Summary
Hier beschrijven we hoe we de geautomatiseerde macromoleculaire kristallografiepijplijnen kunnen gebruiken voor eiwit-naar-structuur, snelle ligand-eiwitcomplexanalyse en grootschalige fragmentscreening op basis van de CrystalDirect-technologie in het HTX-laboratorium in EMBL Grenoble.
Abstract
EMBL Grenoble exploiteert het High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), een grootschalige gebruikersfaciliteit die kristallografiediensten met hoge doorvoer aanbiedt aan gebruikers over de hele wereld. Het HTX lab heeft een sterke focus op de ontwikkeling van nieuwe methoden in macromoleculaire kristallografie. Door de combinatie van een high throughput kristallisatieplatform, de CrystalDirect technologie voor volledig geautomatiseerde kristalmontage en cryokoeling en de CRIMS software hebben we volledig geautomatiseerde pipelines ontwikkeld voor macromoleculaire kristallografie die op afstand via het internet bediend kunnen worden. Deze omvatten een eiwit-naar-structuur pijplijn voor de bepaling van nieuwe structuren, een pijplijn voor de snelle karakterisering van eiwit-ligandcomplexen ter ondersteuning van medicinale chemie, en een grootschalige, geautomatiseerde fragmentscreeningspijplijn die evaluatie van bibliotheken van meer dan 1000 fragmenten mogelijk maakt. Hier beschrijven we hoe u toegang krijgt tot en gebruik maakt van deze bronnen.
Introduction
Automatisering is geïntroduceerd in alle stappen van het experimentele proces van macromoleculaire kristallografie, van kristallisatie tot het verzamelen en verwerken van diffractiegegevens1,2,3,4,5,6,7,8,9,inclusief een aantal technologieën voor monstermontage10,11,12 ,13,14,15,16,17. Dit heeft niet alleen het tempo versneld waarmee kristallografische structuren worden verkregen, maar heeft ook bijgedragen aan het stroomlijnen van toepassingen zoals structuurgeleid medicijnontwerp18,19,20,21,22,23,24. In dit manuscript beschrijven we enkele aspecten van de geautomatiseerde kristallografiepijplijnen die beschikbaar zijn in het HTX-lab in Grenoble, evenals de onderliggende technologieën.
Het HTX-lab van EMBL Grenoble is een van de grootste academische faciliteiten voor kristallisatiescreening in Europa. Het bevindt zich op de European Photon and Neutron (EPN) campus samen met de European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), die enkele van 's werelds meest briljante röntgenstralen produceert en het Institut Laue Langevin (ILL), dat neutronenbundels met hoge flux levert. Sinds de start van de activiteiten in 2003 heeft het HTX-lab diensten verleend aan meer dan 800 wetenschappers en verwerkt het meer dan 1000 monsters per jaar. Het HTX-lab heeft een sterke focus op de ontwikkeling van nieuwe methoden in macromoleculaire kristallografie, waaronder methoden voor monsterevaluatie en kwaliteitscontrole25,26 en de CrystalDirect-technologie, waardoor volledig geautomatiseerde kristalmontage en -verwerking15,16,17mogelijk is. Het HTX-lab heeft ook het Crystallographic Information Management System (CRIMS) ontwikkeld, een webgebaseerd laboratoriuminformatiesysteem dat geautomatiseerde communicatie biedt tussen kristallisatie- en synchrotrongegevensverzamelingsfaciliteiten, waardoor ononderbroken informatiestroom over de hele monstercyclus van puur eiwit tot diffractiegegevens mogelijk is. Door de combinatie van de capaciteiten van de HTX-faciliteit, de CrystalDirect-technologie en de CRIMS-software, hebben we volledig geautomatiseerde eiwit-naar-structuur pijplijnen ontwikkeld die kristallisatiescreening, kristaloptimalisatie, geautomatiseerde kristaloogstverwerking en cryokoeling en röntgengegevensverzameling bij meerdere synchrotrons integreren in een enkele en continue workflow die op afstand kan worden bediend via een webbrowser. Deze pijpleidingen kunnen worden toegepast ter ondersteuning van snelle bepaling van nieuwe structuren, de karakterisering van eiwit-ligandcomplexen en grootschalige screening van verbindingen en fragmenten door middel van röntgenkristallografie.
