Praktiske aspekter ved prøvepreparering og oppsett av ¹H R_1ρ avslapningsspredningsforsøk av RNA

Summary

Vi presenterer en protokoll for å måle mikro- til millisekunddynamikk på ¹³C /¹⁵N-merket og umerket RNA med ¹H R_1ρ avslapningsdispersjon kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Fokuset i denne protokollen ligger i prøvepreparering og oppsett av NMR-eksperimenter med høy renhet.

Abstract

RNA er en svært fleksibel biomolekyl, hvor endringer i strukturer spiller avgjørende roller i funksjonene som RNA-molekyler utfører som cellulære budbringere og modulatorer. Mens disse dynamiske tilstandene forblir skjult for de fleste strukturelle metoder, tillater R_1ρ avslapningsspredning (RD) spektroskopi studiet av konformasjonsdynamikk i mikro- til millisekundregimet ved atomoppløsning. Bruken av ¹H som observert kjerne utvider ytterligere tidsregimet dekket og gir direkte tilgang til hydrogenbindinger og baseparing.

De utfordrende trinnene i en slik studie er høy renhet og høy avkastning prøvepreparering, potensielt ¹³C- og ¹⁵N-merket, samt oppsett av eksperimenter og montering av data for å trekke ut befolkning, valutakurs og sekundær struktur av den tidligere usynlige tilstanden. Denne protokollen gir viktige praktiske trinn i prøvepreparering for å sikre utarbeidelse av en passende RNA-prøve og oppsett av ¹H R_{1ρ-eksperimenter} med både isotopisk merkede og umerkede RNA-prøver.

Introduction

RNAer utfører en rekke regulatoriske¹, katalytiske²og strukturelle^3-funksjoner i cellen, hvorav mange er korrelert med en fleksibel molekylær struktur og intrikate endringer i disse strukturene^4,5,6,7. Lavbefolkede tilstander forblir usynlige for de fleste metoder for strukturbestemmelse eller tillater ikke studiet av disse skjulte tilstandene ved høy atomoppløsning. Løsningstilstand kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi kombinerer begge aspekter ved å gi tilgang til individuelle atomkjerner, samt tilby en stor verktøykasse med eksperimenter rettet mot dynamikk gjennom alle tidsregimer⁸. RD NMR-eksperimenter gir tilgang til konformasjonsutveksling i mellomliggende tidsskala, der endringer i basisparingsmønstre og lokale strukturelle omorganiseringer kan forventes^{5,9,10,11,12,13,14}. RD-eksperimenter utføres så lange R_2-målinger i form av et Carr-Purcell-Meiboom-Gill pulstog¹⁵ eller som avslapningsmålinger i den roterende rammen, kalt R_1ρ RD-eksperimenter¹⁶.

Selv om begge kan brukes til å trekke ut populasjon av og valutakurs og kjemisk skiftforskjell til mindre tilstand, gir R_1ρ RD-eksperimenter også tegn på den kjemiske skiftforskjellen i den begeistrede tilstanden. Dette tillater en inferens på sekundær struktur, som sterkt korrelerer med kjemisk skifte i RNA-strukturer¹⁷. Det kjemiske skiftet er en god indikator på helikitet når det gjelder aromatiske protoner og karboner på nukleobasene, av baseparingspartnere for iminoprotoner, og av sukkerpuckere på C4' og C1' atomer^18,19. Det skal bemerkes at nylig et kjemisk utvekslingsmetningsoverføringseksperiment (CEST) ved hjelp av høyere spinnlås (SL) -kraft, og dermed skiftet anvendbarheten av CEST-eksperimentet til raskere utvekslingstidsskalaer, ble publisert som et alternativ til R_1ρ RD-eksperimentet for systemer med en spent tilstand.

Selv om ¹³C og ¹⁵N isotoper ofte har blitt brukt til å få tilgang til strukturell utveksling, brukte nyere arbeid fra dette laboratoriet aromatiske og imino protoner som sonder for konformasjonsutveksling^9,10. Bruken av ¹H som observert kjerne gir flere fordeler, for eksempel tilgang til utveksling på raskere og langsommere tidsskalaer, høyere følsomhet og kortere måletider. Dette forenkles ytterligere av SELective Optimized Proton Experiment (SELOPE)-tilnærmingen, som gir tilgang til aromatiske protoner gjennom derowding av det endimensjonale (1D) spekteret ved hjelp av homonukleære skalarkoblinger, i stedet for en heteronukleær magnetiseringsoverføring, og eliminerer behovet for isotopetiketter²⁰. Denne protokollen tar for seg målingen i ¹H R_1ρ RD-eksperimenter med jevnt ¹³C/¹⁵N-merkede og umerkede prøver. Derfor presenterer dette dokumentet en prøveforberedelsesmetode som ble funnet å være den mest allsidige for forskjellige prøveforberedelsesbehov²¹ og diskuterer alternativer i den siste delen av denne artikkelen (Figur 1).

På dette tidspunktet bør leseren merke seg at andre prøveforberedelsesteknikker er akseptable for ¹H R_1ρ RD-eksperimenter, og at andre metoder for strukturell og funksjonell analyse kan utføres med prøvene syntetisert med den presenterte teknikken. ¹ H R_1ρ RD-eksperimenter krever høye RNA-konsentrasjoner (ideelt >1 mM) samt høy homogenitet, både i RNA-lengde og strukturell konformasjon for å sikre pålitelig karakterisering av molekylær dynamikk. In vitro transkripsjon (IVT) er den valgte metoden for mange forskere å produsere ¹³C /¹⁵N-merkede RNA-prøver på grunn av tilgjengeligheten av merkede nukleoside triphosfater (NTPs) og facile inkorporering i den enzymatiske reaksjonen²². Imidlertid lider den mye brukte T7 RNA-polymerase (T7RNAP)^23,24,25 av lav 5 ' homogenitet i tilfelle visse initieringssekvenser^26,27 og ofte også 3 ' homogenitet under transkripsjon avrenning²⁸. Rensing av målet RNA-arter blir dyrere og arbeidskrevende på grunn av behovet for store mengder ~ 200 nmol. Metoden som brukes her har blitt presentert tidligere der fordeler ble diskutert på store²¹. Kort sagt løser den beskrevne problemer ved å transkribere en større tandemutskrift som deretter er spesielt spaltet av Escherichia coli RNase H, styrt av et chimerisk oligonukleotid^29,30 (se figur 2 for detaljer).

Inkorporering av en avstandssekvens i de 5' og 3' endene av tandemutskriften tillater bruk av en høy avkastning initiering sekvens og fjerning av terminaloverheng nær lineariseringsstedet til henholdsvis plasmidmalen (Figur 2B). Metoden ble vist å forbedre utbyttet betydelig, samtidig som kostnadene og arbeidskraften reduseres, med forbehold om en mer kompleks malsyntese og behovet for et ekstra enzym og oligonukleotid. Den høye spesifisiteten til RNase H-spalting letter rensing på grunn av mangel på RNA-arter i et lignende størrelsesområde. Den nåværende protokollen bruker en ionutveksling høyytelses flytende kromatografi (HPLC) trinn som har blitt publisert av dette laboratoriet nylig³¹, selv om andre metoder er mulige alternativer. ¹ H R_1ρ RD kan generelt anskaffes på merkede eller umerkede prøver med to respektive pulssekvenser, det "merkede" ¹H R_1ρ heteronuclear single quantum correlation (HSQC)-basert eksperiment med en ¹³C indirekte dimensjon¹⁰ og det "unlabeled" ¹H R_1ρ SELOPE-basert eksperiment med en ¹H indirekte dimensjon²⁰.

Disse todimensjonale (2D) eksperimentene kan fungere som en første sjekk, uavhengig av om dynamikken på R_{1ρ-tidsskalaen} er til stede i eksemplet. En oversikt over RD for alle løste topper i spektra kan oppnås, og topper av interesse for en grundigere RD-analyse kan identifiseres. Dette betyr at selv umerkede prøver kan kontrolleres før en beslutning om å produsere en dyrere, merket prøve blir tatt. Når en topp med konformasjonsutvekslingsbidrag er valgt ut til å bli studert grundigere, er det best å bytte til 1D-versjonene av de ovennevnte eksperimentene (hvis toppen fortsatt kan løses) for å utføre såkalte off-resonanseksperimenter. For den merkede versjonen erstattes HSQC-overføringen til ¹³C med et selektivt heteronukleært krysspolariseringstrinn (HCP) som brukes i ¹³C R_{1ρ-eksperimenter} ^32,33,34,35, mens når det gjelder SELOPE-eksperimentet, kjøres eksperimentet ganske enkelt som en 1D, noe som er spesielt nyttig for H8- og H2-signaler som ligger på diagonalen i 2D uansett. Et kriterium for hvilken sekvens som skal brukes, forutsatt at både et merket og umerket utvalg er tilgjengelig, er hvor godt isolert toppen av interessen er i de to eksperimentene.

