Summary
Vi præsenterer en protokol til måling af mikro- til millisekundsdynamik på 13C /15N-mærket og umærket RNA med 1H R 1ρ afslapningsspredning nuklear magnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Fokus for denne protokol ligger i prøveforberedelse og opsætning af NMR-eksperimenter med høj renhed.
Abstract
RNA er et meget fleksibelt biomolekyle, hvor ændringer i strukturer spiller afgørende roller i de funktioner, som RNA-molekyler udfører som cellulære budbringere og modulatorer. Mens disse dynamiske tilstande forbliver skjult for de fleste strukturelle metoder, R1ρ afslapning spredning (RD) spektroskopi gør det muligt at studere kropsbygning dynamik i mikro-til millisekund regime på atomare opløsning. Brugen af 1H som den observerede kerne udvider yderligere den dækkede tidsordning og giver direkte adgang til brintbindinger og baseparring.
De udfordrende trin i en sådan undersøgelse er prøveforberedelse med høj renhed og højtydende prøve, potentielt 13C- og 15N-mærket, samt opsætning af eksperimenter og montering af data til udvinding af befolkning, valutakurs og sekundær struktur i den tidligere usynlige tilstand. Denne protokol giver afgørende praktiske trin i prøveforberedelsen for at sikre, at der udarbejdes en passende RNA-prøve og opsætning af 1H R1ρ-forsøg med både isotopisk mærkede og ikke-mærkede RNA-prøver.
Introduction
RNA'er udfører et væld af regulatoriske1,katalytiske2og strukturelle3 funktioner i cellen, hvoraf mange er korreleret med en fleksibel molekylær struktur og indviklede ændringer af disse strukturer4,5,6,7. Lavtbefolkede stater forbliver usynlige for de fleste metoder til strukturbestemmelse eller tillader ikke undersøgelse af disse skjulte tilstande ved høj atomopløsning. Opløsningsstatsspektroskopi (NMR) kombinerer begge aspekter ved at give adgang til individuelle atomkerner og tilbyde en stor værktøjskasse med eksperimenter, der er målrettet dynamik gennem alle tidsregimer8. RD NMR-eksperimenter giver adgang til konformationel udveksling i den mellemliggende tidshorisont, hvor ændringer i basisparringsmønstre og lokale strukturelle omlægninger kan forventes5,9,10,11,12,13,14. RD-forsøg udføres så længe R2-målinger i form af et Carr-Purcell-Meiboom-Gill-pulstog15 eller som afslapningsmålinger i den roterende ramme, kaldet R1ρ RD-eksperimenter16.
Selv om begge kan bruges til at udtrække befolkning og valutakurs og kemiske skift forskel til den mindre tilstand, R1ρ RD eksperimenter også give tegn på den kemiske skift forskel i ophidset tilstand. Dette gør det muligt at drage en konklusion om sekundær struktur, som stærkt korrelerer med kemisk skift i RNA-strukturer17. Det kemiske skift er en god indikator for helicitet i tilfælde af aromatiske protoner og kulstof på nukleobaserne, af baseparringspartnere for imino protoner og af sukkerpuckers på C4' og C1' atomerne18,19. Det skal bemærkes, at der for nylig blev offentliggjort et eksperiment med overførsel af kemiske vekselstrømstransaktioner (CEST) ved hjælp af højere spin lock (SL)-effekt, hvorved CEST-eksperimentets anvendelighed blev flyttet til hurtigere udvekslingstidshorisonter, som et alternativ til R1ρ RD-eksperimentet for systemer med en ophidset tilstand.
Selv om 13C og 15N isotoper ofte er blevet brugt til at få adgang til strukturel udveksling, det seneste arbejde fra dette laboratorium anvendes aromatiske og imino protoner som sonder for kropsbygning udveksling9,10. Brugen af 1H som den observerede kerne giver flere fordele, for eksempel adgang til udveksling på hurtigere og langsommere tidsskalaer, højere følsomhed og kortere måletider. Dette lettes yderligere af SELective Optimized Proton Experiment (SELOPE) tilgang, der giver adgang til aromatiske protoner gennem afvældning af det endimensionale (1D) spektrum ved hjælp af homonukleare skalarkoblinger i stedet for en heteronuklear magnetiseringsoverførsel og eliminerer behovet for isotopetiketter20. Denne protokol omhandler målingen i 1H R1ρ RD-forsøg med ensartet 13C /15N-mærkede og ikke-mærkede prøver. Derfor præsenterer dette papir en prøveforberedelsesmetode, der viste sig at være den mest alsidige til forskellige prøveforberedelsesbehov21 og diskuterer alternativer i sidste afsnit af denne artikel (Figur 1).
På dette tidspunkt skal læseren bemærke, at andre prøveforberedelsesteknikker er acceptable for 1H R1ρ RD-forsøg, og at andre metoder til strukturel og funktionel analyse kan udføres med prøverne syntetiseret med den præsenterede teknik. 1 1 1 1 H R1ρ RD-eksperimenter kræver høje RNA-koncentrationer (ideelt >1 mM) samt høj homogenitet, både i RNA-længde og strukturel kropsbygning for at sikre pålidelig karakterisering af molekylær dynamik. In vitro transskription (IVT) er den foretrukne metode for mange forskere til at producere 13C /15N-mærkede RNA-prøver på grund af tilgængeligheden af mærkede nukleoside triphosphater (NTP' er) og letkøbt inkorporering i den enzymatiske reaktion22. Den udbredte T7 RNA-polymerase (T7RNAP)23,24,25 lider imidlertid af lav 5' homogenitet i tilfælde af visse indledningssekvenser26,27 og ofte også 3' homogenitet under transskriptionsafstrømning28. Rensning af mål-RNA-arten bliver dyrere og besværlig på grund af behovet for store mængder ~ 200 nmol. Den metode, der anvendes her, er tidligere blevet præsenteret , hvor fordele blev diskuteret som helhed21. Kort sagt, det løser beskrevne problemer ved at transskribere en større tandem udskrift, der derefter site-specifikt kløvet af Escherichia coli RNase H, styret af en kimære oligonukleotid29,30 (se figur 2 for detaljer).
Inkorporering af en afstandssekvens i 5' og 3'erne af tandemudskriften gør det muligt at anvende en højtydende initieringssekvens og fjernelse af terminaludhæng tæt på henholdsvis plasmidskabelonens lineariseringssted (figur 2B). Metoden blev vist at forbedre udbyttet betydeligt, samtidig med at omkostningerne og arbejdskraften blev reduceret, med forbehold af en mere kompleks skabelonsyntese og behovet for et ekstra enzym og oligonukleotid. Den høje specificitet af RNase H kavalergang letter rensning på grund af manglen på RNA-arter i et lignende størrelsesområde. Den nuværende protokol bruger en ion udveksling højtydende flydende kromatografi (HPLC) trin, der er blevet offentliggjort af dette laboratorium for nylig31, selv om andre metoder er mulige alternativer. 1 1 1 1 H R1ρ RD kan generelt anskaffes på mærkede eller umærkede prøver med to respektive pulssekvenser, det "mærkede" 1HR 1ρ heteronukleare enkeltkvantitetkorrelation (HSQC)-baseret eksperiment med et indirekte 13C-dimension10 og det "umærkede" 1H R1ρ SELOPE-baserede eksperiment med en indirekte dimension20 på 1H .
Disse todimensionale (2D) eksperimenter kan tjene som en første kontrol, uanset om dynamikken på R1ρ tidsskalaen er til stede i prøven. Der kan opnås en oversigt over den regionale udvikling for alle løste toppe i spektrene, og der kan identificeres spidsbelastninger af interesse for en mere grundig analyse af den regionale udvikling. Det betyder, at selv umærkede prøver kan kontrolleres, før der træffes beslutning om at producere en dyrere, mærket prøve. Når et højdepunkt med konformationelt udvekslingsbidrag er valgt til at blive undersøgt mere grundigt, er det bedst at skifte til 1D-versionerne af ovennævnte eksperimenter (hvis toppen stadig kan løses) for at udføre såkaldte off-resonansforsøg. For den navngivne version, HSQC-overførslen til 13C erstattes med et selektivt heteronukleart krydspolariseringstrin (HCP), som anvendes i 13C R1ρ-eksperimenter 32,33,34,35, mens eksperimentet i tilfælde af SELOPE-eksperimentet simpelthen køres som en 1D, hvilket især er nyttigt for H8- og H2-signaler, der alligevel ligger på diagonalen i 2D. Et kriterium for, hvilken rækkefølge der skal anvendes, forudsat at der findes både en mærket og en ikke-mærket prøve, er, hvor godt isolerede de to eksperimenter har den største interesse.
Generelt anbefales SELOPE-eksperimentet til RNA-prøver på op til 50 nukleotider. For større RNA'er vil overlapningen være større; Strukturelt interessante nukleotider forekommer dog ofte i kemiske skiftregioner, der er mindre overlappende og stadig kan være tilgængelige i endnu større RNA'er. Et andet argument ville være, at der i ikke-mærkede prøver ikke forekommer nogen J-kobling mellem 1H og 12C. Men da den mindste spin lock-effekt defineres af den mindste effekt, der bruges til at afkoble disse to spins (~ 1 kHz) i det mærkede eksperiment, tillader det umærkede eksperiment brugen af et bredere udvalg af spin lock (SL) styrker og derfor adgang til en bredere tidshorisont for udveksling. Disse off-resonansforsøg giver yderligere oplysninger til kex, såsom population af ophidset tilstand (alternativ konform), pES, samt meget værdifulde kemiske skiftoplysninger i form af Δω (den kemiske skiftforskel i jordtilstanden og ophidset tilstand).