Het HTX-lab is uitgerust met een volumeloze kristallisatierobot (inclusief een LCP-module die kristallisatie van zowel oplosbare als membraaneiwitten mogelijk maakt), kristalboerderijen (bij 5 °C en 20 °C), twee robotachtige vloeistofbehandelingsstations om kristallisatieschermen voor te bereiden en twee geautomatiseerde CrystalDirect-kristaloogsters met capaciteit om tot 400 bevroren monsterpennen per bewerkingscyclus te produceren en op te slaan. Wetenschappers sturen hun monsters per koerier naar de faciliteit, die vervolgens worden verwerkt door toegewijde technici in het HTX-lab. Wetenschappers kunnen op afstand kristallisatiescreening en optimalisatie-experimenten ontwerpen via een webinterface die wordt geleverd door het CRIMS-systeem. Via deze interface kunnen ze kiezen uit een breed scala aan parameters en experimentele protocollen die beschikbaar zijn in de faciliteit om aan hun specifieke monstervereisten te voldoen. Resultaten samen met alle experimentele parameters worden in realtime beschikbaar gesteld aan gebruikers via CRIMS. Alle ontvangen monsters worden getest met een specifiek ontwikkelde methode die het mogelijk maakt om de kristallisatie waarschijnlijkheid van het monster25,26,27te schatten. Op basis van de resultaten van deze test worden specifieke aanbevelingen gedaan aan gebruikers met betrekking tot de optimale incubatietemperatuur en mogelijke monsteroptimalisatie-experimenten. Zodra kristallisatie-experimenten zijn opgezet, kunnen wetenschappers de resultaten evalueren door te kijken naar kristallisatiebeelden die op verschillende tijdstippen via het web zijn verzameld. Wanneer kristallen worden geïdentificeerd die geschikt zijn voor röntgendiffractie-experimenten, kunnen wetenschappers een speciale interface gebruiken om een kristalmontageplan op te stellen dat vervolgens door de CrystalDirect-robot zal worden uitgevoerd.
De CrystalDirect-technologie is gebaseerd op het gebruik van een gemodificeerde dampdiffusiekristallisatiemicroplaat en een laserstraal om kristalmonsters te monteren en cryo-koelen in diffractiecompatibele ondersteuningen die de automatiseringskloof tussen kristallisatie en gegevensverzamelingdichten 15,16,17. Kortom, kristallen worden gekweekt in een gemodificeerde dampdiffusieplaat, de CrystalDirect-microplaat. Zodra kristallen verschijnen, past de CrystalDirect-oogstrobot automatisch een laserstraal toe om een filmstuk met het kristal weg te verwijderen, het aan een standaard diffractiegegevensverzamelingspin te bevestigen en het cryo-koelen in een stikstofgasstroom (zie Zander et al. 2016 en https://www.youtube.com/watch?v=Nk2jQ5s7Xx8 ). Deze technologie heeft een aantal extra voordelen ten opzichte van handmatige of semi-geautomatiseerde kristalmontageprotocollen. De grootte en vorm van de kristallen is bijvoorbeeld geen probleem, waardoor het even gemakkelijk is om grote kristallen of microkristallen te oogsten, het is vaak mogelijk om het gebruik van cryo-beschermende middelen te vermijden, vanwege de speciale manier waarop de technologie werkt (zie referentie 17, Zander et al.), waardoor röntgendiffractie-analyse veel eenvoudiger wordt. De laserstraal kan ook worden gebruikt als een chirurgisch hulpmiddel om de beste delen van een monster te selecteren wanneer kristallen op clusters groeien of bijvoorbeeld epitaxiale groei vertonen. De CrystalDirect-technologie kan ook worden gebruikt voor geautomatiseerde weekexperimenten17. Levering van oplossingen met kleine moleculen of andere chemicaliën aan kristallen. Hierdoor maakt het het mogelijk om volledig geautomatiseerde, grootschalige compound- en fragmentscreening te ondersteunen. Zodra kristallen zijn geoogst en gecryokoeld door de CrystalDirect-robot, worden ze overgebracht naar SPINE- of Unipuck-pucks die compatibel zijn met de meeste synchrone macromoleculaire kristallografiebundellijnen over de hele wereld. Het systeem kan tot 400 pinnen (de capaciteit van de cryogene opslag Dewar) op een volledig autonome manier oogsten. CRIMS communiceert tijdens het proces met de oogstrobot en zorgt voor geautomatiseerde tracking van kristalmonsters (pucks en pinnen). Pucks zijn gemarkeerd met zowel barcodes als RFID-tags om monsterbeheer21,28te vergemakkelijken.
