Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

De automatiserade kristallografiledningarna vid EMBL HTX-anläggningen i Grenoble

Published: June 5, 2021 doi: 10.3791/62491
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,3, 1, 1, 1,2, 1,2, 1,2, 1, 1,2
1European Molecular Biology Laboratory, 2ALPX S.A.S., 3Institut de Biologie Structurale

Summary

Här beskriver vi hur man använder de automatiserade makromolekylära kristallografiledningarna för protein-till-struktur, snabb ligand-proteinkomplexanalys och storskalig fragmentscreening baserad på CrystalDirect-tekniken vid HTX Laboratory i EMBL Grenoble.

Abstract

EMBL Grenoble driver High Throughput Crystallization Laboratory (HTX Lab), en storskalig användaranläggning som erbjuder kristallografitjänster med hög genomströmning till användare över hela världen. HTX-labbet har ett starkt fokus på utveckling av nya metoder inom makromolekylär kristallografi. Genom kombinationen av en kristalliseringsplattform med hög genomströmning, CrystalDirect-tekniken för helautomatisk kristallmontering och kryokylning och CRIMS-programvaran har vi utvecklat helautomatiska rörledningar för makromolekylär kristallografi som kan fjärrstyras via internet. Dessa inkluderar en protein-till-struktur pipeline för bestämning av nya strukturer, en pipeline för snabb karakterisering av protein-ligand komplex till stöd för medicinsk kemi, och en storskalig, automatiserad fragment screening pipeline möjliggör utvärdering av bibliotek av över 1000 fragment. Här beskriver vi hur du kommer åt och använder dessa resurser.

Introduction

Automatisering har införts i alla steg i den makromolekylära kristallografi experimentella processen, från kristallisering till diffraktionsdata insamling och bearbetning1,2,3,4,5,6,7,8,9, inklusive ett antal tekniker för provmontering10,11,12 ,13,14,15,16,17. Detta har inte bara påskyndat den takt i vilken kristallografiska strukturer erhålls utan har bidragit till att effektivisera applikationer som strukturstyrd läkemedelsdesign18,19,20,21,22,23,24. I detta manuskript beskriver vi några av aspekterna av de automatiserade kristallografipipelines som finns tillgängliga på HTX-labbet i Grenoble samt den underliggande tekniken.

HTX-labbet på EMBL Grenoble är en av de största akademiska anläggningarna för kristalliseringsscreening i Europa. Det är samlokalt på European Photon and Neutron (EPN) campus tillsammans med European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), som producerar några av världens mest briljanta röntgenstrålar och Institut Laue Langevin (ILL), som tillhandahåller högflöde neutronstrålar. Sedan starten av verksamheten 2003 har HTX-labbet tillhandahållit tjänster till över 800 forskare och bearbetar mer än 1000 prover per år. HTX-labbet har ett starkt fokus på utveckling av nya metoder inom makromolekylär kristallografi, inklusive metoder för provutvärdering och kvalitetskontroll25,26 och CrystalDirect-tekniken, vilket möjliggör helautomatisk kristallmontering och bearbetning15,16,17. HTX-labbet har också utvecklat Crystallographic Information Management System (CRIMS), ett webbaserat laboratorieinformationssystem som tillhandahåller automatiserad kommunikation mellan kristallisering och synkrotrondatainsamlingsanläggningar, vilket möjliggör oavbrutet informationsflöde under hela provcykeln från rent protein till diffraktionsdata. Genom kombinationen av kapaciteten hos HTX-anläggningen, CrystalDirect-tekniken och CRIMS-programvaran har vi utvecklat helautomatiska protein-till-struktur-rörledningar som integrerar kristalliseringsscreening, kristalloptimering, automatiserad kristallskördningsbehandling och kryokylning och röntgendatainsamling vid flera synkrotroner till ett enda och kontinuerligt arbetsflöde som kan fjärrstyras via en webbläsare. Dessa rörledningar kan tillämpas för att stödja snabb bestämning av nya strukturer, karakterisering av protein-ligand komplex och storskalig förenings- och fragmentscreening genom röntgenkristallografi.

