 数据比较）仍然代表 GS 和 ES 之间的交换过程，但离共振曲线受多个 ROE 人工制品的影响。
在这种情况下，检测交换过程的 SL 功率更大（> 1.5 kHz），因此跨越了更多的质子，因为离共振曲线跨越了各种 ROE 候选的化学转移差异（对于 H8 来说，它们是：ca 中的氨基质子）。 ± 1000 赫兹， H5 / H1 在 ca. - 1200 Hz， 伊米诺质子在 ca. 3500 Hz） 。到目前为止，还没有发现任何方法可以抑制这些 ROE 人工制品（除了使用部分去质的核苷酸46），并且不应记录用于快速中间交换的失谐数据，因为如果不能通过 NOESY 光谱排除 NOE/ROE 贡献，则无法使用此方法提取有关实际\é 的可靠信息。
J - 耦合 （哈特曼 - 哈恩） 考虑
虽然同核J耦合质子（如H6）的共振曲线被成功记录为10、20，但必须特别注意离共振测量，特别是对于低SL功率，因为哈特曼-哈恩匹配条件可以跨越广泛的研究偏移。哈特曼-哈恩文物可以确定为指数衰变或增加R2+REX值的振荡，在共振RD地块20中具有增强的SL优势。
Disclosures
K.P. 是阿拉基斯治疗公司的顾问，该公司发现针对RNA的小分子。
Acknowledgments
我们感谢卡罗林斯卡研究所的蛋白质科学设施（PSF）对T7 RNA聚合酶和 大肠杆菌 RNase H的表达和纯化，马丁·赫尔伯格对无机磷酸盐的慷慨馈赠，以及整个佩佐德实验室的宝贵讨论。我们感谢卢卡·雷塔蒂诺为U-凸起结构和埃米莉·施泰纳和卡罗来纳·丰塔纳对宏和合适的脚本的贡献。我们感谢卡罗林斯卡研究所和医学生物化学和生物物理学部支持购买600兆赫光谱仪和头寸融资（KI FoAss 和 KID 2-3707/2013）。我们感谢维滕斯卡普斯特雷德（#2014-4303）、斯蒂夫特尔森·费尔·斯特拉特吉斯克·福斯克宁（ICA14-0023和FFL15-0178）和拉格纳尔·塞德伯格·斯蒂夫特尔塞（M91-14）、哈拉尔德·奥赫·格雷塔·让森·斯蒂夫特尔塞（JS20140009），卡尔·特里格斯扼杀（CTS14-383和15-383），伊娃·奥克·奥斯卡·阿伦斯·斯蒂夫特尔塞，艾克·维伯格·斯蒂夫特尔塞（467080968和M14-0109），巨蟹座（CAN 2015/388），J.S. 承认通过玛丽·斯考多夫斯卡-居里IF（欧盟H2020， MSCA-IF项目号747446）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad | 161-0144 | |
| 5-alpha Competent E. coli | NEB | C2987I | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 49199 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | |
| AFC-3000, HPLC Fraction collector | Thermo Scientific | 5702.1 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Amersham ImageQuant 800 UV | GE Healthcare | 29399482 | Replacing LAS-4000 or equivalent |
| Amicon ultra centrifugal filter unit | Sigma-Aldrich | UFC900324 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| ATP-13C10/15N5 | Sigma-Aldrich | 645702 | |
| BamHI restriction enzyme | NEB | R0136L | |
| Bottle top filter | VWR | 514-1019 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | 1081220005 | |
| Cleavage guide | IDT | N/A | or equivalent |
| CTP | Sigma-Aldrich | C1506 | |
| CTP-13C10/15N5 | Sigma-Aldrich | 645699 | |
| D2O | Sigma-Aldrich | 151882 | |
| Dionex Ultimate 3000 UHPLC system | Thermo Scientific | N/A | |
| DL-Dithiotreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DNAPac PA200 22x250 Semi-Prep column | Thermo Scientific | SP6734 | |
| DNAPac PA200 22x50 guard column | Thermo Scientific | SP6731 | |
| E.coli RNase H | NEB | M0297L | or made in-house uniprot ref. P0A7Y4 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Eppendorf centrifuge, rotor: A-4-44 | Eppendorf | 5804R | |
| Ethanol 95% | Fisher scientific | 11574139 | |
| Ethanol 95% denatured | VWR | 85829.29 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671 | |
| GelRed | VWR | 41003 | |
| GeneRuler 1kbp Plus | Fisher Scientific | SM1333 | Optional |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377 | |
| GMP-13C10/15N5 | Sigma-Aldrich | 650684 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| GTP-13C10/15N5 | Sigma-Aldrich | 645680 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma-Aldrich | I1643-100UN | or made in-house uniprot ref. P0A7A9 |
| Invitrogen UltraPure 10X TBE-buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | |
| Julabo TW8 Water bath | VWR | 461-3117 | |
| kuroGEL Midi 13 Horizontal gel electrophoresis | VWR | 700-0056 | or comparable |
| LB broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Low Range ssRNA Ladder | NEB | N0364S | Optional |
| LPG-3400RS Pump | Thermo Scientific | 5040.0036 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 63068 | |
| microRNA Marker | NEB | N2102S | |
| Microwave oven | Samsung | MS23F301EAW | |
| Mini-PROTEAN electrophoresis equipment | Bio-Rad | 1658004 | |
| NucleoBond Xtra Maxi | Machinery-Nagel | 740414.10M | |
| pUC19 plasmid containing tandem insert | Genscript | N/A | or equivalent |
| RNaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | |
| Shigemi tube 5mm | Sigma-Aldrich | Z529427 | |
| Single-use syringe, Luer lock tip | VWR | 613-2008 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 730-1470 | |
| Sodium perchlorate | Sigma-Aldrich | 71853 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| Spermidine trihydrochloride | Sigma-Aldrich | 85578 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher | S11494 | |
| Syringe filters | VWR | 514-0061 | |
| T7 RNA polymerase | Sigma-Aldrich | 10881767001 | or made in-house uniprot ref. P00573 |
| TCC-3000RS Column thermostat | Thermo Scientific | 5730 | |
| Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | 10103203 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375 | |
| UMP-13C9/15N2 | Sigma-Aldrich | 651370 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U6625 | |
| UTP-13C10/15N5 | Sigma-Aldrich | 645672 | |
| VWD-3100 Detector | Thermo Scientific | 5074.0005 |
References
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