CRIMS biedt een application program interface (API) die geautomatiseerde communicatie met het ISPyB-systeem ondersteunt het beheer en de verwerking van röntgengegevensverzameling bij veel synchrotrons in Europa en de wereld29. Nadat het geautomatiseerde verzamelen van kristallen is voltooid, kunnen wetenschappers kristalmonsters (pucks) selecteren en monsterzendingen maken voor de macromoleculaire kristallografiebundellijnen bij de ESRF (Grenoble, Frankrijk)7,8,9 of Petra III synchrotrons (Hamburg, Duitsland)18,19. CRIMS draagt de gegevens die overeenkomen met de geselecteerde beamlinemonsters over naar het synchrotroninformatiesysteem, samen met vooraf geselecteerde parameters voor gegevensverzameling. Zodra de monsters bij de geselecteerde synchrotronbundellijn aankomen, worden röntgengegevens handmatig, via externe bundellijnbediening of op een volledig geautomatiseerde manier uitgevoerd (d.w.z. op de MASSIF-1-bundellijn van de ESRF8 die wordt beheerd door de gezamenlijke EMBL ESRF Joint Structural Biology Group (JSBG)). Na het verzamelen van gegevens haalt CRIMS automatisch informatie op over de resultaten van gegevensverzameling, samen met de eerste resultaten van gegevensverwerking die worden uitgevoerd door de synchrotron-gegevensverwerkingssystemen en presenteert deze aan de wetenschapper via een handige gebruikersinterface.
Het HTX-lab past deze geautomatiseerde pijpleidingen toe ter ondersteuning van drie verschillende toepassingen, snelle bepalingen van nieuwe structuren, snelle karakterisering van eiwit-ligandcomplexen en grootschalige screening van verbindingen en fragmenten. Hieronder beschrijven we hoe ze te gebruiken en te bedienen.
Protocol
OPMERKING: Gefinancierde toegang tot deze pijplijnen voor wetenschappers over de hele wereld wordt ondersteund door een reeks financieringsprogramma's. Op het moment van schrijven van dit manuscript worden aanvragen voor toegang geaccepteerd via het iNEXT Discovery-programma (https://inext-discovery.eu), een Europees facilitair netwerk om translationele structurele biologie20 te stimuleren, gefinancierd door het Horizon 2020-programma van de Europese Commissie of INSTRUCT-Eric (https://instruct-eric.eu/). Neem contact op met de corresponderende auteur voor de huidige modaliteiten en routes voor gefinancierde toegang op een bepaald moment. Dit protocol beschrijft de werking van de eiwit-naar-structuur pijplijn en bevat stappen die gemeenschappelijk zijn voor al onze pijpleidingen, terwijl specifieke kenmerken voor de andere twee pijpleidingen in de volgende sectie worden besproken. De instructies hier verwijzen naar CRIMS V4.0.
1. High Throughput Kristallisatie Laboratorium
- Vraag voordat u begint om registratie bij het HTX-lab via het CRIMS-systeem https://htxlab.embl.fr/#/. De gebruikersreferenties bieden externe toegang tot alle experimentele ontwerp- en evaluatie-interfaces.
- Log in op CRIMS via een webnavigator (Firefox, Chrome en Safari worden ondersteund). De CRIMs-webserver is gecodeerd om te voorkomen dat derden toegang krijgen tot gegevens terwijl deze via internet reizen. Eenmaal in CRIMS helpt een reeks menu's aan de linkerkant van de screening bij het beheren en maken van monsters, het aanvragen van kristallisatie-experimenten, het beheren en visualiseren van platen, enz. Een reeks videozelfstudies is beschikbaar op https://medias01-web.embl.de/Mediasite/Showcase/embl/Channel/a2168bcaa36b4564851663e5b69594014d.
OPMERKING: Gebruikers die monsters per koerier verzenden, moeten de monsters en de gevraagde kristallisatie-experimenten via CRIMS registreren voordat ze het monster verzenden om ervoor te zorgen dat ze bij aankomst zonder vertraging kunnen worden verwerkt. Stuur de verzendgegevens naar htx@embl.fr.
- Log in op CRIMS via een webnavigator (Firefox, Chrome en Safari worden ondersteund). De CRIMs-webserver is gecodeerd om te voorkomen dat derden toegang krijgen tot gegevens terwijl deze via internet reizen. Eenmaal in CRIMS helpt een reeks menu's aan de linkerkant van de screening bij het beheren en maken van monsters, het aanvragen van kristallisatie-experimenten, het beheren en visualiseren van platen, enz. Een reeks videozelfstudies is beschikbaar op https://medias01-web.embl.de/Mediasite/Showcase/embl/Channel/a2168bcaa36b4564851663e5b69594014d.