HTX-labbet är utrustat med en icke-kristalliseringsrobot (inklusive en LCP-modul som möjliggör kristallisering av både lösliga proteiner och membranproteiner), kristallfarmer (vid 5 °C och 20 °C), två robotiska vätskehanteringsstationer för att förbereda kristalliseringsskärmar och två automatiserade CrystalDirect-kristallskördare med kapacitet att producera och lagra upp till 400 frysta provstift per driftscykel. Forskare skickar sina prover till anläggningen med expresskurir, som sedan bearbetas av dedikerade tekniker på HTX-labbet. Forskare kan fjärrdesigna kristalliseringsscreenings- och optimeringsexperiment genom ett webbgränssnitt som tillhandahålls av CRIMS-systemet. Genom detta gränssnitt kan de välja mellan ett brett spektrum av parametrar och experimentella protokoll som finns tillgängliga på anläggningen för att passa deras specifika provkrav. Resultaten tillsammans med alla experimentella parametrar görs tillgängliga för användare i realtid via CRIMS. Alla mottagna prover analyseras genom en särskilt utvecklad metod som gör det möjligt att uppskatta kristalliserings sannolikheten för provet25,26,27. Baserat på resultaten av denna analys görs specifika rekommendationer till användare om optimal inkubationstemperatur och möjliga provoptimeringsexperiment. När kristalliseringsexperiment har ställts in kan forskare utvärdera resultaten genom att titta på kristalliseringsbilder som samlats in vid olika tidpunkter via webben. När kristaller som är lämpliga för röntgendiffraktionsexperiment identifieras kan forskare använda ett dedikerat gränssnitt för att upprätta en kristallmonteringsplan som sedan kommer att utföras av CrystalDirect-roboten.

CrystalDirect-tekniken är baserad på användningen av en modifierad mikroplatta för kristallisering av ångdiffusion och en laserstråle för att montera och kryokyla kristallprover i diffraktionskompatibla stöd för att stänga automatiseringsgapet mellan kristallisering och datainsamling15,16,17. Kortfattat odlas kristaller i en modifierad ångdiffusionsplatta, CrystalDirect-mikroplattan. När kristallerna dyker upp applicerar CrystalDirect-skörderoboten automatiskt en laserstråle för att ta bort ett filmstycke som innehåller kristallen, fäst det på en vanlig datainsamlingsstift och kryokyl den i en kvävegasström (se Zander et al. 2016 och https://www.youtube.com/watch?v=Nk2jQ5s7Xx8 ). Denna teknik har ett antal ytterligare fördelar jämfört med manuella eller halvautomatiska kristallmonteringsprotokoll. Till exempel är kristallernas storlek och form inte ett problem, vilket gör det lika enkelt att skörda stora kristaller eller mikrokristaller, det är ofta möjligt att undvika användning av kryoskyddsmedel, på grund av det speciella sättet på vilket tekniken fungerar (se referens 17, Zander et al.), vilket gör röntgendiffraktionsanalys mycket enklare. Laserstrålen kan också användas som ett kirurgiskt verktyg för att välja de bästa delarna av ett prov när kristaller växer på kluster eller visar epitaxial tillväxt till exempel. CrystalDirect-tekniken kan också användas för automatiserade blötläggningsexperiment17. Leverans av lösningar med små molekyler eller andra kemikalier till kristaller. På så sätt kan det stödja helautomatisk, storskalig förenings- och fragmentscreening. När kristaller har skördats och kryokylts av CrystalDirect-roboten överförs de till antingen SPINE- eller Unipuck-puckar som är kompatibla med de flesta synkron makromolekylära kristallografistrålar runt om i världen. Systemet kan skörda upp till 400 stift (kapaciteten hos den kryogena lagringen Dewar) på ett helt autonomt sätt. CRIMS kommunicerar med skördarroboten under processen och ger automatiserad spårning av kristallprover (puckar och stift). Puckar är märkta med både streckkoder och RFID-taggar för att underlätta provhantering21,28.