Figur 1: Arbejdsgang for den præsenterede protokol. Forberedelse før den faktiske store prøveproduktion, der består af skabelonforberedelse og bekræftelse af vellykket in vitro-transskription og RNase H-kavalergang. Storskalaproduktion, herunder HPLC-rensning, påfyldning af NMR-rør og bekræftelse af RNA-foldning. I tilfælde af isotopmærket syntese skal der udføres en ikke-mærket rensning til gradientoptimering samme dag. NMR karakterisering af kropsbygning dynamik med R1ρ eksperimenter. Hvert trin kan udføres uafhængigt, f.eks. Forkortelser: IVT = in vitro transskription; HPLC = højtydende væskekromatografi; NMR = nuklear magnetisk resonans; RD = afslapning spredning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Formålet med denne protokol er at give praktiske detaljer og kritiske parametre til undersøgelse af kropsbygningsdynamik med 1H R1ρ afslapningsspredning i RNA hårnålemolekyler. Efter at have givet en detaljeret protokol over design, syntese og ionbytning HPLC-rensning af et mål-RNA, der kan udføres ved hjælp af alle, nogle eller ingen NTP'er som 13C /15N-mærkede versioner, er arbejdsgangen for færdiggørelse af NMR-prøven og bekræftelse af konformationel udveksling med NMR-spektroskopi blevet beskrevet. Endelig er detaljerne for opsætningen af 1H R1ρ RD-eksperimenter på et Bruker NMR-spektrometer beskrevet (figur 1). Protokollen giver hvert trin til at oprette 1D-versionen for mærkede prøver og yderligere kommentarer og en tabel til justering for opsætningen af SELOPE-versionen (Tabel 2). Efter protokollen diskuteres kritiske trin og alternative ruter til prøveforberedelse og 1H R1ρ RD-opsætning.
Protocol
Figur 2: Skematisk repræsentation af den rapporterede tandem IVT-protokol. (A) Tandem transskription fra en lineær plasmidskabelon med T7RNAP (til venstre) og efterfølgende kavalergang af RNAse H af udskriften for at opnå mållængde RNA, instrueret af en kimær DNA-guide (højre). (B) Detaljeret skematisk over tandem skabelon starter med den virale T7RNAP promotor, en indledning sekvens. Målsekvensen (mørkeblå, eksempel her er 20 nt lang) gentages "n" gange. Gentagelserne flankeret af en 5 'og 3' afstandssekvenser bestående af de sidste otte og første fire nukleotider, henholdsvis for at give mulighed for fjernelse af indledningen og begrænsning sekvenser fra den første og sidste gentage enhed. (C) Hybridisering af tandem udskrift (rød) og kimære kavalergang guider (grøn). RNase H kløver RNA modsat DNA 5 'ende. De 2'-OMe RNA flanker øge specificitet ved at øge bindende affinitet kavalergang guide til målet RNA. Dette tal er blevet ændret fra den 21. Forkortelser: T7RNAP = T7 RNA polymerase. Klik her for at se en større version af dette tal.
1. Forberedelse af arbejdet med en ny RNA-konstruktion
- Plasmid design og forberedelse
- Skriv skabelonsekvensen i et kloningsværktøj, f.eks.
- Tag T7-promotorsekvensen, og tilføj en højtydende initieringssekvens (T7: 5'-TAATACGACTCACTATA ^GGGAGA-3').
BEMÆRK: Transskriptionen starter ved det nukleotid, der er angivet med et indsætningstegn (^). Indledningssekvensen GGGAGA er variabel, men stærkt sekvensafhængig. derfor anbefales brugen af denne sekvens. - De sidste 8 nukleotider (nt) i målsekvensen tilføjes som en 5' afstandsstykke (5'er).
- Tilføj gentagelser af målsekvensen (TS).
- Tilsæt de første fire nukleotider som en 3'-afstandsstykke efter gentagelserne (5'S).
- Tilføj et BamHI-begrænsningswebsted (RS) eller lignende unikt begrænsningswebsted.
BEMÆRK: Den samlede sekvens som vist vil blive klonet eller let bestilt i en bakteriel højkopieret plasmid (f.eks.pUC19): 5'-T7-5'S-(TS)n-3'S-RS-3'(Figur 2B). Antallet af gentagelser skal være så højt, som det er tilladt ved gensyntese ( højst 600 nt i denne protokol). - Forstærk plasmidet i E. coli ved hjælp af et kommercielt sæt.
- Linearisere det rensede plasmid ved 20 ng/μL ved hjælp af det relevante begrænsningssted. Skalabegrænsning fordøjes med BamHI med op til 1 mL.
- Purificer den fordøjede plasmid, og bekræft vellykket linearisering på en 1% agarose gel. Den lineariserede plasmid opbevares ved -20 °C i flere måneder.
- Udformningen af kavalergangsguiden (figur 2C)
- Skriv de sidste otte nukleotider i mål-RNA-sekvensen i 5'-3'-retningen, og tilsæt de første fire nukleotider i mål-RNA-sekvensen på 3'-enden også i 5'-3'-retningen.
- Generer det omvendte DNA-komplement for den sekvens
- Ret de første og sidste fire nukleotider til deres 2'-OMe-ændringer ved at tilføje et 'm' før nukleotidbogstavet.
BEMÆRK: Til syntese anvendes mU i stedet for mT. - Bestil oligo med standard afsaltning rensning.
BEMÆRK: Kontroller, om den genererede oligo kan binde sig et andet sted end forbindelsen mellem to RNA-sekvenser. Fuld komplementaritet i de centrale fire DNA-nukleotider er påkrævet, mens flankerende regioner kan tillade et misforhold. Om nødvendigt udvides flankerne til op til 18 nt for at generere en unik bindingssekvens36.
- Mindre erhvervsrettede erhvervsrettede erhvervsrettede projekter
BEMÆRK: Til RNase-fri arbejde skal du forberede alle reagenser under sterile og RNase-fri forhold. Brug RNase dekontamineringsreagens (se materialetabellen)og 95% v/v ethanol til at rengøre arbejdsflader og pipetter før brug. Vask handsker med 95% ethanol og brug fnugfrit langærmet tøj. For at minimere RNase-forurening må du ikke trække vejret over åbne rør.- Forbered lageropløsninger af Tris-Cl (pH 8.0), dithiothreitol, MgCl2, spermidin og NTPs / GMP (unbuffered). Blanding af reagenser som vist i tabel 1. Forbered en master blanding af disse reagenser på forhånd, før tilsætning af enzymer eller nukleinsyrer.
BEMÆRK: Hvis du bruger frosne reagenser, blandes dem grundigt efter optøning. Reagenser kan udfældes, hvis de blandes ved for høje koncentrationer, så det anbefales kraftigt at følge rækkefølgen i tabel 1. - Tilføj i følgende rækkefølge: plasmid, kavalergang guide, uorganisk fosfatase (IPPase), RNase H, T7RNAP. Da enzymaktiviteten kan variere for enzymer, der produceres internt, skal du teste flere koncentrationer, før du vælger den bedste.
BEMÆRK: Medtag en negativ kontrol for kavalergangsreaktionen, f.eks. uden RNase H, for at tilskrive et manglende målbånd til fejlbehæftet RNase H-kavalergang og ikke til mislykket transskription. - Reaktionen inkuberes ved 37 °C i 1 time, og reaktionen bekræftes på en denaturerende polyacrylamidgelelektrophoresis (PAGE) (Figur 3A). Prøven fortyndes 10 gange i læsseopløsning, og der på gelen påfylds 1 μL.
BEMÆRK: Gelblanding: 8 M urinstof, 20% acrylamid (19:1 acrylamid:bisacrylamid) i 1x TBE. Læsseopløsning: 5 mM ethylendiaminthaneddikesyre (EDTA), 300 μM bromophenolblå i formamid. RNase H kavalergangsreaktioner kan ikke forventes at være komplette efter 1 time, da der konstant produceres nyt RNA. På dette tidspunkt skal du holde øje med et klart målbånd og fraværet af en art med lignende molekylvægt(f.eks.±3 nukleotidprodukter (nt).
- Forbered lageropløsninger af Tris-Cl (pH 8.0), dithiothreitol, MgCl2, spermidin og NTPs / GMP (unbuffered). Blanding af reagenser som vist i tabel 1. Forbered en master blanding af disse reagenser på forhånd, før tilsætning af enzymer eller nukleinsyrer.
| Reagens | Koncentration af bestanden | Beløb i lille målestok (μL) |
| H2O | - | 24 |
| Tris | 1 M | 5 |
| MgCl2 | 1 M | 0.5 |
| DTT | 1 M | 0.5 |
| Spermidin | 250 mM | 5 |
| GMP | 100 mM | 2.5 |
| ATP | 100 mM | 1.5 |
| GTP | 100 mM | 1.5 |
| UTP | 100 mM | 1.5 |
| CTP | 100 mM | 1.5 |
| Plasmid | 20 ng/μL | 5 |
| Kavalergang guide | 100 μM | 10 |
| iPPase | 10 mg/mL | 0.5 |
| RNase H | 10 μg/mL | 2 |
| T7 RNA polymerase | 5 mg/mL | 2 |
Tabel 1: Reagensbord til tandem IVT og samtidig RNase H kavalergang. Lagerkoncentrationerne kan tilpassesbrugerensbekvemmelighed. Hvis RNase H-kavalergang skal udføres efter T7 IVT, tilsættes kavalergangsguide og RNase H efter varmeinaktivering af T7RNAP. Mængder, der anvendes, skaleres lineært med reaktionsskala. Forkortelser: T7RNAP = T7 RNA polymerase; IVT = in vitro transskribering.
2. NMR-prøveforberedelse
- Opskaler reaktionen på det ønskede volumen (typisk 10 mL), og kør reaktionen natten over. Test for reaktionsafslutning næste dag med en denaturerende PAGE-gel (Figur 3A).
BEMÆRK: Ufuldstændig kavalergangsreaktion vises af højere molekylvægtarter over målbåndet.- Hvis kavalergangen ikke lykkedes eller fuldføres, skal du reanneal RNA og kavalergangsguiden i reaktionsbeholderen ved at opvarme opløsningen i en konventionel mikrobølgeovn ved 450 W i 15 s.
- Opløsningen afkøles langsomt til 37 °C i 40 min. Brug en varmeblok til mængder under 1 mL. Bemærk dannelsen af nyt bundfald.