- Log in op CRIMS (https://htxlab.embl.fr ) met een webbrowser en klik op het menu Voorbeelden. Dit opent een interface met project- en voorbeeldbeheertools.
- Klik op de knop Nieuw voorbeeld en geef de gevraagde informatie op. CRIMS maakt het mogelijk om monsters te organiseren onder verschillende projecten, doelen en constructies. Wijs het voorbeeld toe aan bestaande voorbeelden of maak op dit punt nieuwe.
- Zodra de gevraagde informatie is ingevoerd, klikt u op Opslaan en verzoek indienen. Selecteer het kristallisatieprotocol, de te gebruiken kristallisatieschermen, de incubatietemperatuur en de gewenste datum voor de experimenten.
- Gebruik de commentaarvelden om indicaties te geven over de monsters die belangrijk zijn voor de HTX-laboratoriumoperators om te weten. Aangepaste schermen kunnen ook worden geselecteerd (zie hieronder). Na het indienen van het kristallisatieverzoek wordt het gevalideerd door het HTX Lab Team en wordt de bevestiging over de planning van de experimenten via e-mail verzonden. Zorg ervoor dat u experimentdatums selecteert die compatibel zijn met de tijden die vereist zijn voor het verzenden van monsters.
- Zodra de monsters in de faciliteit aankomen, zullen operators in het HTX-lab de experimenten uitvoeren zoals gevraagd. Zodra kristallisatie-experimenten zijn opgezet, wordt de bevestiging via e-mail verzonden en worden kristallisatiebakken overgebracht naar de geautomatiseerde imagers. CRIMS biedt toegang tot alle experimentele parameters en volgt automatisch nieuwe beeldvormingssessies. E-mailmeldingen worden automatisch verzonden wanneer er nieuwe afbeeldingen beschikbaar zijn. Een op thermofluor gebaseerd 30-monsterkwaliteitsbeoordelingsexperiment op basis van een protocol dat is ontwikkeld in de faciliteit 25,26 wordt op dit moment bij elk monster uitgevoerd en zal beschikbaar zijn via CRIMS.
- Afbeeldingen van de kristallisatie-experimenten samen met de resultaten van de monsterkwaliteitsbeoordeling zullen beschikbaar zijn in CRIMS kort nadat de kristallisatiebakken zijn opgezet. Klik op het menu Thermofluor en navigeer naar het monster om de resultaten van het experiment voor de beoordeling van de monsterkwaliteit te bekijken.
- Klik op het menu Platen om de afbeeldingen van de kristallisatieplaten te bekijken. Navigeer naar het voorbeeld en klik op Weergeven om de laatste beeldbewerkingssessie te bekijken of op het symbool + (uitvouwen) om een andere beeldbewerkingssessie te selecteren. Een reeks hulpmiddelen helpt om de voorbeelden gemakkelijk te vinden en er doorheen te navigeren. Als u bijvoorbeeld in een projectvak boven aan de schermen klikt, worden voorbeelden van voorbeelden voor dat project gefilterd en zijn er zoekfuncties beschikbaar voor de meeste tabelkolommen.
- Gebruik de interface voor plaatweergave om de resultaten van de kristallisatie-experimenten te evalueren en te scoren. Het maakt navigatie door de verschillende putten van de kristallisatieplaten mogelijk, selecteert beeldtypen (dw.w.z. Vis, UV), selecteert bijvoorbeeld de beeldresolutie of registreert scores. Deze interface biedt ook alle experimentele parameters die worden gebruikt voor de kristallisatie-experimenten, inclusief de samenstelling van de kristallisatieoplossingen.
- Klik op het menu Verfijning om kristaloptimalisatieschermen te ontwerpen op basis van primaire hitcondities die tijdens de eerste screening zijn geïdentificeerd. Met de submenu's Chemicals and Stock Solutions kan men de kristallisatievoorraadoplossingen registreren en beheren. Het submenu Schermen biedt toegang tot een interface om uw eigen optimalisatie of aangepaste schermen te ontwerpen.
- Selecteer het plaattype, de voorraadoplossingen of de verloopconfiguraties die het beste bij het experimentele ontwerp passen. Het is mogelijk om CRIMS te vragen een bestand uit te voeren dat direct compatibel is met de Formulator Robot (Formulatrix) om de schermen automatisch in de plaat te pipetten of om een afdrukbaar document met de volumes uit te voeren voor handmatige bediening.