Generelt anbefales SELOPE-eksperimentet for RNA-prøver på opptil 50 nukleotider. For større RNAer blir overlappingen større. Imidlertid vises strukturelt interessante nukleotider ofte i kjemiske skiftregioner som er mindre overlappende og fortsatt kan være tilgjengelige i enda større RNAer. Et annet argument ville være at i umerkede prøver oppstår ingen J-kobling mellom ¹H og ¹²C. Men ettersom den minste spinnlåskraften er definert av minimumskraften som brukes til å koble fra de to spinnene (~ 1 kHz) i det merkede eksperimentet, tillater det umerkede eksperimentet bruk av et bredere spekter av spinnlåsstyrker (SL) og derfor tilgang til en bredere utvekslingstid. Disse off-resonanseksperimentene gir tilleggsinformasjon til k_ex, for eksempel populasjonen av den begeistrede tilstanden (alternativ konform), p_ES, samt svært verdifull kjemisk skiftinformasjon i form av Δω (den kjemiske skiftforskjellen i bakketilstanden og den begeistrede tilstanden).

Figur 1: Arbeidsflyten til den presenterte protokollen. Forberedelse før selve storskala prøveproduksjon, bestående av malforberedelse og bekreftelse av vellykket in vitro transkripsjon og RNase H spalting. Storskala produksjon inkludert HPLC-rensing, fylling av NMR-rør og bekreftelse av RNA-folding. Ved isotopmerket syntese bør det utføres en umerket rensing for gradientoptimalisering samme dag. NMR karakterisering av konformasjonsdynamikk med R_1ρ eksperimenter. Hvert trinn kan utføres uavhengig, for eksempel ^{at 1}H R_1ρ RD-analysen kan brukes på alle egnede RNA-prøver som produseres med en annen metode. Forkortelser: IVT = in vitro transkripsjon; HPLC = høy ytelse flytende kromatografi; NMR = kjernemagnetisk resonans; RD = avslapping dispersjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Målet med denne protokollen er å gi praktiske detaljer og kritiske parametere for studiet av konformasjonsdynamikk med ¹H R_1ρ avslapningsdispersjon i RNA-hårnålsmolekyler. Etter å ha gitt en detaljert protokoll for design, syntese og ionutveksling HPLC-rensing av et mål RNA som kan utføres ved hjelp av alle, noen eller ingen NTPer som ¹³C /¹⁵N-merkede versjoner, er arbeidsflyten for å fullføre NMR-prøven og bekrefte samsvarsutvekslingen med NMR-spektroskopi blitt beskrevet. Til slutt beskrives detaljene for oppsettet av ¹H R_1ρ RD-eksperimenter på et Bruker NMR-spektrometer (Figur 1). Protokollen gir hvert trinn for å konfigurere 1D-versjonen for merkede eksempler og tilleggskommentarer, og en tabell som skal justeres for oppsettet av SELOPE-versjonen (Tabell 2). Etter protokollen diskuteres kritiske trinn og alternative ruter til prøvepreparering og ¹H R_1ρ RD-oppsett.

Protocol

Figur 2: Skjematisk representasjon av den rapporterte tandem IVT-protokollen. (A) Tandemtranskripsjon fra en linearisert plasmidmal med T7RNAP (venstre) og påfølgende spalting av RNAse H av transkripsjonen for å oppnå mållengde RNA, regissert av en chimerisk DNA-guide (høyre). (B) Detaljert skjematisk av tandemmalen som starter med den virale T7RNAP-promotoren, en initieringssekvens. Målsekvensen (mørkeblå, eksempel her er 20 nt lang) gjentas "n" ganger. Repetisjonene flankert av en 5′ og 3′ spacer sekvenser bestående av de siste åtte og første fire nukleotider, henholdsvis for å tillate fjerning av initiering og begrensning sekvenser fra første og siste repetisjon enhet. (C) Hybridisering av tandem transkripsjon (rød) og chimeric spalting guider (grønn). RNase H cleaves RNA motsatt til DNA 5′ enden. 2′-OMe RNA flanker øke spesifisiteten ved å forbedre bindende affinitet av spalting guide til målet RNA. Dette tallet er endret fra ²¹. Forkortelser: T7RNAP = T7 RNA polymerase. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

1. Utarbeide arbeid for en ny RNA-konstruksjon

1. Plasmid design og forberedelse
   1. Skriv malsekvensen i et kloningsverktøy, for eksempelSeriekloner.
   2. Ta T7 promotorsekvensen og legg til en startsekvens med høy avkastning (T7: 5'-TAATACGACTCACTATA ^GGGAGA-3').
      MERK: Transkripsjonen starter ved nukleotidet som er indikert med en cirkumfostre (^). Initieringssekvensen GGGAGA er variabel, men sterkt sekvensavhengig; Derfor anbefales bruk av denne sekvensen.
   3. Legg til de siste 8 nukleotidene (nt) av målsekvensen som en avstandsstykke på 5 ' (5'S).
   4. Legg til gjentakelser av målsekvensen (TS).
   5. Tilsett de fire første nukleotidene som en avstandsstykke på 3' etter repetisjonene (5'S).
   6. Legg til et BamHI-begrensningsområde (RS) eller lignende unikt begrensningsnettsted.
      MERK: Den totale sekvensen som vist vil bli klonet eller lett sortert i en bakteriell høykopiert plasmid (f.eks.pUC19): 5'-T7-5'S-(TS)_n-3'S-RS-3' (Figur 2B). Antall repetisjoner bør være så høyt som tillatt ved gensyntese ( maksimalt 600 nt i denne protokollen).
   7. Forsterk plasmidet i E. coli ved hjelp av et kommersielt sett.
   8. Lineariser renset plasmid ved 20 ng/μL ved hjelp av riktig begrensningssted. Skalabegrensning fordøyes med BamHI med opptil 1 ml.
   9. Rens den fordøyde plasmiden, og bekreft vellykket linearisering på en 1% agarose gel. Oppbevar den lineariserte plasmiden ved -20 °C i flere måneder.
2. Utforming av støttelinje for spalting (figur 2C)
   1. Skriv de siste åtte nukleotidene i mål-RNA-sekvensen i 5'-3'-retningen, og legg til de fire første nukleotidene til mål-RNA-sekvensen på 3'-enden også i 5'-3'retning.
   2. Generer det omvendte DNA-komplementet til den sekvensen
   3. Endre den første og siste fire nukleotider til sine 2'-OMe modifikasjoner ved å legge til en 'm' før nukleotid brevet.
      MERK: For syntese brukes mU i stedet for mT.
   4. Bestill oligo med standard avsalting av rensing.
      MERK: Kontroller om den genererte oligoen kan binde seg på et annet sted enn tilkoblingen av to RNA-sekvenser. Full komplementaritet i de sentrale fire DNA-nukleotidene er nødvendig, mens flankeområdene kan tillate en mismatch. Utvid om nødvendig flankene til opptil 18 nt for å generere en unik bindingssekvens³⁶.
3. Ivt i liten skala
   MERK: For RNase-fritt arbeid, klargjør alle reagenser under sterile og RNase-frie forhold. Bruk RNase dekontamineringsreagens (se materialtabellen) og 95 % v/v etanol til å rengjøre arbeidsflater og pipetter før bruk. Vask hansker med 95% etanol og bruk lofrie langermede klær. For å minimere RNase-forurensning må du ikke puste over åpne rør.
   1. Forbered lagerløsninger for Tris-Cl (pH 8.0), dithiothreitol, MgCl₂, spermidin og NTPs/GMP (ubuffered). Bland reagenser som vist i tabell 1. Forbered en mesterblanding av disse reagensene på forhånd, før tilsetning av enzymer eller nukleinsyrer.
      MERK: Hvis du bruker frosne reagenser, må du blande dem grundig etter opptining. Reagenser kan utløses hvis de blandes ved for høye konsentrasjoner, så det anbefales på det sterkeste å følge rekkefølgen i tabell 1.
   2. Legg i følgende rekkefølge: plasmid, spaltingsguide, uorganisk fosfatase (IPPase), RNase H, T7RNAP. Siden enzymaktivitet kan variere for enzymer produsert internt, må du teste flere konsentrasjoner før du velger den beste.
      MERK: Inkluder en negativ kontroll for spaltingsreaksjonen, for eksempel uten RNase H, for å tilskrive et manglende målbånd til feil RNase H-spalting og ikke til mislykket transkripsjon.
   3. Inkuber reaksjonen ved 37 °C i 1 time og bekreft reaksjon på en denaturerende polyakrylamidgelelektroforese (PAGE) (Figur 3A). Fortynn prøven 10 ganger i lasteoppløsningen, og last 1 μL på gelen.
      MERK: Gelblanding: 8 M urea, 20 % akrylamid (19:1 akrylamid:bisacrylamid) i 1x TBE. Lasteløsning: 5 mM etylendiamintetraacetisk syre (EDTA), 300 μM bromofenolblå i formamid. RNase H spalting reaksjoner kan ikke forventes å være ferdig etter 1 time, som nye RNA produseres hele tiden. På dette tidspunktet, se opp for et klart målbånd og fraværet av en art av lignende molekylvekt(f.eks.±3 nukleotid (nt) produkter).