- Tilsæt mere IPPase og RNase H, og inkubat til yderligere 1-3 timer ved 37 °C. Bekræft færdiggørelsen af kavalergangsreaktionen med denaturering PAGE.
- Når RNase H-kavalergangsreaktionen er afsluttet, skal du slukke for reaktionen ved at tilføje EDTA til 50 mM endelig koncentration og vortex grundigt.
BEMÆRK: Potentiel pyrophosphatudfældning opløses, og der dannes nyt proteinudfældning. - Opløsningen filtreres gennem et 0,2 μm sprøjtefilter, og der koncentreres sig om et volumen, der kan injiceres i et HPLC-system, afhængigt af injektionssløjfens størrelse.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her ved frysning af prøven ved -20 °C.
- Storstilet HPLC-rensning
- Forbered ionbytterbuffere A og B inden for en uge efter brug. Filtrer og afgas bufferne.
BEMÆRK: Buffer A: 20 mM natriumacetat; 20 mM natriumperchlorat, pH 6.5. Buffer B: 20 mM natriumacetat; 600 mM natriumperchlorat, pH 6,5. - Kolonnen skal ligestilles med 100 % buffer B efterfulgt af 100 % buffer A for mindst 2 kolonnemængder ved 75 °C.
- Forbered HPLC-sekvensen (Figur 3B) med en strømningshastighed på 5,5 mL/min. Brug følgende sekvens til rensning af et RNA på mellem 20 og 30 nt: 0-7 min: 0% B; 7-16 min: hældning 0-20% B; 16-46 min: eluering, typisk med en gradient på 20-30% B (optimere efter behov); 46-62 min: 100% B; 62-73 min: 0% B.
BEMÆRK: En ændring i strømningshastigheden fra 5,5 til 8 mL/min påvirkede ikke adskillelsen i denne protokol. - Optimer elueringsgradienten ved injektion af en ækvivalent til 1 mL transskriptionsreaktion (umærket) ad gangen.
BEMÆRK: Yderligere oplysninger og drøftelser findes i Karlsson et al.31 og Feyrer et al.21. - Test de indsamlede brøker på en denaturerende SIDE. Hvis hovedudvælgelsestoppen er godt isoleret og indeholder det rene mål-RNA, skaleres rensningen op til en ækvivalent på 10 mL transskriptionsreaktion.
- Indsaml brøker af interesse, koncentrat og ombyt bufferen med NMR-buffer. Brug en ultracentrifugalfilterenhed (se materialetabellen)til mængder over 50 mL.
BEMÆRK: NMR-buffer: 15 mM natriumphosphat; 25 mM natriumchlorid; 0,1 mM EDTA, pH 6,5. For at minimere tab fra RNA, der klæber til plastrørvægge, skal du vaske alle opsamlingsrør med 1 mL vand, vortex og centrifuge for at samle al væske. - Bestem koncentrationen via ultraviolet spektroskopi. Reaktionsudbyttet beregnes i henhold til Feyrer etal. 21.
BEMÆRK: Koncentrationen af en NMR-prøve til RD-forsøg bør ikke være under 130 nmol, hvilket svarer til 500 μM i et prøvevolumen på 250 μL ved hjælp af NMR-rør (Tabel over materialer).
- Forbered ionbytterbuffere A og B inden for en uge efter brug. Filtrer og afgas bufferne.
- Foldning af en RNA-prøve
- Prøven af et volumen på ~10 mL fortyndes og til aliquot i 1 mL pr. rør.
- RNA-aliquots opvarmes til 95 °C i 5 min.
- Snap-cool prøverne ved at placere dem på is eller i en vand-is-salt blanding og inkubere i 30 min.
- Puljeprøver og koncentrat til ~250 μL i en 2 mL centrifugalfilterenhed.
- Påfyldning af et NMR-rør
- Rengør NMR-røret i NMR-rørrenseren ved at skylle med rigeligt vand, RNase dekontamineringsreagens, vand, 95% ethanol (EtOH) og vand igen. Lad det tørre.
- Rengør stemplet ved at skylle med vand og tørre med RNase dekontamineringsreagens og 95% EtOH ved hjælp af en fnugfri aftørring. Lad det tørre.
- Der tilsættes 10 % (v/v) af D2O til NMR-prøven.
- RNA-prøven fyldes i NMR-røret med en stor pipettespids. Lad væsken flyde langs siden af rørvæggen.
- Sæt stemplet i, og fjern luftbobler ved at skubbe stemplet ned sammen med en hurtig vridningsbevægelse.
- Træk stemplet langsomt op uden at skabe nye luftbobler og fastgør det med paraffinvoksfilm.
- Bekræft foldning af NMR.
BEMÆRK: På dette tidspunkt er det nødvendigt at udføre i det mindste delvis resonanstildeling for at bekræfte den sekundære struktur af RNA-prøven og identificere regioner af interesse for undersøgelsen af kropsbygningsdynamik. En udtømmende beskrivelse af RNA resonans opgave ville overstige denne protokol, derfor henviser vi til veletableret litteratur på dette punkt19,37,38. En elektrofobtisk mobilitetsskiftanalyse (EMSA) kan være en nyttig indikator for RNA-foldning og tjene som supplerende data for NMR-eksperimenter.- Sammenlign følgende spektre af prøven, for hvilken der udføres 1HR 1ρ RD-forsøg med den korrekt foldede referenceprøve (Figur 4): 1H 1D, især iminoregionen 10–15 ppm; Aromatisk 1H,13C-HSQC; 1 1 1 1 H,1H-SELOPE (valgfrit).
BEMÆRK: Et aromatisk fingeraftryk er også nødvendigt, selv i tilfælde af enighed mellem imino-signaler, fordi dimerdannelse ofte viser de samme eller lignende iminosignaler som en RNA-hårnål. SELOPE-eksperimentet kan erstatte en 1H,13C-HSQC for aromatiske fingeraftryk, da heteronukleare eksperimenter på umærkede prøver er meget tidskrævende. - Brug UUCG-løkken som fingeraftryksreference (hvis den findes).
- Udfør denne sammenligning hver gang, før der registreres 1H R1ρ RD-eksperimenter.
- Sammenlign følgende spektre af prøven, for hvilken der udføres 1HR 1ρ RD-forsøg med den korrekt foldede referenceprøve (Figur 4): 1H 1D, især iminoregionen 10–15 ppm; Aromatisk 1H,13C-HSQC; 1 1 1 1 H,1H-SELOPE (valgfrit).
3. 1H R1ρ Afslapningsspredning—resonans (mærket 1D-version)
BEMÆRK: Nedenstående trin beskriver opsætningen af RD-eksperimenter for en mærket prøve ved hjælp af 1D-versionen af den HSQC-baserede RD-pulssekvens. Følg de samme trin for den SELOPE-baserede 1D-sekvens for ikke-mærkede prøver. Tabel 2indeholder en oversigt over parameternavne og -indstillinger for begge tilfælde . Fokus på 1D-versioner er fordi de er mere praktiske til off-resonans målinger, og opsætningen af 2D-versionerne af SELOPE og HSQC-baserede eksperimenter er blevet diskuteret i detaljer af Schlagnitweit et al.20 og Steiner et al.10, henholdsvis.
- Bestem 1H effekt for en hård 90 ° puls (P1).
- Mulighed A: Brug bruker pulsecal kommando.
- Mulighed B: I et zg-eksperiment bestemmes 360° pulsen ved at måle en nutationskurve ved protonens hårde pulseffektniveau på vandtoppen.
BEMÆRK: 90° pulslængden er en fjerdedel af varigheden, hvor der observeres nulsignal (hvis der måles en fuld møtrikkurve, er det det andet nul; dog er det i praksis kun området omkring den forventede værdi for 360°, der udtages prøver af).
- Kør en 1H 1D-spektrum zgesgp.f2f3dec ved hjælp af pulslængden bestemt i trin 3.1 for at bekræfte RNA-foldningen før hver R1ρ-måling.
BEMÆRK: Hvis 1H SL-eksperimenter køres for første gang, skal du kontrollere, om den beregnede SL-effekt svarer til den effekt, der leveres til prøven, ved at kalibrere SL-strøm for hver ønsket båndbredde. Detaljerede kalibreringstrin er beskrevet i Steiner et al.10. - Opret en 1H R1ρ for mærket datasæt, og angiv nøgleparametre.
- Oprette et nyt datasæt. ideelt baseret på et 1H-13C aromatisk HSQC-datasæt, der bruges på fuldt mærkede RNA-prøver til RNA-tildeling.
BEMÆRK: Dette vil sikre, at der allerede er sat 13C samt 15N strøm og afkoblingskraft op. - Angiv de generelle parametre i overensstemmelse med første del af tabel 2.
- Angiv RD-specifikke parametre i henhold til anden del af tabel 2.
- Sæt 1H SL-effekt til den laveste værdi (1,2 kHz) til test.
- Generer en test vd-liste med kun én post, 0 ms( for at optimere vd-listen, som beskrevet i trin 3.4), skal du indstille TDF1 til 1 og opdatere D30.
- Kør et testspektrum med disse indstillinger.
- Oprette et nyt datasæt. ideelt baseret på et 1H-13C aromatisk HSQC-datasæt, der bruges på fuldt mærkede RNA-prøver til RNA-tildeling.
- Optimer vd-listen (liste over SL-længder, der skal bruges).
- Kør eksperimentet med en test vd liste(f.eks.seks indgange: 0 m, 5 m, 10 m, 20 m, 30 m, 40 m; forvrænge disse værdier for at undgå systematiske fejl på grund af opvarmning).
- Opdater D30 og TDF1 i overensstemmelse hermed (i dette eksempel D30 = 42m og TDF1 = 6).
- Plot intensiteten af toppen vs SL længde. Identificer sl-længden, hvor intensiteten af den oprindelige top falder til 1/3.