CRIMS tillhandahåller ett API (Application Program Interface) som stöder automatiserad kommunikation med ISPyB-systemet som stöder hantering och bearbetning av röntgendata vid många synkrotroner i Europa och världen29. När den automatiska kristallskörden är klar kan forskare välja kristallprover (puckar) och skapa provsändningar för de makromolekylära kristallografistrålarna vid antingen ESRF (Grenoble, Frankrike)7,8,9 eller Petra III synkrotroner (Hamburg, Tyskland)18,19. CRIMS överför data som motsvarar de valda strållinjeproverna till synkrotroninformationssystemet tillsammans med förvalda parametrar för datainsamling. När proverna anländer till den valda synkrotronstrålelinjen utförs insamlingen av röntgendata antingen manuellt, genom fjärrövervakning eller på ett helt automatiserat sätt (dvs. vid MASSIF-1-strållinjen i ESRF8 som drivs av den gemensamma EMBL ESRF Joint Structural Biology Group (JSBG)). Efter datainsamling hämtar CRIMS automatiskt information om resultaten av datainsamlingen tillsammans med de första databehandlingsresultaten som utförs av synkrotrondatabehandlingssystemen och presenterar den för forskaren genom ett bekvämt användargränssnitt.

HTX-labbet tillämpar dessa automatiserade rörledningar för att stödja tre olika applikationer, snabba bestämningar av nya strukturer, snabb karakterisering av protein-ligand-komplex och storskalig förenings- och fragmentscreening. Nedan beskriver vi hur du använder och använder dem.

Protocol

OBS: Finansierad tillgång till dessa rörledningar för forskare över hela världen stöds genom en rad finansieringsprogram. Vid skrivandet av detta manuskript godkänns denna manuskriptansökan för tillgång antingen genom iNEXT Discovery-programmet (https://inext-discovery.eu), ett europeiskt nätverk för att stimulera translationell strukturbiologi20 som finansieras genom Europeiska kommissionens Horisont 2020-program eller INSTRUCT-Eric (https://instruct-eric.eu/). Kontakta motsvarande författare för aktuella former och rutter för finansierad åtkomst vid en viss tidpunkt. Detta protokoll beskriver driften av protein-till-struktur-pipelinen och innehåller steg som är gemensamma för alla våra pipelines medan specificiteter för de andra två rörledningarna diskuteras i följande avsnitt. Instruktionerna här hänvisar till CRIMS V4.0.