Reagent	Lagerkonsentrasjon	Mengde liten skala (μL)
H2O	-	24
Tris	1 M	5
MgCl2	1 M	0.5
DTT	1 M	0.5
Spermidin	250 mM	5
GMP	100 mM	2.5
ATP	100 mM	1.5
GTP	100 mM	1.5
UTP	100 mM	1.5
CTP	100 mM	1.5
Plasmid	20 ng/μL	5
Veiledning for spalting	100 μM	10
iPPase	10 mg/ml	0.5
RNase H	10 μg/ml	2
T7 RNA polymerase	5 mg/ml	2

Tabell 1: Reagensbord for tandem IVT og samtidig RNase H-spalting. Lagerkonsentrasjoner kantilpassesbrukerens bekvemmelighet. Hvis RNase H spalting må utføres etter T7 IVT, legge til spalting guide og RNase H etter varme-inaktivering av T7RNAP. Beløp som brukes, skaleres lineært med reaksjonsskala. Forkortelser: T7RNAP = T7 RNA polymerase; IVT = in vitro transkripsjon.

2. NMR prøvepreparering

1. Skaler opp reaksjonen på ønsket volum (vanligvis 10 ml), og kjør reaksjonen over natten. Test for reaksjonsfullføring neste dag med en denaturert PAGE gel (Figur 3A).
   MERK: Ufullstendig spaltingsreaksjon vises av arter med høyere molekylvekt over målbåndet.
   1. Hvis spaltingen ikke var vellykket eller fullstendig, reanneal RNA og spaltingsføreren i reaksjonsbeholderen ved å varme opp løsningen i en konvensjonell mikrobølgeovn ved 450 W i 15 s.
   2. Avkjøl oppløsningen langsomt til 37 °C i 40 minutter. Bruk en varmeblokk for volumer under 1 ml. Legg merke til dannelsen av nytt bunnfall.
   3. Tilsett mer IPPase og RNase H, og inkuber i ytterligere 1-3 timer ved 37 °C. Bekreft fullføring av spaltingsreaksjonen med denaturing PAGE.
   4. Når RNase H spalting reaksjonen er fullført, slukke reaksjonen ved å legge EDTA til 50 mM endelig konsentrasjon og virvel grundig.
      MERK: Potensiell pyrofosfatnedbør vil oppløses, og nye proteinutfellinger dannes.
   5. Filtrer oppløsningen gjennom et 0,2 μm sprøytefilter, og konsentrer deg om et volum som kan injiseres i et HPLC-system, avhengig av størrelsen på injeksjonssløyfen.
      MERK: Protokollen kan settes på pause her ved å fryse prøven ved -20 °C.
2. HPLC-rensing i stor skala
   1. Klargjør ionbyttebufferne A og B innen én ukes bruk. Filtrer og degas bufferne.
      MERK: Buffer A: 20 mM natriumacetat; 20 mM natriumperklorat, pH 6,5. Buffer B: 20 mM natriumacetat; 600 mM natriumperklorat, pH 6,5.
   2. Likevekt kolonnen med 100% buffer B etterfulgt av 100% buffer A for minst 2 kolonnevolumer ved 75 °C.
   3. Klargjør HPLC-sekvensen (figur 3B) med en strømningshastighet på 5,5 ml/min. Bruk følgende sekvens for rensing av en RNA-størrelse mellom 20 og 30 nt: 0-7 min: 0% B; 7-16 min: gradient 0-20% B; 16-46 min: elution, vanligvis med en gradient på 20-30% B (optimaliser i henhold til behov); 46-62 min: 100% B; 62-73 min: 0% B.
      MERK: En endring i strømningshastigheten fra 5,5 til 8 ml/min påvirket ikke separasjonen i denne protokollen.
   4. Optimaliser elutiongradienten ved injeksjon av en tilsvarende 1 ml transkripsjonsreaksjon (uten etikett) om gangen.
      MERK: For ytterligere detaljer og diskusjon, se Karlsson et al.³¹ og Feyrer et al.²¹.
   5. Test de innsamlede brøkene på en denatureringsside. Hvis den viktigste elutiontoppen er godt isolert og inneholder det rene målet RNA, skalerer du opp rensingen til en tilsvarende 10 ml transkripsjonsreaksjon.
   6. Samle brøkdeler av interesse, konsentrer og bytt bufferen med NMR-buffer. Bruk en ultracentrifugal filterenhet (se materialtabellen) for volumer over 50 ml.
      MERK: NMR buffer: 15 mM natriumfosfat; 25 mM natriumklorid; 0,1 mM EDTA, pH 6,5. For å minimere tap fra RNA som holder seg til plastrørvegger, vask alle oppsamlingsrør med 1 ml vann, virvel og sentrifuge for å samle all væske.
   7. Bestem konsentrasjonen via ultrafiolett spektroskopi. Beregn reaksjonsutbyttet i henhold til Feyrer et al²¹.
      MERK: Konsentrasjonen av en NMR-prøve for RD-eksperimenter bør ikke være under 130 nmol, som tilsvarer 500 μM i et prøvevolum på 250 μL ved hjelp av NMR-rør (Materialliste).
3. Folding av en RNA-prøve
   1. Fortynn og aliquot prøven av et volum på ~ 10 ml i 1 ml per rør.
   2. Varm opp RNA-aliquots til 95 °C i 5 minutter.
   3. Avkjøl prøvene ved å plassere dem på is eller i en vann-is-saltblanding og inkubere i 30 minutter.
   4. Bassengprøver og konsentrat til ~ 250 μL i en 2 ml sentrifugalfilterenhet.
4. Fylling av et NMR-rør
   1. Rengjør NMR-røret i NMR-rørrenseren ved å skylle med rikelig vann, RNase dekontamineringsreagens, vann, 95% etanol (EtOH) og vann igjen. La det tørke.
   2. Rengjør stempelet ved å skylle med vann og tørke med RNase dekontamineringsreagens og 95% EtOH ved hjelp av en lofri klut. La det tørke.
   3. Tilsett 10 % (v/v) D₂O i NMR-prøven.
   4. Fyll RNA-prøven i NMR-røret med en stor pipettespiss. La væsken strømme langs siden av rørveggen.
   5. Sett inn stempelet og fjern luftbobler ved å skyve stempelet ned sammen med en rask vridningsbevegelse.
   6. Trekk stempelet sakte opp uten å lage nye luftbobler og fest det med parafinvoksfilm.
5. Bekreft folding med NMR.
   MERK: På dette tidspunktet er det nødvendig å utføre minst delvis resonansoppdrag for å bekrefte sekundærstrukturen i RNA-prøven og for å identifisere interesseområder for studiet av konformasjonsdynamikk. En uttømmende beskrivelse av RNA-resonansoppdraget vil overstige denne protokollen, derfor refererer vi til veletablert litteratur på dette tidspunktet^19,37,38. En elektroforetisk mobilitetsskiftanalyse (EMSA) kan være en nyttig indikator på RNA-folding og fungere som komplementære data for NMR-eksperimenter.
   1. Sammenlign følgende spektra av prøven som ¹H R_1ρ RD eksperimenter utføres med riktig brettet referanseprøve (Figur 4): ¹H 1D, spesielt iminoområdet 10-15 ppm; Aromatisk ¹H,¹³C-HSQC; ¹ H,¹H-SELOPE (valgfritt).
      MERK: Et aromatisk fingeravtrykk er også nødvendig, selv i tilfelle enighet mellom iminosignaler, fordi dimerdannelse ofte viser de samme eller lignende iminosignaler som en RNA-hårnål. SELOPE-eksperimentet kan erstatte en ¹H,¹³C-HSQC for aromatisk fingeravtrykk, da heteronukleære eksperimenter på umerkede prøver er svært tidkrevende.
   2. Bruk UUCG-løkken som en fingeravtrykksreferanse (hvis den finnes).
   3. Utfør denne sammenligningen hver gang før ¹H R_1ρ RD-eksperimenter registreres.