- Opret den endelige vd-liste, der skal bruges i eksperimentet, under hensyntagen til følgende: Bestem den længste SL-længde som beskrevet i det foregående trin; undgå at bruge en liste med faldende eller stigende rækkefølge. og tilføje nogle dubletter til statistiske undersøgelser. Husk at opdatere D30 og TDF1, hver gang der er ændringer i vd-listen.
BEMÆRK: Eksperimentet køres med forskellige SL-længder som angivet på vd-listen på en pseudo-2D-måde. - Vælg antallet af scanninger, så listens svageste top har et signal-til-støj-forhold (SINO) på mindst 10.
BEMÆRK: Selvom vd-listen var optimeret til en lav SL-effekt (1,2 kHz), skal denne vd-liste også testes med den højeste SL-effekt, der skal bruges(f.eks.15 kHz). Dette skyldes, at henfaldet vil være meget langsommere ved høj SL-effekt til toppe med betydeligt kEX-bidrag. Derfor bør et tilstrækkeligt forfald også verificeres ved høj SL-effekt.
| Beskrivelse af parameter | Parameternavn i pulssekvens | |
| 1D mærket | 1D SELOPE | |
| pulsprogram til on-resonans 1D'er | 1HR1rho_HCP_onres1D.es | 1HR1r_HH_onres1D.js |
| 1 1 1 1 H bærefrekvenser (ppm) | O1P = vand resonans i ppm | O1P = kemisk skift af højeste interesse (ppm) |
| CNST28 = kemisk skift af højeste interesse (ppm) | CNST29 = vand resonans i ppm | |
| 1 1 1 1 H hård 90º puls | P1 @ PL1 (som kalibreret i 3.1.1) | P1 @ PL1 (som kalibreret i 3.1.1) |
| Formede impulser og kræfter til vandundertrykkelse | P25 = 1000 os @ sp3 | P12 = 2000 os @ sp1 |
| (Det er ikke noget, vi kan gøre. | (excitation skulptur) | |
| 13 år C bærefrekvens, on-resonans med 13C kemisk skift af højeste interesse | O2P | – |
| 15 år N bærefrekvens, gennemsnitlig 15N kemisk skift til afkobling (som anvendt i aromatisk HSQC) | O3P | – |
| 13 år C/15N afkobling (oprettet som i HSQC) | pcpd2, CPD2 | – |
| pcpd3, cpd3 | ||
| HCP-overførsel (f.eks. p=1/J @ 100 Hz) | – | |
| pulse og pulsef2 kommandoer kan bruges til at bestemme kræfter fra hårde pulser | ||
| Varighed (fastsat til1/J( 1H-13C) af højeste rente) | P11 | |
| Effekt 1H og tænd for 13C | SP1, SP12 | |
| SELOPE overførsel (d = 1/4J(H5-H6)) | – | D5 |
| Selektiv puls (f.eks aromatisk region) for SELOPE (4000 os, Eburp) | – | P13 - SP4 |
| SL / RD-specifikke parametre: | ||
| 1 1 1 1 H SL-effekt, opnået fra kalibreret hård puls (f.eks. ved hjælp af pulskommandoen). | Pl25 & CNST12 (1,2 – 15 kHz) | Pl24 (50 Hz – 15 kHz) |
| Liste over variable forsinkelser for SL-varighed (oprindeligt 1 post, 0, optimering beskrevet under 3.1.3) | vdlist (~ 0 – 40 ms) | vdlist (~ 0 - 150 ms på grund af den lave R2 i umærkede prøver) |
| TDF1 antal poster på vd-listen (oprindeligt 1) | TDF1 | TDF1 |
| Varmekompensation: | ||
| D30 = største værdi i vd list + 2ms | D30 | D30 |
| Yderligere varmekompensation for meget bred vifte af SLs | PL25 | |
| Off-resonans specifikke parametre: | ||
| pulsprogram til off-resonans 1D'er | 1HR1rho_HCP_offres1D.es | 1HR1r_HH_offres1D.js |
| Forskydning for eksperimenter uden for resonans | CNST30 | CNST30 |
Tabel 2: Oversigt over parametre til opsætning af 1D HCP-baserede og 1D-SELOPE-baserede 1H R1ρ-eksperimenter. Forkortelser: 1D = endimensional; HCP = heteronuklear krydspolarisering; SELOPE = SELective Optimeret Proton Eksperiment; ppm = dele pr. million; HSQC= heteronuklear spin kvantekorrelation; SL = spin lock; RD = afslapningsspredning
- Opsætte og erhverve on-resonans 1H R1ρ eksperimenter
- Kopier eksperimentet fra afsnit 3.4 til en ny mappe i Topspin.
- I denne mappe skal du oprette eksperimenter med forskellige SL-styrker, hver gang pl25 og CNST12ændres. Bestem det korrekte effektniveau for hver SL-styrke ved hjælp af pulskommandoen. Brug SL-styrker fra 1,2 til 15 kHz med en tættere prøvetagning for lavere SL-styrker (se figur 5G for udvalgte SL-styrker). Tilføj kopier af nogle af de eksperimenter, der har dubletter for nogle af de SL styrker.
- Kør disse eksperimenter.
- Analyse af on-resonans 1H R1ρ forsøg
- I TopSpin skal du behandle hvert udsnit af hvert pseudo-2D-datasæt ved hjælp af de samme behandlingsparametre(f.eks. linjeforlængelse, fase) ved hjælp af kommandoen xf2og opdele datasættet i 1D'er ved hjælp af Bruker AU-programmet split2D.
- Opnå signalintensiteter og -diskenheder for hver 1D-skive.
BEMÆRK: I praksis er det bedre at dekonvolvere spektre for at slippe af med bidrag fra potentielt overlappende toppe og tillader brugen af Bruker AU-programmet multidcon, som bekvemt opsummerer intensiteterne eller områderne af toppene af alle skiver i et eksperiment i tekstfilen decall.txt, som derefter let kan læses op med andre programmer (Python-scripts skrevet internt blev brugt her, som beskrevet af Steiner et al.10) i trin 3.6.3 og 3.6.4. - Der monteres et mono eksponentielt henfald for hver SL-styrke for at opnå R1ρ-værdien (eller on-resonans, R2+REX).
- Plot disse R2+REX værdier (y) vs. SL-styrke (x) (Figur 5F, G).
BEMÆRK: Hvis værdierne er betydeligt højere for lave SL-styrker og falder med højere SL-effekt (som vist i figur 5G), viser den undersøgte top spredning, og det kan være interessant at udføre yderligere (off-resonans) eksperimenter for at få information om befolkningen og den kemiske skiftforskel i ophidset tilstand vs. jordtilstanden.
4. 1H R1ρ Afslapning spredning-off-resonans (mærket 1D-version)
- Opsætte og erhverve off-resonans 1H R1ρ eksperimenter
- I en ny topspin mappe, oprette eksperimenter på en vis SL styrke (normalt først på den laveste SL styrke som REX bidrag er højest der, se figur 5G for et repræsentativt udvalg af off-resonans SLs), men med forskellige forskydninger, hver gang du ændrer CNST30.
- Brug forskydninger på op til ± (3 eller 4)*SL-styrke med en tættere prøvetagning omkring 0 forskydning, som det kan ses i figur 5H,I.
- Kør disse eksperimenter.
- Analyse af off-resonans 1H R1ρ eksperimenter
- Brug den samme behandlingsstrategi som i 3.6.1-3.6.3 til at bestemme en R1ρ-værdi for hver forskydning.
- Afbilde disse værdier vs. forskydning (Figur 5G).
BEMÆRK: En asymmetri i denne kurve kan allerede indikere, at der kan opnås oplysninger om kemiske skift for ophidset tilstand. Der skal foretages grundig tilpasning og analyse ved hjælp af Bloch-McConnell- eller Laguerre-ligninger for at få oplysninger om kEX, pES samt Δω10,20 ( Figur5G). Eksempeldatasæt, pulsprogrammer og makroer til begge 1D-eksperimenter kan findes på Petzold Lab Github-lageret (https://github.com/PetzoldLab). Tabel 2indeholder en oversigt over parametrene .
Representative Results
Protokollen for RNA-produktion letter rensning gennem generering af udskrifter med høj renhed. Figur 3A viser resultaterne af flere kavalergangsreaktioner af tandemudskrifter, der giver både vellykkede og mislykkede reaktioner. Bane 1 viser det optimale tilfælde af en fuldt kløvet udskrift med kun svage spor af sideprodukter. Lane 2a viser ufuldstændig kavalergang, som kan løses ved re-annealing og tilføjelse af mere RNase H (Lane 2b, trin 2.1.2). RNA-konstruktionerne af bane 1, 2a og 2b er de samme. Prøven i bane 3 viser mislykket kavalergang. Fejlfinding af denne reaktion ville indebære en kontrol af kavalergang guide sekvens, renhed af DNA-skabelon, og udglødning temperaturer. Potentielt skal RNase H-kavalergang udføres efter T7 IVT som vist for prøve 2.
Prøven i bane 4 viser en betydelig mængde kavalergang sideprodukter, som er vanskelige at fjerne via ion-udveksling HPLC. Fejlfinding af en sådan prøve kan omfatte (a) sænkning af temperaturen, mængden af RNase H eller reaktionstid, (b) reduktion af reduktionsgradient og injektionsvolumen og forsøg på at adskille målfraktionerne fra sideprodukterne. Karlsson og al.31har drøftet yderligere oplysninger om , hvordan resolutionen kan øges i forbindelse med udveksling af HPLC-rensning . HPLC adskiller mål-RNA'et fra længere eller kortere nukleinsyrer og protein eller forurenende stoffer med lille molekyle. Figur 3B viser det optimale resultat for ionbytteren HPLC-rensning. Elueringsgradienten bør vælges således, at mål-RNA-arten udvisker mindst et kolonnevolumen (i dette eksempel: 35 mL) efter den næste mindre art og et kolonnevolumen før den næste større art.