1. Crystallization Laboratory med hög genomströmning

  1. Innan du börjar ber du om registrering på HTX-labbet via CRIMS-systemet https://htxlab.embl.fr/#/. Användarautentiseringsuppgifterna ger fjärråtkomst till alla experimentella design- och utvärderingsgränssnitt.
    1. Logga in på CRIMS via en webbnavigatör (Firefox, Chrome och Safari stöds). CriMs webbserver är krypterad för att förhindra att tredje part kommer åt data medan den färdas via webben. En gång i CRIMS hjälper en serie menyer till vänster om screeningen till att hantera och skapa prover, begära kristalliseringsexperiment, hantera och visualisera plattor etc. En serie videohandledning finns på https://medias01-web.embl.de/Mediasite/Showcase/embl/Channel/a2168bcaa36b4564851663e5b69594014d.
      OBS: Användare som skickar prover med kurir måste registrera proverna och de begärda kristalliseringsexperimenten via CRIMS innan de skickar provet för att säkerställa att de kan bearbetas utan dröjsmål vid ankomsten. Skicka leveransinformationen till htx@embl.fr.
  2. Logga in på CRIMS (https://htxlab.embl.fr) med en webbläsare och klicka på Exempelmenyn. Detta öppnar ett gränssnitt med projekt- och exempelhanteringsverktyg.
  3. Klicka på knappen Nytt exempel och ange den begärda informationen. CRIMS gör det möjligt att organisera prover under olika projekt, mål och konstruktioner. Tilldela exemplet till befintliga eller skapa nya i det här läget.
  4. När den begärda informationen har angetts klickar du på Spara & Gör begäran. Välj kristalliseringsprotokollet, kristalliseringsskärmarna som ska användas, inkubationstemperaturen och önskat datum för experimenten.
    1. Använd kommentarsfälten för att ge indikationer om de exempel som är viktiga för HTX-labboperatörerna att känna till. Anpassade skärmar kan också väljas (se nedan). Efter att ha skickat in kristalliseringsbegäran kommer den att valideras av HTX Lab Team och bekräftelse om schemaläggningen av experimenten kommer att skickas via e-post. Se till att välja experimentdatum som är kompatibla med de tider som krävs för provutleverans.
  5. När proverna anländer till anläggningen kommer operatörerna på HTX-labbet att utföra experimenten på begäran. När kristalliseringsexperiment har konfigurerats kommer bekräftelsen att skickas via e-post och kristalliseringsbrickor kommer att överföras till de automatiserade bildsbilderna. CRIMS ger tillgång till alla experimentella parametrar och spårar automatiskt nya bildbehandlingssessioner. E-postmeddelanden skickas automatiskt när nya bilder är tillgängliga. Ett termofluorbaserat30-provkvalitetsbedömningsexperiment baserat på ett protokoll som utvecklats vid anläggningen25, 26 utförs med varje prov vid denna tidpunkt och kommer att finnas tillgängligt via CRIMS.
  6. Bilder av kristalliseringsexperimenten tillsammans med resultaten av provkvalitetsbedömningen kommer att finnas tillgängliga i CRIMS kort efter att kristalliseringsbrickorna har ställts in. Klicka på Thermofluor-menyn och navigera till exemplet för att se resultaten av provkvalitetsbedömningsexperimentet.
    1. Klicka på menyn Tallrikar för att se bilderna från kristalliseringsplattorna. Navigera till exemplet och klicka antingen på Visa för att se den senaste bildsessionen eller på + (expandera) symbolen för att välja en annan bildbehandlingssession. En serie verktyg hjälper till att enkelt hitta och navigera genom exemplen. Om du till exempel klickar i en projektruta högst upp på skärmarna filtrerar exempel för det projektet och sökfunktioner är tillgängliga för de flesta tabellkolumner.
  7. Använd gränssnittet för plattan View för att utvärdera och poängsätta resultaten av kristalliseringsexperimenten. Det tillåter navigering genom kristalliseringsplattornas olika brunnar, välj bildtyper (dvs Vis, UV), välj bildupplösning eller spela in poäng, till exempel. Detta gränssnitt ger också alla experimentella parametrar som används för kristalliseringsexperimenten, inklusive sammansättningen av kristalliseringslösningarna.