3. ¹H R_1ρ Avslapningsdispersjon—resonans (merket 1D-versjon)

MERK: Trinnene nedenfor beskriver oppsettet av RD-eksperimenter for en merket prøve ved hjelp av 1D-versjonen av den HSQC-baserte RD-pulssekvensen. Følg de samme trinnene for den SELOPE-baserte 1D-sekvensen for umerkede prøver. En oversikt over parameternavn og -innstillinger for begge tilfeller vises i tabell 2. Fokuset på 1D-versjoner er fordi de er mer praktiske for off-resonansmålinger, og oppsettet av 2D-versjonene av SELOPE- og HSQC-baserte eksperimenter har blitt diskutert i detalj av henholdsvis Schlagnitweit et al.²⁰ og Steiner et al.¹⁰.

1. Bestem ¹H-effekt for en hard 90° puls (P1).
   1. Alternativ A: Bruk pulskommandoen Bruker.
   2. Alternativ B: I et zg-eksperiment bestemmer du 360° pulsen ved å måle en nøttekurve ved protonens hardpulseffektnivå på vanntoppen.
      MERK: Pulslengden på 90° er en fjerdedel av varigheten der nullsignal observeres (hvis en full mutterkurve måles, er det den andre nullen; men i praksis er det bare regionen rundt forventet verdi for 360° som prøves).
2. Kjør en ¹H 1D-spektrum zgesgp.f2f3dec ved hjelp av pulslengden som er bestemt i trinn 3.1 for å bekrefte RNA-foldingen før hver R_1ρ-måling.
   MERK: Hvis ¹H SL-eksperimenter kjøres for første gang, må du kontrollere om den beregnede SL-effekten tilsvarer strømmen som leveres til prøven ved å kalibrere SL-strøm for hver ønskede båndbredde. Detaljerte kalibreringstrinn er beskrevet i Steiner et al.¹⁰.
3. Opprett en ¹H R_1ρ for merket datasett, og angi nøkkelparametere.
   1. Opprett et nytt datasett. ideelt basert på et ¹H-¹³C aromatisk HSQC-datasett som brukes på fullt merkede RNA-prøver for RNA-oppdrag.
      MERK: Dette sikrer at ¹³C samt ¹⁵N strøm- og frakoblingseffekt allerede er satt opp.
   2. Angi de generelle parameterne i henhold til den første delen av tabell 2.
   3. Angi RD-spesifikke parametere i henhold til den andre delen av tabell 2.
   4. Sett ¹H SL-strøm til laveste verdi (1,2 kHz) for testing.
   5. Generer en test vd -liste med bare én oppføring, 0 ms(for å optimalisere vd -listen, som beskrevet i trinn 3.4), sett TDF1 til 1 og oppdater D30.
   6. Kjør et testspekter med disse innstillingene.
4. Optimaliser vd-listen (liste over SL-lengder som skal brukes).
   1. Kjør eksperimentet med en test vd-liste (f.eks.seks oppføringer: 0 m, 5 m, 10 m, 20 m, 30 m, 40 m; rykk disse verdiene for å unngå systematiske feil på grunn av oppvarming).
   2. Oppdater D30 og TDF1 tilsvarende (i dette eksemplet D30 = 42m og TDF1 = 6).
   3. Plottintensiteten til topp- og SL-lengden. Identifiser SL-lengden der intensiteten til den opprinnelige toppen reduseres til 1/3.
   4. Opprett den endelige vd-listen som skal brukes i eksperimentet, med tanke på følgende: bestem den lengste SL-lengden som beskrevet i forrige trinn; unngå å bruke en liste med synkende eller stigende rekkefølge; og legge til noen duplikater for statistiske studier. Husk å oppdatere D30 og TDF1 hver gang det er noen endringer i vd-listen.
      MERK: Eksperimentet kjøres med forskjellige SL-lengder som angitt i vd-listen på en pseudo-2D-måte.
   5. Velg antall skanninger slik at den svakeste toppen på listen har et signal-til-støy-forhold (SINO) på minst 10.
      MERK: Selv om vd-listen ble optimalisert for lav SL-effekt (1,2 kHz), bør denne vd-listen også testes med den høyeste SL-effekten som skal brukes (f.eks.15 kHz). Dette er fordi forfallet vil være mye tregere ved høy SL-kraft for topper med betydelig k_EX-bidrag. Derfor bør et tilstrekkelig forfall også verifiseres ved høy SL-kraft.

Beskrivelse av parameter	Parameternavn i pulssekvens
	1D merket	1D SELOPE
pulsprogram for 1D-er med resonans	1HR1rho_HCP_onres1D.es	1HR1r_HH_onres1D.js
1 H bærefrekvenser (ppm)	O1P = vann resonans i ppm	O1P = kjemisk skifte av interessestopp (ppm)
	CNST28 = kjemisk skifte av interessestopp (ppm)	CNST29 = vann resonans i ppm
1 H hard 90º puls	P1 @ PL1 (kalibrert i 3.1.1)	P1 @ PL1 (kalibrert i 3.1.1)
Formede pulser og krefter for vannundertrykking	P25 = 1000 oss @ sp3	P12 = 2000 oss @ sp1
	(Watergate)	(eksitasjonsskulptur)
13 C bærerfrekvens, on-resonans med 13C kjemisk skifte av topp av interesse	O2P	–
15 N bærerfrekvens, gjennomsnittlig 15N kjemisk skifte for frakobling (som brukt i aromatisk HSQC)	O3P	–
13 C/15N frakobling (definert som i HSQC)	pcpd2, cpd2	–
	pcpd3, cpd3
HCP-overføring (f.eks. p=1/J @ 100 Hz)		–
puls- og pulsf2-kommandoer kan brukes til å bestemme krefter fra harde pulser
Varighet (satt til 1/J(1H-13C) av interessestopp)	P11
Strøm 1H og strøm på 13C	SP1, SP12
SELOPE overføring (d = 1/4J (H5-H6))	–	D5
Selektiv puls (f.eks. aromatisk region) for SELOPE (4000 oss, Eburp)	–	P13 og SP4
SL/RD-spesifikke parametere:
1 H SL-effekt, hentet fra kalibrert hardpuls (f.eks. ved hjelp av pulskommandoen).	Pl25 og CNST12 (1,2 – 15 kHz)	Pl24 (50 Hz – 15 kHz)
Variabel forsinkelsesliste for SL-varighet (opprinnelig 1 oppføring, 0, optimalisering beskrevet under 3.1.3)	vdlist (~ 0 – 40 ms)	vdlist (~ 0 – 150 ms på grunn av de lave R2 i umerkede prøver)
TDF1 antall oppføringer i vd-listen (opprinnelig 1)	TDF1	TDF1
Varmekompensasjon:
D30 = største verdi i vd-liste + 2 ms	D30	D30
Ekstra varmekompensasjon for svært bredt spekter av SLs		PL25
Spesifikke parametere for off-resonans:
pulsprogram for off-resonans 1Ds	1HR1rho_HCP_offres1D.es	1HR1r_HH_offres1D.js
Offset for eksperimenter med off-resonans	CNST30	CNST30

Tabell 2: Oversikt over parametere for å sette opp 1D HCP-baserte og 1D-SELOPE-baserte ¹H R_{1ρ-eksperimenter.} Forkortelser: 1D = endimensjonal; HCP = heteronukleær krysspolarisering; SELOPE = SELective Optimalisert Proton Eksperiment; ppm = deler per million; HSQC= heteronukleær spinn kvantekorrelasjon; SL = spinnlås; RD = avslapping dispersjon

5. Oppsett og oppkjøp av on-resonans ¹H R_1ρ eksperimenter
   1. Kopier eksperimentet fra del 3.4 til en ny mappe i Topspin.
   2. I denne mappen konfigurerer du eksperimenter med forskjellige SL-styrker, hver gang du endrer PL25 og CNST12. Bestem riktig effektnivå for hver SL-styrke ved hjelp av pulskommandoen. Bruk SL-styrker fra 1,2 til 15 kHz, med en tettere prøvetaking for lavere SL-styrker (se figur 5G for utvalgte SL-styrker). Legg til kopier av noen av eksperimentene for å ha duplikater for noen av SL-styrkene.
   3. Kjør disse eksperimentene.