Mindre arter i denne metode omfatter enkeltkerner, aborterende produkter (8-12 nt), 3' og 5' afstandssekvenser (5-14 nt) og kavalergangsguide (12 nt kimær nukleinsyre), mens længere sekvenser potentielt er uraved tandem repeats og plasmid. Når en velsepareret elueringstop er opnået, kan rensningen skaleres op til hvad der svarer til ~ 20 mL IVT-reaktion pr. Injektion. Den korrekte fold af en RNA-prøve er afgørende for RD-eksperimenter og skal bekræftes før hver måling. Figur 4 viser et A-mærket 22-mer RNA før foldeprotokollen i trin 2.4 (blå) blev anvendt, og den samme prøve efter den korrekte foldning er opnået (rød). En Mc-Fold sekundær struktur forudsigelse (Figur 4C) foreslår den præsenterede hårnål struktur med 4 base par resulterer i 5 imino signaler.
Begge spektre i figur 4A bekræfter disse forudsagte signaler, om end med lidt forskellige relative intensiteter, hvilket indikerer, at nogle fejlfoldede strukturer (her en dimer) kan være problematiske at vurdere med kun 1H 1D-spektre. Et aromatisk 1H-,13C-HSQC-spektrum (Figur 4B) viser dog kun 3 af de aromatiske signaler for prøven før foldeprotokollen (blå), men alle 4 signaler for prøven, der er foldet i henhold til trin 2.4 (rød). Den prøve, der blev vist med blåt, dannede sandsynligvis en homodimer (struktur foreslået i figur 4D),som ville resultere i de samme iminosignaler som hårnålen. Signalet fra A13H2 synes udveksling-udvidet. Disse resultater bidrager til at fremhæve vigtigheden af foldebekræftelse med både imino- og aromatiske fingeraftrykseksperimenter før hvert RD-eksperiment. De 1H R1ρ pulssekvenser, der er beskrevet i denne protokol, gør det muligt at detektere dynamikken i det mellemliggende udvekslingssystem. I første omgang registreres en resonanskurve, og hvis der er dynamik for en bestemt rest, er en spredning synlig inden for de opnåede R2+REX-værdier, mens denne kurve er flad for rester uden udveksling.
Figur 5 viser repræsentative resonanskurver opnået for to forskellige H8-atomer i en syntetisk RNA-hårnål (Figur 5A), hvori G6H8-erfaringer udveksles (Figur 5C), mens A4H8 ikke(Figur 5B). Da udvekslingen er forholdsvis langsom i denne prøve (kEX = 292 ± 40 Hz), blev fordelen ved SELOPE-eksperimentet for at opnå lave SL-styrker udnyttet, og de to resonanskurver blev registreret ved hjælp af 1D-versionen af pulssekvensen. Den samme pulssekvens blev derefter brugt til at opnå off-resonansdata for restkoncentrationerne, der viste spredning i resonansprofilen. Figur 5D viser de opnåede R1ρ-værdier vs. offset, hvori en let asymmetri af kurven allerede angiver tegnet af Δω.
Dette bliver endnu tydeligere i R2+REX-plottet, hvor R1-bidraget fjernes ( figur5E). Højre kolonne i samme figur viser repræsentative on-resonanskurver opnået for to forskellige H8-atomer i en lidt anden syntetisk RNA-hårnål med hurtigere udveksling, hvor G6H8-erfaringer udveksles (Figur 5G), mens A4H8 ikke (Figur 5F). Den hurtigere valutakurs (kEX = 43.502 ± 38.478 Hz) gjorde det muligt at registrere rd-optagelser af alle aromatiske protoner på én gang ved hjælp af SELOPE 2D-versionen for at opnå både on- og off-resonansdata (G6H8-data, der vises i figur 5H, I).
Generelle id'er for positive og negative resultater
Positive resultater i tandem IVT og RNase H kavalergang kan identificeres som følger: 1) Målet bandet er det stærkeste bånd i denaturering PAGE gel. 2) Der er ingen eller kun svage bånd omkring hovedbåndet. 3) Der er ingen eller kun svage højere molekylvægtarter. 4) HPLC-kromatogrammet viser en godt adskilt top af mål-RNA'et. 5) Når der udtages prøver af hovedtoppen, vises der kun ét bånd på en denaturerende PAGE-gel.
Negative resultater i tandem IVT og RNase H kavalergang til stede som følger: 1) Nej eller bare en svag hovedbånd er synlig på en denaturering PAGE gel. 2) Et mønster af høj molekylvægt arter fra RNA tandem gentagelser er synlig. 3) Selv om hovedbåndet er til stede, er bånd med lignende intensitet over eller under hovedbåndet inden for ± 3 nt.
En godt foldet prøve kan identificeres som følger: 1) Antallet af observerede imino protoner svarer til antallet afimino protoner, der forventes af en sekundær struktursimulering (f.eks. 2) Syn G-U wobble base par i en UUCG loop (hvis til stede) er synlig på ~ 9,5 ppm, undertiden kun synlig ved lavere temperatur. Yderligere fingeraftryk af UUCG-sløjfen er blevet beskrevet af Fürtig og kolleger40. 3) Det aromatiske fingeraftryk er i overensstemmelse med en tidligere tildelt prøve, der er blevet bekræftet at folde korrekt (Figur 4C).
En fejlfoldet eller nedbrudt prøve kan identificeres som følger: 1) Der er flere imino-signaler end en sekundær struktursimulering forudsiger (BEMÆRK: færre iminosignaler indebærer ikke nødvendigvis fejlfoldning, da lukning af basispar ofte ikke er synlige, og kropsudveksling udvider linjer). 2) Fravær af imino signaler. 3) Smalle signaler af høj intensitet i aromatisk region, der angiver enkelte nukleotid nedbrydningsprodukter. 4) Afvigelse mellem imino- eller aromatiske signaler og en referenceprøve af bekræftet foldning (figur 4C).
Et atom, der ikke viser nogen udveksling i den påviselige tidshorisont, kan identificeres som følger: 1) fra en flad RD-profil (på grund af det manglende REX-bidrag, der varierer med den anvendte SL-effekt)(figur 5B og figur 5F). 2) Der skal udvises forsigtighed i forbindelse med langsom mellemliggende udveksling, når kEX og Δω er af samme størrelsesorden. I så fald kan resonansbidraget være meget lille, som det fremgår af figur 5C (i dette tilfælde er de monterede parametre kEX = 292 ± 40 Hz og Δω = 112 ± 4 Hz). Hvis du er i tvivl, kan en lav SL off-resonans kurve registreres til verifikation.
Et atom, der viser udveksling i den mellemliggende tidsskala, kan identificeres 1) fra en ikke-flad afslapningsspredningsprofil i et on-resonans RD-eksperiment(figur 5B og figur 5F); 2) en bredere linewidth i HSQC eller SELOPE eksperiment kan også være en indikator for udveksling.
Velvalgte SL-effektværdier for kurver for off-resonans(figur 5E,F): 1) har et betydeligt kEX-bidrag i on-resonanskurven (udvalgte SL-effektværdier er angivet i figur 5C og figur 5G). 2) Da off-resonanskurver måles for mindst 3 SL-effektværdier, skal de valgte SL-effektværdier spredes ud over regionen af on-resonanskurven med kEX-bidrag. 3) Bly til ikke-flade R2+REX kurver efter Laguerre pasform (f.eks Figur 5D: SL styrker 25, 50 og 75 Hz; Figur 5E).
Dårligt udvalgte SL-effektværdier for kurver uden for resonans (Figur 5E, F) fører til flade R2+REX-kurver efter Laguerre-pasformen. Et eksempel er vist i figur 5E, hvor 100 Hz off-resonanskurven er meget flad og derfor ikke giver væsentlige oplysninger om Δω.
Indikationer for roterende-frame nukleare Overhauser effekt (ROE) artefakter: 1) Δω opnået fra off resonans kurver matche kemiske skift af protoner i rumlig nærhed / protoner, som viser en cross peak med toppen af interessen for den nukleare Overhauser effekt spektroskopi (NOESY) spektrum. (f.eks.viser figur 5I brede off-resonanskurver som forventet for hurtig-mellemliggende udveksling, men kurverne har også skarpere træk, f.eks.ved -3000 Hz og +1500 Hz. Disse er meget sandsynligt på grund af en ROE artefakt snarere end et kemisk skift for denne H8 i en anden konform). 2) Laguerre fit virker, men fungerer ikke godt (giver høje fejl eller fysisk umulige værdier) for en on-resonans og mindst 3 off-resonans kurver, selv om eksponentielle blev opnået fra forsøg med høj SINO (>20) (f.eks kEX = 43.502 ± 38.478 Hz). Ofte passer hver SL individuelt godt, men at montere dem sammen giver en meget højere fejl; den modsatte adfærd forventes for en sand ophidset tilstand.
Indikationer for "sand" udveksling Δω: 1) Δω opnået fra kurver uden for resonansen stemmer ikke overens med kemiske skift af protoner i geografisk nærhed/protoner, som viser en krydsspids med den største interesse for NOESY-spektret (f.eks. figur 5E). 2) Laguerre fit giver lave fejl for en on-resonans og mindst 3 off-resonans kurver(f.eks Figur 5E vs. Figur 5I, se billedtekst for at få passende resultater).