  8. Klicka på menyn Förfining för att designa kristalloptimeringsskärmar baserat på primära träffförhållanden som identifierats genom den första screeningen. Undermenyn Kemikalier och lagerlösningar gör det möjligt för en att registrera och hantera kristalliseringslagerlösningarna. Undermenyn Skärmar ger tillgång till ett gränssnitt för att utforma din egen optimering eller anpassade skärmar.
    1. Välj den plåttyp, lagerlösningar eller gradientkonfigurationer som bäst passar den experimentella designen. Det är möjligt att be CRIMS att mata ut en fil som är direkt kompatibel med Formulator Robot (Formulatrix) för att automatiskt pipettera skärmarna i plattan eller att mata ut ett utskrivbart dokument med volymerna för manuell drift.
  9. Iterera genom steg 1.2-1.8 för att utföra kristalloptimeringsexperiment.
  10. När kristaller som är lämpliga för röntgendiffraktionsexperiment har identifierats navigerar du till plattan View-gränssnittet och väljer bilden som motsvarar rätt kristalliseringsdroppe. Förinstallade poäng hjälper dig att göra detta enkelt.
    1. Klicka antingen på Crystal Harvesting för att spela in en automatiserad kristallskördsplan för CrystalDirect-skördarroboten eller på manuell skörd för traditionell manuell kristallmontering, om du använder CRIMS på en anläggning som inte är utrustad med CrystalDirect. Båda gränssnitten kommer att vägleda användaren genom kristallskördsprocessen. CRIMS registrerar automatiskt och lagrar platsen för skördade kristaller i antingen SPINE eller Unipucks21.
  11. Välj Crystal Manager-menyn i CRIMS. Klicka på undermenyn Skördade kristaller för att inspektera de frysta proverna. Vid användning av CrystalDirect-skördaren presenteras bilder av skördeprocessen, inklusive bilder av stiften med de skördade kristallerna.
  12. Välj menyn Leveranser för att ansluta till antingen ESRF- eller Petra III-synkrotroner och skapa exempelsändningar för röntgendiffraktionsanalys. Klicka på knappen Skapa sändning och välj den synkrotron du vill använda och påsnumret (påslösenordet på synkrotronen är nödvändigt här). Nästa serie gränssnitt används för att välja de pukcs som ska ingå i leveransen. Systemet gör det möjligt att ge kommentarer för att stödja datainsamling och bestämma datainsamlingsparametrar för automatiserade strållinjer som MASSIF-1.
  13. Om datainsamlingen utförs vid ESRF eller Petra III HTX-labbet kommer operatörerna att överföra proverna till strållinjen, datainsamling på andra synkrotroner kommer att göras på användarens egen bekostnad. Det är möjligt att samla in data genom att resa till synkrotronen, genom fjärrstrålning eller vid MASSIF-1. I det senare fallet är datainsamlingsprocessen helt automatiserad. På synkrotronen tillåter specifika gränssnitt i ISPyB29 användare att återställa informationen som skickas av CRIMS och associera provpuckar till den så att resultaten av datainsamlingen spåras automatiskt. För de experiment som beskrivs här utfördes datainsamling vid synkrotroner vanligtvis med MXcube31-programvaran, medan databehandling och strukturförfining utfördes med atuoPROC32, Staraninso33, BUSTER33,Pipedream32,33 och Coot35.
  14. När datainsamlingsexperiment har utförts hämtar CRIMS sammanfattande information tillsammans med resultaten av den första databehandlingen vid synkrotronen från ISPyB29-systemet. Gå till CRIMS Crystal Manager-menyn och klicka på undermenyn Crystal Diffraction Data. All information och metadata om datainsamling av diffraktion är tillgänglig. Det är också möjligt att ladda ner bearbetade data från synkrotronen samt råa diffraktionsbilder. Visa flera datasamlingar eller välj specifika datamängder. Exempelhanteringsverktyg gör det möjligt att navigera och välja exempel för specifika projektkonstruktioner.
    OBS: Denna pipeline ger helt automatiserad drift över internet från rent protein till röntgendiffraktionsresultat och kan drivas med ett eller flera prover samtidigt. Det kan tillämpas på olika sammanhang och projekttyper inom strukturbiologi.