6. Analyse av on-resonans ¹H R_1ρ eksperimenter
   1. I TopSpin behandler du hver sektor i hvert pseudo-2D-datasett ved hjelp av de samme behandlingsparameterne (for eksempel linjeforlenging, fase) ved hjelp av kommandoen xf2, og deler datasettet i 1D ved hjelp av Bruker AU-programmet split2D.
   2. Oppnå signalintensiteter og volumer for hver 1D-skive.
      MERK: I praksis er det bedre å dekonvolvere spektraet for å kvitte seg med bidrag fra potensielt overlappende topper og tillater bruk av Bruker AU-programmet multidcon, som enkelt oppsummerer intensitetene eller områdene av toppene i alle skiver i ett eksperiment i tekstfilen decall.txt, som deretter enkelt kan leses opp med andre programmer (Python-skript skrevet internt ble brukt her, som beskrevet av Steiner et al.¹⁰) i trinn 3.6.3 og 3.6.4.
   3. Monter et monoeksponentielt forfall for hver SL-styrke for å oppnå R_1ρ (eller on-resonans, R₂+R_EX) -verdien.
   4. Tegn inn verdiene R₂+R_EX (y) vs. SL-styrke (x) (Figur 5F,G).
      MERK: Hvis verdiene er betydelig høyere for lave SL-styrker og reduseres med høyere SL-kraft (som vist i figur 5G), viser den undersøkte toppen spredning, og det kan være interessant å utføre ytterligere (off-resonans) eksperimenter for å få informasjon om befolkningen og kjemisk skiftforskjell av den begeistrede tilstanden vs. bakketilstanden.

4. ¹H R_1ρ Avslapningsdispersjon – off-resonans (merket 1D-versjon)

1. Oppsett og oppkjøp av off-resonans ¹H R_1ρ eksperimenter
   1. I en ny topspin-mappe setter du opp eksperimenter med en viss SL-styrke (vanligvis først med lavest SL-styrke ettersom R_EX-bidraget er høyest der, se Figur 5G for et representativt utvalg av SLs off-resonans), men med forskjellige forskyvninger, hver gang du endrer CNST30.
   2. Bruk forskyvninger opptil ± (3 eller 4)*SL-styrke, med en tettere prøvetaking rundt 0 forskyvning, som vist i figur 5H,I.
   3. Kjør disse eksperimentene.
2. Analyse av off-resonans ¹H R_1ρ eksperimenter
   1. Bruk den samme behandlingsstrategien, som i 3.6.1–3.6.3, til å bestemme en R_1ρ-verdi for hver forskyvning.
   2. Tegn inn disse verdiene i forhold til forskyvning ( Figur5G).
      MERK: En asymmetri i denne kurven kan allerede indikere at kjemisk skiftinformasjon for den begeistrede tilstanden kan oppnås. Grundig montering og analyse ved hjelp av Bloch-McConnell- eller Laguerre-ligninger må utføres for å få informasjon om k_EX, p_ES samt Δω^10,20 ( Figur5G). Du finner eksempeldatasett, pulsprogrammer og makroer for begge 1D-eksperimentene på Petzold Lab Github-repositoriet (https://github.com/PetzoldLab). En oversikt over parametere er angitt i tabell 2.

Representative Results

Protokollen for RNA-produksjon letter rensing gjennom generering av transkripsjoner med høy renhet. Figur 3A viser resultatene av flere spaltingsreaksjoner av tandemutskrifter, noe som gir både vellykkede og mislykkede reaksjoner. Lane 1 viser det optimale tilfellet av en fullstendig spaltet transkripsjon med bare svake spor av sideprodukter. Lane 2a viser ufullstendig spalting, som kan løses ved å re-annealing og tillegg av mer RNase H (Lane 2b, trinn 2.1.2). RNA-konstruksjonene av baner 1, 2a og 2b er de samme. Prøven i bane 3 viser mislykket spalting. Feilsøking av denne reaksjonen vil innebære en kontroll av spaltingsguidesekvensen, renheten til DNA-malen og glødetemperaturen. Potensielt må RNase H-spalting utføres etter T7 IVT som vist for prøve 2.

Prøven i bane 4 viser en betydelig mengde spaltingssideprodukter, som er vanskelige å fjerne via ionbytte HPLC. Feilsøking av en slik prøve kan innebære (a) senketemperatur, mengde RNase H eller reaksjonstid, (b) redusere elutiongradient og injeksjonsvolum og forsøke å skille målfraksjonene fra sideproduktene. Ytterligere informasjon om hvordan du øker oppløsningen i ionbytte HPLC rensing har blitt diskutert av Karlsson et al.³¹. HPLC skiller målet RNA fra lengre eller kortere nukleinsyrer og protein eller småmolekyler. Figur 3B viser det optimale resultatet for ionbyttet HPLC-rensing. Elution gradient bør velges slik at målet RNA arter elutes minst ett kolonnevolum (i dette eksemplet: 35 ml) etter neste mindre arter og en kolonne volum før neste større arter.

Mindre arter i denne metoden inkluderer enkelt nukleotider, abortive produkter (8-12 nt), 3' og 5' spacer sekvenser (5-14 nt), og spalting guide (12 nt chimeric nucleic acid), mens lengre sekvenser er potensielt urent tandem repetisjoner og plasmid. Når en godt separert elutionstopp oppnås, kan rensing skaleres opp til tilsvarende ~ 20 ml IVT-reaksjon per injeksjon. Riktig fold av en RNA-prøve er avgjørende for RD-eksperimenter og må bekreftes før hver måling. Figur 4 viser en A-merket 22-mer RNA før foldeprotokollen i trinn 2.4 (blå) ble påført, og den samme prøven etter at riktig folding er oppnådd (rød). En Mc-Fold sekundær struktur prediksjon (Figur 4C) foreslår den presenterte hårnål strukturen med 4 basepar som resulterer i 5 imino signaler.

Begge spektraene i figur 4A bekrefter disse predikerte signalene, om enn med litt forskjellige relative intensiteter, noe som indikerer at en eller annen feilfoldet struktur (her en dimer) kan være problematisk å vurdere med bare ¹H 1D-spektra. Et aromatisk ¹H,¹³C-HSQC-spektrum (figur 4B), viser imidlertid bare 3 av de aromatiske signalene for prøven før foldeprotokollen (blå), men alle 4 signalene for prøven som er brettet i henhold til trinn 2.4 (rød). Prøven vist i blått dannet sannsynligvis en homodimer (struktur foreslått i figur 4D) som ville resultere i de samme iminosignalene som hårnålen. Signalet til A13H2 virker utvekslingsforse utvidet. Disse resultatene bidrar til å markere viktigheten av å brette bekreftelse med både imino- og aromatiske fingeravtrykkseksperimenter før hvert RD-eksperiment. ¹H R_1ρ pulssekvenser beskrevet i denne protokollen tillater deteksjon av dynamikken i mellomutvekslingsregimet. I utgangspunktet registreres en resonanskurve, og hvis dynamikken er til stede for en bestemt rest, er en dispersjon synlig innenfor de oppnådde R₂+R_EX-verdiene, mens denne kurven er flat for rester uten utveksling.

Figur 5 viser representative resonanskurver oppnådd for to forskjellige H8-atomer i en syntetisk RNA-hårnål (figur 5A), der G6H8 opplever utveksling (Figur 5C), mens A4H8 ikke gjør det (Figur 5B). Siden utvekslingen er relativt langsom i denne prøven (k_EX = 292 ± 40 Hz), ble fordelen med SELOPE-eksperimentet for å oppnå lave SL-styrker utnyttet, og de to resonanskurvene ble registrert ved hjelp av 1D-versjonen av pulssekvensen. Den samme pulssekvensen ble deretter brukt til å innhente off-resonansdata for restene som viste spredning i on-resonansprofilen. Figur 5D viser de oppnådde R_1ρ -verdiene i forhold til forskyvningen, der en liten asymmetri av kurven allerede angir tegnet for Δω.

Dette blir enda tydeligere i R₂+R_EX-plottet der R_1-bidraget fjernes ( Figur5E). Høyre kolonne i samme figur viser representative resonanskurver oppnådd for to forskjellige H8-atomer i en litt annen syntetisk RNA-hårnål med raskere utveksling, der G6H8 opplever utveksling (Figur 5G), mens A4H8 ikke gjør det (Figur 5F). Den raskere valutakursen (k_EX = 43 502 ± 38 478 Hz) tillot RD-registrering av alle aromatiske protoner samtidig ved hjelp av SELOPE 2D-versjonen for å få både on- og off-resonansdata (G6H8-data vist i figur 5H, I).