Figur 3: Prøveproduktion ved T7 tandem IVT og RNase H kavalergang reaktion. Stigehøjde refererer til RNA referencer, 12 * refererer til kimære kavalergang guide. Bane 1: Succesfuld generation af et 20 nt mål-RNA. Få kortere og længere produkter er til stede. Lane 2a: Ufuldstændig kavalergang af tandem udskrift. Selvom HPLC-rensning er mulig, vil meget materiale gå til spilde. Vognbane 2b: Fortsat RNase H-kavalergang på Bane 2 giver en ren prøve klar til HPLC-injektion (identisk med Vognbane 1). Bane 4: RNase H kavalergang var stort set mislykket, og ingen mål band blev produceret. Den fulde længde tandem udskrift er stadig synlig på 600 nt. Lane 5: Et mål band blev produceret, men en stærk -1 band er til stede. Selvom HPLC kan udføres, er omhyggelig fjernelse af sideproduktet nødvendig. (B) Eksempel på en vellykket HPLC-injektion. Toppen ved 38 min indeholder rent RNA af mållængden, mens længere og kortere produkter er godt adskilt fra mål-RNA'et. Panel B er blevet ændret fra 21. Forkortelser: IVT = in vitro transskription; HPLC = højtydende væskekromatografi; nt = nukleotider; AU = vilkårlige enheder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Eksempel på en RNA-hårnål før (blå) og efter (rød) foldetrinnet 2.4 (se protokollen) i NMR. (A) Imino-regionen i et 1H-1D-spektrum af et A-mærket 22-mer RNA. Forventede områder for basisparidentitet af iminosignaler er angivet med gråt nedenfor. (B) 1H,13C-HSQC-spektret af RNA's aromatiske resonanser fra panel A. Prøven efter foldning (rød) viser 4 signaler som forventet, mens prøven før foldning (blå) kun viser 3 signaler. (C)Mc-Fold forudsigelse af 22-mer RNA som en hårnål. Der kan forventes fem iminosignaler fra denne sekundære struktur, som kan findes i begge prøver i panel A. (D) Foreslået struktur af en homodimer dannet af 22-mer RNA, hvilket resulterer i de samme 5 basepar som hårnålestrukturen. Forkortelser: NMR = nuklear magnetisk resonans; 1D = endimensional; HSQC = heteronuklear enkelt kvantekorrelation; ppm = dele pr. million. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: 1H R1ρ REPRÆSENTATIVE resultater for to forskellige konstruktioner baseret på en RNA hårnål. (A) Den venstre kolonne viser resultater opnået på RNA med et C-G basepar over det bulede U, mens højre kolonne viser resultater opnået på en prøve, hvor basisparret i stedet blev skiftet til G-C. (B) og (F) viser flade spredningsprofiler som anskaffet for A4H8 for de to konstruktioner, hvilket ikke indikerer nogen kropsbygningsudveksling. (C–E) udviser on-resonans, off-resonans og monterede data, der er indhentet for G6 i (G-C) konstruktionen. Laguerre-pasformen fører til følgende resultat: R1 = 2,87 ± 0,01 Hz, R2 = 7,76 ± 0,03 Hz, k EX =292 ± 40 Hz, p ES = 0,31 ± 0,03 %, Δω = 112 ± 4 Hz. (G–I) viser on-resonans, off-resonans og monterede data opnået for G6 i (G-C) konstruktionen. Laguerre-pasformen fører til følgende resultat: R1 = 1,93 ± 0,02 Hz, R2 = 6,71 ± 0,86 Hz, k EX = 43,502 ± 38,478 Hz, p ES = 27 ± 16 %, Δω = 203 ± 166 Hz. Dette tal blev ændret fra den 20. Forkortelse: SL = spin lock. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Den protokol , der præsenteres heri , er en syntese af flere protokoller , der tidligere er offentliggjort i form af forskningsartikler10,20,21,31. Derfor kan segmenter af protokollen anvendes, mens andre kan udveksles til læserens præference. F.eks. kan R1ρ-målingerne udføres på en RNA-prøve, der er fremstillet med en hvilken som helst metode, da foldning og homogenitet af længden antages. Desuden indeholder protokollen ikke oplysninger om resonanstildeling af RNA-sekvensen - et trin , der kræves til RD-eksperimenter - da dette er blevet dækket udførligt i tidligere litteratur19,37,38. Delvise, segment- eller stedspecifikke mærkningsordninger36,41,42,43,44 er tilgange til at lette resonanstildeling eller reducere overlapningen af resonanser, der er af interesse for RD-eksperimenter og er blevet beskrevet udførligt i litteraturen. Denne metode gør det muligt at bruge ensartet mærkning af enhver nukleotididentitet, hvilket allerede kan forenkle resonanstildelingen betydeligt.
Den IVT-metode, der præsenteres her, overvinder kendte problemer med sekvenser og mærkning, øger udbyttet og reducerer omkostninger og arbejdstid sammenlignet med andre metoder. Brugen af den virale indledningssekvens reducerer behovet for reaktionsoptimering, hvilket er et kendt problem på området, der kan være tidskrævende at udføre og giver kun få kopier af udskriften i tilfælde af ikke-G-indledning. T7 IVT og RNase H kavalergang af tandem udskrift kan udføres samtidigt i samme fartøj. Et mønster af multimeric tandem gentagelser kan ses på en denaturerende PAGE gel under reaktionen, som smelter sammen til et enkelt bånd på målet RNA efter afslutningen af RNase H reaktion (Figur 3A, bane 1 og 2b). Typiske udbytter ved hjælp af denne metode ligger mellem 30 og 70 nmol RNA pr. 1 mL IVT. Men den metode, der er baseret på RNase H kavalergang af tandem gentagelser kommer ikke uden visse problemer i sig selv. Den RNase H kavalergang reaktion ofte ikke gå til afslutning, når de køres samtidig med T7 transskription(Figur 3A, lane 2a).
Adskillelsen af tandem enheder kan afsluttes ved at annealing kavalergang guide til udskrift og tilføje mere RNase H(Figur 3A, lane 2b, trin 2.1.2). Da opvarmningen af store mængder er langsom og fører til Mg2+katalyseret hydrolyse af RNA, blev der anvendt en konventionel mikrobølgeovn, som opvarmer prøven til >95 °C i 10-15 s. Der er endnu ikke observeret skadelige virkninger på de producerede prøver. Nogle konstruktioner viser et mindre andet bånd, der ikke kunne elimineres ved optimering af reaktionsbetingelserne (Figur 3A, bane 4). Normalt er disse ret tydeligt synlige som en skulder i HPLC-kromatogrammet, hvis der anvendes en godt optimeret elueringsgradient og kan fjernes (trin 2.2.5). Den følgende diskussion har til formål at fremhæve kritiske trin i protokollen, specielt med hensyn til at opnå data af høj kvalitet, der muliggør en fortolkning af kropsbygningsdynamik.
RNase forurening
Ekstracellulære RNases er allestedsnærværende, meget stabile og udgør den største trussel for langsigtet stabilitet af NMR-prøver. Derfor er det afgørende at arbejde i et RNase-frit miljø og holde alle reagenser og plasticware RNase-fri. Brugen af filter tips og måske endda ansigtsmasker anbefales. Dette er specifikt vigtigt efter HPLC-rensning. NMR-prøver, der er forurenet med RNases, udviser typisk smalle toppe, der er synlige i 1H-1D-spektre efter dage eller uger på grund af enkeltkernede nedbrydningsprodukter. En sådan prøve er ikke egnet til R1ρ-målinger.
NMR-prøve
På grund af sin meget ladede karakter kan RNA anvendes i høje koncentrationer uden nedbør sammenlignet med de fleste proteiner. Brugen af Shigemi NMR-rør (se materialetabellen)er fordelagtig, da de tillader centrering af den stærkt koncentrerede prøve i midten af spolen, mens de stadig giver ideelle shimming- og låseforhold på grund af den modtagelighedsmatchede glasbund og stemplet. På denne måde reduceres B1-inhomogeneity, hvilket giver anledning til smallere linjer. Det typiske prøvevolumen i et NMR-rør er 250 μL, og den typiske koncentration er 1-2 mM. Prøver under 500 μM anbefales ikke til RD-forsøg, da forsøget ville tage for lang tid og en god shim. På samme måde anbefales prøvevolumen under 200 μL ikke, fordi der kræves en god shim og feltstabilitet (lås). Ved indsætning af stemplet er det vigtigt at undgå dannelse af bobler i prøven (trin 2.4.5). Hvis stemplet ikke er korrekt fastgjort, kan det glide ned i prøven, hvilket reducerer den påviselige lydstyrke. Desuden kan hurtige temperaturændringer føre til dannelse af nye bobler i prøven. Derfor skal der udvises forsigtighed ved transport af prøven og ved ændring af sondetemperaturen i NMR-spektrometeret. Kontroller prøven for bobler, når du måler igen efter en længere periode.
RNA-foldning
Dynamiske RNA-molekyler kan eksistere i flere konformationer, når de ikke foldes korrekt. Selvom smeltetemperaturerne i sekundære konstruktioner kun kan være lidt over stuetemperaturen, anbefales en grundig opvarmnings- og snap-kølingsprocedure før måling. Stærkt koncentrerede hårnåleprøver, der foldes under kinetisk kontrol (opvarmning og snap-køling), kan danne homodimere over tid, hvilket kræver streng kontrol af RNA-foldning før hver NMR-måling. Hvis det målte RNA ikke er en hårnålestruktur, men en RNA-dupleks, skal der påføres langsom foldning under termodynamisk kontrol.
I dette tilfælde skal afkølingsprocessen efter opvarmning være inden for timer, mens RNA'et anvendes ved det endelige volumen og koncentration i NMR-prøven. En første optælling af forventede imino- og aromatiske resonanser kan give indsigt i prøvens homogenitet. Hvis prøven ikke ser ud som forventet, skal den foldes igen. Mg2+ (tilsat som chloridsalt) kan hjælpe med at folde RNA-strukturer45. I praksis tjener foldestyringen som en sammenligning med en prøve, der er blevet brugt til i det mindste delvist at tildele NMR-resonanser og til at løse den sekundære struktur eksperimentelt.
Overvejelser vedrørende spinlåskraft og opvarmning
I tilfælde af at køre 1H R1ρ RD eksperimenter som 2D oversigt eksperimenter, SL magt bør ikke være lavere end 1,2 kHz. Radiofrekvensen for sendere skal placeres midt i ppm-området af de højeste sider af interesse(f.eks.7,5 ppm for aromatiske protoner). Båndbredden på 1,2 kHz vil derefter være stor nok til at spin-låse disse protoner uden større off-resonans effekter. Sådanne virkninger kan identificeres i profilen for den regionale udvikling. Hvis de opstår, stiger R2+REX-værdierne i stedet for at falde med stigende SL-effektværdier, især for lav SL-effekt. Kontroller, om de beregnede SL-effektværdier svarer til den effekt, der leveres til prøven. I praksis kan beregnet SL-effekt anvendes, hvis den 1H 90° hårde puls blev kalibreret omhyggeligt på nyere spektrometre. Dette kan dog kontrolleres ved at kalibrere SL-strøm for hver ønsket båndbredde.