- Doorloop stappen 1.2-1.8 om kristaloptimalisatie-experimenten uit te voeren.
- Zodra kristallen die geschikt zijn voor röntgendiffractie-experimenten zijn geïdentificeerd, navigeert u naar de interface van de plaatweergave en selecteert u het beeld dat overeenkomt met de juiste kristallisatiedruppel. Vooraf opgeslagen scores helpen u dit gemakkelijk te doen.
- Klik op Crystal Harvesting om een geautomatiseerd kristaloogstplan voor de CrystalDirect-oogstrobot op te nemen of op Handmatig oogsten voor traditionele handmatige kristalmontage, als u CRIMS gebruikt in een faciliteit die niet is uitgerust met CrystalDirect. Beide interfaces begeleiden de gebruiker door het kristaloogstproces. CRIMS registreert en slaat de locatie van geoogste kristallen automatisch op in SPINE of Unipucks21.
- Selecteer het menu Crystal Manager in CRIMS. Klik op het submenu Geoogste kristallen om de bevroren monsters te inspecteren. Bij gebruik van de CrystalDirect rooier worden beelden van het oogstproces gepresenteerd, inclusief afbeeldingen van de pinnen met de geoogste kristallen.
- Selecteer het menu Zendingen om verbinding te maken met ESRF- of Petra III-synchrotrons en maak monsterzendingen voor röntgendiffractieanalyse. Klik op de knop Zending maken en selecteer de synchrotron die u wilt gebruiken en het bagagenummer (het bagagewachtwoord bij de synchrotron is hier vereist). De volgende reeks interfaces worden gebruikt om de pukcs te selecteren die in de zending moeten worden opgenomen. Het systeem maakt het mogelijk om opmerkingen te geven ter ondersteuning van gegevensverzameling en gegevensverzamelingsparameters te bepalen voor geautomatiseerde beamlines zoals MASSIF-1.
- Als gegevensverzameling wordt uitgevoerd in ESRF of Petra III HTX-lab, zullen operators de monsters overbrengen naar de beamline, gegevensverzameling bij andere synchrotrons zal op eigen kosten van de gebruiker worden gedaan. Het is mogelijk om gegevens te verzamelen door naar het synchrotron te reizen, via externe beamline-bediening of bij MASSIF-1. In het laatste geval is het proces van gegevensverzameling volledig geautomatiseerd. Bij het synchrotron stellen specifieke interfaces in ISPyB29 gebruikers in staat om de door CRIMS verzonden informatie te herstellen en er voorbeeldpucks aan te koppelen, zodat de resultaten van gegevensverzameling automatisch worden bijgehouden. Voor de hier beschreven experimenten werd de gegevensverzameling bij synchrotrons meestal uitgevoerd met de MXcube31-software, terwijl gegevensverwerking en structuurverfijning werd uitgevoerd met atuoPROC32,Staraninso33,BUSTER33,Pipedream32,33 en Coot35.
- Zodra experimenten met gegevensverzameling zijn uitgevoerd, haalt CRIMS samenvattende informatie op, samen met resultaten van de initiële gegevensverwerking bij het synchrotron van het ISPyB29-systeem. Ga naar het CRIMS Crystal Manager-menu en klik op het submenu Crystal Diffraction Data. Alle informatie en metadata met betrekking tot het verzamelen van diffractiegegevens is beschikbaar. Het is ook mogelijk om verwerkte gegevens van de synchrotron en onbewerkte diffractiebeelden te downloaden. Bekijk meerdere gegevensverzamelingen of selecteer specifieke gegevenssets. Voorbeeldbeheertools maken het mogelijk om te navigeren en voorbeelden te selecteren voor specifieke projectconstructies.
OPMERKING: Deze pijplijn biedt volledig geautomatiseerde bediening via internet van pure eiwit- tot röntgendiffractieresultaten en kan tegelijkertijd met één of meerdere monsters worden gebruikt. Het kan worden toegepast op verschillende context- en projecttypen in de structurele biologie.
Representative Results
De hierboven beschreven geautomatiseerde kristallografiepijplijn is toegepast om een groot aantal interne en externe projecten met opmerkelijk succes te ondersteunen. Enkele hoogtepunten zijn het project van Djinović-Carugo en medewerkers van de Max Perutz Laboratories (Wenen) dat zich richt op de structurele en functionele analyse van een dipeptidyl peptidase die essentieel is voor de groei van een bacteriële ziekteverwekker. De snelle opeenvolging van kristallisatiescreening, diffractie-evaluatie, kristaloptimalisatie en röntgengegevensverzamelingscycli (tot 8 iteraties voor dit project) maakte het mogelijk om structurele modellen te verkrijgen voor drie verschillende conformatietoestanden van het eiwit in slechts enkele weken, wat een belangrijk mechanistisch inzicht gaf in de functie van deze klasse van eiwitten36 (zie figuur 1).