Generelle identifikatorer for positive og negative resultater
Positive resultater i tandem IVT og RNase H spalting kan identifiseres som følger: 1) Målbåndet er det sterkeste båndet i denaturering PAGE gel. 2) Det er ingen eller bare svake bånd rundt hovedbåndet. 3) Det er ingen eller bare svake høyere molekylvektarter. 4) HPLC-kromatogrammet viser en godt separert topp av målet RNA. 5) Når hovedtoppen er samplet, vises bare ett bånd på en denaturing PAGE gel.

Negative resultater i tandem IVT og RNase H spalting til stede som følger: 1) Nei eller bare et svakt hovedbånd er synlig på en denaturing PAGE gel. 2) Et mønster av arter med høy molekylvekt fra RNA tandem repetisjoner er synlig. 3) Selv om hovedbåndet er til stede, er bånd med lignende intensitet over eller under hovedbåndet i ± 3 nt.

En godt brettet prøve kan identifiseres som følger: 1) Antall observerte iminoprotoner samsvarer med antall iminoprotoner som forventesfra en sekundær struktursimulering (f.eks. 2) Syn G-U wobble basepar i en UUCG sløyfe (hvis til stede) er synlig ved ~ 9.5 ppm, noen ganger bare synlig ved lavere temperatur. Ytterligere fingeravtrykk av UUCG-løkken er beskrevet av Fürtig og kolleger⁴⁰. 3) Det aromatiske fingeravtrykket er enig med en tidligere tildelt prøve som er bekreftet å brettes riktig (Figur 4C).

En feilfoldet eller degradert prøve kan identifiseres som følger: 1) Det er flere iminosignaler enn en sekundær struktursimulering forutsier (MERK: færre iminosignaler innebærer ikke nødvendigvis feilfolding, da lukkebasepar ofte ikke er synlige, og konformasjonsutveksling utvider linjer). 2) Fravær av iminosignaler. 3) Smale signaler med høy intensitet i den aromatiske regionen, noe som indikerer enkelt nukleotidforringelsesprodukter. 4) Divergens mellom imino- eller aromatiske signaler til en referanseprøve av bekreftet folding (Figur 4C).

Et atom som ikke viser noen utveksling i den påvisbare tidsskalaen kan identifiseres som følger: 1) fra en flat RD-profil (på grunn av det manglende R_EX-bidraget som varierer med den påførte SL-effekten) (Figur 5B og Figur 5F). 2) Det må tas hensyn til tilfelle av langsom mellomliggende utveksling når k_EX og Δω er av samme størrelsesorden. I så fall kan resonansbidraget være svært lite som det fremgår av figur 5C (i dette tilfellet er de monterte parametrene k_EX = 292 ± 40 Hz og Δω = 112 ± 4 Hz). Hvis du er i tvil, kan en lav SL off-resonanskurve registreres for verifisering.

Et atom som viser utveksling i mellomtidsskalaen kan identifiseres 1) fra en ikke-flat avslapningsdispersjonsprofil i et RD-eksperiment på resonans (figur 5B og figur 5F); 2) en bredere linewidth i HSQC- eller SELOPE-eksperimentet kan også være en indikator for utveksling.

Godt valgte SL-kraftverdier for off-resonanskurver (Figur 5E,F): 1) har et betydelig k_EX-bidrag i resonanskurven (utvalgte SL-kraftverdier er angitt i figur 5C og figur 5G). 2) Når off-resonanskurver måles for minst 3 SL-kraftverdier, bør de valgte SL-kraftverdiene spres ut over regionen av on-resonanskurven med k_EX-bidrag. 3) Føre til ikke-flate R₂+R_EX-kurver etter Laguerre-passformen (f.eks. Figur 5E).

Dårlig valgte SL-strømverdier for off-resonanskurver (Figur 5E,F) fører til flate R₂+R_EX-kurver etter laguerre-passformen. Et eksempel vises i Figur 5E, der 100 Hz off-resonanskurven er svært flat og derfor ikke gir betydelig informasjon om Δω.

Indikasjoner for roterende ramme kjernefysiske Overhauser effekt (ROE) gjenstander: 1) Δω oppnådd fra off resonans kurver matche kjemiske skift av protoner i romlig nærhet / protoner, som viser en krysstopp med toppen av interesse for kjernefysisk Overhauser effekt spektroskopi (NOESY) spektrum. (f.eks., figur 5I viser brede off-resonanskurver som forventet for rask mellomliggende utveksling, men kurvene har også skarpere funksjoner, for eksempelved -3000 Hz og +1500 Hz. Disse er svært sannsynlig på grunn av en ROE artefakt i stedet for et kjemisk skifte for denne H8 i en annen konform). 2) Laguerre passform fungerer, men fungerer ikke bra (gir høye feil eller fysisk umulige verdier) for en on-resonans og minst 3 off-resonans kurver, selv om eksponentielle ble oppnådd fra eksperimenter med høy SINO (>20) (f.eks., k_EX = 43,502 ± 38,478 Hz). Ofte passer hver SL individuelt godt, men å montere dem sammen gir en mye høyere feil; Den motsatte virkemåten forventes for en sann opphisset tilstand.

Indikasjoner for "sann" utveksling Δω: 1) Δω oppnådd fra off-resonanskurver samsvarer ikke med kjemiske skift av protoner i romlig nærhet / protoner, som viser en krysstopp med toppen av interesse for NOESY-spekteret (f.eks. 2) Laguerre-passform gir lave feil for en resonans og minst 3 off-resonanskurver(f.eks. Figur 5I, se bildetekst for å få best mulig resultat).

Figur 3: Prøveproduksjon av T7 tandem IVT og RNase H spalting reaksjon. (A) Denaturing PAGE av positive og negative resultater av tandem IVT og RNase H spalting. Stigehøyde refererer til RNA-referanser, 12* refererer til den chimeriske spaltingsguiden. Lane 1: Vellykket generasjon av en 20 nt mål RNA. Få kortere og lengre produkter er til stede. Lane 2a: Ufullstendig spalting av tandemutskriften. Selv om HPLC-rensing er mulig, vil mye materiale være bortkastet. Lane 2b: Fortsatt RNase H spalting av Lane 2 produserer en ren prøve klar for HPLC injeksjon (identisk med Lane 1). Lane 4: RNase H spalting var stort sett mislykket, og ingen målbånd ble produsert. Tandemutskriften i full lengde er fortsatt synlig på 600 nt. Lane 5: Et målbånd ble produsert, men et sterkt -1-bånd er til stede. Selv om HPLC kan utføres, er det nødvendig med forsiktig fjerning av sideproduktet. (B) Eksempel på en vellykket HPLC-injeksjon. Toppen på 38 min inneholder ren RNA av mållengden, mens lengre og kortere produkter er godt skilt fra målet RNA. Panel B er endret fra ²¹. Forkortelser: IVT = in vitro transkripsjon; HPLC = høy ytelse flytende kromatografi; nt = nukleotider; AU = vilkårlige enheter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Eksempel på en RNA-hårnål før (blå) og etter (rød) foldetrinnet 2.4 (se protokoll) i NMR. (A) Imino-regionen i et ¹H-1D-spektrum av en A-merket 22-mer RNA. Forventede regioner for basisparidentitet av iminosignaler er angitt i grått nedenfor. (B) ¹H,¹³C-HSQC spektrum av aromatiske resonanser av RNA fra panel A. Prøven etter folding (rød) viser 4 signaler som forventet, mens prøven før folding (blå) bare viser 3 signaler. (C) Mc-Fold prediksjon av 22-mer RNA som en hårnål. Fem iminosignaler er å forvente fra denne sekundære strukturen, som finnes i begge prøvene i panel A. (D) Foreslått struktur av en homodimer dannet av 22-mer RNA, noe som resulterer i de samme 5 baseparene som hårnålstrukturen. Forkortelser: NMR = kjernemagnetisk resonans; 1D = endimensjonal; HSQC = heteronukleær enkelt kvantekorrelasjon; ppm = deler per million. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: ¹H R_1ρ RD representative resultater for to forskjellige konstruksjoner basert på en RNA-hårnål. (A) Den venstre kolonnen viser resultater oppnådd på RNA med et C-G-basispar over den buede U, mens den høyre kolonnen viser resultater oppnådd på et utvalg der basisparet ble byttet til G-C i stedet. (B) og (F) viser flate dispersjonsprofiler som oppnådd for A4H8 for de to konstruksjonene, noe som indikerer ingen konformasjonsutveksling. (C–E) viser resonans, off-resonans og monterte data innhentet for G6 i (G-C)-konstruksjonen. Laguerre-passformen fører til følgende resultat: R₁ = 2,87 ± 0,01 Hz, R₂ = 7,76 ± 0,03 Hz, k_EX =292 ± 40 Hz, p_ES = 0,31 ± 0,03 %, Δω = 112 ± 4 Hz. (G–I) viser resonans, off-resonans og monterte data innhentet for G6 i (G-C)-konstruksjonen. Laguerre-passformen fører til følgende resultat: R₁ = 1,93 ± 0,02 Hz, R₂ = 6,71 ± 0,86 Hz, k _EX = 43 502 ± 38 478 Hz, p _ES = 27 ± 16 %, Δω = 203 ± 166 Hz. Dette tallet ble endret fra ²⁰. Forkortelse: SL = spinnlås. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Protokollen som presenteres her er en syntese av flere protokoller publisert tidligere i form av forskningsartikler^10,20,21,31. Derfor kan segmenter av protokollen brukes, mens andre kan byttes til leserens preferanse. For eksempel kan R_{1ρ-målingene} utføres på en RNA-prøve produsert med hvilken som helst metode, gitt at folding og homogenitet av lengde antas. Protokollen inneholder heller ikke informasjon om resonanstilordning av RNA-sekvensen - et trinn som kreves for RD-eksperimenter - da dette har blitt dekket mye i tidligere litteratur^19,37,38. Delvise, segmentelle eller stedsspesifikke merkingsordninger^{36,41,42,43,44} er tilnærminger for å lette resonanstilordning eller redusere overlappingen av resonanser som er av interesse for RD-eksperimenter og har blitt beskrevet i lengden i litteraturen. Denne metoden tillater bruk av ensartet merking av enhver nukleotididentitet, noe som allerede kan forenkle resonansoppdrag betydelig.