Sl-effektområdet, som kan bruges i 1H R1ρ RD-eksperimenter, er meget bredt, hvilket fører til varierende prøveopvarmning (1,2 kHz til 15 kHz for HSQC for HCP-baserede sekvenser og 50 Hz til 15 kHz for SELOPE-eksperimenter). Ulige prøveopvarmning kan påvises som en lille ændring i kemisk skift ved sammenligning af 1D'er opnået for laveffektS-SL'er vs. højeffekt-SL'er. Denne effekt tages normalt ikke i betragtning i varmekompensationer i R1ρ-forsøg med heteronuklei. Varmekompensation i disse eksperimenter er normalt sat op til at korrigere for forskellig opvarmning på grund af de forskellige spin lock varigheder, der er angivet i vd listen over hver spin lock power serie. Især for SELOPE eksperiment, en anden varme kompensation bør anvendes på tværs af alle anvendte SL styrker som beskrevet i20.
overvejelser i forbindelse med vd-liste
Som tidligere nævnt skal vd-listen indeholde et tidspunkt længe nok til at opnå et betydeligt forfald af intensitet (ideelt set ned til 30% af det oprindelige signal eller så lavt som muligt, hvis det ikke er muligt at nå et 70% forfald inden for sondens specifikationer). Selvom vd-listen var optimeret til en lav SL-effekt (1,2 kHz), skal denne vd-liste også testes med den højeste SL-effekt, der skal bruges(f.eks.15 kHz). Dette skyldes det faktum, at for toppe med betydelige REX bidrag, vil henfaldet være meget langsommere ved høj SL magt. Så en tilstrækkelig forfald bør også verificeres ved høj SL magt. Det samme skal overvejes for henfald ved høje forskydninger i off-resonans eksperimenter. Det ideelle maksimale tidspunkt for vd-listen kan være væsentligt anderledes for de forskellige regioner i spredningseksperimentet. I dette tilfælde kan flere punkter medtages på vd-listen, og de længere vd-listepunkter for højere SL-effekt eller højere forskydninger under analysen, baseret på den lave SINO, de vil føre til, kan kasseres. Generelt bør 5-8 vd listepunkter anses for at være i stand til at spotte potentielle artefakter, der fører til ikke-eksponentielle henfald som J-kobling (se nedenfor).
1D-Overvejelser i forbindelsemed HCP-selektivitet
Der skal udvises særlig forsigtighed, når du kører den HCP-baserede 1D-version, hvis der er en anden top, der overlapper med toppen af interessen for 1H-dimensionen af det 2D HSQC-baserede eksperiment. HCP-baserede overførsler er meget, men aldrig 100% selektive, og det kan derfor ske, at en anden top bidrager til intensiteten og henfaldsadfærden af toppen af interessen for 1D. En indikation af dette ville være en forskel i on-resonans R1ρ værdier opnået ved hjælp af 1D og 2D versioner af det mærkede eksperiment.
Roe overvejelser:
For off-resonanskurver af atomer med langsom-mellemliggende udveksling kan ROE-artefakter identificeres på grundlag af en sammenligning af det opnåede Δω med et NOESY- eller ROESY-spektrum. Hvis en krydsspids kan identificeres ved en kemisk skiftforskel svarende til Δω, kan den observerede ophidsede tilstand faktisk være en ROE-artefakt(f.eks.blev roes fundet mellem aromatiske protoner, som alle er i samme kemiske skiftområde og derfor dækket af disse off-resonanskurver20). Af erfaring, altid dette førte til dårlige passer med store fejl, muligvis på grund af ROE ikke følger det samme mønster som REX med stigende SL magt. Situationen bliver vanskeligere for mellemhurtig udveksling. Mens on-resonans kurven er (fra sammenligning med 13C-data opnået på den nærliggende kerne) stadig repræsentativ for udvekslingsprocessen mellem GS og ES, er off-resonanskurven påvirket af flere ROE-artefakter.
I dette tilfælde er SL-kraften til at opdage udvekslingsprocessen større (> 1,5 kHz) og spænder derfor over et større antal protoner, da off-resonanskurver spænder over kemiske skiftforskelle mellem forskellige ROE-kandidater (for H8 ville disse være: aminoprotoner ved ca. ±1000 Hz, H5/H1 er på ca. -1200 Hz, imino protoner ved ca. 3500 Hz). Indtil videre er der ikke fundet nogen metode til at undertrykke disse ROE-artefakter (bortset fra delvis anvendelse af deutererede nukleotider46), og der bør ikke registreres off-resonansdata til hurtig mellemliggende udveksling, da der ikke kan udtrækkes pålidelige oplysninger om den faktiske Δω med denne metode, hvis NOE/ROE-bidraget ikke kan udelukkes via NOESY-spektre.
Overvejelser vedrørende J-Kobling (Hartmann-Hahn)
Selv om on-resonans kurver for homonukleare J-koblede protoner, såsom H6, blev med succes registreret10,20, særlig omhu skal tages for off-resonans målinger, især for lav SL effekt som Hartmann-Hahn matchende betingelser kan spænde over en bred vifte af de undersøgte offsets. Hartmann-Hahn artefakter kan identificeres som svingninger på eksponentiel henfald eller stigende R2+REX værdier med stigende SL styrker i on-resonans RD parceller20.
Disclosures
K.P. er konsulent for Arrakis Therapeutics, et firma, der opdager små molekyler rettet mod RNA.
Acknowledgments
Vi takker proteinvidenskabsfaciliteten (PSF) på Karolinska Institutet for udtryk og rensning af T7 RNA polymerase og E. coli RNase H, Martin Hällberg for den generøse gave fra den uorganiske fosfatase og hele Petzoldlab for værdifulde diskussioner. Vi takker Luca Retattino for forberedelsen af U-bule konstruktioner og Emilie Steiner og Carolina Fontana for deres bidrag til makroer og montering scripts. Vi anerkender Karolinska Instituttet og Institut for Medicinsk Biokemi og Biofysik for støtte til køb af et 600 MHz spektrometer og positionsfinansiering (KI FoAss og KID 2-3707/2013). Vi er taknemmelige for det økonomiske bidrag fra Vetenskapsrådet (#2014-4303), Stiftelsen för strategisk Forskning (ICA14-0023 og FFL15-0178) og Ragnar Söderberg Stiftelse (M91-14), Harald och Greta Jeansson Stiftelse (JS2 0140009), Carl Tryggers stiftelse (CTS14-383 og 15-383), Eva och Oscar Ahréns Stiftelse, Åke Wiberg Stiftelse (467080968 og M14-0109), Cancerfonden (CAN 2015/388), J.S. anerkender finansiering gennem marie skłodowska-curie IF (EU H2020, MSCA-IF-projekt nr 747446.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad | 161-0144 | |
| 5-alpha Competent E. coli | NEB | C2987I | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 49199 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | |
| AFC-3000, HPLC Fraction collector | Thermo Scientific | 5702.1 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Amersham ImageQuant 800 UV | GE Healthcare | 29399482 | Replacing LAS-4000 or equivalent |
| Amicon ultra centrifugal filter unit | Sigma-Aldrich | UFC900324 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| ATP-13C10/15N5 | Sigma-Aldrich | 645702 | |
| BamHI restriction enzyme | NEB | R0136L | |
| Bottle top filter | VWR | 514-1019 | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | 1081220005 | |
| Cleavage guide | IDT | N/A | or equivalent |
| CTP | Sigma-Aldrich | C1506 | |
| CTP-13C10/15N5 | Sigma-Aldrich | 645699 | |
| D2O | Sigma-Aldrich | 151882 | |
| Dionex Ultimate 3000 UHPLC system | Thermo Scientific | N/A | |
| DL-Dithiotreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DNAPac PA200 22x250 Semi-Prep column | Thermo Scientific | SP6734 | |
| DNAPac PA200 22x50 guard column | Thermo Scientific | SP6731 | |
| E.coli RNase H | NEB | M0297L | or made in-house uniprot ref. P0A7Y4 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Eppendorf centrifuge, rotor: A-4-44 | Eppendorf | 5804R | |
| Ethanol 95% | Fisher scientific | 11574139 | |
| Ethanol 95% denatured | VWR | 85829.29 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671 | |
| GelRed | VWR | 41003 | |
| GeneRuler 1kbp Plus | Fisher Scientific | SM1333 | Optional |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377 | |
| GMP-13C10/15N5 | Sigma-Aldrich | 650684 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| GTP-13C10/15N5 | Sigma-Aldrich | 645680 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma-Aldrich | I1643-100UN | or made in-house uniprot ref. P0A7A9 |
| Invitrogen UltraPure 10X TBE-buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | |
| Julabo TW8 Water bath | VWR | 461-3117 | |
| kuroGEL Midi 13 Horizontal gel electrophoresis | VWR | 700-0056 | or comparable |
| LB broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Low Range ssRNA Ladder | NEB | N0364S | Optional |
| LPG-3400RS Pump | Thermo Scientific | 5040.0036 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 63068 | |
| microRNA Marker | NEB | N2102S | |
| Microwave oven | Samsung | MS23F301EAW | |
| Mini-PROTEAN electrophoresis equipment | Bio-Rad | 1658004 | |
| NucleoBond Xtra Maxi | Machinery-Nagel | 740414.10M | |
| pUC19 plasmid containing tandem insert | Genscript | N/A | or equivalent |
| RNaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | |
| Shigemi tube 5mm | Sigma-Aldrich | Z529427 | |
| Single-use syringe, Luer lock tip | VWR | 613-2008 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 730-1470 | |
| Sodium perchlorate | Sigma-Aldrich | 71853 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| Spermidine trihydrochloride | Sigma-Aldrich | 85578 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher | S11494 | |
| Syringe filters | VWR | 514-0061 | |
| T7 RNA polymerase | Sigma-Aldrich | 10881767001 | or made in-house uniprot ref. P00573 |
| TCC-3000RS Column thermostat | Thermo Scientific | 5730 | |
| Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | 10103203 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375 | |
| UMP-13C9/15N2 | Sigma-Aldrich | 651370 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U6625 | |
| UTP-13C10/15N5 | Sigma-Aldrich | 645672 | |
| VWD-3100 Detector | Thermo Scientific | 5074.0005 |
References
- Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
- Doudna, J. A., Cech, T. R. The chemical repertoire of natural ribozymes. Nature. 418 (6894), 222-228 (2002).