Een ander voorbeeld is de combinatie van Macias en medewerkers van het Institute of Biomedical Research (IRB, Barcelona) die bioinformatica-instrumenten en structurele benaderingen combineerden om nieuwe DNA-bindingsmotieven te identificeren voor de SMAD3- en SMAD4-transcriptiefactoren die betrokken zijn bij de regulatie van het lot van cellen. Dit werk heeft 6 hoge resolutie structuren van SMAD3 & 4 in complex geproduceerd met verschillende DNA-bindingsmotieven37,38 onthullen een tot nu toe onvermoed vermogen van deze transcriptiefactoren om een breed scala aan DNA-sequenties te herkennen en eraan te binden, wat de sleutel is voor de interpretatie van hun functie in verschillende biologische contexten. Deze technologieën zijn ook toegepast om eigen onderzoek te ondersteunen in de context van geneesmiddelenontwerpprojecten van onderzoeksgroepen in farmaceutische en biotechbedrijven. Dankzij de snelheid die door deze pijplijnen wordt bijgedragen, kan bijvoorbeeld de structurele analyse van meerdere ligand-doelcomplexen binnen enkele dagen worden bereikt, wat van grote waarde is om opeenvolgende rondes medische chemie-optimalisatie in de context van medicijnontwikkeling te ondersteunen. Tot slot hebben we deze infrastructuur ook toegepast voor grootschalige röntgenscreening39.
Figuur 1: Geautomatiseerde kristallografiepijplijn. Geïntegreerde werking van het EMBL HTX-lab inclusief de CrystalDirect-technologie en de CRIMS-software met de MASSIF-1-beamline bij ESRF en geautomatiseerde communicatie tussen de CRIMS- en ISPyB-software maken het mogelijk om volledig geautomatiseerde, op afstand bestuurbare eiwit-naar-structuur pijplijn te ondersteunen die kristallisatiescreening en -optimalisatie integreert, geautomatiseerde kristaloogst en cryokoeling en geautomatiseerde gegevensverzameling en -verwerking. De structurele modellen komen overeen met drie verschillende conformatietoestanden van een protease van een pathogene bacterie die in een recordtijd is geïdentificeerd door deze pijplijn toe te passen36. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
De geautomatiseerde kristallografiepijplijnen die hier worden beschreven, zijn beschikbaar voor onderzoekers over de hele wereld via verschillende financieringsprogramma's. Momenteel kan gefinancierde toegang voor kristallisatie-experimenten en de CrystalDirect-technologie worden verkregen door zich aan te melden bij het iNEXT Discovery-programma en INSTRUCT-ERIC, terwijl toegang tot macromoleculaire kristallografiebundellijnen bij de ESRF wordt ondersteund via het ESRF-gebruikerstoegangsprogramma. Deze aanpak minimaliseert de vertraging tussen kristalgroei en meting, versnelt de voortgang van zeer uitdagende projecten die op diffractie gebaseerde optimalisatie van eiwitproductie en kristallisatieomstandigheden vereisen en bevrijdt wetenschappers van complexe bewerkingen in verband met kristallisatie, kristalverwerking en bundellijnwerking, waardoor kristallografie toegankelijker wordt voor niet-expertgroepen. Het kan ook worden gebruikt voor snelle exploratie van kristallisatieadditieven, faseringsmiddelen of voor samengestelde screening door middel van co-kristallisatie-experimenten. Hoewel de meeste kristallografieprojecten mogelijk baat kunnen hebben bij deze aanpak, kunnen sommige monsters speciale protocollen vereisen die niet vatbaar zijn voor automatisering of voor de hier gepresenteerde pijpleidingen, bijvoorbeeld die waarvoor microfluïdische systemen of zeer gespecialiseerde kristallisatie-apparaten of monsters nodig zijn die extreem labiel zijn en geen verzending zouden tolereren.