IVT-metoden som presenteres her, overvinner kjente problemer med sekvenser og merking, øker utbyttet og reduserer kostnader og arbeidstid sammenlignet med andre metoder. Bruken av den virale initieringssekvensen reduserer behovet for reaksjonsoptimalisering, noe som er et kjent problem i feltet som kan være tidkrevende å utføre og gir bare få kopier av transkripsjonen i tilfelle ikke-G-initiering. T7 IVT- og RNase H-spaltingen av tandemutskriften kan utføres samtidig i samme fartøy. Et mønster av multimeriske tandem repetisjoner kan ses på en denaturing PAGE gel under reaksjonen, som samles til et enkelt bånd på målet RNA etter ferdigstillelse av RNase H reaksjon (Figur 3A, baner 1 og 2b). Typiske utbytter ved bruk av denne metoden varierer mellom 30 og 70 nmol RNA per 1 ml IVT. Likevel kommer metoden basert på RNase H-spalting av tandem-repetisjoner ikke uten visse egne problemer. RNase H spalting reaksjonen går ofte ikke til ferdigstillelse når den kjøres samtidig med T7 transkripsjon (Figur 3A, lane 2a).

Separasjonen av tandemenheter kan fullføres ved å gløde spaltningsguiden til transkripsjonen og legge til mer RNase H (Figur 3A, bane 2b, trinn 2.1.2). Ettersom oppvarming av store volumer er treg og fører til Mg²⁺katalysert hydrolyse av RNA, ble det brukt en konvensjonell mikrobølgeovn, som varmer prøven til >95 °C i 10-15 s. Bivirkninger på de produserte prøvene er ikke observert så langt. Noen konstruksjoner viser et mindre andre bånd som ikke kunne elimineres ved optimalisering av reaksjonsforholdene (Figur 3A, bane 4). Vanligvis er disse ganske tydelig synlige som en skulder i HPLC-kromatogrammet, hvis en godt optimalisert elutiongradient brukes, og kan fjernes (trinn 2.2.5). Følgende diskusjon tar sikte på å fremheve kritiske trinn i protokollen, spesielt med hensyn til å skaffe data av høy kvalitet som tillater tolkning av konformasjonsdynamikk.

RNase forurensning
Ekstracellulære RNases er allestedsnærværende, svært stabile og utgjør den største trusselen for langsiktig stabilitet av NMR-prøver. Derfor er det avgjørende å jobbe i et RNase-fritt miljø og holde alle reagenser og plastvarer RNase-fri. Bruk av filtertips og kanskje til og med ansiktsmasker anbefales. Dette er spesielt viktig etter HPLC-rensing. NMR-prøver kontaminert med RNases viser vanligvis smale topper som er synlige i ¹H-1D-spektra etter dager eller uker på grunn av enkeltkjernede nedbrytningsprodukter. En slik prøve er ikke egnet for R_{1ρ-målinger.}

NMR-prøve
På grunn av sin høyt ladede natur kan RNA brukes i høye konsentrasjoner uten nedbør sammenlignet med de fleste proteiner. Bruken av Shigemi NMR-rør (se materialtabellen) er fordelaktig, da de tillater sentrering av den svært konsentrerte prøven i midten av spolen, samtidig som den gir ideelle shimming- og låseforhold på grunn av følsomhetstilpasset glassbunn og stempel. På denne måten reduseres B1-inhomogeneity, noe som gir opphav til smalere linjer. Det typiske prøvevolumet i et NMR-rør er 250 μL, og typisk konsentrasjon er 1-2 mM. Prøver under 500 μM anbefales ikke for RD-eksperimenter, da eksperimentet vil ta for lang tid og en god shim. På samme måte anbefales ikke prøvevolum under 200 μL fordi det kreves god avstandsskive og feltstabilitet (lås). Når du setter inn stempelet, er det viktig å unngå dannelse av bobler i prøven (trinn 2.4.5). Hvis stempelet ikke er riktig festet, kan det gli ned i prøven og redusere det påvisbare volumet. Videre kan raske temperaturendringer føre til dannelse av nye bobler i prøven. Det bør derfor utvises forsiktighet ved transport av prøven og ved endring av sondetemperaturen i NMR-spektrometeret. Kontroller prøven for bobler når du måler igjen etter en lengre periode.

RNA folding
Dynamiske RNA-molekyler kan eksistere i flere konformasjoner når de ikke brettes riktig. Selv om smeltetemperaturer på sekundære konstruksjoner bare kan være litt over romtemperatur, anbefales en grundig oppvarmings- og snap-kjøleprosedyre før måling. Høyt konsentrerte hårnålsprøver som brettes under kinetisk kontroll (oppvarming og snap-kjøling) kan danne homodimere over tid, noe som krever streng kontroll av RNA-folding før hver NMR-måling. Hvis den målte RNA ikke er en hårnålsstruktur, men en RNA-dupleks, bør langsom folding under termodynamisk kontroll påføres.

I dette tilfellet bør kjøleprosessen etter oppvarming være i løpet av timer, mens RNA brukes ved sitt endelige volum og konsentrasjon i NMR-prøven. En innledende telling av forventede imino- og aromatiske resonanser kan gi innsikt i homogeniteten til prøven. Hvis prøven ikke ser ut som forventet, bør den brettes på nytt. Mg²⁺ (tilsatt som kloridsalt) kan hjelpe med å brette RNA-strukturer⁴⁵. I praksis fungerer foldekontrollen som en sammenligning med et utvalg som i det minste delvis har blitt brukt til å tildele NMR-resonansene og løse den sekundære strukturen eksperimentelt.

Hensyn til spinnlås og oppvarming
Ved kjøring av ¹H R_1ρ RD-eksperimenter som 2D-oversiktseksperimenter, bør SL-effekten ikke være lavere enn 1,2 kHz. Radiofrekvensen for senderen skal plasseres midt i ppm-området av toppene av interesse(f.eks.7,5 ppm for aromatiske protoner). Båndbredden på 1,2 kHz vil da være stor nok til å spinne disse protonene uten noen store off-resonanseffekter. Slike effekter kan identifiseres i RD-profilen. Hvis de oppstår, øker R₂+R_EX-verdiene i stedet for reduksjon med økende SL-kraftverdier, spesielt for lav SL-effekt. Kontroller om de beregnede SL-strømverdiene tilsvarer strømmen som leveres til prøven. I praksis kan beregnet SL-effekt brukes hvis ^{den 1}H 90° harde pulsen ble kalibrert nøye på nyere spektrometre; Dette kan imidlertid kontrolleres ved å kalibrere SL-strøm for hver ønsket båndbredde.