- Sehgal, P. B., Westley, J., Lerea, K. M., DiSenso-Browne, S., Etlinger, J. D. Biomolecular condensates in cell biology and virology: phase-separated membraneless organelles (MLOs). Analytical Biochemistry. , 597 (2020).
- Herschlag, D., Allred, B. E., Gowrishankar, S. From static to dynamic: the need for structural ensembles and a predictive model of RNA folding and function. Current Opinion Structural Biology. 30, 125-133 (2015).
- Kimsey, I. J., Petzold, K., Sathyamoorthy, B., Stein, Z. W., Al-Hashimi, H. M. Visualizing transient Watson-Crick-like mispairs in DNA and RNA duplexes. Nature. 519 (7543), 315-320 (2015).
- Dethoff, E. A., Petzold, K., Chugh, J., Casiano-Negroni, A., Al-Hashimi, H. M. Visualizing transient low-populated structures of RNA. Nature. 491 (7426), 724-728 (2012).
- Baisden, J. T., Boyer, J. A., Zhao, B., Hammond, S. M., Zhang, Q. Visualizing a protonated RNA state that modulates microRNA-21 maturation. Nature Chemical Biology. 17 (1), 80-88 (2021).
- Marušič, M., Schlagnitweit, J., Petzold, K. RNA dynamics by NMR spectroscopy. Chembiochem. 20 (21), 2685-2710 (2019).
- Baronti, L., et al. Base-pair conformational switch modulates miR-34a targeting of Sirt1 mRNA. Nature. 583 (7814), 139-144 (2020).
- Steiner, E., Schlagnitweit, J., Lundström, P., Petzold, K. Capturing excited states in the fast-intermediate exchange limit in biological systems using 1H spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (51), 15869-15872 (2016).
- Moschen, T., et al. Ligand-detected relaxation dispersion NMR spectroscopy: dynamics of preQ1-RNA binding. Angewandte Chemie International Edition. 54 (2), 560-563 (2015).
- LeBlanc, R. M., Longhini, A. P., Tugarinov, V., Dayie, T. K. NMR probing of invisible excited states using selectively labeled RNAs. Journal of Biomolecular NMR. 71 (3), 165-172 (2018).
- Strebitzer, E., Nußbaumer, F., Kremser, J., Tollinger, M., Kreutz, C. Studying sparsely populated conformational states in RNA combining chemical synthesis and solution NMR spectroscopy. Methods. 1148, 39-47 (2018).
- Rangadurai, A., Shi, H., Al-Hashimi, H. M. Extending the sensitivity of CEST NMR spectroscopy to micro-to-millisecond dynamics in nucleic acids using high-power radio-frequency fields. Angewandte Chemie International Edition. 59 (28), 11262-11266 (2020).
- Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. Using relaxation dispersion NMR spectroscopy to determine structures of excited, invisible protein states. Journal of Biomolecular NMR. 41 (3), 113-120 (2008).
- Lundström, P., Akke, M. Off-resonance rotating-frame amide proton spin relaxation experiments measuring microsecond chemical exchange in proteins. Journal of Biomolecular NMR. 32 (2), 163-173 (2005).
- Lee, J., Dethoff, E. A., Al-Hashimi, H. M. Invisible RNA state dynamically couples distant motifs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), 9485-9490 (2014).
- Schnieders, R., Keyhani, S., Schwalbe, H., Fürtig, B. More than proton detection- new avenues for NMR spectroscopy of RNA. Chemistry. 26 (1), 102-113 (2020).
- Fürtig, B., Richter, C., Wöhnert, J., Schwalbe, H. NMR spectroscopy of RNA. Chembiochem. 4 (10), 936-962 (2003).
- Schlagnitweit, J., Steiner, E., Karlsson, H., Petzold, K. Efficient detection of structure and dynamics in unlabeled RNAs: The SELOPE approach. Chemistry. 24 (23), 6067-6070 (2018).
- Feyrer, H., Munteanu, R., Baronti, L., Petzold, K. One-pot production of RNA in high yield and purity through cleaving tandem transcripts. Molecules. 25 (5), 1142 (2020).
- Baronti, L., Karlsson, H., Marušič, M., Petzold, K. A guide to large-scale RNA sample preparation. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (14), 3239-3252 (2018).
- Brunelle, J. L., Green, R. In vitro transcription from plasmid or PCR-amplified DNA. Methods in Enzymology. 530, 101-114 (2013).
- Borkotoky, S., Murali, A. The highly efficient T7 RNA polymerase: A wonder macromolecule in biological realm. International Journal of Biological Macromolecules. 118, Pt A 49-56 (2018).
- Arnaud-Barbe, N., Cheynet-Sauvion, V., Oriol, G., Mandrand, B., Mallet, F. Transcription of RNA templates by T7 RNA polymerase. Nucleic Acids Research. 26 (15), 3550-3554 (1998).
- Guillerez, J., Lopez, P. J., Proux, F., Launay, H., Dreyfus, M. A mutation in T7 RNA polymerase that facilitates promoter clearance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (17), 5958-5963 (2005).
- Kuzmine, I., Gottlieb, P. A., Martin, C. T. Binding of the priming nucleotide in the initiation of transcription by T7 RNA polymerase. Journal of Biological Chemistry. 278 (5), 2819-2823 (2003).
- Gholamalipour, Y., Karunanayake Mudiyanselage, A., Martin, C. T. 3' end additions by T7 RNA polymerase are RNA self-templated, distributive and diverse in character - RNA-Seq analyses. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9253-9263 (2018).
- Inoue, H., Hayase, Y., Iwai, S., Ohtsuka, E. Sequence-dependent hydrolysis of RNA using modified oligonucleotide splints and RNase H. FEBS Letters. 215 (2), 327-330 (1987).
- Wang, X., Li, C., Gao, X., Wang, J., Liang, X. Preparation of small RNAs using rolling circle transcription and site-specific RNA disconnection. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 4, 215 (2015).
- Karlsson, H., Baronti, L., Petzold, K. A robust and versatile method for production and purification of large-scale RNA samples for structural biology. RNA. 26 (8), 1023-1037 (2020).
- Hartmann, S. R., Hahn, E. L. Nuclear double resonance in the rotating frame. Physical Review. 128 (5), 2042-2053 (1962).
- Chiarparin, E., Pelupessy, I., Bodenhausen, G. Selective cross-polarization in solution state NMR. Molecular Physics. 95 (5), 759-767 (1998).
- Korzhnev, D. M., Orekhov, V. Y., Kay, L. E. Off-resonance R 1ρ NMR studies of exchange dynamics in proteins with low spin-lock fields: an application to a Fyn SH3 domain. Journal of the American Chemical Society. 127 (2), 713-721 (2005).
- Hansen, A. L., Nikolova, E. N., Casiano-Negroni, A., Al-Hashimi, H. M. Extending the range of microsecond-to-millisecond chemical exchange detected in labeled and unlabeled nucleic acids by selective carbon R 1ρ NMR spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 131 (11), 3818-3819 (2009).
- Duss, O., Maris, C., von Schroetter, C., Allain, F. H. -T. A fast, efficient and sequence-independent method for flexible multiple segmental isotope labeling of RNA using ribozyme and RNase H cleavage. Nucleic Acids Research. 38 (20), 188 (2010).
- Krähenbühl, B., Lukavsky, P., Wider, G. Strategy for automated NMR resonance assignment of RNA: application to 48-nucleotide K10. Journal of Biomolecular NMR. 59 (4), 231-240 (2014).
- LeBlanc, R. M., Longhini, A. P., Le Grice, S. F. J., Johnson, B. A., Dayie, T. K. Combining asymmetric 13C-labeling and isotopic filter/edit NOESY: a novel strategy for rapid and logical RNA resonance assignment. Nucleic Acids Research. 45 (16), 146 (2017).
- Parisien, M., Major, F. The MC-Fold and MC-Sym pipeline infers RNA structure from sequence data. Nature. 452 (7183), 51-55 (2008).
- Fürtig, B., Richter, C., Bermel, W., Schwalbe, H. New NMR experiments for RNA nucleobase resonance assignment and chemical shift analysis of an RNA UUCG tetraloop. Journal of Biomolecular NMR. 28 (1), 69-79 (2004).
- Keyhani, S., Goldau, T., Blümler, A., Heckel, A., Schwalbe, H. Chemo-enzymatic synthesis of position-specifically modified RNA for biophysical studies including light control and NMR spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition. 57 (37), 12017-12021 (2018).
- Marchanka, A., Kreutz, C., Carlomagno, T. Isotope labeling for studying RNA by solid-state NMR spectroscopy. Journal of Biomolecular NMR. 71, 151-164 (2018).
- Becette, O., Olenginski, L. T., Dayie, T. K. Solid-phase chemical synthesis of stable isotope-labeled RNA to aid structure and dynamics studies by NMR spectroscopy. Molecules. 24 (19), 3476 (2019).
- Zhang, X., Li, M., Liu, Y. Optimization and characterization of position-selective labelling of RNA (PLOR) for diverse RNA and DNA sequences. RNA Biology. 17 (7), 1009-1017 (2020).
- Roh, J. H., et al. Effects of preferential counterion interactions on the specificity of RNA folding. The Journal of Physical Chemistry Letters. 9 (19), 5726-5732 (2018).
- Juen, M. A., et al. Excited states of nucleic acids probed by proton relaxation dispersion NMR spectroscopy. Angewandte Chemie German Edition. 55 (39), 12008-12012 (2016).