De CrystalDirect-technologie maakt ook geautomatiseerde kristalweeking17 mogelijk voor de karakterisering van kleine molecuul-doelcomplexen. Hiervoor wordt voorafgaand aan het oogstproces een kleine opening met de laser gemaakt en wordt een druppel van een oplossing met de gewenste chemicaliën (d.w.z. faseringsmiddelen of potentiële liganden) bovenop toegevoegd, zodat deze in contact komt met en diffundeert in de kristallisatieoplossing en uiteindelijk het kristal bereikt. Chemische oplossingen kunnen worden geformuleerd in water, DMSO of andere organische oplosmiddelen. Na een bepaalde incubatietijd kunnen de kristallen worden geoogst en geanalyseerd door diffractie zoals hierboven beschreven. Deze benadering is toegepast op de snelle karakterisering van ligand-eiwitcomplexen in de context van structuurgebaseerd medicijnontwerp, evenals op grootschalige screening van verbindingen en fragmenten. In het laatste geval kunnen fragmentbibliotheken met honderden tot meer dan duizend fragmenten snel worden geanalyseerd. Specifieke CRIMS-interfaces die hier niet worden gepresenteerd, vergemakkelijken het ontwerp en de geautomatiseerde tracking van kristalweekexperimenten, terwijl integratie tussen de CRIMS-software en de Pipedream-softwaresuite, ontwikkeld door Global Phasing Ltd (VK), geautomatiseerde gegevensverwerking, fasering, ligandidentificatie en structuurverfijning mogelijk maakt over honderden datasets parallel, waardoor gegevensanalyse en -interpretatie worden gestroomlijnd32,33 . Deze pijplijn werd bijvoorbeeld onlangs toegepast op de identificatie van fragmenten die zich binden aan zowel de actieve site als verschillende allosterische sites van Trypanosoma brucei farnesylpyrofosfaatsynthase, een belangrijk enzym van de parasiet die menselijke Afrikaanse trypanosomiasis veroorzaakt.
De hier gepresenteerde pijpleidingen kunnen bijdragen aan het versnellen van het tempo van ontdekkingen in de structurele biologie en macromoleculaire kristallografie toegankelijker maken voor een groter aantal onderzoeksgroepen. Bovendien kunnen zij, door grootschalige screening van verbindingen en fragmenten te vergemakkelijken, bijdragen aan het bevorderen van translationeel onderzoek en het versnellen van het proces van geneesmiddelenontdekking, wat bijdraagt aan de ontwikkeling van betere en veiligere geneesmiddelen tegen een groter aantal doelen.
Disclosures
JAM is co-auteur van een patent op het CrystalDirect-systeem
Acknowledgments
We willen de gezamenlijke EMBL-ESRF Structural Biology Group (JSBG) bedanken voor de ondersteuning bij het gebruik en de werking van de ESRF macromoleculaire beamlines. We zijn Matthew Bowler dankbaar voor de ondersteuning bij het verzamelen van gegevens op de MASSIF-1-bundellijn van ESRF en Thomas Schneider en het EMBL Hamburg Team voor uitstekende ondersteuning bij het verzamelen van gegevens op P14 van de PetraIII synchrotron (DESY, Hamburg, Duitsland). De CrystalDirect rooier is ontwikkeld in samenwerking met het Instrumentation Team van EMBL Grenoble. Dit project werd ondersteund door financiering van het H2020-programma van de Europese Gemeenschap in het kader van de projecten iNEXT (subsidie nr. 653706) en iNEXT Discovery (subsidie nr. 871037) en de Région Auvergne-Rhône-Alpes via het Booster-programma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CrystalDirect harvester | Arinax | Automated crystal mounting and cryocooling | |
| CrystalDirect Crystallization plate | Mitegen | SKU: M-XDIR-96-2 | 96-well crytsallization microplate |
| Formulator 16 | Formulatrix | For the autoamted preparation of crystallization screens | |
| Mosquito crystallization Robot | SPT Labtech | For the preparation of crystallization experiments | |
| Tecan Evo Liquid handling station | Tecan | For the preparation of crystallization solutions | |
| Spine Pucks | Mitegen | SKU: M-SP-SC3-1 | SPINE-compatible cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers |
| UniPucks | Mitegen | SKU: M-CP-111-021 | Universal cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers |
References
- Abola, E., Kuhn, P., Earnest, T., Stevens, R. C.
- Banci, L., et al. First steps towards effective methods in exploiting high-throughput technologies for the determination of human protein structures of high biomedical value. Acta crystallographica. Section D, Biological. 62 (10), 1208-1217 (2006).
- Edwards, A. Large-scale structural biology of the human proteome. Annual Review in Biochemistry. 78, 541-568 (2009).