Representative Results

Den automatiserade kristallografipipelinen som beskrivs ovan har tillämpats för att stödja ett stort antal interna och externa projekt med anmärkningsvärd framgång. Några höjdpunkter inkluderar projektet från Djinović-Carugo och medarbetare från Max Perutz Laboratories (Wien) med fokus på den strukturella och funktionella analysen av en dipeptidyl peptidas som är nödvändig för tillväxten av en bakteriell patogen. Den snabba följden av kristalliseringsscreening, diffraktionsutvärdering, kristalloptimering och röntgendatainsamlingscykler (upp till 8 iterationer för detta projekt) gjorde det möjligt att erhålla strukturella modeller för tre olika konformationstillstånd av proteinet på bara några veckor, vilket gav viktig mekanistisk förståelse för funktionen hos denna klass av proteiner36 (se figur 1).

Ett annat exempel är från Macias och medarbetare från Institute of Biomedical Research (IRB, Barcelona) som kombinerade bioinformatikverktyg och strukturella metoder för att identifiera nya DNA-bindande motiv för SMAD3- och SMAD4-transkriptionsfaktorer som är involverade i regleringen av cellöde. Detta arbete har producerat 6 högupplösta strukturer av SMAD3 & 4 i komplex med olika DNA-bindande motiv37,38 avslöjar en hittills intet ont anande förmåga hos dessa transkriptionsfaktorer att känna igen och binda till en mängd olika DNA-sekvenser, vilket är nyckeln till tolkningen av deras funktion i olika biologiska sammanhang. Dessa tekniker har också tillämpats för att stödja proprietär forskning inom ramen för läkemedelsdesignprojekt från forskargrupper i läkemedels- och bioteknikföretag. Till exempel, tack vare snabbheten som dessa pipelines bidrar med, kan den strukturella analysen av flera ligand-målkomplex uppnås inom några dagar, vilket är av stort värde för att stödja successiva rundor medicinsk kemioptimering i samband med läkemedelsutveckling. Slutligen har vi också tillämpat denna infrastruktur för storskalig röntgenbaserad fragmentscreening39.