Utvalget av SL-effekt, som kan brukes i ¹H R_1ρ RD-eksperimenter, er svært bredt, noe som fører til varierende prøveoppvarming (1,2 kHz til 15 kHz for HSQC for HCP-baserte sekvenser og 50 Hz til 15 kHz for SELOPE-eksperimenter). Ulik prøveoppvarming kan påvises som en liten endring i kjemisk skift når man sammenligner 1D-er oppnådd for laveffekts SLs vs. høyeffekts SLs. Denne effekten vurderes vanligvis ikke i varmekompensasjoner i R_1ρ eksperimenter på heteronuclei. Varmekompensasjon i disse eksperimentene er vanligvis satt opp for å korrigere for forskjellig oppvarming på grunn av de forskjellige spinnlåsvarighetene som er angitt i vd-listen over hver spinnlåseffektserie. Spesielt for SELOPE-eksperimentet bør en ekstra varmekompensasjon brukes på tvers av alle påførte SL-styrker som beskrevet i²⁰.

vd-liste hensyn
Som nevnt tidligere, bør vd-listen inneholde et tidspunkt lenge nok til å oppnå et betydelig forfall av intensitet (ideelt sett ned til 30% av det første signalet, eller så lavt som mulig hvis det ikke er mulig å nå et 70% forfall innenfor sondens spesifikasjoner). Selv om vd-listen ble optimalisert for en lav SL-effekt (1,2 kHz), bør denne vd-listen også testes med den høyeste SL-effekten som skal brukes (f.eks.15 kHz). Dette skyldes det faktum at for topper med betydelig R_EX-bidrag, vil forfallet være mye tregere ved høy SL-kraft. Så et tilstrekkelig forfall bør også verifiseres ved høy SL-kraft. Det samme må vurderes for forfall ved høye offsets i off-resonans eksperimenter. Det ideelle maksimale tidspunktet til vd-listen kan være betydelig forskjellig for de forskjellige områdene i dispersjonseksperimentet. I så fall kan flere poeng inkluderes i vd-listen, og de lengre vd-listepunktene for høyere SL-kraft eller høyere forskyvninger under analyse, basert på den lave SINO de vil føre til, kan kastes. Generelt bør 5-8 vd listepunkter vurderes å kunne oppdage potensielle gjenstander som fører til ikke-eksponentielle forfall som J-kobling (se nedenfor).

1D-HCP-selektivitetshensyn
Det må utvises spesiell forsiktighet ved kjøring av den HCP-baserte 1D-versjonen hvis det er en annen topp som overlapper med toppen av interesse for ¹H-dimensjonen til det 2D HSQC-baserte eksperimentet. HCP-baserte overføringer er veldig, men aldri 100% selektive, og det kan derfor skje at en annen topp bidrar til intensiteten og forfallsadferden til toppen av interesse i 1D. En indikasjon på dette vil være en forskjell i R_1ρ-verdier oppnådd på resonans ved hjelp av 1D- og 2D-versjonene av det merkede eksperimentet.

ROE-hensyn:
For off-resonanskurver av atomer med langsom mellomliggende utveksling, kan ROE-gjenstander identifiseres basert på en sammenligning av den oppnådde Δω med et NOESY- eller ROESY-spektrum. Hvis en krysstopp kan identifiseres ved en kjemisk skiftforskjell som tilsvarer Δω, kan den observerte spente tilstanden faktisk være en ROE-artefakt (f.eks.ROE ble funnet mellom aromatiske protoner, som alle er i samme kjemiske skiftområde og derfor dekket av de off-resonanskurvene²⁰). Av erfaring førte dette alltid til dårlige passformer med store feil, muligens på grunn av at ROE ikke fulgte samme mønster som R_EX med økende SL-kraft. Situasjonen blir vanskeligere for mellom-rask utveksling. Mens resonanskurven er (fra sammenligning med ¹³C-data innhentet på nabokjernen) fortsatt representativ for utvekslingsprosessen mellom GS og ES, påvirkes off-resonanskurven av flere ROE-gjenstander.

I så fall er SL-kraften til å oppdage utvekslingsprosessen større (>1,5 kHz) og spenner derfor over et større antall protoner når off-resonanskurver spenner over kjemiske skiftforskjeller mellom ulike ROE-kandidater (for H8 ville disse være: aminoprotoner på ca. ± 1000 Hz, H5/H1 er på ca. -1200 Hz, imino protoner på ca. 3500 Hz). Så langt er det ikke funnet noen metode for å undertrykke disse ROE-gjenstandene (annet enn å bruke delvis deuterte nukleotider⁴⁶), og off-resonansdata bør ikke registreres for rask mellomliggende utveksling, da ingen pålitelig informasjon om den faktiske Δω kan trekkes ut med denne metoden, hvis NOE / ROE-bidrag ikke kan utelukkes via NOESY-spektra.

J-Kobling (Hartmann-Hahn) hensyn
Selv om resonanskurver for homonukleære J-koblede protoner, som H6, ble registrert^10,20, må det tas særlig hensyn til off-resonansmålinger, spesielt for lav SL-effekt, da Hartmann-Hahn matchende forhold kan strekke seg over et bredt spekter av de undersøkte forskyvningene. Hartmann-Hahn-gjenstander kan identifiseres som svingninger på eksponentiell forfall eller økende R₂+R_EX-verdier med økende SL-styrker i RD-plott på resonans²⁰.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% Acrylamide/Bis Solution	Bio-Rad	161-0144
5-alpha Competent E. coli	NEB	C2987I
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	49199
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	34851
AFC-3000, HPLC Fraction collector	Thermo Scientific	5702.1
Agarose	Sigma-Aldrich	A9414
Amersham ImageQuant 800 UV	GE Healthcare	29399482	Replacing LAS-4000 or equivalent
Amicon ultra centrifugal filter unit	Sigma-Aldrich	UFC900324
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
ATP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	645702
BamHI restriction enzyme	NEB	R0136L
Bottle top filter	VWR	514-1019
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	1081220005
Cleavage guide	IDT	N/A	or equivalent
CTP	Sigma-Aldrich	C1506
CTP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	645699
D2O	Sigma-Aldrich	151882
Dionex Ultimate 3000 UHPLC system	Thermo Scientific	N/A
DL-Dithiotreitol	Sigma-Aldrich	43815
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
DNAPac PA200 22x250 Semi-Prep column	Thermo Scientific	SP6734
DNAPac PA200 22x50 guard column	Thermo Scientific	SP6731
E.coli RNase H	NEB	M0297L	or made in-house uniprot ref. P0A7Y4
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
Eppendorf centrifuge, rotor: A-4-44	Eppendorf	5804R
Ethanol 95%	Fisher scientific	11574139
Ethanol 95% denatured	VWR	85829.29
Formamide	Sigma-Aldrich	47671
GelRed	VWR	41003
GeneRuler 1kbp Plus	Fisher Scientific	SM1333	Optional
GMP	Sigma-Aldrich	G8377
GMP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	650684
GTP	Sigma-Aldrich	G8877
GTP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	645680
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	H1758
Inorganic pyrophosphatase	Sigma-Aldrich	I1643-100UN	or made in-house uniprot ref. P0A7A9
Invitrogen UltraPure 10X TBE-buffer	Sigma-Aldrich	T4415
Julabo TW8 Water bath	VWR	461-3117
kuroGEL Midi 13 Horizontal gel electrophoresis	VWR	700-0056	or comparable
LB broth (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022
LB broth with agar (Lennox)	Sigma-Aldrich	L2897
Low Range ssRNA Ladder	NEB	N0364S	Optional
LPG-3400RS Pump	Thermo Scientific	5040.0036
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	63068
microRNA Marker	NEB	N2102S
Microwave oven	Samsung	MS23F301EAW
Mini-PROTEAN electrophoresis equipment	Bio-Rad	1658004
NucleoBond Xtra Maxi	Machinery-Nagel	740414.10M
pUC19 plasmid containing tandem insert	Genscript	N/A	or equivalent
RNaseZAP	Sigma-Aldrich	R2020
Shigemi tube 5mm	Sigma-Aldrich	Z529427
Single-use syringe, Luer lock tip	VWR	613-2008
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	730-1470
Sodium perchlorate	Sigma-Aldrich	71853
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S3264
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S3139
Spermidine trihydrochloride	Sigma-Aldrich	85578
SYBR Gold	ThermoFisher	S11494
Syringe filters	VWR	514-0061
T7 RNA polymerase	Sigma-Aldrich	10881767001	or made in-house uniprot ref. P00573
TCC-3000RS Column thermostat	Thermo Scientific	5730
Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
Tris Base	Fisher Scientific	10103203
UMP	Sigma-Aldrich	U6375
UMP-13C9/15N2	Sigma-Aldrich	651370
Urea	Sigma-Aldrich	U5378
UTP	Sigma-Aldrich	U6625
UTP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	645672
VWD-3100 Detector	Thermo Scientific	5074.0005