- Rupp, B., et al. The TB structural genomics consortium crystallization facility: towards automation from protein to electron density. Acta crystallographica. Section D, Biological. 58 (10), 1514-1518 (2002).
- Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).
- Cusack, S., et al.
- McCarthy, A. A., et al. ID30B – a versatile beamline for macromolecular crystallography experiments at the ESRF. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 1249-1250 (2018).
- Bowler, M. W., et al. MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
- von Stetten, D., et al. ID30A-3 (MASSIF-3) – a beamline for macromolecular crystallography at the ESRF with a small intense beam. Journal of Synchrotron Radiation. 27 (3), 844-851 (2020).
- Viola, R., et al. First experiences with semi-autonomous robotic harvesting of protein crystals. Journal of Structural and Functional Genomics. 12, 77-82 (2011).
- Khajepour, M. Y. H., et al. REACH: Robotic Equipment for Automated Crystal Harvesting using a six-axis robot arm and a micro-gripper. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69 (3), 381-387 (2013).
- Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69, 1297-1302 (2006).
- Collins, P. M. Gentle, fast and effective crystal soaking by acoustic dispensing. Acta crystallographica. D73, 246-255 (2017).
- Deller, M. C., Rupp, B. Approaches to automated protein crystal harvesting. Acta crystallographica. F70, 133-155 (2014).
- Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (10), 1393-1399 (2012).
- Márquez, J. A., Cipriani, F. CrystalDirectTM: A Novel Approach for Automated Crystal Harvesting Based on Photoablation of Thin Films. Structural Genomics. 1091, 197-203 (2014).
- Zander, U., et al. Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).
- Cianci, M., et al. P13, the EMBL macromolecular crystallography beamline at the low-emittance PETRA III ring for high- and low-energy phasing with variable beam focusing. Journal of Synchrotron Radiation. 24 (1), 323-332 (2017).
- Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).
- iNEXT Consortium . iNEXT: a European facility network to stimulate translational structural biology. FEBS Letters. 592 (12), 1909-1917 (2018).
- Papp, G., et al. Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).
- Whittle, P. J., Blundell, T. L.
- Blundell, T. L., Jhoti, H., Abell, C. High-throughput crystallography for lead discovery in drug design. Nature Reviews Drug Discovery. 1, 45-54 (2002).
- Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein–ligand structure determination. Acta Crystallographica. D73, 267-278 (2017).
- Mariaule, V., Dupeux, F., Márquez, J. A. Estimation of Crystallization Likelihood Through a Fluorimetric Thermal Stability Assay. Structural Genomics. 1091, 189-195 (2014).
- Dupeux, F., Röwer, M., Seroul, G., Blot, D., Márquez, J. A. A thermal stability assay can help to estimate the crystallization likelihood of biological samples. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (11), 915-919 (2011).
- Dimasi, N., Dupeux, F., Marquez, J. A. Expression, crystallization and X-ray data collection from microcrystals of the extracellular domain of the human inhibitory receptor expressed on myeloid cells IREM-1. Acta Crystallographica. F63, 204-208 (2007).
- Hiraki, M., Matsugaki, N., Yamada, Y., Hikita, M., Yamanaka, M., Senda, T. RFID tag system for sample tracking at structural biology beamlines. , 060074 (2019).
- Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
- Ericsson, U., et al. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
- Gabadinho, J., et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17, 700-707 (2010).
- Vonrhein, C., et al. Data processing and analysis with the autoPROC toolbox. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 293-302 (2011).
- Smart, O. S., et al. Exploiting structure similarity in refinement: automated NCS and target-structure restraints in BUSTER. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (4), 368-380 (2012).
- Bezerra, G. A., et al. Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition. Scientific Reports. 7 (1), 2848 (2017).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K.
- Bezerra, G. A., et al. Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition. Scientific Reports. 7 (1), 2848 (2017).
- Martin-Malpartida, P., et al. Structural basis for genome wide recognition of 5-bp GC motifs by SMAD transcription factors. Nature Communications. 8 (1), 2070 (2017).
- Aragón, E., et al. Structural basis for distinct roles of SMAD2 and SMAD3 in FOXH1 pioneer-directed TGF-β signaling. Genes & Development. 33 (21-22), 1506-1524 (2019).
- Münzker, L., et al. Fragment‐Based Discovery of Non‐bisphosphonate Binders of Trypanosoma brucei Farnesyl Pyrophosphate Synthase. ChemBioChem. 21 (21), 3096-3111 (2020).