Figure 1
Bild 1: Automatiserad kristallografipipeline. Integrerad drift av EMBL HTX-labbet inklusive CrystalDirect-tekniken och CRIMS-programvaran med MASSIF-1-strållinjen vid ESRF och automatiserad kommunikation mellan CRIMS- och ISPyB-programvaran gör det möjligt att stödja helautomatisk, fjärrstyrd protein-till-struktur-pipeline som integrerar kristalliseringsscreening och optimering, automatiserad kristallskörd och kryokylning och automatiserad datainsamling och bearbetning. Konstruktionsmodellerna motsvarar tre olika konformationstillstånd hos ett proteas från en patogen bakterie som identifierats på rekordtid genom tillämpning av dessa rörledningar36. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Discussion

De automatiserade kristallografipipelines som beskrivs här är tillgängliga för forskare över hela världen genom olika finansieringsprogram. För närvarande kan finansierad åtkomst för kristalliseringsexperiment och CrystalDirect-tekniken erhållas genom att ansöka till iNEXT Discovery-programmet och INSTRUCT-ERIC, medan tillgång till makromolekylära kristallografiska strålar vid ESRF stöds genom ESRF-användaråtkomstprogrammet. Detta tillvägagångssätt minimerar fördröjningen mellan kristalltillväxt och mätning, påskyndar utvecklingen av mycket utmanande projekt som kräver diffraktionsbaserad optimering av proteinproduktions- och kristalliseringsförhållanden och befriar forskare från komplexa operationer i samband med kristallisering, kristallhantering och strållinjedrift, vilket gör kristallografi mer tillgänglig för icke-expertgrupper. Det kan också användas för snabb utforskning av kristalliseringstillsatser, fasningsmedel eller för sammansatt screening genom samkristalliseringsexperiment. Även om de flesta kristallografiprojekt potentiellt kan dra nytta av detta tillvägagångssätt, kan vissa prover kräva speciella protokoll som inte är mottagliga för automatisering eller de rörledningar som presenteras här, till exempel de som kräver mikrofluidiska system eller högspecialiserade kristalliseringsenheter eller prover som är extremt labila och inte tolererar leverans.

CrystalDirect-tekniken möjliggör också automatiserad kristall blötläggning17 för karakterisering av små molekylmålkomplex. För detta skapas en liten bländare med lasern före skördeprocessen och en droppe av en lösning som innehåller önskade kemikalier (dvs fasningsmedel eller potentiella ligands) läggs ovanpå, så att den kommer i kontakt med och sprider sig till kristalliseringslösningen så småningom når kristallen. Kemiska lösningar kan formuleras i vatten, DMSO eller andra organiska lösningsmedel. Efter en viss inkubationstid kan kristallerna skördas och analyseras genom diffraktion enligt beskrivningen ovan. Detta tillvägagångssätt har tillämpats på snabb karakterisering av ligand-protein komplex i samband med strukturbaserad läkemedelsdesign samt på storskalig förening och fragment screening. I det senare fallet kan fragmentbibliotek med hundratals till över tusen fragment snabbt analyseras. Specifika CRIMS-gränssnitt som inte presenteras här underlättar design och automatiserad spårning av kristall blötläggningsexperiment, medan integration mellan CRIMS-programvaran och Pipedream-programvarusviten, utvecklad av Global Phasing Ltd (Storbritannien) möjliggör automatiserad databehandling, fasning, ligandidentifiering och strukturförfining över hundratals datamängder parallellt, vilket effektiviserar dataanalys och tolkning32,33 . Till exempel tillämpades denna pipeline nyligen på identifiering av fragment som binder både till den aktiva platsen och flera allosteriska platser i Trypanosoma brucei farnesyl pyrofosfatsyntas, ett nyckelenzym i parasiten som orsakar mänskliga afrikanska trypanosomiasis.

De pipelines som presenteras här kan bidra till att påskynda upptäcktstakten inom strukturbiologin och göra makromolekylär kristallografi mer tillgänglig för ett större antal forskargrupper. Genom att underlätta storskalig screening av föreningar och fragment kan de dessutom bidra till att främja translationell forskning och påskynda processen för läkemedelsupptäckt, vilket bidrar till att underlätta utvecklingen av bättre och säkrare läkemedel mot ett större antal mål.

Disclosures

JAM är medförfattare till ett patent på CrystalDirect-systemet

Acknowledgments

Vi vill tacka den gemensamma EMBL-ESRF Structural Biology Group (JSBG) för stöd i användningen och driften av ESRF makromolekylära strållinjer. Vi är tacksamma mot Matthew Bowler för stöd med datainsamling vid MASSIF-1-strållinjen i ESRF och Thomas Schneider och EMBL Hamburg Team för utmärkt stöd med datainsamling på P14 av PetraIII synkrotron (DESY, Hamburg, Tyskland). CrystalDirect-skördaren är utvecklad i samarbete med Instrumentation Team på EMBL Grenoble. Detta projekt stöddes av finansiering från Europeiska gemenskapensH2020-program inom ramen för projekten iNEXT (Grant No 653706) och iNEXT Discovery (Grant No 871037) samt Région Auvergne-Rhône-Alpes genom Booster-programmet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CrystalDirect harvester Arinax Automated crystal mounting and cryocooling
CrystalDirect Crystallization plate Mitegen SKU: M-XDIR-96-2 96-well crytsallization microplate
Formulator 16 Formulatrix For the autoamted preparation of crystallization screens
Mosquito crystallization Robot SPT Labtech For the preparation of crystallization experiments
Tecan Evo Liquid handling station Tecan For the preparation of crystallization solutions
Spine Pucks Mitegen SKU: M-SP-SC3-1 SPINE-compatible cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers
UniPucks Mitegen SKU: M-CP-111-021 Universal cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abola, E., Kuhn, P., Earnest, T., Stevens, R. C. Automation of X-ray crystallography. Nature Structural Biology. 7, 973-977 (2000).
  2. Banci, L., et al. First steps towards effective methods in exploiting high-throughput technologies for the determination of human protein structures of high biomedical value. Acta crystallographica. Section D, Biological. 62 (10), 1208-1217 (2006).
  3. Edwards, A. Large-scale structural biology of the human proteome. Annual Review in Biochemistry. 78, 541-568 (2009).
  4. Rupp, B., et al. The TB structural genomics consortium crystallization facility: towards automation from protein to electron density. Acta crystallographica. Section D, Biological. 58 (10), 1514-1518 (2002).
  5. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).
  6. Cusack, S., et al. Small is beautiful: protein micro-crystallography. Nature Structural and Molecular Biology. 5, 634-637 (1998).
  7. McCarthy, A. A., et al. ID30B – a versatile beamline for macromolecular crystallography experiments at the ESRF. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 1249-1250 (2018).
  8. Bowler, M. W., et al. MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
  9. von Stetten, D., et al. ID30A-3 (MASSIF-3) – a beamline for macromolecular crystallography at the ESRF with a small intense beam. Journal of Synchrotron Radiation. 27 (3), 844-851 (2020).
  10. Viola, R., et al. First experiences with semi-autonomous robotic harvesting of protein crystals. Journal of Structural and Functional Genomics. 12, 77-82 (2011).
  11. Khajepour, M. Y. H., et al. REACH: Robotic Equipment for Automated Crystal Harvesting using a six-axis robot arm and a micro-gripper. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69 (3), 381-387 (2013).
  12. Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69, 1297-1302 (2006).
  13. Collins, P. M. Gentle, fast and effective crystal soaking by acoustic dispensing. Acta crystallographica. D73, 246-255 (2017).
  14. Deller, M. C., Rupp, B. Approaches to automated protein crystal harvesting. Acta crystallographica. F70, 133-155 (2014).
  15. Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (10), 1393-1399 (2012).
  16. Márquez, J. A., Cipriani, F. CrystalDirectTM: A Novel Approach for Automated Crystal Harvesting Based on Photoablation of Thin Films. Structural Genomics. 1091, 197-203 (2014).
  17. Zander, U., et al. Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).
  18. Cianci, M., et al. P13, the EMBL macromolecular crystallography beamline at the low-emittance PETRA III ring for high- and low-energy phasing with variable beam focusing. Journal of Synchrotron Radiation. 24 (1), 323-332 (2017).
  19. Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).
  20. iNEXT Consortium . iNEXT: a European facility network to stimulate translational structural biology. FEBS Letters. 592 (12), 1909-1917 (2018).
  21. Papp, G., et al. Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).
  22. Whittle, P. J., Blundell, T. L. Protein Structure-Based drug design. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 349-375 (1994).
  23. Blundell, T. L., Jhoti, H., Abell, C. High-throughput crystallography for lead discovery in drug design. Nature Reviews Drug Discovery. 1, 45-54 (2002).
  24. Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein–ligand structure determination. Acta Crystallographica. D73, 267-278 (2017).
  25. Mariaule, V., Dupeux, F., Márquez, J. A. Estimation of Crystallization Likelihood Through a Fluorimetric Thermal Stability Assay. Structural Genomics. 1091, 189-195 (2014).
  26. Dupeux, F., Röwer, M., Seroul, G., Blot, D., Márquez, J. A. A thermal stability assay can help to estimate the crystallization likelihood of biological samples. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (11), 915-919 (2011).
  27. Dimasi, N., Dupeux, F., Marquez, J. A. Expression, crystallization and X-ray data collection from microcrystals of the extracellular domain of the human inhibitory receptor expressed on myeloid cells IREM-1. Acta Crystallographica. F63, 204-208 (2007).
  28. Hiraki, M., Matsugaki, N., Yamada, Y., Hikita, M., Yamanaka, M., Senda, T. RFID tag system for sample tracking at structural biology beamlines. , 060074 (2019).
  29. Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
  30. Ericsson, U., et al. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
  31. Gabadinho, J., et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17, 700-707 (2010).
  32. Vonrhein, C., et al. Data processing and analysis with the autoPROC toolbox. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 293-302 (2011).
  33. Smart, O. S., et al. Exploiting structure similarity in refinement: automated NCS and target-structure restraints in BUSTER. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (4), 368-380 (2012).
  34. Bezerra, G. A., et al. Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition. Scientific Reports. 7 (1), 2848 (2017).
  35. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica. D66, 486-501 (2010).
  36. Bezerra, G. A., et al. Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition. Scientific Reports. 7 (1), 2848 (2017).
  37. Martin-Malpartida, P., et al. Structural basis for genome wide recognition of 5-bp GC motifs by SMAD transcription factors. Nature Communications. 8 (1), 2070 (2017).
  38. Aragón, E., et al. Structural basis for distinct roles of SMAD2 and SMAD3 in FOXH1 pioneer-directed TGF-β signaling. Genes & Development. 33 (21-22), 1506-1524 (2019).
  39. Münzker, L., et al. Fragment‐Based Discovery of Non‐bisphosphonate Binders of Trypanosoma brucei Farnesyl Pyrophosphate Synthase. ChemBioChem. 21 (21), 3096-3111 (2020).

Tags

Biokemi nummer 172
De automatiserade kristallografiledningarna vid EMBL HTX-anläggningen i Grenoble
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cornaciu, I., Bourgeas, R.,… More

Cornaciu, I., Bourgeas, R., Hoffmann, G., Dupeux, F., Humm, A. S., Mariaule, V., Pica, A., Clavel, D., Seroul, G., Murphy, P., Márquez, J. A. The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble. J. Vis. Exp. (172), e62491, doi:10.3791/62491 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter